CN106995846A

CN106995846A - 一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

Info

Publication number: CN106995846A
Application number: CN201710221180.XA
Authority: CN
Inventors: 彭波; 孙艳芳; 袁红雨; 孔冬艳; 庞瑞华; 李金涛
Original assignee: Xinyang Normal University
Current assignee: Xinyang Normal University
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2017-04-06
Publication date: 2017-08-01

Abstract

本发明公开了一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用，其中检测豫南香稻品种的方法包括以下步骤：对豫南香稻品种的叶片采用CTAB法提取全基因组的DNA；利用Badh2基因功能标记所提取的DNA进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行电泳，采用凝胶成像***进行观察结果。本发明还公开了一种Badh2基因功能标记在香稻品种的育种中的应用。本发明鉴定了豫南香稻品种对应的突变类型，为利用分子标记辅助选择培育优质香稻新品种奠定基础。

Description

一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有超过一半的人口且我国有三分之二的人口以稻米为主食。随着生活水平的提高，人们对优质稻米的需求正在不断增加。然而稻米品质性状复杂，主要包括营养品质、外观品质、研磨加工品质、蒸煮和食味品质等几个方面，而在这些品质当中，消费者往往更注重稻米的蒸煮和食味品质。而作为栽培稻特殊类型的香稻，由于香气馥郁、米饭芬芳、营养价值较高等特点，被视为稻米中的珍品。传统的香稻品种地域性强、抗性较差且产量偏低，难以大面积推广，故香米价格较高，但是人们对香米的需求近年来却显著增加。因此，香稻的遗传育种受到国内外水稻遗传学家和育种学家的高度关注。

目前，在水稻中已经有超过200种挥发性物质被分离并得到鉴定，其中2-乙酰-1-吡咯啉(2-Acetyl-1-pyrroline,2-AP)被认为是香稻中主要的挥发性物质之一，且2-AP在较低的浓度条件下就能够被检测到。已经有多种方法用来检测水稻材料中的香味，其中咀嚼法和KOH法是在传统育种过程中最为常用的方法，但是这两种依靠人的感官来进行判定香味的方法准确性较差。前期研究表明：位于水稻第8染色体上的隐性基因fgr，是一个与香味密切相关的基因，该基因随后被分离克隆。进一步研究揭示：基因fgr编码甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase homologue 2,Badh2)，抑制fgr基因的表达、敲除fgr基因或者fgr基因发生变异，导致Badh2酶功能的缺失，都会使2AP前体物质增加，进而积累2AP使水稻产生香味。因此，fgr基因和Badh2基因为同一个香味基因。

针对Badh2基因，在280份普通野生稻和242份普通栽培稻中的测序分析发现：除了在第2外显子存在一个7-bp的缺失和第8外显子存在一个7-bp的***突变之外，在Badh2基因的第1、10、13、和14外显子均存在变异位点。进一步研究发现：在Badh2基因的第4和5外显子、第1外显子和第1内含子的剪接位点、启动子区域及其5’UTR区也有***、缺失或者单个核苷酸变异位点。目前已经开发了多个与水稻香味有关的分子标记，并用于水稻新品种或者恢复系的选育。然而，这些分子标记大多是单核苷酸多态性分子标记、***或者缺失类型的分子标记，且PCR产物的碱基差异比较小，必须利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离分析。因此，整个实验操作的过程比较繁琐，不利于大规模利用分子标记进行准确地检测与分析工作。同时，基于DNA的分子标记一般是利用其基因组序列的多态性位点设计，往往标记与目的基因较远，会发生标记与对应的表型不完全吻合的现象。基因的功能标记，是针对特异的基因而设计的，与基因对应的表型是完全吻合的，相对于普通的香味相关的分子标记，Badh2基因的功能标记在作物的遗传改良过程中更加准确。由于Badh2基因在不同的香稻品种中存在不同的突变类型，而一个Badh2基因功能标记只能够检测一种类型的突变，在利用已经开发的分子标记或者功能标记进行分子标记辅助选择育种的过程中，将多个Badh2等位基因的功能标记同时用于豫南香稻品种的检测与分析还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明针对水稻香味基因相关的分子标记在香稻遗传育种过程中可能会出现筛选不准确，筛选过程比较繁琐，不利于大规模针对香稻育种中间材料进行准确快速地检测与分析的问题，提供了一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用，本发明利用Badh2基因开发的7个基因功能标记，针对香稻品种进行了检测与分析，旨在明确香稻资源香味基因的变异类型，进而利用分子标记辅助选择香稻资源进行香稻的分子育种，为优质香稻新品种的培育奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用Badh2基因功能标记检测豫南香稻品种的方法，包括以下步骤：

步骤1、PCR扩增：对豫南香稻品种的叶片采用CTAB法提取全基因组的DNA；

步骤2、利用Badh2基因功能标记所提取的DNA进行PCR扩增；

步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，采用凝胶成像***进行观察结果。

进一步地，所述Badh2基因功能标记包括FMU1-2、FME2、FME4-5、FME7、FME12、FME13和FME14引物对；所述FMU1-2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示FMU1-2 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的FMU1-2 R引物；所述FME2引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示FME2 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的FME2 R引物；所述FME4-5引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示FME4-5 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的FME4-5R引物；所述FME7引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的FME7 F1引物和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的FME7 R1引物；以及如SEQ ID No.9所示的FME7 F2引物和核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的FME7 R2引物；所述的FME12引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示FME12 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的FME12 R引物；所述的FME13引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示FME13 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的FME13 R引物；所述的FME14引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.15所示FME14 F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的FME14 R引物。

进一步地，PCR反应体系包括DNA模板2μL，10×Buffer 2.5μL，25mmol·L^-1的MgCl₂1.5μL，2.5mmol·L^-1的dNTP 2.0μL，正向和反向引物(12.5μmol·L^-1)各1.0μL，5U·μL^-1的Taq酶0.4μL，补充无菌水至20μL。

进一步地，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s,55℃～61℃退火30s，72℃延伸30s～90s，反应32个循环后72℃再延伸10min，25℃保存。

进一步地，功能标记FME4-5和FME7的PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，采用凝胶成像***进行观察结果；FME2基因功能标记的PCR产物均在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后硝酸银银染后观察。

本发明还公开了一种上述的Badh2基因功能标记在香稻品种的育种中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明可以针对水稻中Badh2基因的多个功能性位点同时进行准确快速地检测与分析。

2)本发明能够利用Badh2基因开发的7个基因功能标记，鉴定不同的豫南香稻品种中的Badh2基因的变异类型及其对应的基因型。

3)本发明能够利用Badh2基因的功能标记，直接利用分子标记辅助选择培育优质豫南香稻新品种。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明7个Badh2基因功能标记对16个香稻和4个非香水稻材料电泳检测图；其中，A为功能标记FMU1-2的PCR检测条带；B为功能标记FME2的PCR检测条带；C为功能标记FME4-5的PCR检测条带；D为功能标记FME7的PCR检测条带；E为功能标记FME12-13的PCR检测条带；F为功能标记FME14的PCR检测条带；WT为4个非香水稻品种(信粳46、豫农31、豫农32和豫农9)混合样品，1～16全部为香稻品种，其编号对应于表1。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明中所有的材料均为粳稻类型的水稻品种，其中来源于豫南地区16份香稻资源具有广泛的代表性，有14份常规香稻和2份糯型香稻，并选取4种常规粳稻品种作为对照(表1)。所有的香稻品种及其对照材料均于2016年播种在信阳市农业科学院同一试验大田中，每个品种种植2行，每行12株，株行距为16.5×26.4cm。从播种到种子成熟期间实行普通大田常规栽培管理。

表1试验材料及其来源

实施例11.2基因功能标记

香味基因Badh2在自然群体中存在多种等位基因的形式，并且不同的等位基因其香味有所差别，针对Badh2基因在5’UTR区、第2、4、5、7、12、13和14外显子存在***、缺失或者单核苷酸变异位点开发了7个Badh2基因功能标记。其中功能标记FME14是酶切扩增多态性序列标记(The cleaved amplified polymorphic sequence marker,CAPS)，其余的均为普通PCR分子标记，各个Badh2基因功能标记扩增产物的大小、引物的序列、退火温度等详细信息见表2。所有的引物均为南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并且通过预试验表明，该7个Badh2基因功能标记均在反应体系表现稳定、结果清晰可靠。

表2 Badh2基因功能标记信息

实施例2豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测

1)PCR扩增：豫南香稻品种和4个对照粳稻的叶片均采用CTAB法提取全基因组的DNA。

PCR反应体系包括DNA模板2μL，10×Buffer 2.5μL，25m mol·L^-1的MgCl₂1.5μL，2.5m mol·L^-1的dNTP 2.0μL，正向和反向引物(12.5μmol·L^-1)各1.0μL，5U·μL^-1的Taq酶0.4μL，补充无菌水至20μL。所用的试剂采购于上海生工生物工程技术有限公司。

PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s,55℃～61℃退火30s,72℃延伸30s～90s，反应32个循环后72℃再延伸10min，25℃保存。

2)PCR产物检测

功能标记FME14的PCR产物先经过BslⅠ限制性内切酶(在CutSmart缓冲液条件下)在55℃反应3小时，然后在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳；功能标记FME4-5和FME7的PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，采用凝胶成像***进行观察结果。其余的Badh2基因功能标记的PCR产物均在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后硝酸银银染后观察。

3)试验结果：

3.1)功能标记FME2的检测结果

分别以16份豫南香稻品种和4份常规粳稻品种的基因组DNA为模板，利用Badh2基因功能标记FME2进行PCR扩增，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。其检测结果(图1B)表明：信香粳1号、香粳805、常香粳101和农香粳共有4份香稻品种能够扩增出100bp大小的片段，说明这4份香稻材料在Badh2基因的第2外显子处都存在一个7bp的缺失片段，它们属于同一种香味基因的变异类型。其余的4份常规粳稻品种和12份豫南香稻品种都扩增出一条107bp大小的片段，说明这12份豫南香稻材料不属于Badh2基因的第2外显子突变类型。

3.2)功能标记FME4-5的检测结果

以16份豫南香稻品种和4份常规粳稻品种的基因组DNA为模板，利用Badh2基因功能标记FME4-5分别进行PCR扩增，采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。其检测结果(图1C)表明：白香粳和香粳805可以扩增出321bp大小的片段，说明这2份香稻材料在Badh2基因的第4和5外显子处都存在一个803bp的缺失片段，它们属于同一种香味基因的变异类型。其余的4份常规粳稻品种和14份豫南香稻品种都扩增出一条1123bp大小的片段，说明这14份豫南香稻材料不属于Badh2基因的第4和5外显子突变类型。

3.3)功能标记FME7的检测结果

分别以16份豫南香稻品种和4份常规粳稻品种的基因组DNA为模板，利用Badh2基因功能标记FME7进行PCR扩增，采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。其检测结果(图1D)表明：矮秆香稻丸、信香糯933、香丰916、淮滨香香稻和息县香稻丸均能够扩增出大小为583bp和169bp的2个片段，说明这5份香稻材料在Badh2基因的第7外显子处存在一个8bp的缺失片段和3bp的突变，它们属于同一种香味基因的突变类型。其余的4份常规粳稻品种和11份豫南香稻品种扩增出大小分别为591bp和449bp的2个条带，说明这11份豫南香稻材料不属于Badh2基因的第7外显子突变类型。

3.4)功能标记FMU1-2、FME12-13和FME14的检测结果

以16份豫南香稻品种和4份常规粳稻品种的基因组DNA为模板，分别利用Badh2基因功能标记FMU1-2、FME12-13和FME14进行PCR扩增，采用凝胶电泳分别检测。其检测结果(图1D)表明：利用Badh2基因功能标记FMU1-2和FME12-13，所有的香稻品种和对照材料都只扩增出一条条带，大小分别为163bp(图1A)和192bp(图1E)的片段，说明这16份香稻品种在Badh2基因的5’-UTR区、第12和13外显子处均不存在突变，它们都属于这种香味基因突变类型。利用Badh2基因功能标记FME14做PCR扩增，然后采用限制性内切酶BslⅠ酶切检测，结果表明所有的香稻材料和非香稻材料都能够被BslⅠ酶切出205bp大小的条带，说明这16份豫南香稻品种在Badh2基因的第14外显子处并不存在一个1bp的***突变(图1F)。

在本试验材料中，香宝2号、郑香粳11、黑香稻193、农香粳4号、香糯1862和香宝1号共6份香稻材料在已知的Badh2基因变异位点(5’-UTR区、第12、13和14外显子)处，并没有发现变异发生(图1A、E和F)。其余的10份香稻材料分别在Badh2基因的第2、4、5和7外显子处存在突变，其中香粳805在Badh2基因的第二外显子处存在一个7bp的缺失，并且在第4和5外显子处存在一个803bp的缺失片段，详细的结果见表3。

表3 16份豫南香稻品种Badh2基因功能标记检测结果分类

4)结论：

4.1)香稻分子标记的检测：本发明利用上述7个Badh2基因功能标记对16份豫南香稻品种进行了检测分类，共有4份香稻材料在Badh2基因的第2外显子处存在变异；2份香稻材料在Badh2基因的第4和5外显子处存在803bp的缺失；有4份香稻材料在Badh2基因的第7外显子处存在8bp的缺失和3bp的突变(图1；表3)，其余的香稻材料在Badh2基因的5’-UTR区、第12、13和14外显子处并没有发现变异发生(图1)。因此，针对特定的香稻品种开展分子标记的检测与分析，能够极大地提高香稻新品种的育种效率。

4.2)豫南香稻功能标记的开发及应用

优质香稻在市场上深受广大消费者的青睐，其稻米中的香味是非常重要的食味品质性状。香味基因功能标记总是与特定的稻米香气性状联系在一起，那么针对豫南香稻品种资源，开展香稻Badh2基因功能标记的检测与分析，将为优质香稻新品种的培育提供重要参考与借鉴。本研究结果发现，豫南香稻品种中有10份材料在Badh2基因的第2、4、5或者7外显子处存在变异，可以利用现有的功能标记进行分子标记选择来加快优质香稻新品种的育种。而香宝2号、郑香粳11、黑香稻193、农香粳4号、香糯1862和香宝1号共6份香稻材料和4份非香水稻材料在这7个功能性分子标记检测的结果是一样的。因此，这6份香稻材料有可能是已经发现的Badh2基因的其他突变类型，需要进一步鉴定这些香稻材料的功能标记；也有可能这6份香稻材料中存在尚未发现的Badh2基因的新等位基因类型，根据这些香稻材料可以在今后进行新基因的定位、分离、克隆和功能标记的开发与利用。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 信阳中国师范学院

<120> 一种豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

<130> 2017

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcccaccacc actccaca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgaagagct gccgctgc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggaggcgct gaagagga 18

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggtagtcac caccctacct tg 22

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgctggatgc tttgagta 18

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtttagcaca cctgaaggaa gacca 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccggtgctcc tttgtcatc 19

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgaaactggt aaaaagatta tggc 24

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagcagctga aatatatacc 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgcatcctg ctcgtctgg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttggtccagt gctctgtgtg 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaccagcca gaccataac 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttggtccagt gctctgtgtg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcaccagcca gaccataac 19

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgatgccgg aattatctgg gtga 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tccccacggc tcatcggagg 20

Claims

1.一种用Badh2基因功能标记检测豫南香稻品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2、利用Badh2基因功能标记所提取的DNA进行PCR扩增；

2.根据权利要求1所述的用Badh2基因功能标记检测豫南香稻品种的方法，其特征在于，所述Badh2基因功能标记包括FMU1-2、FME2、FME4-5、FME7、FME12、FME13和FME14引物对；所述FMU1-2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示FMU1-2F引物和核苷酸序列如SEQID No.2所示的FMU1-2R引物；所述FME2引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示FME2F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的FME2R引物；所述FME4-5引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示FME4-5F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的FME4-5R引物；所述FME7引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的FME7F1引物和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的FME7R1引物；以及如SEQ ID No.9所示的FME7F2引物和核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的FME7R2引物；所述的FME12引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.11所示FME12F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的FME12R引物；所述的FME13引物对包括核苷酸序列如SEQID No.13所示FME13F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的FME13R引物；所述的FME14引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.15所示FME14F引物和核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的FME14R引物。

3.根据权利要求1所述的用Badh2基因功能标记检测豫南香稻品种的方法，其特征在于，PCR反应体系包括DNA模板2μL，10×Buffer2.5μL，25mmol·L^-1的MgCl₂1.5μL，2.5mmol·L^-1的dNTP 2.0μL，正向和反向引物(12.5μmol·L^-1)各1.0μL，5U·μL^-1的Taq酶0.4μL，补充无菌水至20μL。

4.根据权利要求1所述的用Badh2基因功能标记检测豫南香稻品种的方法，其特征在于，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s,55℃～61℃退火30s，72℃延伸30s～90s，反应32个循环后72℃再延伸10min，25℃保存。

5.根据权利要求1所述的用Badh2基因功能标记检测豫南香稻品种的方法，其特征在于，功能标记FME4-5和FME7的PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，采用凝胶成像***进行观察结果；FME2基因功能标记的PCR产物均在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后硝酸银银染后观察。

6.权利要求1所述的Badh2基因功能标记在香稻品种的育种中的应用。