JPH06502526A - 結合ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 結合ドメイン 本発明は、結合ドメインを含んで成る分子、それらの調製方法および利用方法に 関する。本発明は特に、免疫グロブリンファミリーまたはスーパーファミリーの 一員の天然の一重鎖可変ドメインの合成類似体であるドメインを含んで成る分子 に関する。本発明は前記ドメインを含んで成る分子をデザインする方法、そうし てデザインされた分子、並びに療法および診断において前記分子を利用するため のキットおよび利用方法に関する。

抗体および免疫グロブリンスーパーファミリーの他の員、例えばＴ細胞レセプタ ーは、分子例えば抗原を特異的に認識しそしてそれらを高親和力で結合する能力 を有する。天然に存在する抗体では、抗原結合部位は重（Ｈ）ｌと軽（Ｌ）鎖の 両方の可変（Ｖ）　ドメインの近位により形成される。それらの鎖の各々の内部 には、抗原と相互作用する残基を含んで成るアミノ酸配列部分、即ち相補性決定 領域（ＣＤＲ）が３つある。この３つのＣＤＲは４つのフレームワーク領域（Ｆ Ｒ）と交互に存在している。Ｗｉｎｔｅｒらは、一本鎖Ｖドメインが高親和力と 高特異性で抗原を結合できることを証明したＣＷａｒｄら、　Ｎａｔｕｒｅ　３ ４１．５４４−５４６　（１９８９））　、それらの−重鎖ドメイン抗体（ＶＨ ）は、完全抗体（ｒｍｍ　＝１６０，０００　）や他の抗体断片に比べてサイズ が小さいために幾つかの用途に有益であるだろうと提案された。

しかしながら、ＶＨドメインは残念ながらそれらの効用を制限するユニークな欠 点を有する。遭遇する難点は、関連するかもしれない少なくとも２つのＶＨドメ インの性質を反映する。それらは細菌中でクローニングした時に少量で発現され （Ｆｖ断片の１０■／−に比べて約２００μｇノー細胞上清）、そしてＶＨドメ インの精製の間に相当量の物質が失われる。例えば限外濾過およびクロマトグラ フィーカラム上での精製を使ったＶＨ−重鎖ドメインの濃縮は、しばしば低い回 収率を引き起こす。これはおそらく表面への非特異的結合によるものであろう。

これはＷａｒｄら（１９８９）前掲により直接観察されており、彼らはプラスチ ックへの有意な（そして非特異的な）結合を示す一重鎖ドメイン抗体を高い比率 で単離した。生体内では、組織中の非特異的結合は腫瘍画像診断や癌療法研究と いった用途において低い効能を引き起こすであろう。

完全抗体または抗体断片、例えばＦｖもしくはＦａｂ断片では、一般的にそれら の難点に遭遇することはない。従って、問題は不対の一重鎖ドメインを含有する 抗体断片に特有であると思われる。

よって、本発明は、豊富な商業的利用のために抗原結合性を保持しながら、−重 鎖可変ドメイン結合メンバーに関係する上記のまたは他のあらゆる問題を改善す ることを目的とする。

本出願人は、−重鎖ドメイン抗体の望よしくない性質の最もありそうな原因が一 重鎖可変ドメイン、例えばＶＨ−重鎖ドメインの疎水性面が水性溶媒に暴露され ることにあると理解した。生来の抗体では、この面はＶＬドメインの近位の疎水 性面と相互作用し、そして抗体分子の内側に埋もれている。この面の暴露は、表 面、例えばクロマトグラフィー母材との強力な相互作用を引き起こすため、その 表面から材料を回収することができないだろう。その上、水性溶媒への疎水性面 の暴露が一重鎖可変ドメイン、例えばＶＨ−重鎖ドメインの安定性の低下を引き 起こし、これが次いで精製操作の間の変性と結合活性の損失を引き起こすと考え られる。最も重要なのは、この疎水性面が非特異的結合の有力な原因であり、生 体内および試験管内でのそれらの一重鎖可変ドメイン分子の利用性を相当制限す るということである。

ＶＨ−重鎖ドメインは非常に小さいけれとも、その活性は該分子の異なる部分の 間の相互作用を含む複雑な三次元構造に依存する（Ｃｈｏｔｈｉａ、　Ｃ，ら、 　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８６．６５１−６６３　（１９８５）　）　 、幾つかの場合では、抗原結合部位中の側鎖と重要な相互作用を有する側鎖がフ レームワーク中にある。例えば、抗プロゲステロン抗体ＤＢ３では、トリプトフ ァン４７（フレームワーク）がプロゲステロンと接触することが示されており（ Ａｒｅｖａｌｏ、　Ｊ、Ｈ，、Ｔａｕｓｓｉｇ、　Ｍ、および１Ｖｉｌｓｏｎ、 　ｉ　私信〕、そして−ヒドロキシビタミンに結合抗体ｒｇＧＩＮＥＷでは一ヒ ドロキシビタミンにと接触することが示されている（Ｔｗｉｎｉｎｇ、　Ｓ、Ｓ 、およびＡｔａｓｓｉ、　Ｍ、Ｚ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５３． ５２５９（１９７８））。ある抗体では、残基７１　（フレームワーク）とＣＤ Ｒ残基との相互作用が抗原結合の維持に重要であることが示されているＣＣｈｏ ｔｈｉａ、　Ｃ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２．８７７−８８３　（１９８９） 　）　、基本抗体または可変ドメイン構造への任意の変異がおそらく該抗体また は可変ドメインの三次元構造に対して多面的結果を与え、そしてそれらを所望の 特異性と親和力で抗原結合できなくするだろうことは、当業者に明らかであろう 。このことは、抗すゾチームー重鎖ドメイン抗体を使った最近の実験において例 証されている。Ａｓｎ　３５をＨｉｓで置換する単一アミノ酸変化は、大腸菌中 での発現レベルを約１０００倍向上させることがわかった。しかしながら、変更 された分子はごく弱くしかりゾチームを結合しないと批判された（ε、Ｓ、　Ｗ ａｒｄ、　Ｌ、　Ｒｅｊ−ｃｈｍａｎｎ、　Ｇ、Ｐ、　Ｗｉｎｔｅｒ、私信）。

活性構造の構築、特にＶＨドメインの構築の原因となる相互作用は完全には解明 されていないため、基本構造に行うどのアミノ酸変化も、非常に注意深く選択し なければならない。ＶＨ−重鎖ドメインとＶＬドメインとの界面にある残基がＣ ＤＲからだけでなくフレームワーク領域からも得られるという事実によって、あ る変化の選択は更に複雑になる。抗リゾチーム抗体Ｄ　１．３　（Ａｍｉｔ、　 Ａ、Ｇ、ら　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．７５５−７５８　（１９８６）　；　Ｃ ｈｏｔｈｉａ。

Ｃ１ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．７５５−７５８　（１９８６）　）の界面 にあるフレームワーク残基（例えば残基３７．３９．４５．４７．９１．９３お よび１０３）は、全ての種の抗体において高度に保存されている。それらは不変 であるか、またはまれに、一般に保存性の置換、即ち同様な化学的性質を育する アミノ酸によるアミノ酸の置換を有する。例えば、脂肪族疎水性残基は通常、類 似の脂肪族残基により置換される。よって、もしそれらのフレームワーク残基中 に置換を行う場合、該分子の構造を破壊し、従って抗体または一重鎖可変ドメイ ン例えばＶＨによる抗原の結合を破壊する危険性が大いにある。ＣＤＲ残基は抗 体間で異なり、抗原への結合の特異性と親和力を決定する。本出願人は高い親和 力と特異性で様々な抗原を結合する能力を保持したいと望むため、それらのＣＤ Ｒ残基を変更する可能性を保持しておくことが必要である。

本発明は、従って、特定の結合メンバーに対する特異性を有する結合ドメインを 含んで成る天然分子の一部または全部の類似体であって、天然の結合物質に比較 して前記類似体の疎水性を減少させるように１または複数のアミノ酸が変更され ている類似体である、ポリペプチド配列を有する結合ドメインを含んで成る分子 を提供する。

前記類似体は、例えば特異性、親和力または結合活性に関して、天然の結合性物 質と実質的に同じ結合性質を有することができる。

場合によっては、それらの性質が改善され得る。変更は、ポリペプチド配列の疎 水性を減少させる任意のアミノ酸変更であることができ、例えばアミノ酸置換、 削除または付加であることができる。

結合ドメインを含んで成る分子は、抗体または他のレセプター分子、並びに抗体 またはレセプター分子の断片および誘導体を含んで成ることができる。特に、該 分子は、抗体分子中に存在する型の一重鎖可変ドメインを含んで成ることができ る。変更は相補性決定領域中および／またはフレームワーク領域中であることが できる。変更はフレームワーク領域中が好ましい。疎水性を減少させる変更がフ レームワーク領域中である場合、アミノ酸置換、削除、付加または反転によって 相補性決定領域も更に変更し、結合性物質の特異性および／または結合性質を変 更することができる。

結合ドメインを含んで成る分子は、実施例２〜１１に記載の変更のいずれか１つ または複数を含んで成ることができる。

よって、本発明は、免疫グロブリンファミリーまたはスーパーファミリーの一員 の別の一重鎖可変ドメインの合成類似体である一重鎖可変ドメインで、該類似体 中の前記ドメインの１または複数の界面アミノ酸残基が前記別のドメインに比較 して変更されており、前記変更アミノ酸は、前記類似体が前記別のドメインより も親水性であるように、免疫グロブリンファミリーまたはスーパーファミリーの 一員の相同位置に存在する残基により置換されている一重鎖可変ドメインを提供 する。

変更アミノ酸残基はフレームワーク領域中にあってもよい。変更アミノ酸残基は 相補性決定領域中にあってもよい。合成類似体は前記別のドメインと本質的に同 じ結合活性を有することができる。相補性決定領域の配列を更にアミノ酸置換、 削除、付加または反転により変更して、前記別のドメインに比較して該類似体の 特異性および／または結合特性を変えることもできる。

−重鎖可変ドメインは一重鎖可変免疫グロブリン重鎮ドメインの合成類似体であ ることができる。この場合、アミノ酸残基３７．３９゜４５、４７．９１．９３ および１０３のうちの１つまたは複数が変更され得る。

二のアミノ酸変更は下記のうちの１つまたは複数を含んで成ることができる。

ｉ）グルタミンまたはスレオニンによるバリン３７の置換：ｉｉ）グルタミン酸 によるグルタミン３９の置換：１ｉｉ）グルタミンによるロイシン４５の置換： ｉｖ）アスパラギン酸またはグリシンによるトリプトファン４７の置換： ■）スレオニン、セリンまたはメチオニンによるチロシン９１の置換； ｖｉ）セリンまたはグルタミン酸によるアラニン９３の置換：ｖｉｉ）グルタミ ン酸、チロシンまたはスレオニンによるトリプトファン１０３の置換； ｖｉ）アスパラギン、スレオニンまたはセリンのいずれかによるノくリン３７、 ロイシン４５、トリプトファン４７、アラニン９３および／またはトリプトファ ン１０３の置換； ｉｘ）スレオニンによるバリン３７の置換およびグルタミン酸によるグルタミン ３９の置換およびグリシンによるトリプトファン４７の置換：Ｘ）セリンまたは メチオニンによるチロシン９１の置換およびグルタミン酸によるアラニン９３の 置換およびスレオニンによるトリプトファン１０３の置換。

本発明の一重鎖可変ドメインは、更に他の分子成分に結合させることができる。

更に他の分子成分は、酵素標識、蛍光標識もしくは放射能標識または免疫グロブ リンの一部分であることができる。

本発明はまた、診断試験を実施するための１または複数の補助試薬と一緒に上述 の一重鎖可変ドメインを含んで成る診断キットを提供する。

本発明は、少な（とも上述の一重鎖可変ドメインを含んで成る治療用組成物も提 供する。該組成物は更にｌまたは複数の賦形剤も含んで成ることができる。

本発明の一観点によれば、上記で指摘したような改善された性質を有し且つ種々 のＣＤＲから新規フレームワークへの置換により様々な結合相手に対する特異性 を生せしめる一重鎖可変ドメイン、例えばＶＨ−重鎖ドメインフレームワークが 提供される。本出願人は、予め単離した一重鎖ドメインを含んで成る分子のフレ ームワーク残基を置換してそれらをより一層極性にすることを提供する。変更さ れた分子は所望の抗原を結合する能力を保持すべきである。好ましくは、該変更 は、ヒトに投与した時に界面を免疫原性にしないであろう。

本発明はまた、免疫グロブリンファミリーまたはスーパーファミリーの一員の別 の一重鎖可変ドメインの親水性合成類似体である一重鎖可変ドメインを製造する 方法であって、（ｉ）前記−重鎖可変ドメインの界面領域を詳しく調べて疎水性 アミノ酸残基を同定し、そして （ｉｉ）　１または複数の前記疎水性残基が、免疫グロブリンファミリーまたは スーパーファミリーの一員の相同位置に存在する一層疎水性の小さい残基により 置換されている（ｉ）の前記−重鎖可変ドメインの前記類似体を作製する、 ことを含んで成る方法を提供する。

該方法は、 （ａ）前記同定された疎水性残基のうちの１または複数をコードするヌクレオチ ド配列を得； （ｂ）部位特異的突然変異誘発を使って前記ヌクレオチド配列を変更して代替ア ミノ酸をコードするトリプレットを導入し；（Ｃ）変更されたヌクレオチド配列 を組換え発現系において使って合成類似体を発現せしめる ことを含んで成ることができる。

この方法では、複数のアミノ酸残基を置換することができる。代替アミノ酸は免 疫グロブリンスーパーファミリーの天然の単量体メンバーから誘導することがで きる。天然の単量体メンバーはｒｈｙ−ｔであってもよい。合成類似体は前記の 別のドメインと本質的に同じ結合活性を有することができる。

結合ドメインを含んで成る分子か免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの断片も しくは誘導体である場合、変更に適するアミノ酸部位は次のようにして同定する ことができる：ｉ）結合物質の表面上にあると予想される疎水性アミノ酸につい て該分子を調査し： ｉｉ）免疫グロブリンの重鎮ドメインと軽鎖ドメインの界面に埋まっていると予 想されるものに関してアミノ酸残基をより詳しく調査し；ｉｉ）　（ｉｉ）にお いて同定された残基が、−重鎖ドメインを別個に使った時に溶媒に暴露されるこ とを調べる。

行うのに適する変更は、関連物質のファミリーの一員の相同アミノ酸配列を参考 にして同定することができる。例えば、上述したように同定された変更部位にお ける分子のアミノ酸配列は、ファミリ一群の１または複数の員のなかのその部位 と相同になるように変更することができる。

関連物質のファミリーは、免疫グロブリンファミリー、その断片および誘導体を 含んで成ることができる。あるいは、関連物質のファミリーは、免疫グロブリン に構造的に関連するドメインを含むタンパク質の一層、即ち免疫グロブリンスー パーファミリーを含んで成ることができる。

ヌクレオチド配列は、所望の変更を導入するようにデザインされたオリゴヌクレ オチドを使った部位特異的突然変異誘発により変更することができる。あるいは 、ポリメラーゼ連鎖反応として知られる技術を使って変更を達成することもでき る。

本発明はまた、本明細書中に提供されるような結合ドメインを含んで成る分子を 有するキットも包含する。該キットは、診断、精製または触媒キットであること ができる。本発明は更に、本発明に係る結合ドメインを含んで成る分子を含有す る医薬品を包含する。

これは、別の分子の特定の立体および極性構造に特異的に結合し、従ってそれと 相補的であると定義される、タンパク質の表面上の領域またはキャビティを言う 。ドメインはそれ自体の内部でそして同一タンパク質の別の部分と無関係に且つ 相補的結合メンバーと無関係に折り畳まれる。

免疫グロブリン これは、全てがジスルフィド結合により一緒に連結した２組の重鎮ポリペプチド と２組の軽鎖ポリペプチドとから成る構造的に関連したタンパク質の一層を言う 。それらは与えられた免疫グロブリンが別の分子に特異的に結合するような別の 分子のための結合ドメインを有する。

該タンパク質は天然であることもでき、または部分的にもしくは全体的に合成的 に製造することもできる。この用語は、免疫グロブリンの結合ドメインに相同で ある結合ドメインを有する任意のタンパク質をも包含する。

ここで、免疫グロブリンアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ、Ｅ、Ａ、 ら　”５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ’Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅ ａｌｔｈ　ａｎｄ　）Ｉｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　１９８７に従う。

抗体 これは、天然のまたは部分的にもしくは全体的に合成された免疫グロブリンを言 う。この用語は免疫グロブリンの結合ドメインに相同である結合ドメインを有す る任意のタンパク質も包含する。それらのタンパク質は天然源から誘導すること もでき、または部分的にもしくは全体的に合成することもできる。

抗体の例は免疫グロブリンイソタイプおよびＦａｂ、　Ｆ（ａｂ’）ｚ、　５ｃ Ｆｖ。

Ｆｖ、　ｄＡｂ、　Ｆｄ断片である。

免疫グロブリンスーパーファミリー これは、構成員が免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインの構造に関連す る構造を持つ少なくとも１つのドメインを有する、ポリペプチドの一層である。

前記ドメインは２つのβ−シートと通常は１つの保存されたジスルフィド結合を 含む（Ａ、Ｆ、　ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ、Ｎ、　Ｂａｒｃｌａｙ　１９８８ 　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６３８１−４５０を参照のこと）。

免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員の例はＣＤ４、血小板由来増殖因子 レセプター（ＰＤＧＦＲ）　、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）である。

文脈が異なって規定されない限り、この出願における免疫グロブリンおよび免疫 グロブリン類似体への言及は免疫グロブリンスーパーファミリーおよびその類似 体の構成員を包含する。

界面 これは、相補的な重鎖または軽鎖と会合する免疫グロブリンの特定の重鎮または 軽鎖上の領域を言う。

フレームワーク 免疫グロブリンの重鎖は定常（Ｃ）領域と可変（Ｖ）領域を有する。各Ｖ領域は 、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）により隔てられた３つの相補性決定領域（ ＣＤＲ）から構成される。ＣＤＲはアミノ酸配列の可変性区間であり、そして他 の分子に結合する機能を提供する。免疫グロブリンに様々な結合特異性を提供す る可変性がある。ＦＲはＣＤＲの間に入る実質上一定のアミノ酸配列の区間であ る。

本発明をより完全に理解するために、第一に一般的な概論で、そして第二に単に 例示のつもりであって限定のつもりではない特定の実施例への参照により、本発 明をより一層詳細に説明することにする。下記の説明は図面への参照である。

図１は、ｐＵｃ１１９中にクローニングされた抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＶＨ ドメインのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示し：図２は、天然に存在する免 疫グロブリン重鎮中に見つかる残基の置換のための変異オリゴヌクレオチドを示 し：図３は、ｒｈｙ−ｔからの相同残基による置換のための変異オリゴヌクレオ チドを示し： 図４は、ＶＨＤｌ、３中へのＴｈｙ−１残基の置換により得られる変異配列を示 し。

図５は、ＶＨＤｌ、３中へのアスパラギン、セリンまたはスレオニンの無作為置 換のためのオリゴヌクレオチドを示し；図６は、ＴＧＩ　（対照）　、ＶＨＤｌ 、３、ＶＨＴＨＹ−１およびＶＨＴＨＹ−２（７）リゾチーム結合活性を表すグ ラフであり； 図７は、ｐ［Ｊｃ１１９　（対照）、ＶＨＤｌ、　３、ＶＨＭｕｔＴｒｐ、　Ｖ ＨＭｕｔＬｅｕおよびｖＨ’ｒｈｙ−３のリゾチーム結合活性を表すグラフであ り：図８は、ｐＵｃ１１９　（対照）、Ｖ）ＩＤ１．３、ｖＨ’ｒｈｙ−ｉ、　 Ｔｈｙ−２、Ｖ）ＩＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−３およびＶＨＭｕｔＷＤのリゾチーム 結合活性を表すグラフであり；図９は、クローニング部位の周りのベクターｆｄ Ｐｓ／Ｂｓのヌクレオチド配列を示しそしてＰｓｔｌおよびＢｓｔＥ１１制限部 位を示し；そして図１０ハ、ベクターｆｄＰｓ／Ｂｓ　（対照’）　、ｒｃｔｖ Ｈ’ｒｈｙｔＴｈｙ２、ｆｄＶＨＤｌ、　３およびファージ抗体Ｄ１．３のリゾ チーム結合活性を表すグラフである。

本出願人は、フレームワークに行う変更の選択のための３つの関連する方策を発 明した。この発明は、生体内および試験管内用途に向けて改善された性質を有す る抗体および一重鎖可変ドメイン例えばＶＨドメインの作製を可能にする。

異なる免疫グロブリン間で相当なアミノ酸配列相同性がある。相同性は、異なる 配列を１つずつ一列に並べ、そして異なる配列間で最大レベルの一致に到達する まで鎖を互いに関してスライドさせることにより決定される。それらの解析は通 常はコンピューター上で行われる。上述したように、フレームワーク残基は高度 に保存されており、即ち、一連の異なる抗体中の同じ位置に特定のアミノ酸が存 在するだろう。しかしながら、まれな置換は起こるので、本出願人はＶＨ界面残 基の天然に存在する置換について調査した。これは、容易に利用可能な抗体配列 の編集物〔例えば、Ｋａｂａｔ、　Ｅ、Ａ、ら、”５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ’、 　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａ−ｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａ ｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（１９８７））　ヘの参照によって行った。この解析は 、任意の位置における天然の変異の同定を可能にする。抗体中にそれらの変異残 基が天然に存在するので（まれではあるカリ、本出願人はそれらがおそらくドメ イン構造をひどくは破壊しないであろうと認識した。それらの天然の置換は抗体 分子あたり一回の割合で最も頻繁に起こっている。しかしながら、本出願人は数 個の抗体から入手可能な置換を同一分子中に一緒に組み合わせる。天然の置換の 種々の組合せを利用することが可能である。

Ｚ　免疫グロブリンスーパーファミリーの別のタンパク質中の相同特に着目され るのは、免疫グロブリン折り畳み（他のタンパク質中に見つかっている抗体ドメ インに特有の三次元構造）を含むドメインを有するが、別のドメインとは会合し ないタンパク質である。

免疫グロブリン可変ドメインに相同な一重鎖ドメインを含む分子の例としては、 Ｔｈｙｌ、　Ｐｏミニリン、ＣＤ７　、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４が挙げられ る（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ａ、Ｆ。およびＢａｒｅｌａｙ、　Ａ、Ｎ、、　Ａｎ ｎ、　Ｒｅｖ、［ｍｍｕｎｏｌ。

６、３８１−４０５　（１９８８）　）。

別のタンパク質は複数の不対の抗体様ドメインを含む。ＣＤ４とＭＲＣＯＸ２は 各々、抗体分子の可変ドメインに相同なＮ末端ドメイン（ＭＲＣＯＸ２中に１つ 、ＣＤＪ中に２つの゛Ｖ′型ドノドメイン、抗体分子の定常ドメインに相同なＣ 末端ドメイン（ＭＲＣＯＸ２とＣＤ４の各々に１つの°Ｃ゛型ドノドメイン含む （Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ａ、Ｆ、およびＢａｒｃｌａｙ、　Ａ、Ｎ、、　Ａｎｎ 、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．３８１−４０５　（１９８８）　）。

それらの不対ドメインタンパク質と該ドメイン含有抗体との間の三次元構造の類 似は、アミノ酸配列レベルでの相同性にある程度反映される。この場合の配列の 整列は不確かであり得るけれども、アミノ酸相同性は上記の１とほとんど同じ方 法で与えられる。’ｒｈｙ−ｉについては、ＶＨ残基３７．３９．９１および９ ３での整列が比較的簡単である。しかしながら、ＶＨ残基４５および４７はＴｈ ｙ−ｉ　との２種類の異なる整列において報告されている（Ａ、Ｆ、　Ｗｉｌｌ ｉａｍｓおよびＪ。

能な整列がある場合、最も適切なものを同定するために別の置換の探究が必要で あるかもしれない。

ＶＨ一本鎖ドメイン中の暴露される変更ＶＨ界面がヒトに抗原性である可能性が ある。これは生体内での療法利用にとって不利であるたろう。ヒトＴｔｔｙ−１ 中に天然に存在する残基による置換が、この起こり得る抗原応答を減少させるか もしれない。

＆　界面残基の所での極性アミノ酸の手鋸作為挿入この方策は、あまり直接的で ない方法を使って一重鎖ドメインの改善を可能にする。突然変異誘発用のオリゴ ヌクレオチドを、成るトリブレットの所へのアミノ酸挿入に向けて曖昧さを与え るために、幾つかの位置の塩基の混合物を使って合成する。例えば、本出願人は 、２番目の位置に曖昧性を有するコドンを使うことにより高極性残基であるアス パラギン、セリンまｔ；はスレオニンの無作為挿入を可能にするであろう方策を 考案した。それらの残基は、例えばＶＨドメインの界面位置３７．４５．４７． ９３および１０３に挿入することができる。次いで、この突然変異誘発から生じ る２４３の可能なフレームワークをスクリーニングし、手鋸作為の組合せのうち 所望の性質を存するものを同定することができる。得られた半熱作為集団をスク リーニングするための方策は、ＥＬＩＳＡによる抗原結合親和力と非特異的結合 の評価を含むだろう（下記参照）。

これは、上記の１）および２）に概説した方策に頼ることなく、手鋸作為的な方 式で界面残基を変更するのに用いることができる多数の方策のうちの一例である 。

本発明は、生体内および試験管内用途のために改善された性質を存する一重鎖ド メイン分子中に、同定した抗体の結合親和性および特異性を導入することができ る。

抗体Ｄ１．３のＶＨドメイン（Ｖｌ（０１，３）を使ったモデル系を用いて作製 されたフレームワークは、所望の親和力と特異性の抗体分子由来のものイこよる そのＣＤＲの一部分または全部の置換にまり、任意の特異性の抗体のためのフレ ームワ・−りとして使うことができる。これを達成するのには多数の方法がある 。例えば、所望の性質（例えば結合特異性）の抗体のＣＤＲの配列を決定した後 、抗体／抗体ドメインを一層極性にするのに必要なヌクレオチド置換を含むフレ ームワーク領域と面記ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドおよび一連のオリ ゴヌクレオチドを合成する。次いでＰＣＲを使ってこのオリゴヌクレオチドを増 幅し、適当なベクター、例えばＩＩＵＣ１１９中にクローニングし、そして細菌 中で生産物を発現せしめることができる。

あるいは、所望の特異性を有する現存の一重鎖ドメイン抗体中に界面の所に適切 な変更を導入してその抗体の性質を改善することができる。これは、様々な方法 により、例えば部位特異的突然変異誘発、またはＰＣＲ（例えばＨｅｍ５ｌｅｙ 、　Ａ、ら［Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６゜６５４５−６５５１　（ １９８９）］の方法を使って）により、達成することができる。

これに加えて、改善された一重鎖ドメイン抗体は非特異性の減少を示す。これに より提供される一重鎖可変ドメイン抗体の性質は、例えばｆｄファージ中にクロ ーニングされた一重鎖ドメインを使って、所望の特異性および親和性の一重鎖ド メイン抗体の選択を可能にする。本発明に記載されるフレームワークをｆｄファ ージ中にクローニングしそして現存のＣＤＲをＣＤＲのレパートリ−により置換 して一重鎖ドメイン抗体分子の新規集団を作製することができ、その新規集団を 所望の結合特異性についてスクリーニングすることができる。あるいは、例えば 、Ｗａｒｄら（１９８９，前掲）により記載されたように一重鎖ドメイン抗体を 単離することもできるが、それらの親和力と特異性に改善を要する場合がある。

それらの抗体からのＣＤＲを本発明に記載の極性フレームワーク中にクローニン グし、ｆｄファージ中にクローニングされた一重鎖ドメインに挿入することかで きる。次いてそれらのＣＤＲの無作為突然変異誘発を行い、アフィニティー法を 使って所望の親和性および特異性の抗体の選択を行う、二とができる。

本明細書中の実施例１５と１６は、より極性の大きいフレームワークを有するＶ ＨＤｌ、３の誘導体を、結合活性を保持した状態て遺伝子■タンパク質（ＭｃＣ ａｆｆｅｒｔｙ、Ｊ、ら、１９９０、Ｎａ、ｔｕｒｅ　３４８．　ｐ５５２−５ ５４）との融合体としてファージ上に表示できることを示す。ファージ上への表 示は、手鋸作為的突然変異誘発法によるフレームワーク残基の所での置換の組合 せの作製（その−例が実施例１１に与えられる）およびその後の好ましい結合特 性を有するものの選択を可能にする。

本発明の改善された一重鎖ドメイン抗体は従来の一重鎖ドメイン抗体の優秀な変 形を構成するので、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびそれらの分子または断片のス ーパーファミリーと同様に多数の方法で利用することができる。例えば、１ｇ分 子は調査、療法（例えば癌療法、免疫状態の板形、および病原体により引き起こ される病気の治療）、診断（例えばホルモン状態の評価）、ホルモンまたは成長 因子の活性の板形、検出、バイオセンサー、触媒、他の分子の精製、および製薬 産業における治療化合物についてのスクリーニング操作において利用されている 。改良一本鎖ドメイン抗体の低い非特異的結合は、上記用途に特に有用であると わかるだろう。

親水性の増加は、アフィニティークロマトグラフィー、特に弱アフィニティーク ロマトグラフィー（Ｚｏｐｆ、　Ｄ、および０ｈｌｓｏｎ、　Ｓ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３４６．８７−８９．１９９０）の際の結合分子としてのそれら の利用に特に重要であろう。

抗イデイオタイプ改良一本鎖ドメイン抗体を作ることもできる。

抗イデイオタイプ特異性（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１７８．　Ｊ、Ｊ 、　Ｌａｎｇｏｎｅ　’編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）　 ）は二段階法で作製される。第一に、特定の抗原またはエピトープに対して向け られた抗体Ａをそのまま使って別の抗体を惹起せしめる。抗Ａ抗体の一部である 抗体Ｂは、Ｂの抗原結合部位がへのそれに相補的であるような抗体への抗原結合 部位に対して向けられるだろう。要するに、抗イデイオタイプ抗体である抗体Ｂ の抗原、結合部位は、抗体Ａにより認識されるもとの抗原またはエピトープを構 造上模倣する。もとの抗原はタンパク質、または他の任意の化合物、例えば炭水 化物もしくはステロイドであることができ、そして操作のいずれかの段階で使う 抗体が改良−重鎖トメイン抗体であることができる。最終の抗イデイオタイプ抗 体が本明細書中に記載のように製造された改良−重鎖ドメイン抗体であることも でき、または抗イデイオタイプ決定基が改良−重鎖ドメイン抗体フレームワーク 中に移行される免疫グロブリンスーパーファミリーの分子であることもできる。

そのような抗イデイオタイプ分子は様々な用途に有利である（Ｍｅｔｈｏｄｓ　 Ｅｎｚｙｍｏｌ、１７８．　Ｊ、Ｊ、　Ｌａｎｇｏｎｅ編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）：ｌ。それらとしては、癌の治療並びに細菌、ウィル スおよび寄生生物により引き起こされる病気の治療のためのワクチンが挙げられ る。それらは上述の病原体に対する細胞レセプターをブロックするため、並びに ホルモンに対する細胞レセプターをブロックするために用いることができる。そ れらは診断操作において、例えばＥＬＩＳＡにおいて抗原やペプチドの代わりと しても有益である。抗イデイオタイプ特異性は製薬産業において有用であること が知られている（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋７８．　Ｊ、Ｊ、　Ｌａ ｎｇｏｎｅ　ＩＮ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。

本発明は、免疫グロブリン（［ｇ）スーパーファミリーの分子から誘導される改 良−重鎖ドメイン抗体およびレセプター、前記改良を選択および実施する方法、 並びに調査、療法、診断、精製、触媒および新規治療薬の開発における前記抗体 およびレセプターの利用並びにそのためのキットに関する。

実施例１　グルタミンでのバリン３７の置換による一層極性の大きいフレームワ ークを有するＶＨＤｌ、３の調製図１は、突然変異誘発実験に使用するｐＵｃ１ １９　ＶＨＤｌ、３クローンのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す（Ｗａｒ ｄら、　１９８９．前掲）。

ＶＬと相互作用するＶＨドメイン中のアミノ酸残基は３７．３９．４５．４７゜ ９１．９３および１０３と同定されている（Ａｍｉｔら（１９８６）前掲、　Ｃ ｈｏｔｈｉａ。

Ｃ９ら（１９８６）前掲〕。免疫グロブリン配列の編集物〔例えば、Ｋａｂａｔ 。

Ｅ、　Ａ、ら、”５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｒｍｍ ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ”、Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ 　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（１９８７） 　）を使って、ＶＨドメイン中に天然に存在するアミノ酸を調査した。天然重鎮 中の３７．３９．４５．４７．９１．９３および１０３位において置換が見つか った。次の実施例における突然変異誘発による界面残基の置換にむけて、現在ま でに配列決定されている抗体の中でそれらの各残基の所の最大極性置換を選択し た。

残基３７は、調査した４３４配列のうちの３８′５がバリンである。他の４８配 列では、脂肪族アミノ酸に置換されていた。残りの１つの例であるヒト重鎮疾患 の症例では、有意に極性の大きい残基であるグルタミンに置換されていた。ＶＨ Ｄｌ、３中へのこの変異の組み込みのためにオリゴヌクレオチド（図２に記載の ＶＨＭＬＩＴＶＡＬ）をデザインした。

この変異および下記の実施例に記載の他の変異を種々の組み合わせにおいて集成 して、更なる新規誘導体を作製することができる。

試験管内突然変異誘発 （１）試験管内突然変異誘発の前に、図２に記載のオリゴヌクレオチドをＡｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９１　ＤＮＡ合成装置上で合成し、標準技 術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ 　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　（第２版）　”　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１１．２３） を使って尿素−アクリルアミドゲル上で精製した。

（２）突然変異誘発用の一本鎖ＤＮＡ鋳型の調製。本発明を例証するのに用いる ＶＨＤｌ、３抗体遺伝子（Ｗａｒｄら、　＋９８９．前掲）をプラスミドｐＵｃ 　１１９　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら　’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ　（第２版）　”　、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

１．１４）上に担持させた。増殖および精製のための標準技術（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ、Ｊ、ら　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　ｍａｎｕａｌ　（第２版）　”、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　４．４６）を使って、該プラスミドを 含有するＴＧ１細胞をＭＩ３　ＫＯ７Ｏ７ヘルパーファージ染せしめることによ り一本鎖鋳型ＤＮＡを調製した。

（３）製造業者の指示通りに”Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓ ｙｓｔｅｍ、　Ｏｌｉｇｏ−ｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｉ［’ ″（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使って部位特異的突然 変異誘発を実施した。突然変異誘発から生じたアンピシリン耐性コロニーを、　 １００μｇ／イのアンピシリンを含む２ＹＴ（２ＹＴ＝水１ｊｌ’あたりバクト ートリプトン１６ｇ、酵母エキス１０　ｇ、ＮａＣ１５ｇ）中で一晩増殖させた 。それらの培養物を新鮮な２ＹＴ中に希釈し、そして上記（２）と同様なＭ２Ｓ 　ＫＯ７感染により一本鎖鋳型ＤＮＡを調製した。５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０ 型キツトを使ったＤＮＡ配列決定により変異体を確かめた。

実施例１に記載のものと同様な論理および方法を使って、３９位の所へのグルタ ミン酸残基の導入のためのすリボヌクレオチドＶＨＭＵＴＧＬＮ　（図２）をデ ザインした。この置換は、調査した４２０の重鎮のうちの１つに認められる。グ ルタミン酸はグルタミンよりもわずかに極性が大きいと考えられるＣＲｏｓｅら 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．８３４−８３８゜１９８５）　。

実施例１に記載のものと同様な論理および方法を使って、４５位のロイシンのグ ルタミンでの置換を導入するオリゴヌクレオチドＶＨＭＵＴＬＥＵ　（図２）を デザインした。この変更は、調査した４０２の配列のうちの２つに認められる（ ３９６はこの位置にロイシンを有する）。

この位置にグルタミンを含む抗体の１つは、抗旧、６Ｄ−ガラクタンに特異的な マウス抗体である。

実施例４　アスパラギン酸でのトリプトファン４７の置換による一層極性の大き いフレームワークを有するＶＨＤｌ、３の調製実施例１に記載のものと同様な論 理および方法を使って、４７位の所へのアスパラギン酸の導入のためのオリゴヌ クレオチドＶｌ（Ｍ［ＪＴＷＩ）（図２）をデザインした。この置換は、調査し た３９２の重鎮のうちの１つに認められる。

実施例５　スレオニンでのチロシン９１の置換による一層極性の大きいフレーム ワークを有するＶＨＤＩ。３の調製実施例１に記載のものと同様な論理および方 法を使って、９１位の所へのスレオニンの導入のためのオリゴヌクレオチドＶＨ ＭＵＴＴＹＲをデザインした。この置換は、調査した３９８の重鎮のうちの１つ に認められる。

実施例６　セリンでのアラニン９３の置換による一層極性の大きいフレームワー クを有するＶＨＤｌ、３の調製実施例Ｉに記載のものと同様な論理および方法を 使って、９３位のアラニンをセリンで置換するためのオリゴヌクレオチドＶＨＭ ＵＴＡＬＡ（図２）をデザインした。この置換は、調査した４１０の重鎮のうち の４つに認められる。それらの１つはマウス抗Ｂ２．１フルクトサンの中にある 。

置換による一層極性の大きいフレームワークを有するＶＨＤｌ、３の調製 実施例１に記載のものと同様な論理および方法を使って、１０３位の所へのグル タミン酸およびチロシンそれぞれの導入のための２つのオリゴヌクレオチドＶＨ ＭＩＪＴＴＲＰおよびＶＨＭＵＴＷＹ　（図２）をデザインした。これらの置換 は、調査した３０８の重鎮の中に各々１度認められる。グルタミン酸はトリプト ファンよりもずっと極性が大きい。

チロシンはトリプトファンよりも極性が大きいけれども、−要保存的な置換であ る。

ｒｈｙ−ｔは免疫グロブリンスーパーファミリーの一重鎖ドメインタンパク質で ある。ｒｈｙ−ｔの残基と免疫グロブリン重鎮の残基との整列はＷｉｌｌｉａｍ ｓにより行われている（Ａ、Ｆ、　ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＪ、　Ｇａｇｎｏｎ 。

５ｃｉｅｎｃｅ　２１６．６９６−７０３．　１９８２　：　Ａ、Ｆ、　Ｗｉｌ ｌｉａｍｓおよびＡ、Ｎ、　Ｂａｒｃｌａｙ。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．３８１−４０５．１９８８）。両 刊行物ではＶＨドメインの残基３７．３９．９１および９３がＴｈｙ−１の同一 残基と整列されているけれども、４５および４７位の残基は異なる残基と整列さ れ、それらの位置の隣接アミノ酸の相同性が低いことを反映している。Ｗｉｌｌ ｉａｍｓ　＆Ｇａｇｎｏｎ　（１９８２）前掲により公表された整列を使って、 相同のＴｈｙ−を位置に見つかる３７．３９および４７位の最大極性残基を導入 するためにオリゴヌクレオチドＶＨＴＨＹ−１（図３）をデザインした。実施例 １と同様に突然変異誘発を実施した。生じたアミノ酸置換を図４に示す。

残基での９１．９３および１０３位の残基の置換による、一層極性の大きいフレ ームワークを有するＶＨＤｌ、３の調製実施例８に記載の方法を使って、相同Ｔ ｂｙ−１残基の所にＶＨ残基９１゜９３および１０３の最大極性置換を組み込む ためにオリゴヌクレオチドＶＨＴＨＹ−２（図３）をデザインした（Ｋａｂａｔ 、　Ｅ、Ａ、ら、“５ｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　［ｍｍ ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ ｔ　ｏｆＨｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（＋９８７） ）　ｏ　ＶＨ界面に相同な残基の所に、全体として最も極性であると思われるラ ット脳’ｒｈｙ−＋中の同位置に見つかる残基を組み込むために別のオリゴヌク レオチドＶＨＴ）ＩＹ−３（図３）をデザインした。突然変異誘発は実施例１に 記載の通りである。生じたアミノ酸変化を図４に示す。

実施例１０　免疫グロブリンファミリータンパク質Ｔｈｙ−ｔからの相同残基で の３７．３９．４７．９１．９３および１０３位の残基の置換による、一層極性 の大きいフレームワークを有するＶＨＤｌ、３の調製鋳型として変異タンパク質 ＶＨＴＨＹ−１のＤＮＡ配列、並びに部位特異的変異を組み込むための変異オリ ゴヌクレオチドＶＨＴＨＹ−２およびＶＨＴＨＹ−３（図３）を使って、実施例 １に記載の如く突然変異誘発実験を実施することにより、実施例８と９に詳述し たアミノ酸変更を組み合わせた。

実施例１１　アスパラギン、スレオニンまたはセリンでの３７．４５．４７゜９ ３および１０３位の残基の置換による、一層極性の大きいフレームワークを有す るＶＨＤｌ、３の調製 ３７、３９．４５．４７．９１．９３および１０３位の各々にトリブレットＧＸ Ｔ　（ここでＸは塩基Ｃ，ＧおよびＴの任意混合物である：図５）を含むオリゴ ヌクレオチドを調製する。実施例１に記載のような突然変異誘発プライマーとし てのそれらの使用は、塩基が組み込まれたものに依存してそれぞれＳｅｒ、　Ｔ ｈｒおよびＡｓｎの挿入をもたらすだろう。次いて生した誘導体を抗原結合およ び改善された性質についてスクリーニングする。

実施例１２　ＶＨＴｈｙ−１およびＶ）ｆＴｈｙ−２変異一本鎖ドメイン抗体の 抗原結合状態の評価 実施例８および９に記載のようにして作製されたＶＨＤｌ、３界面変異体ＶＨＴ ｈｙ−１およびＶＨＴｈｙ−２を、リゾチーム結合活性について評価した。変異 一本鎖ドメイン抗体の抗原結合状態は、当業界で公知の技術に従ってＥＬ［ＳＡ 　（エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ）により測定した。

これは、抗原−抗体結合を測定するのに利用することかできる広範囲の方法のう ちのわずか１つにすぎない。他のものとしては、ウェスタンブロッティング、競 合ラジオイムノアッセイおよび蛍光消光か挙げられる。

変異一本鎖ドメインによるリゾチーム結合についてのＥＬＩＳＡは次の通り実施 した。

アンピシリン耐性クローンの一晩培養物を新鮮な２ＹＴ（１００μｇ／ｍｌのア ンピシリンを含む）中に１１０希釈し、そして３７°Ｃで１時間増殖させた。イ ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（［ＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度 に添加し、３７°Ｃにて更に２４〜３０時間細胞を培養した。ＥＬ［ＳＡで直接 使用するために遠心によって上清を調製した。

ｌ）　プレート（Ｆａｌｃｏｎミクロテスト■フレキシブルプレート）を、５０ ｍＭ　ＮａＨＣＯ＋、　ｐＨ９，６中のＩｍｇ／ｍｌの鶏卵リゾチーム２ｏｏＬ ｔｌ／ウエルにより室温で一晩コーティングした。

２）　リン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）での３回洗浄によりウェルをすすぎ、３ ００μＥ／ウエルのＰＢＳ中２％スキムミルク粉末を使って３７°Ｃにて２時間 ブロックした。

３）　ＰＢＳでの３回洗浄によりウェルをすすぎ、２００μｌの培養上清を添加 し、そして室温で２時間インキュベートした。

４）　０．０５％Ｔ＋ｖｅｅｎ　２０／ＰＢＳて２回、そしてＰＢＳて３回、ウ ェルを洗浄した。

５）２％スキムミルク粉末／ＰＢＳ中のＦｖ断片に対するウサギポリクローナル 抗血清の適当な希釈液（１：１ＯＯＯ）　２００μ！を各ウェルに添加し、２時 間インキュベートした。

６）　（４）の通りに洗浄を繰り返した。

７）２％スキムミルク粉末／ＰＢＳ中の、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ 抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）の適当な希釈液（１：５０００）　２００μ！を各 ウェルに添加し、そして室温で１時間インキユベートシた。

８）　（４１の通りに洗浄を繰り返した。

９）　２００μβの２．２′−アジノービス（３−エチルチアゾリンスルホン酸 ）　［Ｓｉｇｍａｌ　（１０ｍｌあたりｌｕＩ！の３０％過酸化水素／水を含む クエン酸緩衝液（クエン酸緩笥液は、１００　ｄあたり５４ｍ１の５０ｍＭクエ ン酸＋４６−の５０ｍＭクエン酸三ナトリウムを含んで成る）中０．５５■／　 ｍｌ！　）を各ウェルに添加し、そして室温で１０分間まで発色させた。

５０ｍＭクエン酸ｐＨ４，３中の０．０５％アジ化ナトリウムを添加することに より反応を停止させた。Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　Ｍ、Ｃ，中で ４０５　ｎｍにおいてＥＬＩＳＡプレートを読み、各ウェル中の光学濃度の読み を与えた。光学濃度の読みは、ＥＬＩＳＡに使用した一次抗体（この場合は一重 鎖ドメイン抗体）の量および親和力に比例する。

図６に示した結果は、それらの変異体がリゾチームを結合する能力を保持してい たことを証明する。ｖＨｒｈｙ−ｉ変異体は、親のＶＨＤｌ、３よりも高いリゾ チーム結合活性の親和力／量を有し、一方変異体ＶＨＴｈｙ−２はわずかに低い と思われる。

問題の複雑性（上記参照）を仮定すれば、この結果は驚くべきことであり、この 明細書中に教示されるように、抗原結合を過度に傷つけることなくＶＨ一本鎖ド メイン抗体の性質が驚くべき程に改善され得るという論点を強化する。

実施例１３　ＶＨＭｕｔＴｒｐ、　ＶＨｌｌｉｕｔＬｅｕおよびＶＨＴｈｙ−３ 変異一本鎖ドメイン抗体の抗原結合状態の評価 それぞれ実施例３，７および９に記載の通りに作製したＶＨＤｌ、３界面変異体 ＶＨＭｕｔＬｅｕ、　ＶＨＭｕｔＴｒｐおよびＶＨＴｈｙ−３をリゾチーム結合 活性について評価した。変異−重鎖結合ドメインの抗原結合状態を実施例１２に 記載の通りＥＬＩＳＡにより測定した。図７に示した結果は、それらの変異体が リゾチームを結合する能力を保持していたことを証明する。

実施例１４　ＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２：　ＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−３およ びＶＨＭｕｔＷＤ変異一本鎖ドメイン抗体の抗原結合状態の評価それぞれ実施例 １Ｏおよび４に記載の通りに作製したＶＨＤｌ、３界面変異体ＶＨＴｈｙ（、Ｔ ｈｙ−２：　ＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−３およびＶＨＭｕｔＷＤ　ヲ’Ｊゾチー ム結合活性について評価した。変異−重鎖結合ドメイン抗体の抗原結合状態を実 施例１２に記載の通りＥＬ（ＳＡにより測定した。図８に示した結果は、それら の変異体がリゾチームを結合する能力を保持していたことを証明する。

このように、リゾチームを結合する能力に影響を及ぼすことなく該ドメインの極 性を増加させる広範囲の変化（６アミノ酸置換）をＶＨ界面に行うことができる 。本明細書中に教示した置換を選択するのに用いたアプローチは、いずれのＶＨ ドメインにも適用できると期待される。

鋳型としての変異タンパク質ＶＨＴｈｙ−１のＤＮＡ配列と部位特異的変異を組 み込むための変異オリゴヌクレオチドＶＨＴｈｙ−２とを使うことによって実施 例１０で作製された誘導体ＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２をコードする遺伝子を、 遺伝子■タンパク質との融合体としてこのＶＨドメインをファージ上に表示する ためにベクターｆｄＰｓ／Ｂｓ中にサブクローニングした。ベクターｆｄＰｓ／ Ｂｓは、クローニングのためのＰｓｔｌおよびＢｓｔＢ１１制限部位を含むこと 以外はｆｄｃＡＴｌ　（ＭｅＣａｆｆｅｒｔｙ、　Ｊ、ら。

１９９０、　Ｎａｔｕｒｅ　３４８．　ｐ５５２−５５４）と同じである（図９ ）。

標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、　１９８９．前掲）を使ってｐＵｃ１１９　ＶＨ Ｔｈｙ−１，ＴｈＹ−２ＤＮＡのミニ調製物を調製した。プライマーＲＶＨＴＨ ＹＦＯＲおよびＫＳＪ６を使ってＰＣＲによりＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２コ一 ド配列を増幅せしめた。

ＲＶＨＴＨＹＦＯＲ ５’　ＴＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＧＣＣＴＴＧ　 ＧＣＣＡＧＴ　Ｇ　３’これはＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２遺伝子の３′末端ｆ 、：ＢｓｔＥ１１部位を導入する。

５Ｊ６ ５’　ＡＧＧ　ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　Ｇ　３’これはＶ ＨＴｈｙ−４，７ｈｙ−２遺伝子の５′末端にＰｓｔ［部位を導入する。

ＰＣＲは、全量１００μｆにおいて２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（７０°ＣでｐＨ７， ３）。

５０ｍＭ　ＫＣｌ、　４ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　０．０１％ゼラチン、ｉｏμｕの 各オリゴヌクレオチド、　１ｍＭの各ｄＮＴＰ、　５単位のＴａｑポリメラーゼ および約５０　ｎｇのｐｃＵ１１９　ＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２ＤＮＡを使っ て実施した。ＰＣＲ反応生成物をエタノール沈澱せしめ、そして２０ｕ１．のｌ ｏｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，０，１ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁した。ｌＯμ ｍ部分を全量５０μβにおいてＮＥＢ緩衝液２中でＰｓｔＩ　（２０単位）とＢ ｓｔＥｌｌ　（２ｏ単位）により３７°Ｃにて２時間消化した（制限酵素はＮｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　ＣＰ　Ｌａｂｓ、　Ｂ１５ｈｏｐｓＳ ｔｏｒｔｆｏｒｄから入手した）。消化後、反応混合物をフェノール抽出し、エ タノール沈澱せしめた。生成物を１％アガロース−Ｔｒｉｓ酢酸塩−ＥＤＴＡゲ ル上で電気泳動し、そして約３５０　ｂｐのバンドを切り取り、Ｇｅｎｅｃｌｅ ａｎ　（Ｂｉｏ　１０１、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を使っ てＤＮＡを精製した。標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、　１９８９．前掲）を使っ てベクターＤＮＡ　（ｆｄＰｓ／Ｂｓ　ＲＦ型）を調製した。このＤＮＡ　（１ ，２μｇ）を１００μｆのＮＥＢ緩衝液３中でＰｓｔ［とＢｓｔＥｌｌ　（５０ 単位）により３７°Ｃにて９０分間消化した。生成物をフェノール抽出し、エタ ノール沈澱せしめ、そして再懸濁したＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， 前掲）により記載されたようにしてホスファターゼ処理した。調製用０．７％Ｔ ｒｉｓ−はう酸塩−ＥＤＴＡ−アガロース電気泳動を行い、約９ｋｂのバンドを 切り取り、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを使ってＤＮＡを精製し、そして１０ｔｔｌのｌ ｏｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸濁した。消化し たベクターと挿入断片ＤＮＡ各５μβを使って１０μ！のＮＥＢリガーゼ緩衝液 中て２００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを使って連結を行った。この連結混合物 （８μりを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，前掲）に従って調製したコ ンピテントＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＣ１０６１細胞を形質転換せしめ、そ して２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む２ＹＴ寒天上で混合物を平板培養 した。コロニーを採集し、一本ｊ！ＤＮＡを調製しく　Ｓａｍｂｒｏｏｋら。

１９８９、前掲）　、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０キツト（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔ ａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を使ってＤＮＡを配列決定した。挿入断 片の配列はＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２と一致した。この誘導体をｆｄＶＨＴｈ ｙ−１，Ｔｈｙ−２と命名した。

ｐＵｃ１１９ＶＨＤ１．３から出発しテｆｄＰｓ／Ｂｓ中（７）　ＶＨＤｌ、　 ３（７）　クローンを調製した。ＰｓｔｌとＢＳｔＥｌｌでのｐｓＷｌ−ＶＨＤ ｌ、３−ＴＡＧＩ　（Ｗａｒｄ　Ｅ、Ｓ、ら、１９８９゜前掲）の消化によって ＶＨＤｌ、３をコードする挿入断片を調製した。その他の手順は上記と同様であ った。この誘導体をｆｄＶＨＤｌ、’３と命名した。

実施例１５で作製したｆｄＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２フアージは、ＥＬＩＳＡ ア・ソセイを使って、抗原リゾチームの結合に関して機能的であることが証明さ れた。

ｆｄＶＨＴｔ＋ｙ−１，Ｔｈｙ−２；　ｆｄＶＨＤｌ、３　：フｙ−ジ抗体０１ ．３　（表示５ｃＦｖＤ１．３　＋　ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、　Ｊ、ら、　１９ ９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４８、ｐ５５２−５５４）またはｆｄＰｓ／Ｂｓを含 有するＥ、コリＭＣ１０６１細胞を、１５μｇ／艷のテトラサイクリンを含む２ ＹＴ培地５〇−中で１６〜２４時間増殖させることにより、ウィルス粒子を調製 した。８Ｘ５０１ｎＩ！ローター中での１１０００ｏｒｐでの１０分間の遠心分 離により培養上清を収集した。１１５容の２０％ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）　／２．５Ｍ　ＮａＣ１を添加し、４°Ｃで１時間置くことによりファージ 粒子を沈澱せしめた。上記と同様の１５分間の遠心分離によってファージ粒子を ペレット化し、このベレットを、１％ゼラチンを含む無菌の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 、　ｐＨ８，０，ｌｌＩＩＭ　ＥＤＴＡ中に、元の容量のｌ／４０になるように 再懸濁した。

１、　実施例１２に記載の通りに、ＥＬＩＳＡプレートをリゾチームでコーティ ングし、そしてスキムミルク粉末含有ＰＢＳによりブロックした。

Ｚ　ウェルをＰＢＳで洗浄した。

３、適宜各ウェルに濃縮ファージ（２００μｌ）を添加し、室温で２時間インキ ュベートした。

４、　ウェルを０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回、ＰＢＳで３回洗浄し た。

５．２％スキムミルク粉末含１ｆＰＢＳ中のヒツジ抗Ｍ１３血清（２００μｍ　 ：　１：１Ｏ００）を各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。

６８４と同様に洗浄を繰り返した。

７、　ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（２００μｌ；１：５ ０００　：　Ｓｉｇｍａ）を添加し、１時間インキュベートした。

８．４と同様に洗浄を繰り返した。

９、　実施例１２に記載の通りにペルオキシダーゼ基質を添加し、１時開発色せ しめた。

ｆｄＶＨＴｈｙ−１，Ｔｈｙ−２とｆｄＶＨＤｌ、　３（７）両方が、ｆｄＰｓ ／Ｂｓを使ッテ得られた値よりも４〜５倍高いＥＬＩＳＡシグナルを与え、一方 、ファージ抗体Ｄ１．３を使った場合、シグナルはｆｄＰｓ／Ｂｓを使って得ら れた値の約８倍であった（図１０）。よって、ＶＨ界面残基の変更は、ファージ 上に表示した時にリゾチームを結合する該ドメインの能力に影響を及ぼさなかっ た。

本発明を単に例示のつもりで記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく 該方法に相当な変更を行って同様な結果を成し遂げることができることは、当業 者に明白であろう。

＋３０　１４０　１５０　１６０１７０　１ｅｌＯコ１０コ２０３３０３４０３ ５０３６０ミ←蓋 ト１ ：り自　ミ・目→弓 ＝・Ｕ　ミ・ｌ ；１１０目　＝０３ 舎・８・８　；弓・舌・（ 訃目　ｇ０卜 ν耘←阜　ｐｌ・目を藍 変異ＶＨドメインのＥＬＩＳＡ ＦもＪ℃ゴ。

ＶＨ変異ドメインのＥＬＩＳＡ 遺伝子■ ｆｄＶＨＴｈｙ−１，７ｈｙ−２および対照のＥＬＩＳＡＩｗｌ−、−Ｎｏ　ρ ＣＴ／ＧＢ　９１１０１２５３フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ８５１７−４ＨＣ１２Ｎ　１５／１２ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） ＣＯ７Ｋ　９９：００ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ。

ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、ＭＣ， ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＵ、　ＵＳ Ｉ （７２）発明者　ジャクソン、ロナルド　ヘンリーイギリス国、ケシブリッジ　 シーピー１２エヌユー、キックストン　ストリート（７２）発明者　チスウエル 、デビット　ジョンイギリス国、パツキンガム　エムグー１８２エルデイー、ミ ドル　クレイトン、サンドヒル　ハウス　１

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫グロブリンファミリーまたはスーバーファミリーの一員の別の一本鎖可 変ドメインの合成類似体である一本鎖可変ドメインであって、前記類似体では前 記ドメインの１または複数の界面アミノ酸残基が前記別のドメインに比較して変 更されており、ここで前記変更アミノ酸は、該類似体が前記別のドメインよりも 一層親水性であるように、免疫グロブリンファミリーまたはスーバーファミリー の一員の相同部位に存在する残基により置換されている、前記一本鎖可変ドメイ ン。
2. ２．前記変更アミノ酸残基がフレームワーク領域中にある、請求項１に記載の一 本鎖可変ドメイン。
3. ３．前記変更アミノ酸残基が相補性決定領域中にある、請求項１または請求項２ に記載の一本鎖可変ドメイン。
4. ４．前記合成類似体が前記別のドメインと本質的に同じ結合活性を有する、請求 項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖可変ドメイン。
5. ５．本来のドメインに比べて前記類似体の特異性および／または親和力を変更す るために、アミノ酸置換、削除、付加または反転により相補性決定領域のアミノ 酸配列が更に変更されている、請求項２または請求項３に記載の一本鎖可変ドメ イン。
6. ６．一本鎖可変免疫グロブリン重鎖ドメインの合成類似体である、請求項１〜５ のいずれか一項に記載の一本鎖可変ドメイン。
7. ７．アミノ酸残基３７，３９，４５，４７，９１，９３および１０３の１つまた は複数が変更されている、請求項６に記載の一本鎖可変ドメイン。
8. ８．アミノ酸変更が、 ｉ）グルタミンまたはスレオニンによるバリン３７の置換；ｉｉ）グルタミン酸 によるグルタミン３９の置換；ｉｉｉ）グルタミンによるロイシン４５の置換； ｉｖ）アスパラギン酸またはグリシンによるトリプトファン４７の置換； Ｖ）スレオニン、セリンまたはメチオニンによるチロシン９１の置換； ｖｉ）セリンまたはグルタミン酸によるアラニン９３の置換；ｖｉｉ）グルタミ ン酸、チロシンまたはスレオニンによるトリプトファン１０３の置換； ｖｉｉｉ）アスパラギン、スレオニンまたはセリンのいずれかによるバリン３７ 、ロイシン４５、トリブトファン４７、アラニン９３および／またはトリプトフ ァン１０３の置換； ｉｘ）スレオニンによるバリン３７の置換およびグルタミン酸によるグルタミン ３９の置換およびグリシンによるトリブトファン４７の置換；ｘ）セリンまたは メチオニンによるチロシン９１の置換およびグルタミン酸によるアラニン９３の 置換およびスレオニンによるトリブトファン１０３の置換 のうちの１つまたは複数を含んで成る、請求項６または請求項７に記載の一本鎖 可変ドメイン。
9. ９．更に他の分子成分に結合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の一本 鎖可変ドメイン。
10. １０．前記更に他の分子成分が酵素標識、蛍光標識もしくは放射能標識、または 免疫グロブリンの一部分である、請求項９に記載の免疫グロブリン−本鎖可変ド メイン。
11. １１．診断試験を実施するための１または複数の補助試薬と共に、請求項１〜１ ０のいずれか一項に記載の一本鎖可変ドメインを含んで成る診断キット。
12. １２．少なくとも請求項１〜１０のいずれか一項に記載の一本鎖可変ドメインを 含んで成る治療用組成物。
13. １３．免疫グロブリンファミリーまたはスーバーファミリーの一員の別の一本鎖 可変ドメインの親水性合成類似体である一本鎖可変ドメインの製造方法であって 、 （ｉ）前記一本鎖可変ドメインの界面領域を詳しく調べて疎水性アミノ酸残基を 同定し；そして （ｉｊ）１または複数の前記疎水性残基が、免疫グロブリンファミリーまたはス ーバーファミリーの一員の相同位置に存在する一層疎水性の小さい残基により置 換されている（ｉ）の前記一本鎖可変ドメインの前記類似体を製造する、 ことを含んで成る方法。
14. １４．次の段階： （ａ）前記同定された疎水性残基のうちの１または複数をコードするヌクレオチ ド配列を得； （ｂ）部位特異的突然変異誘発を使って前記ヌクレオチド配列を変更して代替ア ミノ酸をコードするトリプレットを導入し；（ｃ）変更されたヌクレオチド配列 を組換え発現系において使って合成類似体を発現せしめる ことを含んで成る、請求項１３に記載の方法。
15. １５．複数のアミノ酸残基が置換される、請求項１３または請求項１４に記載の 方法。
16. １６．代替アミノ酸が免疫グロブリンスーバーファミリーの天然の単量体メンバ ーから誘導される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. １７．天然の単量体メンバーがＴｈｙ−１である、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記合成類似体が前記別のドメインと本質的に同じ結合活性を有する、請 求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。