CN106995806A - H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2‑H5株的构建及其应用 - Google Patents

H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2‑H5株的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2‑H5株的构建及其应用。本发明设计构建了一株重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2‑H5，该毒株是表达5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒，可用于制备制备成活疫苗，可预防鸭瘟和鸡、水禽H5亚型禽流感；在构建过程中的缺失UL2基因、携带绿色荧光标记的重组鸭肠炎病毒载体(rDEVΔUL2‑GFP)，可通过同源重组的方法，应用该载体表达外源基因，为鸭肠炎病毒作为载体构建抗鸭瘟和其他病原的新型重组疫苗打下基础。

Description

H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株的构建及其 应用
技术领域
本发明涉及H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株的构建及其应用，属于病毒学和兽用生物制品领域。
背景技术
鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)，又名鸭瘟病毒(Duck Plague virus)，可感染鸭、鹅及其它雁形目禽类，引起血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变的一种急性、接触性、败血性传染病——鸭病毒性肠炎(Duckviral enteritis,DVE)，或称鸭瘟(Duck plague,DP)(Sandhu and Metwally,2008)。自1923年被首次发现以来(Baudet,1923)，本病相继发生于法国、印度、比利时、英国、泰国和加拿大等国家(殷震和刘景华,1997)，流行范围、感染禽类的种类有逐步扩大的趋势，至少48种雁形目中的禽类对DEV易感(Kaleta et al.,2007)。鸭瘟是一种广泛嗜全身性感染的传染病，发病率和死亡率都很高，给水禽养殖业带来巨大损失。免疫接种是预防和控制该病暴发的重要措施，目前我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。DEV具有良好的免疫原性，免疫力产生快速，免疫后3天便可抵抗鸭瘟强毒攻击；免疫期长，可达一年。
DEV属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型(http://www.ictvonline.org)。李玉峰应用Shot-gun方法首次完成了DEV——我国鸭瘟商品化疫苗(DEV VAC)的全基因组测序。DEV VAC基因组全长为158,089bp，G+C含量为44.91％，由长独特区(Unique Long,UL)和短独特区(Unique Short,US)组成，US区两端为一对反向重复序列，分别称为内部重复序列(Internal Repeat,IR)和末端重复序列(Terminal Repeat,TR)。基因组结构为UL-IR-US-TR，呈典型的D型疱疹病毒基因组结构(Li et al.,2009)。我们完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定，该毒株基因组全长为162,131bp，共78个ORF，编码76个蛋白(Yang et al.,2014)。与DEV CSC相比，鸡胚连续传代致弱株DEVK p63基因组短4040bp，在UL区的5’端连续缺失3,513bp导致UL56移框突变，以及3’端连续缺失528bp导致UL2缺失176个氨基酸。DEV CSC UL2编码了一个HSV-1同源物——尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase，UNG)。UNG是一个普遍存在的极保守的DNA修复酶。与DEVCSC相比，DEV K p63 UL2在65位氨基酸后缺失176aa，导致缺少前3个结构基序而不能形成HSV-1UL2相似的3D结构(Savva et al.,1995)和活性中心(Arnold et al.,2006；Bordoli et al.,2009；Guex and Peitsch,1997；Guex et al.,2009；Schwede et al.,2003)。研究表明，UL2对HSV-1在细胞培养中的正常复制是非必需的，但对病毒在神经元中的复制具有重要作用。通过同源重组的方法，构建了缺失UL2的HSV-1突变体，小鼠颅内直接接种后，其神经毒力比亲本毒低10倍，而外周途径接种后神经毒力低100,000倍(Pyles andThompson,1994)。DEV UL2基因是否具有HSV-1相似的功能，有待进一步研究。
禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种禽类的病毒性疫病，1878年意大利最早报道，随后在世界各国均有发生。目前在我国流行的高致病性禽流感主要由H5亚型禽流感病毒引起，不仅给养禽业带来毁灭性打击，而且还屡屡突破种间屏障，造成人的感染和死亡。研究表明，水禽是AIV的天然储存库，从水禽中分离到的禽流感病毒几乎涵盖所有血清亚型，这些病毒可在水禽体内感染、进化且持续向外界排出，所以水禽也是禽流感发生的重要源头。另外，水禽的生态环境复杂，家养水禽与野生水禽(野鸭等)、其他家禽、家畜和人等构成多重交叉生态界面，AIV既可由家养水禽传播给野生水禽，又可经家养水禽传播给鸡等陆禽、家畜和人，家养水禽在AIV的进化及高致病性禽流感的长期地方性流行中起着特殊作用。
随着基因工程技术的发展，重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗研究的热点。利用基因工程技术，将外源DNA***到病毒基因重组，利用病毒表达外源DNA蛋白，制备成一种活载体疫苗。这种疫苗可以同时启动机体细胞和体液免疫，可以通过一次免疫预防多种疾病，降低了生产成本，简化了免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗之间的干扰现象。
本发明通过同源重组技术，构建了一株缺失UL2基因196-723位核苷酸、带有GFP标记的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP株，然后应用绿色荧光蛋白负筛选技术，获得了表达H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株。该重组病毒免疫鸭后，能抵抗DEV强毒株的攻击，还能诱导较高的H5 HI抗体。此外，也用于免疫鸡，预防H5亚型禽流感。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒，即本发明先构建了一株缺失UL2基因、携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP株，然后应用绿色荧光蛋白负筛选技术，获得了表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株。将重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株制备成活疫苗，可预防水禽鸭瘟和H5亚型禽流感，也可用于预防鸡H5亚型禽流感。
本发明的技术方案
1.一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该毒株为鸭肠炎病毒(Duck enteritisvirus)rDEVΔUL2-H5株，该病毒株已于2017年04月24日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13794.
2.本发明所述一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株的UL2基因内***了H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因。
3.本发明所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该毒株作为疫苗生产毒株用于制备H5亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗，预防水禽H5亚型禽流感和鸭瘟，也可用于预防鸡H5亚型禽流感。
4.本发明所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于是将该株病毒接种长满单层的无特定病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成所述H5亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗。
具体实施方式
1.重组病毒构建
本发明所述的重组病毒为表达H5亚型禽流感病毒HA基因的鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株，该病毒构建方法如下：
(1)载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt(见图1)，由本发明人所在实验室构建、保存。
(2)引物设计
根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物：
表1本发明构建所涉及的相关引物信息
(3)含GFP标记的鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP的构建
1)转移载体pT-UL2-GFP-gpt的构建
以鸭肠炎病毒基因组DNA(AV1221)为PCR扩增模板，以引物UL2-uF、UL2-uR扩增UL2基因的左端1185bp片段。以引物UL2-d、UL2-dR扩增UL2基因的右端1302bp片段。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒pT-UL2u和pT-UL2d。用SalI和HindIII双酶切上述重组质粒，分别回收3800bp和1302bp片段，获得重组质粒pT-UL2ud。将重组质粒pT-UL2ud用SalI酶切，电泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用SalI酶切，电泳回收2.1kb片段，将GFP-gpt表达盒***到pT-UL2ud中，获得转移载体pT-UL2-GFP-gpt。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书，将转移载体pT-UL2-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1～4h；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μL Lipofectamine 2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μL Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5ml M199营养液中，冻融1次后接种6孔板CEF细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVΔUL2-GFP株。
(4)H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5)的构建
1)转移载体pT-UL2-H5的构建
根据GenBank公布的鸭源H5亚型禽流感病毒HA基因序列，人工合成HA基因，两端分别含有酶切位点Nhe I和BamH I。分别用NheI和BamHI双酶切重组质粒pT-UL2-GFP-gpt和HA基因片段，分别回收6.0kb片段和1.7kb片段，并将两片段连接，获得重组转移载体pT-UL2-H5。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H5与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的rDEVΔUL2-GFP，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μL Lipofectamine 2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μL Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察无绿色荧光的蚀斑，挑选单个无荧光蚀斑于0.5ml M199营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得重组病毒并将该病毒命名为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVΔUL2-H5株，该病毒株已于2017年04月24日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.13794。
4)重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5的鉴定
采用H5亚型禽流感病毒F1、R1引物重组毒rDEVΔUL2-H5株和亲本毒进行PCR扩增鉴定，结果显示重组病毒扩增出1700bp左右条带(泳道2)，而亲本毒对照鸭肠炎病毒(AV1221)未扩增出目的条带(泳道3)，表明HA基因成功***到UL2基因内。
5)重组病毒rDEVΔUL2-H5病毒含量测定
重组病毒rDEVΔUL2-H5接种CEF，细胞病变达70％～80％时收获，冻融1次后用CEF测定病毒含量，为105.8TCID50/0.1ml。
(5)动物试验
将30只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组10只。第1组肌肉注射rDEVΔUL2-H5，每只1000TCID50，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID50，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血后，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况。攻毒对照组100％死亡，rDEVΔUL2-H5、DEV亲本毒免疫组均100％保护，均能完全抵抗鸭瘟强毒的攻击。血清测定结果，rDEVΔUL2-H5免疫组血清中H5HI抗体效价几何平均值为1:64，DEV亲本毒免疫组和对照组血清中H5HI抗体效价均低于1:4，说明rDEVΔUL2-H5免疫后具有良好的免疫原性。
将30只3周龄SPF鸡，随机分成3组，每组10只。第1组肌肉注射rDEVΔUL2-H5，每只1000TCID50，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID50，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血、分离血清，测定HI抗体效价，rDEVΔUL2-H5免疫组血清中H5HI抗体效价几何平均值为1:294，DEV亲本毒免疫组和对照组血清中H5HI抗体效价均低于1:2，说明rDEVΔUL2-H5免疫鸡也具有良好的免疫原性。
2.疫苗制备及检验
(1)疫苗制备
1)细胞制备：选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。
2)病毒液的制备：按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒rDEVΔUL2-H5株接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。
3)半成品的检验
①无菌检验：每组分别取样，按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一五年版(三部).中国农业出版社，2016，本发明称《中国兽药典》)的方法规定进行检验，应无菌生长。
②病毒含量测定：每0.1ml病毒含量应≥105.0TCID50。
4)配苗及分装：将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。
5)冻干：分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版，化学工业出版社，2001，437页以下称《规程》)附录中的方法迅速进行冷冻真空干燥。
(2)疫苗检验
本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》的方法进行。
1)性状：淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2)无菌检验：按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
3)支原体检验：按《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。
4)外源病毒检验：按《中国兽药典》进行检验，应无外源病毒污染。
5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60min后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml，同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组应全部出现病变，中和组应不出现细胞病变。
6)安全检验用2～4周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，应全部健活。
7)效力检验
①鸭肠炎病毒部分，下列方法任择其一。
病毒含量测定：按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID50。每羽份病毒含量应≥103.5TCID50。
用鸭检验：用2～8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD鸭瘟病毒强毒(CVCC AV1221)，观察14日。对照鸭应至少4只死亡，免疫鸭应至少8只保护。
②H5亚型禽流感病毒HA蛋白部分，下列方法任择其一。
病毒含量测定：按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察96小时。用间接免疫荧光染色方法检测重组鸭肠炎病毒表达的H5亚型禽流感病毒HA蛋白。对照鸡胚成纤维细胞应无特异性荧光，根据每孔绿色荧光情况，按Reed-Muench法计算FAID50。每羽份病毒含量应≥103.5FAID50。
用鸭检验：用2～8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。21～28日后，每只鸭静脉注射0.1-0.2ml H5亚型禽流感病毒(含108EID50)。攻毒后第1日和第2日，采集每只鸭的喉拭子于1mlPBS溶液(含1万单位双抗)，将同一只鸭两日的喉拭子混合作为1个样品，每个样品经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，在37℃培养5日。每日照蛋1次，及时取出死胚置2～8℃。培养结束时测定死胚、活胚尿囊液的血凝(HA)价,5枚胚中至少1枚鸡胚的胚液的HA价不低于1:16时，判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再判定。免疫鸭应至少由8只病毒分离为阴性，对照鸭应至少有4只病毒分离为阳性。
8)剩余水分测定按《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
9)真空度测定按《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
附图说明
图1含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt示意图。
图2重组病毒rDEVΔUL2-H5株的鉴定电泳图，图中泳道2显示重组病毒扩增出1700bp左右条带；泳道3为亲本毒对照，未扩增出目的条带。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物为：鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)CVCC AV1221株，又名鸭瘟病毒(中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138)保存于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；经分子生物技术，将H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因***到DEV UL2基因内，获得的重组缺失病毒，命名为H5亚型禽流感病毒重组鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVΔUL2-H5株，该株病毒已于2017年04月24日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13794。
本发明的积极意义
本发明涉及H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株的构建及其应用。本发明设计构建了一株重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5，该毒株是表达H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒，可用于制备制备成活疫苗，可预防鸭瘟和鸡、水禽H5亚型禽流感；在构建过程中的缺失UL2基因、携带绿色荧光标记的重组鸭肠炎病毒载体(rDEVΔUL2-GFP)，可通过同源重组的方法，应用该载体表达外源基因，为鸭肠炎病毒作为载体构建抗鸭瘟和其他病原的新型重组疫苗打下基础。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5株)的构建
本发明所述鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5株)的构建方法如下：
(1)载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt(见图1)，由本发明人所在实验室构建、保存。
(2)引物设计
根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物：见表1。
(3)含GFP标记的重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-GFP的构建
1)转移载体pT-UL2-GFP-gpt的构建
以鸭肠炎病毒基因组DNA为PCR扩增模板，以引物UL2-uF和UL2-uR(序列1和序列2)扩增UL2基因的左端1185bp片段。以引物UL2-d和UL2-dR(序列3和序列4)扩增UL2基因的右端1302bp片段。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒pT-UL2u和pT-UL2d。用SalI和HindIII双酶切上述重组质粒，分别回收3800bp和1302bp片段，获得重组质粒pT-UL2ud。将重组质粒pT-UL2ud用SalI酶切，电泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用SalI酶切，电泳回收2.1kb片段，将GFP-gpt表达盒***到pT-UL2ud中，获得转移载体pT-UL2-GFP-gpt。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书，将转移载体pT-UL2-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1～4h；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μL Lipofectamine 2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μL Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5ml M199营养液中，冻融1次后接种6孔板CEF细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得的重组病毒命名为rDEVΔUL2-GFP株。
4)重组病毒rDEVΔUL2-GFP的鉴定
采用ORF C17F、ORF C17R引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，重组病毒缺失了UL2基因，并成功***了GFP标记基因(见图2)。
(4)H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5)的构建
1)转移载体pT-UL2-H5的构建
根据GenBank公布的鸭源H5亚型禽流感病毒HA基因序列，人工合成HA基因，两端分别含有酶切位点Nhe I和BamH I。分别用NheI和BamHI双酶切重组质粒pT-UL2-GFP-gpt和HA基因，分别回收6.0kb片段和1.7kb片段，并将两片段连接，获得重组转移载体pT-UL2-H5。
2)同源重组
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H5与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：
六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的rDEVΔUL2-GFP，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μL Lipofectamine 2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μL Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μL Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d。
3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察无绿色荧光的蚀斑，挑选单个无荧光蚀斑于0.5ml M199营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得重组病毒并将该病毒被命名为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus)rDEVΔUL2-H5株，该株病毒已于2017年04月24日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.13794。
实施例2
——鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5的鉴定
1.采用ORF C17F和ORF C17R(序列4和序列5)引物(见表1)进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，HA基因成功***到UL2基因内。
2.重组病毒rDEVΔUL2-H5病毒含量测定
重组病毒rDEVΔUL2-H5接种CEF，细胞病变达70％～80％时收获，冻融1次后用CEF测定病毒含量，为105.8TCID50/0.1ml。
3.动物试验
将30只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组10只。第1组肌肉注射rDEVΔUL2-H5，每只1000TCID50，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID50，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血后，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况。攻毒对照组100％死亡，免疫100％保护，血清中禽流感病毒H5HI抗体效价几何平均值为1:64，说明重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株具有良好的免疫原性。
实施例3
——疫苗的制备
本发明所提供的制备疫苗的方法，是将重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5)接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞(SPF CEF)，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
1.细胞制备：选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。
2.病毒液的制备：按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5)接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72h，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。
3.半成品的检验
(1)无菌检验：每组分别取样，按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一五年版(三部).中国农业出版社，2016，本发明称《中国兽药典》)的方法进行，应无菌生长。
(2)病毒含量测定：每0.1ml病毒含量≥105.0TCID50。
4.配苗及分装：将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。
5.冻干：分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)附录437页迅速进行冷冻真空干燥。
实施例4
——疫苗检验
本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》)的方法进行。
(1)性状：淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验：按《中国兽药典》进行检验，均无菌生长。
(3)支原体检验：按《中国兽药典》进行检验，均无支原体生长。
(4)外源病毒检验：按《中国兽药典》进行检验，均无外源病毒污染。
(5)鉴别检验：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60min后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组全部出现病变，中和组未出现细胞病变。
(6)安全检验：用21日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，均全部健活。
(7)效力检验
1)鸭肠炎病毒部分
病毒含量测定：每羽份病毒含量为104.4TCID50。
用鸭检验：对照鸭5/5死亡，免疫鸭10/10保护。
2)H5亚型禽流感病毒HA蛋白部分
病毒含量测定：每羽份病毒含量为104.4FAID50。
(8)剩余水分测定：按《中国兽药典》规定方法进行测定，剩余水分为3.1％、3.0％、2.9％、3.0％，符合规定。
(9)真空度测定：按《中国兽药典》规定方法进行测定，均出现紫色辉光，符合规定。
实施例5
——重组病毒rDEVΔUL2-GFP的应用
根据GenBank公布的鸭H5亚型禽流感病毒HA基因序列，人工合成HA基因(序列7)，通过NheI和BamHI***到质粒pT-UL2-GFP-gpt中，获得重组转移载体pT-UL2-H5。
按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H5与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。经蚀斑纯化，获得的重组病毒rDEVΔUL2-H5株。
H5亚型禽流感病毒HA基因序列(序列7)
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 7
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增UL2基因左同源臂的上游引物UL2uF
<400> 1
GCGAATTCTG GCGGACTTGT GTAGTTTGC 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增UL2基因左同源臂的下游引物UL2uR
<400> 2
GCGTCGACGG ATCGCATGTA GACGTTGGT 29
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增UL2基因右同源臂的上游引物UL2dF
<400> 3
ATGTCGACCG CTGGCGCACC ACAAGG 26
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增UL2基因右同源臂的下游引物UL2dR
<400> 3
GCAAGCTTCG AACCGCATTA GGCGACAA 28
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：鉴定用上游引物F1
<400> 5
ATGGAGAAAA TAGTGCTCCT 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：鉴定用下游引物R1
<400> 6
TTAGATGCAA ATTCTGCATT GC 22
<210> 7
<211> 1714
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：H5亚型禽流感病毒HA基因序列
<400> 7
GCTAGCCGCC ACCATGGAGA AAATAGTGCT CCTTCTTGCA ATAGTCAGCC TTGTTAAAAG 060
TGATCAGATT TGCATTGGTT ACCATGCAAA CAACTCGACA GAGCAGGTTG ACACAATAAT 120
GGAAAAGAAC GTCACTGTTA CACATGCCCA AGACATACTG GAAAAGACAC ACAACGGGAA 180
GCTCTGCGAT CTAGATGGAG TGAAGCCTCT GATTTTAAGA GATTGTAGTG TAGCTGGATG 240
GCTCCTCGGA AACCCAATGT GTGACGAATT CATCAATGTG CCGGAATGGT CTTACATAGT 300
GGAGAAGGCC AATCCAGCCA ATGACCTCTG TTACCCAGGG AATTTCAACG ACTATGAAGA 360
ACTGAAACAC CTATTGAGCA GAATAAACCA TTTTGAGAAA ATTCAGATCA TCCCCAAAGA 420
TTCTTGGTCC GATCATGAAG CCTCATCAGG GGTGAGCTCA GCATGTCCAT ACCAGGGAAC 480
GCCCTCCTTT TTCAGAAATG TGGTATGGCT TATCAAAAAG AACAATGCAT ACCCAACAAT 540
AAAGAAAAGC TACAATAATA CCAACCAAGA AGATCTTTTG GTACTGTGGG GGATTCACCA 600
TCCTAATGAT GCGGCAGAGC AGACAAGGCT CTATCAAAAC CCAACCACCT ATATTTCCGT 660
TGGGACATCA ACACTAAACC AGAGATTGGT ACCAAAAATA GCTACTAGAT CCAAAGTAAA 720
CGGGCAAAGT GGAAGGATGG ATTTCTTCTG GACAATTTTA AAACCGAATG ATGCAATCAA 780
CTTCGAGAGT AATGGAAATT TCATTGCTCC AGAATATGCA TACAAAATTG TCAAGAAAGG 840
AGACTCAACA ATTATGAAAA GTGAAGTGGA ATATGGTAAC TGCAACACCA AGTGTCAGAC 900
TCCAATAGGG GCGATAAACT CCAGTATGCC ATTCCACAAC ATACACCCTC TCACCATCGG 960
GGAATGCCCC AAATATGTGA AATCAAACAA ATTAGTCCTT GCGACTGGGC TCAGAAATAG 1020
CCCTCAAGGA GAGACTCGAG GACTATTTGG AGCTATAGCA GGTTTTATAG AGGGAGGATG 1080
GCAGGGAATG GTAGATGGTT GGTATGGGTA CCACCATAGC AATGAGCAGG GGAGTGGGTA 1140
CGCTGCAGAC AAAGAATCCA CTCAAAAGGC AATAGATGGA GTCACCAATA AGGTCAACTC 1200
GATCATTGAC AAAATGAACA CTCAGTTTGA GGCCGTTGGA AGGGAATTTA ATAACTTAGA 1260
AAGGAGAATA GAGAATTTAA ACAAGAAGAT GGAAGACGGA TTCCTAGATG TCTGGACTTA 1320
TAATGCTGAA CTTCTGGTTC TCATGGAAAA TGAGAGAACT CTAGACTTCC ATGACTCAAA 1380
TGTCAAGAAC CTTTACGACA AGGTCCGACT ACAGCTTAGG GATAATGCAA AGGAGCTGGG 1440
TAACGGTTGT TTCGAGTTCT ATCACAAATG TGATAATGAA TGTATGGAAA GTGTAAGAAA 1500
CGGAACGTAT GACTACCCGC AGTATTCAGA AGAAGCAAGA TTAAAAAGAG AGGAAATAAG 1560
TGGAGTAAAA TTGGAATCAA TAGGAACTTA CCAAATACTG TCAATTTATT CAACAGTGGC 1620
GAGTTCCCTA GCACTGGCAA TCATGGTGGC TGGTCTATCT TTATGGATGT GCTCCAATGG 1680
GTCGTTACAA TGCAGAATTT GCATCTAAGG ATCC 1714
2

Claims (4)

1.一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该毒株为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus)rDEVΔUL2-H5株，该病毒株已于2017年04月24日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13794。
2.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株的UL2基因内***了H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因。
3.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该毒株作为疫苗生产毒株用于制备H5亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗，预防水禽H5亚型禽流感和鸭瘟，也可用于预防鸡H5亚型禽流感。
4.如权利要求3所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于是将该株病毒接种长满单层的无特定病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成所述H5亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗。
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