CN107022010B - 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 - Google Patents

一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 Download PDF

Info

Publication number
CN107022010B
CN107022010B CN201710219921.0A CN201710219921A CN107022010B CN 107022010 B CN107022010 B CN 107022010B CN 201710219921 A CN201710219921 A CN 201710219921A CN 107022010 B CN107022010 B CN 107022010B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
seq
amino acid
acid sequence
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710219921.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107022010A (zh
Inventor
束长龙
耿丽丽
张�杰
曹蓓蓓
宋福平
彭琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201710219921.0A priority Critical patent/CN107022010B/zh
Publication of CN107022010A publication Critical patent/CN107022010A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107022010B publication Critical patent/CN107022010B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1278—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列。杀虫蛋白具有如(I)和(II)中的至少一种的氨基酸序列：(I)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；(II)与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在98％以上，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

Description

一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
技术领域
本发明涉及一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的***，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。
现有技术主要认为Bt之所以能够具有杀虫活性，主要是由于其体能能够产生各种Cry蛋白、Cyt蛋白和Vip蛋白。
然而，鲜有报道Bt还能够产生不同于以上三种蛋白的杀虫活性物质，特别是对某些鞘翅目(Coleoptera)害虫，例如华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)具有优良活性的杀虫活性物质。
发明内容
本申请之一提供了一种杀虫蛋白，其具有如(I)和(II)中的至少一种的氨基酸序列：
(I)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
(II)与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
通过(II)限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(II)限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，优选杀虫蛋白的氨基酸序列为与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在98％以上，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(II)限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，优选杀虫蛋白的氨基酸序列为与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(II)限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，优选杀虫蛋白的氨基酸序列为与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(II)限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如SEQID No.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
在一个具体实施例中，所述杀虫蛋白还可以为如(I)的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸后，与具有如(I)的氨基酸序列的杀虫蛋白具有相同功能的蛋白。通过这种方式限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的同时，可以获得具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相当或者更优的效果，这将在本申请的保护范围之内。不过在不影响使用所述杀虫蛋白的情况下，通过(II)限定的杀虫蛋白在与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列获得具有相同功能的同时，获得比如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列稍差的效果，例如其效果是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的效果的50％-99.999％时，也在本申请的保护范围之内。
本申请的杀虫蛋白对害虫的杀虫活性，特别是对华北大黑鳃金龟的杀虫活性显著优于现有技术中的杀虫蛋白的杀虫活性，其可以弥补例如Cry8G蛋白在对华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)杀虫活性较弱的不足。因此，其丰富了杀虫蛋白资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，具有重要的经济、社会和生态效益。
本申请之二提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码如本申请之一所述的杀虫蛋白中任意一种的核苷酸序列。该核苷酸序列可以以其来源菌株为模板，或以克隆的全长DNA片段为模板，通过PCR扩增得到；也可以根据给定的序列人工合成。
在一个具体的实施例中，当所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示时，编码所述杀虫蛋白的所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本申请之三提供了一种组合物，其包括如本申请之一所述杀虫蛋白的至少一种。
在一个具体的实施例中，当所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示时，编码所述杀虫蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本申请之四提供了一种含有本申请之二所述的核苷酸序列，且能产生本申请之一相应的所述的杀虫蛋白的转基因微生物。
在一个具体的实施例中，优选所述转基因微生物包括芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种。
在一个具体的实施例中，优选所述芽胞杆菌包括苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、萎缩芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)中的至少一种；所述假单胞菌包括荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)；所述肠杆菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一个具体实施例中，本申请的转基因微生物的出发株(即在转入本申请之二所述的核苷酸序列之前的微生物)为野生微生物和/或遗传工程微生物。
其中，野生微生物是指从自然界中分离出的未经过人工改造的微生物。
遗传工程微生物是指将野生微生物人工改造的微生物。
本申请的转基因微生物和/或遗传工程微生物的物种并不因进行了转基因修饰而改变，因此，转基因微生物与发生转基因之前的微生物(即作为受体微生物)为相同的物种。
在一个具体实施例中，如上的本申请二的所述的核酸序列能够被连接在表达载体上。所述表达载体例如可以是能够在大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌中穿梭的pSTK表达载体。
本申请之五提供了根据本申请之二所述的核苷酸序列在制备转基因植物中的应用，其中，所述转基因植物能够产生如本申请之一所述的杀虫蛋白；所述转基因植物包括十字花科(Cruciferae)、蝶形花科(Papilionaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和菊科(Compositae)中的至少一种。
在一个具体的实施例中，优选所述转基因植物包括芸薹属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、苜蓿属(Medicago)、甜菜属(Beta)和莴苣属(Lactuca)中的至少一种。
在一个具体的实施例中，优选所述转基因植物包括油菜(Brassica campestris)、大白菜(Brassica rapa)、小白菜(Brassica chinensis)、甘蓝(Brassica oleracea)、萝卜(Raphanus sativus)、苜蓿(Medicago sativa)、甜菜(Beta vulgaris)和莴苣(Lactucasativa)中的至少一种。
转基因植物的物种并不因进行了转基因修饰而改变，因此，转基因植物与发生转基因之前的植物(即作为受体植物)为相同的物种。
本申请之六提供了一种制备如本申请之一所述的杀虫蛋白的方法，其包括利用本申请之四所述的转基因微生物，和/或利用本申请之五所述的应用中的转基因植物来生产所述杀虫蛋白。
在一个具体的实施例中，优选还包括在利用所述转基因微生物和/或转基因植物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到80％以上。
在一个具体的实施例中，更优选在利用所述转基因微生物和/或转基因植物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到90％以上。
在一个具体的实施例中，甚至是在利用所述转基因微生物和/或转基因植物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到99％以上。
因此，本申请之七提供了根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治鞘翅目(Coleoptera)中的至少一种害虫中的应用。
在一个具体的实施例中，优选根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治叶甲科(Chrysomelidae)中的至少一种害虫中的应用。
在一个具体的实施例中，特别优选根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治猿叶甲属(Colaphellus)中的至少一种害虫中的应用。
在一个具体的实施例中，最优选根据本申请之一所述的杀虫蛋白，本申请之三所述的组合物，本申请之四所述的转基因微生物，以及本申请之五所述的应用中的转基因植物中的至少一种在防治大猿叶甲(Colaphellus bowring)中的应用。
单克隆抗体的制备技术已经较为成熟，因此，根据现有技术的常规技术手段，可以制得本申请之一所述的杀虫蛋白的单克隆抗体。在制备单克隆抗体过程中，选用的抗原可以是本申请之一所述的杀虫蛋白的全长序列，也可以是本申请之一所述的杀虫蛋白的部分氨基酸序列。所述抗原的纯品可以通过本申请之六提供的制备如本申请之一所述的杀虫蛋白的方法来获得；所述抗原，特别是当其为部分氨基酸序列时，也可以通过人工合成的方式获得。因此，本申请之八提供了根据本申请之一所述的杀虫蛋白的单克隆抗体。优选所述单克隆抗体为仅特异识别所述杀虫蛋白的单克隆抗体。
在本申请中没有特殊说明的情况下，本申请中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
1)液体LB：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，pH 7.0，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。
2)固体LB：在液体LB培养基中加1.3％琼脂，15磅灭菌15min。用于培养大肠杆菌。
3)抗生素：氨苄青霉素水溶液100mg/ml，用时稀释500倍-20℃保存。其中pET21b质粒载体具有氨苄青霉素抗性。
蛋白电泳检测
120V预电泳约10-20min，取蛋白样品40μL，加入10μL 5×加样缓冲液，混匀，再将上清和沉淀分别梯度稀释，煮沸5-10min，12000rpm离心5min，取10L上清点样。80V恒压电泳至样品浓缩呈直线，150V恒压电泳至指示的溴酚蓝到达凝胶底部。
脱色：电泳后取出凝胶，电泳后取出凝胶并用蒸馏水冲洗，加入50mL溶液I，微波炉中加热30s，60rpm振荡10min。
染色：倒掉溶液I后加入溶液II(每50mL溶液II加200L溶液III)微波炉加热30s，60rpm振荡15min以上。
倒掉溶液II，加入无菌水，凝胶成像***照相保存。
观察结果，根据蛋白条带着色程度比较目的蛋白表达情况，用凝胶成像***照相保存。
表1为SDS聚丙烯酰氨凝胶的制备表。
表1 SDS聚丙烯酰氨凝胶的制备表
Figure BDA0001263401960000061
实施例1新基因的筛选及克隆
Bt基因组提取
S1：5mL 1M Tris-HCL，1mL 0.5M EDTA，171.15g蔗糖，pH7.0，定容至500mL，115℃20min灭菌。
S2：10％SDS 4mL+ddH2O 6mL，pH4.8-5.2。
S3：5M异硫氰酸胍，1M NaAc。
TE：10mM Tris-HCL 3mL，1mM EDTA 600ul，pH8.0，定容至300mL。
1)将苏云金芽胞杆菌4CE1菌株划线接种于LB培养基上，30℃培养过夜；
2)尽可能刮取平板上全部菌体于1.5ml EP管中，用150μl S1充分悬浮；
3)加入100mg石英砂，组织破碎仪上破碎1分钟；
4)加入200μl S2，充分混匀；
5)加入400μl S3，充分混匀，12000rpm离心10分钟；
6)将最上层上清转移至1.5EP管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置20分钟；
7)12000rpm离心10分钟，弃上清；
8)70％无水乙醇清洗沉淀，室温晾干；
9)加100μl TE溶液溶解沉淀；
10)0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组质量和浓度，-20℃保存备用。
以4CE1sip_F1：ATGTGTGTATCTGCCCCTGGTAGTGT(SEQ ID No.3)和4CE1sip_R：ATTGAAACTTCTTGTCGCCACTAATT(SEQ ID No.4)为引物，以4CE1菌株基因组为PCR模板，进行PCR扩增。扩增循环：94℃预变性10min；94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。按照Axygen公司的DNA回收试剂盒的操作说明进行PCR产物回收，并将其连接到pMD-19T克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，获得重组克隆载体，被命名为pMD-4CE1sip。然后以4CE1sip_F2：CACCATGTGTGTATCTGCCCCTGGTAGTGT(SEQ ID No.5)；4CE1sip_R：ATTGAAACTT CTTGT CGCCACTAATT(SEQID No.4)为引物，以pMD-4CE1sip为PCR模板，利用金牌Mix(green)试剂盒(购自北京擎科新业生物技术有限公司)进行PCR扩增。扩增循环：94℃预变性10min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸；30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。按照Axygen公司的DNA回收试剂盒的操作说明进行PCR产物回收，并将其连接到pDE2表达载体(北京擎科新业生物技术有限公司pDE2 Directional TOPO Expression Kit Ver.2试剂盒)上，转化DH5α感受态细胞，进行抗性筛选，获得重组表达载体，被命名为pDE2-4CE1sip。
经测序分析，4CE1sip(SEQ ID No.1)基因长度912bp，其编码蛋白为4CE1sip，共304个氨基酸(SEQ ID No.2)，表达33kDa蛋白。
然后提取pDE2-4CE1sip重组质粒，并将其转化到表达菌株Rosetta(DE3)。将4CE1sip在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳结果发现，4CE1sip基因在可溶组分和不可溶组分中均表达；其中表达约33kDa左右蛋白，与预期结果相符。阴性对照(即不含有4CE1sip基因，但含有pET-21b载体的大肠杆菌Rosetta(DE3))在可溶和不可溶性组分中都没有相应蛋白的表达条带。
实施例2
蛋白的表达与定量分析
将携带4CE1sip基因的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株以1％的接种量接种于LB液体培养基中，37℃培养至OD600值达到0.5-1.0之间时，加入诱导物50mM IPTG，在150rpm，20℃低温下诱导12h。然后在4℃下，8000rpm离心3min。离心收集菌体，加入50mM Tris·Cl(pH8.0)悬浮；破碎菌体(利用超声波常规完全破碎)，将超声破碎后的菌液在4℃下12,000rpm离心15min；然后收集上清液。按照如下方法对所述上清液进行SDS-PAGE定量分析：制备以下5种不同浓度梯度的BSA：0.8μg/μL、0.4μg/μL、0.2μg/μL、0.1μg/μL、0.05μg/μL，并将目标蛋白进行梯度稀释，使其终浓度介于0.8-0.05μg/μL，目标蛋白和5种不同浓度的BSA(蛋白定量试剂盒：DC Protein Assay)上样量均为10μL，进行蛋白电泳检测。以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白制作蛋白浓度标准曲线，测定大肠杆菌Rosetta(DE3)重组菌株中总蛋白的浓度。结合ImageMaster VDS软件分析SDS-PAGE中目的蛋白所占比例，计算目的蛋白，即得到上清液中的4CE1sip的浓度。
对比例1
以克隆到pET21b上的cry3Aa7(SEQ ID No.5)基因在大肠杆菌Rosetta(DE3))中相同条件下的表达产物为生物活性测定分析的阳性对照。Cry3Aa7(SEQ ID No.6)蛋白的表达与定量分析同实施例2。
实施例3
活性分析
大猿叶甲(Colaphellus bowringii)由中国农业科学院植物保护研究所生物技术组提供。
害虫的生物活性测定操作步骤如下：
(1)选取鲜嫩一致的叶片，用清水洗净，晾干，剪成一次性平皿(直径＝6cm)大小；
(2)将叶片在配制好的系列稀释的上清液(加入洗涤剂，终浓度0.1％)中浸泡30s；
(3)在实验台上铺一层保鲜膜，蘸有样品的叶片置于保鲜膜上，室温晾干；
(4)将叶片分别放于培养皿中，培养皿(直径＝9cm)中垫入无菌水喷湿的滤纸(所述滤纸需用锡箔纸包装灭菌)；
(5)用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每个叶片接幼虫30头作为一个处理，每个处理做三次重复，接完虫后以2层吸水纸严格密封，并用橡皮筋固定，防止幼虫爬出；
(6)放置25℃生化培养箱中，光周期为16h：8h，湿度50％左右，每天观察叶片是否腐烂或干枯，是否有水蒸气凝结，并调整生化培养箱内的水分，保持箱内湿度；
(7)48h后调查各个处理的死、活虫数，计算死亡率、存活率、校正死亡率和LC50。
其中，对试虫进行LC50测定之前，首先使用如上的生物活性测定方法经过初筛初步确定杀虫的浓度范围，然后再测定一系列的浓度梯度下的杀虫活性，进而计算出LC50。在某一特定浓度下的死亡率和校正死亡率计算公式如下：
Figure BDA0001263401960000091
Figure BDA0001263401960000092
Figure BDA0001263401960000101
根据生测数据采用SPSS(V13.0)软件计算致死中浓度(LC50)。其结果见表2。
表2
Figure BDA0001263401960000102
由表2的结果可知，本申请的4CE1sip杀虫蛋白对大猿叶甲的活性显著地优于已知的Cry类杀虫蛋白Cry3Aa7。将本申请的4CE1sip杀虫蛋白用于防治大猿叶甲，不但提供了一种新型的杀虫蛋白，而且还可以显著地降低生产成本，从而带来更为可观的经济效益。
虽然本发明已经参照其优选地具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。例如，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物或方法步骤。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。并且利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
LHA1760148 核 苷 酸 和 氨 基 酸 序 列 表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
<130> LHA1760148
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）
<223> 4CE1sip
<400> 1
ATGTGTGTATCTGCCCCTGGTAGTGTATTAGCAGCAGAAAATCCCCCAACTAGTGTTAATGAAAATGTAAGAGTTGGTATTACGGATGTCAAATCTGAATTAAAAAAAATAGGTGAGTACTATTATGCTAATGAAATAGCAGGTACAGAAATTAAGGTAGGTCCTTTAAATTATTTAACATTTGAAAGAACGCCAAGAAGTGTTGAAACAAAAGTTAACTTCGGTATTACAGCTACTGCAAATGAATTGAAATATGATAGTTCCATCGTTGAATACATTGGAGAAAATATATTTACGAACAATTCAGATGTAACCCAAAAGTTCTCAACAGCTAAATATAATAAAACTGTAACAGAATCAATAACAACATCGACAACAAAGGGTTTTAAAGTGGGTGGTTCAGGTGACGGTAGTAACATATTTACCATTCCATTGCTATTAAATAATGGTATGAAAGTAAATGCAGAATTCAACTCTTCTACTACAGAGTCAAAAACAAAATCCGAATCAAGAGGAATAGAAGCATCTGCACAAACTGTAGAAGTTCCACCAAATAAAACATTTAAAGCAGAAGTTGTATTGGAACAAAGAAGTTTTTGGAGTGATGTTACACTTAACGGTGTAGGGAATGATCTTGAGACTACAATAGTTGCAAAGGCAGGAAAAGTGAATTCGGGCGAATCTTTAATTAAAGAATACACATTTAAAGATAAAACTGTAAATTACTGGAATAAACTAAGTGCTTCTCAAAAACTTAGTCTAAATGGAATCACATTTAATAATAATAATAATAGTGTAAATGTAAATGGGACAGCAAAAGTTGAAGGTATATTTGGTAGTGAGTTAAATGTGAAAATTTATGATATTACAGATAAATCAAATCCTAAATTAGTGGCGACAAGAAGTTTCAAT；
<210> 2
<211>304
<212> PRT
<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）
<223> 4CE1sip
<400> 2
MCVSAPGSVLAAENPPTSVNENVRVGITDVKSELKKIGEYYYANEIAGTEIKVGPLNYLTFERTPRSVETKVNFGITATANELKYDSSIVEYIGENIFTNNSDVTQKFSTAKYNKTVTESITTSTTKGFKVGGSGDGSNIFTIPLLLNNGMKVNAEFNSSTTESKTKSESRGIEASAQTVEVPPNKTFKAEVVLEQRSFWSDVTLNGVGNDLETTIVAKAGKVNSGESLIKEYTFKDKTVNYWNKLSASQKLSLNGITFNNNNNSVNVNGTAKVEGIFGSELNVKIYDITDKSNPKLVATRSFN；
<210>3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 4CE1sip_F
<400> 3
ATGTGTGTATCTGCCCCTGGTAGTGT；
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>4CE1sip_R
<400> 4
ATTGAAACTTCTTGTCGCCACTAATT；
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>4CE1sip_F2
<400> 5
CACCATGTGTGTATCTGCCCCTGGTAGTGT；
<210> 6
<211> 1956
<212> DNA
<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）
<223> cry3Aa7
<400> 6
atgataagaaagggaggaagaaaaatgaatccgaacaatcgaagtgaacatgatacaataaaaactactgaaaataatga
ggtgccaactaaccatgttcaatatcctttagcggaaactccaaatccaacactagaagatttaaattataaagagtttt
taagaatgactgcagataataatacggaagcactagatagctctacaacaaaagatgtcattcaaaaaggcatttccgta
gtaggtgatctcctaggcgtagtaggtttcccgtttggtggagcgcttgtttcgttttatacaaactttttaaatactat
ttggccaagtgaagacccgtggaaggcttttatggaacaagtagaagcattgatggatcagaaaatagctgattatgcaa
aaaataaagctcttgcagagttacagggccttcaaaataatgtcgaagattatgtgagtgcattgagttcatggcaaaaa
aatcctgtgagttcacgaaatccacatagccaggggcggataagagagctgttttctcaagcagaaagtcattttcgtaa
ttcaatgccttcgtttgcaatttctggatacgaggttctatttctaacaacatatgcacaagctgccaacacacatttat
ttttactaaaagacgctcaaatttatggagaagaatggggatacgaaaaagaagatattgctgaattttataaaagacaa
ctaaaacttacgcaagaatatactgaccattgtgtcaaatggtataatgttggattagataaattaagaggttcatctta
tgaatcttgggtaaactttaaccgttatcgcagagagatgacattaacagtattagatttaattgcactatttccattgt
atgatgttcggctatacccaaaagaagttaaaaccgaattaacaagagacgttttaacagatccaattgtcggagtcaac
aaccttaggggctatggaacaaccttctctaatatagaaaattatattcgaaaaccacatctatttgactatctgcatag
aattcaatttcacacgcggttccaaccaggatattatggaaatgactctttcaattattggtccggtaattatgtttcaa
ctagaccaagcataggatcaaatgatataatcacatctccattctatggaaataaatccagtgaacctgtacaaaattta
gaatttaatggagaaaaagtctatagagccgtagcaaatacaaatcttgcggtctggccgtccgctgtatattcaggtgt
tacaaaagtggaatttagccaatataatgatcaaacagatgaagcaagtacacaaacgtacgactcaaaaagaaatgttg
gcgcggtcagctgggattctatcgatcaattgcctccagaaacaacagatgaacctctagaaaagggatatagccatcaa
ctcaattatgtaatgtgctttttaatgcagggtagtagaggaacaatcccagtgttaacttggacacataaaagtgtaga
cttttttaacatgattgattcgaaaaaaattacacaacttccgttagtaaaggcatataagttacaatctggtgcttccg
ttgtcgcaggtcctaggtttacaggaggagatatcattcaatgcacagaaaatggaagtgcggcaactatttacgttaca
ccggatgtgtcgtactctcaaaaatatcgagctagaattcattatgcttctacatctcagataacatttacactcagttt
agacggggcaccatttaatcaatactatttcgataaaacgataaataaaggagacacattaacgtataattcatttaatt
tagcaagtttcagcacaccattcgaattatcagggaataacttacaaataggcgtcacaggattaagtgctggagataaa
gtttatatagacaaaattgaatttattccagtgaat；
<210> 7
<211> 652
<212> PRT
<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）
<223> Cry3Aa7
<400> 7
MIRKGGRKMNPNNRSEHDTIKTTENNEVPTNHVQYPLAETPNPTLEDLNYKEFLRMTADNNTEALDSSTTKDVIQKGISVVGDLLGVVGFPFGGALVSFYTNFLNTIWPSEDPWKAFMEQVEALMDQKIADYAKNKALAELQGLQNNVEDYVSALSSWQKNPVSSRNPHSQGRIRELFSQAESHFRNSMPSFAISGYEVLFLTTYAQAANTHLFLLKDAQIYGEEWGYEKEDIAEFYKRQLKLTQEYTDHCVKWYNVGLDKLRGSSYESWVNFNRYRREMTLTVLDLIALFPLYDVRLYPKEVKTELTRDVLTDPIVGVNNLRGYGTTFSNIENYIRKPHLFDYLHRIQFHTRFQPGYYGNDSFNYWSGNYVSTRPSIGSNDIITSPFYGNKSSEPVQNLEFNGEKVYRAVANTNLAVWPSAVYSGVTKVEFSQYNDQTDEASTQTYDSKRNVGAVSWDSIDQLPPETTDEPLEKGYSHQLNYVMCFLMQGSRGTIPVLTWTHKSVDFFNMIDSKKITQLPLVKAYKLQSGASVVAGPRFTGGDIIQCTENGSAATIYVTPDVSYSQKYRARIHYASTSQITFTLSLDGAPFNQYYFDKTINKGDTLTYNSFNLASFSTPFELSGNNLQIGVTGLSAGDKVYIDKIEFIPVN。

Claims (16)

1.一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种编码如权利要求1所述的杀虫蛋白的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID No. 1所示。
4.一种组合物，其包括如权利要求1所述的杀虫蛋白。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括编码所述杀虫蛋白的核酸，所述核酸的序列如SEQ ID No. 1所示。
6.一种含有根据权利要求2或3所述的核酸，且能产生如权利要求1所述的杀虫蛋白的转基因微生物。
7.根据权利要求6所述的转基因微生物，其特征在于，所述转基因微生物为芽胞杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、肠杆菌（Escherichia）和酵母（Saccharomyces）中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的转基因微生物，其特征在于，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）和蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）中的至少一种；所述假单胞菌为荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）；所述肠杆菌为大肠杆菌（Escherichiacoli）。
9.一种制备如权利要求1所述的杀虫蛋白的方法，其包括利用根据权利要求6至8中任意一项所述的转基因微生物来生产所述杀虫蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在利用所述转基因微生物生产所述杀虫蛋白后，纯化所述杀虫蛋白使所述杀虫蛋白的纯度达到80%以上。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，使所述杀虫蛋白的纯度达到90%以上。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使所述杀虫蛋白的纯度达到99%以上。
13.根据权利要求1所述的杀虫蛋白，根据权利要求4或5所述的组合物，根据权利要求6至8中任意一项所述的转基因微生物中的至少一种在防鞘翅目（Coleoptera）中的至少一种害虫中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述应用为在防治叶甲科（Chrysomelidae）中的至少一种害虫中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述应用为在防治猿叶甲属（Colaphellus）中的至少一种害虫中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述应用为在防治大猿叶甲（Colaphellus bowring）中的应用。
CN201710219921.0A 2017-04-06 2017-04-06 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 Active CN107022010B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710219921.0A CN107022010B (zh) 2017-04-06 2017-04-06 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710219921.0A CN107022010B (zh) 2017-04-06 2017-04-06 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107022010A CN107022010A (zh) 2017-08-08
CN107022010B true CN107022010B (zh) 2020-08-07

Family

ID=59527726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710219921.0A Active CN107022010B (zh) 2017-04-06 2017-04-06 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107022010B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108586587B (zh) * 2018-05-12 2020-05-05 西北农林科技大学 一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用
EP3956350A4 (en) * 2019-04-16 2023-05-10 The Chinese University Of Hong Kong MODIFIED CRY PROTEINS FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC AGENTS
CN111574599B (zh) * 2020-05-18 2022-10-28 福建农林大学 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
CN111647058B (zh) * 2020-05-18 2021-08-03 福建农林大学 对松墨天牛等墨天牛属昆虫具有毒力的Bt毒素
CN117229377B (zh) * 2023-11-16 2024-02-27 中国农业大学 一种杀虫蛋白及其在防治鳃金龟中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995024492A1 (en) * 1994-03-11 1995-09-14 Calgene Inc. Expression of bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995024492A1 (en) * 1994-03-11 1995-09-14 Calgene Inc. Expression of bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A genetically modified broad-spectrum strain of Bacillus thuringiensis toxic against Holotrichia parallela,Anomala corpulenta and Holotrichia oblita;Yanhua Jia等;《World J Microbiol Biotechnol》;20130913;第30卷;全文 *
hypothetical protein [Bacillus thuringiensis];NCBI;《Genbank database》;20130516;第1页 *
Use of Redundant Exclusion PCR To Identify a Novel Bacillus thuringiensis Cry8 Toxin Gene from Pooled Genomic DNA;Fengjiao Zhang等;《Applied and Environmental Microbiology》;20160415;第82卷(第13期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107022010A (zh) 2017-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107022010B (zh) 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
CN100427600C (zh) 抗虫融合基因、融合蛋白及其应用
WO2009003412A1 (fr) Souche du bacillus thuringiensis, ses gènes cry8g et protéines codant pour ces gènes, tous hautement toxiques afin de lutter contre les insectes coléoptères et leurs utilisations
CN106928329B (zh) 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
CN110066322B (zh) 一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用
CN102187874B (zh) 一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因的应用
CN110093301B (zh) 一种苏云金芽孢杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用
CN101984045B (zh) 苏云金芽孢杆菌cry8Na1基因，表达蛋白及其应用
CN117965394A (zh) 一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌
CN107043716A (zh) 一种苏云金芽胞杆菌及其应用
CN111235166B (zh) 一种新型诱导表达的Cry2Ab杀虫基因及其应用
CN111850009A (zh) 一种Cry2Ab-2杀虫基因及其应用
CN109929015B (zh) 苏云金芽胞杆菌杀虫基因cry79Aa1、表达蛋白及其应用
CN107022009B (zh) 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
CN104388349A (zh) 苏云金芽胞杆菌分泌杀虫基因sip1A,表达蛋白及其应用
CN111196844B (zh) 一种杀虫蛋白及其核酸、制备方法和应用
CN112522132B (zh) 一种芽孢杆菌SJ110、杀虫蛋白、vip3-like杀虫基因及应用
AU768073B2 (en) Insecticidal agents
CN106905420B (zh) 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
CN106905421B (zh) 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列
CN108359673A (zh) 一种高效杀食用菌眼蕈蚊的Bt cry11基因、编码蛋白及其应用
CN114958647A (zh) 一种苏云金芽孢杆菌及其应用
CN103525836B (zh) 一种Bt Cry71Aa1操纵子基因及其编码蛋白和应用
JP2022536185A (ja) バチルス・チューリンゲンシス株
CN102408475B (zh) 一种Bt蛋白Cyt1Da1、其编码基因及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant