CN108586587B - 一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用，属于基因工程和生物农药技术领域，所述杀虫蛋白为由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或***一个或几个氨基酸序列所获得的具有同等活性的蛋白质。本发明还提供了所述杀虫蛋白的编码基因、表达载体、工程菌、本发明还提供了类假结核耶尔森菌杀虫蛋白分离纯化方法。所述蛋白在杀虫药剂中的应用以及所述蛋白的编码基因在转化植物中的应用。本发明提供了一种杀虫蛋白的编码基因；本发明的杀虫蛋白可以用于杀死大蜡螟、棉铃虫、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟等鳞翅目害虫，提高转基因作物的杀虫能力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物农药技术领域，涉及一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用，具体地说，涉及来源于假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)的杀虫毒蛋白YpkA303及其基因和在生物防治中的应用。
背景技术
我国的主要农业灾害之一，是农作物病虫害，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾等特点，其发生范围和严重程度对我国农业生产常造成重大损失。据统计，我国每年因病虫害损失粮食高达500亿斤、各类经济作物1800万吨。我国农作物常见病虫害有：玉米螟、棉铃虫、、蝗虫、大蜡螟、甜菜夜蛾等。目前，防治作物的各种虫害主要依赖于化学农药的使用。长期大量使用农药，一方面，导致部分昆虫产生了一定的耐药性或抗性，致使在生产实践中农药的使用剂量在逐年增加，或更换毒性更强的全新农药，同时，迫使农药研究者不得不开发新的农药。另一方面，长期过度使用化学农药，对自然生态环境受到不同程度污染和不可修复的破坏。因此，寻找全新的、安全可靠的、符合可持续发展要求的，环境友好型生物防治手段已经成为当前农业研究和生产中的重大科学问题。利用生物技术的手段，寻找抗虫基因，培育抗虫转基因作物成为成为当前各国农业生产研究中的重大方向。
现今，开发最成熟，使用最广泛的植物外源抗虫基因是来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)2类抗虫基因，按照其毒性活性分为：源自芽胞形成时所产生的伴孢晶体毒素，即杀虫晶体蛋白(insecticidal crystalline protein,ICP),包括晶体毒素(crystalline toxin,Cry)和细胞裂解毒素(cytolytic toxin，Cyt)。其中，ICP是由Cry基因和Cyt基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。但这些转基因抗虫作物多使用CrylA类杀虫蛋白基因，杀虫蛋白基因的单一化、大面积使用加速害虫抗性的产生，制约了转CrylA类抗虫转基因作物的应用年限。另外，多数目前广泛使用Bt杀虫基因存在不同程度的交互抗性。因此，有必要挖掘新的杀虫基因，寻找新的、更高毒力、且与已经使用的杀虫蛋白基因无交互抗性的新基因应用于农业生产中。但是，目前还未见报道来源于假结核耶尔森菌的杀虫毒蛋白及其基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用，是一种新型具有广谱杀虫活性的杀虫蛋白及其基因。
其具体技术方案为：
一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或***一个或几个氨基酸序列所获得的具有同等活性的蛋白质。
一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明所述假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白在杀虫药剂制备过程中的应用。
本发明所述假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白的编码基因在杀虫药剂制备过程中的应用。
一种本发明所述假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白的诱导与纯化方法，包括以下步骤：
1)活化：将已构建好的蛋白表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(pET28a-YpkA303)，挑单菌落，接种于含有适量Km 5mL液体LB培养基中，于220rpm，37℃摇床中培养至平台期；
2)转接扩大培养：按1％的比例将菌转接于含有适量Km的500mL LB液体培养基的1L的三角瓶中，37℃，180rpm摇动培养；检测OD600，至0.6时，将摇床温度调至26℃，并按终浓度0.5mM加入诱导剂IPTG，开始诱导；过夜培养，约16-18小时后，诱导完毕；
3)收菌：用低温离心机在4℃下收集菌体，8000rpm，10分钟，重复此步骤，直至收集到所有菌液中的菌体，然后用Binding buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，30mMimidazole)洗涤菌体两次；
4)破碎菌体：加入适量Binding buffer，充分震荡，将菌体悬浮起来，经低温高压细胞破碎仪压榨破碎菌体后，置于超声波破碎仪中进行超声用Binding buffer充分悬浮菌体，在4℃条件下，用超声波细胞破碎仪破碎，功率为200W，工作4s,间歇5s，循环数为99，直至将菌液超清，10000rpm，4℃下离心30分钟，将上清转移到干净的三角瓶中；
5)上柱：将上一步中的上清分批全部加入到事先活化好的Ni-NTA亲和纯化柱中，直至全部液体通过柱子流下；
6)洗涤：用Washing buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，100mM imidazole)将柱子洗两遍；
7)洗脱：用Elution buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，250mM imidazole)洗脱，且每次洗脱液收集在1.5mL事先预冷的EP管中，放置于冰上。
8)透析：将煮好的透析袋用去离子水清洗干净，将收集到的蛋白洗脱液注入透析袋中，两端用夹子夹好，放入透析液(10mM Tris-Cl，100mM NaCl)中(透析液中加入DTT，以防止蛋白被氧化)，4℃下透析过夜；
9)分装：将蛋白溶液分装，-80℃保存；跑SDS-PAGE胶来检测蛋白的纯化情况及进行杀虫活性检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的杀虫蛋白基因YpkA303，来源于假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)，与已经报道的和目前广泛应用的Bt杀虫蛋白基因及发光杆菌杀虫基因TccC均不具有同源性，是一种全新的杀虫蛋白和基因。
附图说明
图1是YpkA303基因PCR扩增结果；
图2是YpkA303重组质粒小诱导结果；
图3是YPKA303重组蛋白纯化结果；
图4是YPKA303菌落PCR；
图5是YPKA303双酶切基因片段；
图6是YpkA303重组载体。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
YpkA303诱导表达载体的构建
获得新基因YpkA303,利用特异引物从野生型假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis YPIII)基因组DNA中扩增YpkA303引物序列如下
正向引物YpkA303-F:5'-CGCGGATCCATGAAACCGTTAGATCAGAATATTA-3'
反向引物YpkA303-R:5'-CCGCTCGAGTTAACATCCTCCGCCACCTTTTGAG-3'
(1)YpkA303基因的扩增
表1 YpkA303基因PCR扩增体系
PCR程序：
结束后将PCR产物进行电泳检测
(2)YpkA303基因PCR扩增产物双酶切：
表2 YpkA303PCR产物双酶切反应体系(150μL)
离心混匀后，放入37℃水浴中，酶切过夜(14-16hours)；加入15μL LoadingBuffer(10×)，100℃加热3min,终止酶活；取少量酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(3)YpkA303PCR酶切片段的回收(参照天根质粒回收试剂盒说明书)
1)柱平衡：将CB2放入预先准备好的收集管中，用移液枪吸取500μL BL，加入到吸附柱CB2中，静置5min，12,000rpm，离心1min，弃去管中废液；
2)将YpkA303PCR酶切产物加等倍提交的PC溶液混匀后，全部转移至吸附柱CB2中，静置5min，12,000rpm离心1min，弃去管中废液；
3)加入600μl PW至吸附柱中，12,000rpm，离心1min，弃去管中废液；
4)重复步骤5；
5)12,000rpm，离心3min，以甩干柱子里残余的液体，将吸附柱于通风处，晾干至无乙醇气味；
6)把吸附柱放于1.5mL EP上，向回收柱内中间位置，悬空加入灭菌ddH2O 80μL(已于55℃预热)，12,000rpm，离心2min，为提高回收效率，可重复一次；
7)于-20℃贮存。
(4)表达质粒pET28a提取(参照天根质粒提取试剂盒方法略有改动)
1)在吸附柱CP3中，用移液器加500μL的BL，12000rpm,离心1min，弃去废液；
2)从含pET28a表达载体的大肠杆菌TG1平板上各挑取3个单克隆接种到5mL含Km的液体LB培养基中，37℃、220r摇床，过夜培养；
3)离心收集菌体：将过夜培养的含pET28a表达空载菌液TG1 3Ml,12000rpm,离心2min收集到1.5mL EP管中，加250μL溶液P1，彻底悬浮菌体；加250μL溶液P2，上下翻转4-6次(要轻柔)，使菌体充***解，注意避免裂解过度；加350μL溶液P3，立即上下翻转4-6次(要轻柔)，至出现白色絮状沉淀，冰浴5min，12000rpm,离心20min；转移上清至吸附柱中，12000rpm,离心1min，重复一次，弃去废液；加500μL PD，12000rpm，离心2min，弃去废液；加入600μLPW于吸附柱中，2000rpm，离心1min，重复一次；将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm，离心2min；将吸附柱于通风处，晾干至无乙醇气味；把吸附柱置于灭菌处理新的1.5mL EP管，向回收柱中间位置悬空加入灭菌ddH2O 100μL(已于55℃预热)，12,000rpm，离心2min，重复一次；-20℃贮存。
(5)表达质粒pET28a的双酶切
按如下体系加入各反应物
表3 pET28a质粒双酶切反应体系(200μL)
离心混匀后，放入37℃培养箱中，过夜酶切；加入20μL Binding Buffer(10×)混匀，终止酶活，将产物进行琼脂糖电泳检测分析；对目标片段进行回收。
(6)重组表达载体的构建：
1)按如下反应体系加入各反应物
表4载体片段连接体系
置于16℃连接仪,连接过夜。
2)热激转化(全过程于冰上进行)取出TG1感受态细胞；于超净台中将连接产物完全加入感受态细胞，切勿吹打；冰浴半小时，42℃热激90秒，立即放至冰上，冰浴3-5分钟；加入800μl LB培养基,(37℃预热无抗)，100rpm，37℃摇床，复苏40-55分钟；4000rpm，离心3min，弃上清。重悬沉淀，涂板，37℃，过夜培养。
3)菌落PCR阳性克隆的筛选和鉴定
表5重组质粒转化TG1的菌落PCR初步筛选
按照上述PCR反应体系为加入各反应组分，含转化克隆的平板上挑取适量单克隆，加入PCR管中；进行PCR程序；
PCR程序：
结束后将PCR产物进行电泳检测；筛选出正确阳性克隆；挑取阳性克隆，于液体5MlLB培养基中，37℃，120rpm摇床，过夜培养。进行小量双酶切验证；并对酶切验证的阳性克隆宋上海生工生物公司进行测序，筛选出测序结果突变的阳性克隆质粒，保存备用。
(7)获得表达克隆：
取出预先制备好的-80℃保存的L21(DE3)感受态细胞，在超净台中加入1μL阳性克隆质粒，轻轻混匀后；冰浴半小时，42℃热激90秒，立即放至冰上，冰浴3-5分钟；加入800μlLB培养基,(37℃预热无抗)，100rpm，37℃摇床，复苏60-90分钟；取50-100μL菌液涂板，37℃，过夜培养，获得重组表达克隆的单菌落。
YpkA303蛋白的诱导与纯化
1)活化：将已构建好的蛋白表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(pET28a-YpkA303)，挑单菌落，接种于含有适量Km 5mL液体LB培养基中，于220rpm，37℃摇床中培养至平台期；
2)转接扩大培养：按1％的比例将菌转接于含有适量Km的500mL LB液体培养基的1L的三角瓶中，37℃，180rpm摇动培养；检测OD600，至0.6时，将摇床温度调至26℃，并按终浓度0.5mM加入诱导剂IPTG，开始诱导；过夜培养，约16-18小时后，诱导完毕；
3)收菌：用低温离心机在4℃下收集菌体，8000rpm，10分钟，重复此步骤，直至收集到所有菌液中的菌体，然后用Binding buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，30mMimidazole)洗涤菌体两次；
4)破碎菌体：加入适量Binding buffer，充分震荡，将菌体悬浮起来，经低温高压细胞破碎仪压榨破碎菌体后，置于超声波破碎仪中进行超声用Binding buffer充分悬浮菌体，在4℃条件下，用超声波细胞破碎仪破碎，功率为200W，工作4s,间歇5s，循环数为99，直至将菌液超清，10000rpm，4℃下离心30分钟，将上清转移到干净的三角瓶中；
5)上柱：将上一步中的上清分批全部加入到事先活化好的Ni-NTA亲和纯化柱中，直至全部液体通过柱子流下；
6)洗涤：用Washing buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，100mM imidazole)将柱子洗两遍；
7)洗脱：用Elution buffer(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，250mM imidazole)洗脱，且每次洗脱液收集在1.5mL事先预冷的EP管中，放置于冰上。
8)透析：将煮好的透析袋用去离子水清洗干净，将收集到的蛋白洗脱液注入透析袋中，两端用夹子夹好，放入透析液(10mM Tris-Cl，100mM NaCl)中(透析液中加入DTT，以防止蛋白被氧化)，4℃下透析过夜；
9)分装：将蛋白溶液分装，-80℃保存；跑SDS-PAGE胶来检测蛋白的纯化情况及进行杀虫活性检测；
YpkA303纯化蛋白的虫试实验：
为了检测经原核表达得到的杀虫蛋白YpkA303的杀虫活性，对大蜡螟、棉铃虫、甜菜夜蛾和玉米螟统一采用血腔注射的方法。使用微量注射器从5龄大幼虫的第二对右腹足分别注射注射50μL浓度为0.00μg/g、5.00μg/g、10.00μg/g、15.00μg/g、20.00μg/g、30.00μg/g、40.00μg/g蛋白溶液至血腔内，对照组注射50μL昆虫生理盐水，将注射后的幼虫放置于37℃恒温箱中，每组取体重相似的30头幼虫，记录虫体重量，每次实验重复3遍。每隔2h观察幼虫状态，记录24h内死亡情况，统计结果并用SPSS Statistics软件进行数据处理。
YpkA303纯化蛋白杀虫数据分析LC50的结果详见表6。
表6：YpkA303蛋白对大蜡螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟杀虫活性测定结果
| YpkA303 | LC50μg/g | 95％limiteds |
| 大蜡螟 | 10.00 | 20.00 |
| 棉铃虫 | 10.00 | 20.00 |
| 甜菜夜蛾 | 5.00 | 10.00 |
| 玉米螟 | 15.00 | 30.00 |
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Pro Leu Asp Gln Asn Ile Thr Tyr Gly Gln Ala Arg Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Gln Phe Tyr Ile Asp Glu Phe Gly Thr Lys Thr Gly Val Arg Gly
20 25 30
Asp Asp Ile Ser Pro Met Asn Arg Gly Asn Lys Ile Asn Ser Tyr Asp
35 40 45
Ser Asn Ser Thr Thr Arg Asp Pro Ile Arg Gln Gln Tyr Phe Asp Asp
50 55 60
Ala Tyr Asp Ser Lys Lys Ser Gly Thr Ser Ser Lys Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Cys
<210> 2
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaccgt tagatcagaa tattacatat ggtcaagctc gtggctatga gcagttttat 60
attgatgagt ttggaaccaa aactggggtg aggggagatg atatatcacc aatgaatcga 120
ggaaataaaa taaactccta cgatagtaat agtacaactc gtgatccaat aagacagcaa 180
tattttgatg atgcttatga tagtaagaaa agtggtacga gctcaaaagg tggcggagga 240
tgttaa 246
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcca tgaaaccgtt agatcagaat atta 34
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt taacatcctc cgccaccttt tgag 34
Claims (1)
1.一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白在制备杀虫药剂过程中的应用，其特征在于，所述假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸酸序列为SEQ ID NO:2所示。
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