CN106928354A

CN106928354A - 抗IL‑1β单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN106928354A
Application number: CN201710276999.6A
Authority: CN
Inventors: 冯晓; 王涛; 金磊; 秦锁富; 陈宇珩
Original assignee: JINSAI DRUG CO Ltd CHANGCHUN
Current assignee: JINSAI DRUG CO Ltd CHANGCHUN; Changchun Genescience Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN106928354B

Abstract

本发明抗体药物技术领域，公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的全人源抗人IL‑1β单克隆抗体，并公开了编码该单克隆抗体的DNA分子、包含编码该单克隆抗体的DNA分子表达载体、宿主细胞及用途。本发明所述抗IL‑1β单克隆抗体能够阻断人IL‑1β与人IL‑1R的结合；进一步通过结合IL‑1β，阻断IL‑1β和其受体信号通路的可以降低非必要的IL‑lβ最初因诱导发热、扩增淋巴细胞相应和刺激急性期应答。本发明所述抗IL‑1β单克隆抗体可用于检测IL‑1β表达，同时用于冷吡啉相关周期性综合征的预防和治疗。

Description

抗IL-1β单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及全人源抗IL-1β单克隆抗体及其应用。

背景技术

白细胞介素1β(IL-1β)是一种主要由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子和多肽调节因子，在细胞免疫激活中发挥调节作用。IL-1β，含153个氨基酸，其理论分子量为17.5KD。IL-1β，不含有二硫键，但两个半胱氨酸(Cys)残基是IL-1β活性所必需的。

IL-1β具有很强的生物学活性，包括：(1)介导炎症反应：IL-1β不仅本身能够引起炎症反应，而且可以诱导环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、iNOS、IL-6等其他炎症因子的表达，从而进一步激活基质细胞和免疫细胞产生更多的IL-1β参与炎症反应；(2)免疫调节作用，协同刺激T细胞，诱导许多细胞产生其他淋巴因子；(3)参与恶液质的形成，有致负氮平衡的效应，可以刺激骨骼肌分解蛋白质；(4)诱导急性时相蛋白参与急性期反应；(5)诱导成纤维细胞增殖等。

IL-1β可以和效应细胞上的IL-1RA受体结合，并且快速引起下游信号传导，在不同细胞类型，如：单核细胞，巨噬细胞，上皮细胞，血管内皮细胞，软骨细胞，成纤维细胞中多达数百个基因的表达，诱导机体的炎症反应。研究认为，IL-1β为机体中一种促炎因子，它的产生给机体带来的弊大于利，IL-1β非正常表达也是一些疾病的典型特征，其异常表达可能导致机体正常组织病变及破坏。

人体正常的免疫***处于平衡状态，在此平衡状态中，促炎性和抗炎性的细胞及分子被调节来促使机体在不破坏自身组织的条件下进行正常的免疫防御。一旦这种调节的平衡被打破，非特异性刺激和活化可导致大量有效的破坏性免疫分子和炎症分子生成和释放。过量产生促炎细胞因子或在错误的生物学背景下细胞因子的产生与大量疾病的发病率和死亡率密切相关。

IL-lβ参与多种生物途径，是种有效分子，能够通过触发细胞少至一或两个受体来起作用。IL-lβ作为一种信号分子，能够在非常低的浓度，甚至微摩尔级别下起作用。IL-lβ最初因诱导发热、扩增淋巴细胞相应和刺激急性期应答被人们所认知。IL-lβ在感染时能够诱导炎症反应。IL-1β为一种致炎细胞因子，广泛参与了人体组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程。它可促进β防御素-4的生成，但总体上，破坏大于防御。如青少年全身特发性关节炎(sJIA)是由白介素-1β介导的自身炎症性疾病。

卡那单抗(canakinumab)是一可快速和选择性阻滞IL-1β的全人单抗，2009年6月经FDA批准上市，用于治疗儿童和成人冷吡啉相关周期性综合征(cryopyrin-associatedperiodic syndrome,CAPS)，包括并限于家族性寒冷型自身炎症性综合征(famil-ial coldauto-inflammatory syndrome,FCAS)与穆-韦综合征(Muckle-Wells syndrome,MWS)。卡那单抗与秋水仙碱相比减少了48％-75％的痛风发作，与曲安奈德相比其可有效地缓解疼痛，痛风发作率下降94％，但此药有较高的不良反应发生率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供全人源抗IL-1β单克隆抗体、编码该单克隆抗体的核苷酸分子、载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子作为药物用于临床上由于IL-1β异常表达所导致的适应症的使用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的抗IL-1β单克隆抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：

(Ⅰ)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:1-6任一项所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；

和/或

(Ⅱ)所述轻链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No:7-12任一项所示；者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

优选的，所述取代、缺失或添加多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

优选的，所述抗IL-1β单克隆抗体，其具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：

(ⅰ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

(ⅱ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

(ⅲ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

(ⅳ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

(Ⅴ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

(Ⅵ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

优选的，本发明所述抗IL-1β单克隆抗体，其重链类型为IgG1、IgG2、IgG3或Ig4。更优选为IgG4。

优选的，本发明所述抗IL-1β单克隆抗体，其轻链类型为κ或λ。更优选为λ。

本发明所述的单克隆抗体不仅包括可变区，还包括恒定区。优选的，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种。

本发明还提供了编码所述抗IL-1β单克隆抗体的DNA分子。

优选的，所述DNA分子具有

(Ⅰ)如SEQ ID NO:13-18任一项所示的重链可变区的核苷酸序列；或者因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)的核苷酸序列不同的序列；

和/或

(Ⅱ)如SEQ ID No:7-12任一项所示的轻链可变区的核苷酸序列；或者因遗传密码的简并性而与(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列。

本发明还提供了一种表达载体，包括编码所述抗IL-1β单克隆抗体的DNA分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞经由上述的表达载体转化或转染而来，为原核细胞或真核细胞。

本发明还提供了一种抗原，具有如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的所述抗IL-1β单克隆抗体。

优选的，所述化学标记为同位素标记、免疫毒素标记和/或化学药物标记；所述生物标记为生物素标记、亲和素标记或酶标记。

本发明还提供了一种偶联物，其由所述抗IL-1β单克隆抗体和/或所述结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述抗人IL-1β单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了所述抗IL-1β单克隆抗体、所述结合物和/或所述偶联物在制备检测IL-1β表达的产品中的应用。

进一步，本发明还提供了一种试剂盒，包含所述抗IL-1β单克隆抗体、所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了所述抗IL-1β单克隆抗体、所述结合物和/或所述偶联物在制备阻断IL-1β与IL-1RA结合的制剂中的应用。

本发明还提供了所述抗IL-1β单克隆抗体、所述结合物和/或所述偶联物在制备预防或治疗冷吡啉相关周期性综合征的药物中的应用。

优选的，所述冷吡啉相关周期性综合征为家族性寒冷型自身炎症性综合征与穆-韦综合征、肿瘤坏死因子受体相关性周期发热综合征、高免疫球蛋白D综合征/甲羟戊酸激酶缺乏症和/或家族性地中海热。

本发明公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的全人源抗人IL-1β单克隆抗体，并公开了编码该单克隆抗体的DNA分子、包含编码该单克隆抗体的DNA分子表达载体、宿主细胞及用途。本发明所述抗IL-1β单克隆抗体作为抗IL-1β的新抗体，能够结合人IL-1β、猴IL-1β及鼠IL-1β，且亲和力和特异性优异，可呈剂量依赖性阻断人IL-1β与人IL-1R的结合；结合血液中的IL-1β并剂量依赖性阻断其与细胞表面人IL-1R的结合，有效的抑制IL-1β刺激产生的发热，淋巴细胞反应激增及急性应答反应增加；进一步通过结合IL-1β，阻断IL-1β和其受体信号通路的可以降低非必要的IL-lβ最初因诱导发热、扩增淋巴细胞相应和刺激急性期应答。本发明所述抗IL-1β单克隆抗体可用于检测IL-1β表达，同时用于包括并不限于家族性寒冷型自身炎症性综合征与穆-韦综合征、周期性发热综合征-肿瘤坏死因子受体相关性周期综合征，高免疫球蛋白D综合征/甲羟戊酸激酶缺乏症和家族性地中海热等冷吡啉相关周期性综合征的预防和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 SDS-PAGE电泳检测纯化的人的IL-1β-连接肽-mIgG1Fc和阳性抗体，其中A为SDS-PAGE电泳检测纯化的人的IL-1β-连接肽-mIgG1Fc，泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1：人IL-1β-连接肽-mIgG1Fc(非还原)；泳道2:人IL-1β-连接肽-mIgG1Fc(还原)；B为SDS-PAGE电泳检测阳性抗体(卡那单抗)，泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1：卡那单抗(非还原)；泳道2：卡那单抗(还原)；

图2为噬菌粒载体pCANTAB5E-SF载体图谱；

图3为人PBMC总RNA电泳检测图，其中，泳道M：DNA标记DL2000；泳道1：总RNA；

图4为人VH、VL PCR扩增产物电泳检测图，其中，泳道M：DNA标记DL2000；泳道1～4：人VH PCR扩增产物；泳道5～8：人VL PCR扩增产物；

图5为SDS-PAGE电泳检测纯化的优选6个候选抗体；泳道M:蛋白质分子量标记；泳道1:048Ab-1纯化抗体(还原)；泳道2:048Ab-2纯化抗体(还原)；泳道3:048Ab-3纯化抗体(还原)；泳道4:048Ab-4纯化抗体(还原)；泳道5:048Ab-5纯化抗体(还原)；泳道6：048Ab-6纯化抗体(还原)；泳道7：048Ab-1纯化抗体(非还原)；泳道8：048Ab-2纯化抗体(非还原)；泳道9：048Ab-3纯化抗体(非还原)；泳道10：048Ab-4纯化抗体(非还原)；泳道11：048Ab-5纯化抗体(非还原)；泳道12：048Ab-6纯化抗体(非还原)；

图6为优选6个候选抗体细胞活性检测；6个候选抗体048Ab-1、048Ab-2、048Ab-3、048Ab-4、048Ab-5、048Ab-6的IC₅₀分别为2200pM、2103pM、1254pM、1106pM、7343pM、2597pM；

图7为优选抗体048Ab-4进行动物体内药效检测；048Ab-4能在小鼠体内显著抑制由IL-1β诱导的mIL-6表达，表达量由1411±428.3pg/mL降到了34.13±9.93pg/mL。

具体实施方式

本发明公开了抗IL-1β单克隆抗体及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。

“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。

本发明通过噬菌体展示技术筛选针对IL-1β的人源化抗体，并利用基因工程方法得到完整抗体，从而提供用于治疗IL-1β异常表达所导致的相关疾病的药物。

具体抗IL-1β单克隆抗体的制备及相关检测方法如下：构建IL-1β全人源抗体库，包括噬菌体展示载体的优化改造、PBMC细胞的分离、RNA抽提、cDNA反转录以及抗体基因的扩增和酶切、连接、电转等；筛选抗体，包括抗原制备、噬菌体展示筛选、ELISA筛选等；构建全长抗体，表达，纯化，以及亲和力测定，细胞活性测定等。

和/或

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗IL-1β单克隆抗体具有：

(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:7的轻链可变区；或

(2)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:8的轻链可变区；或

(3)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:9的轻链可变区；或

(4)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:10的轻链可变区；或

(5)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:11的轻链可变区；或

(6)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:12的轻链可变区。

具体的，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。

具体的，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:10所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:11所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

或，抗IL-1β的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:12所示。

本发明提供的抗IL-1β单克隆抗体能够结合人IL-1β及猴IL-1β。在某些实施方案中，抗体与其靶点之间的亲和力用Ka、Kd(解离常数)、KD(平衡解离常数)来表征，本发明提供抗IL-1β单克隆抗体的KD值不高于1.76nM。

本发明提供的抗IL-1β单克隆抗体能够中和IL-1β后，使得含有IL-1受体的人肺纤维细胞MRC-5，由IL-1β诱导IL-6的表达降低，其抑制的IC50值不高于7343pM。

本发明提供的抗IL-1β单克隆抗体还能够抑制人源IL-1β(R&D system)激活小鼠体内IL-6的表达，能在每只老鼠注射75ng IL-1β后，能显著显著抑制mIL-6表达，mIL-6表达量由1411±428.3pg/mL降到了34.13±9.93pg/mL。

本发明提供的抗IL-1β单克隆抗体中有6个抗IL-1β单克隆抗体与人IL-1β、猴IL-1β具有良好的亲和力，能够阻断IL-1β与IL-1R的结合，降低非必要的IL-lβ最初因诱导发热、扩增淋巴细胞相应和刺激急性期应答。6个抗IL-1β单克隆抗体分别命名为048Ab-1、048Ab-2、048Ab-3、048Ab-4、048Ab-5、048Ab-6，具体具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：

(ⅰ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示(H1L4，命名为048Ab-1)；

(ⅱ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示(H1L5，命名为048Ab-2)；

(ⅲ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示(H2L5，命名为048Ab-3)；

(ⅳ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示(H2L6，命名为048Ab-4)；

(Ⅴ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示(H3L6，命名为048Ab-5)；

(Ⅵ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示(H4L5，命名为048Ab-6)。

其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQNO:12所示的抗IL-1β单克隆抗体048Ab-4(H2L6)阻断IL-1β与IL-1R的结合的效果最佳，能中和IL-1β后，使得含有IL-1受体的人肺纤维细胞MRC-5，由IL-1β诱导IL-6的表达降低，其抑制的IC50值低至1106Pm,在小鼠体内能显著抑制由人IL-1β诱导mIL-6表达，表达量由1411±428.3pg/mL降到了34.13±9.93pg/mL。

本发明所述抗IL-1β单克隆抗体，其重链类型优选为IgG1、IgG2、IgG3或Ig4。更优选为IgG4。

本发明所述抗IL-1β单克隆抗体，其轻链类型优选为κ或λ。更优选为λ。

本发明所述的单克隆抗体是全人源的。

本发明还提供了编码所述抗IL-1β单克隆抗体的DNA分子。

优选的，所述DNA分子具有

和/或

其中，所述化学标记包括但不限于同位素、免疫毒素、化学药物。

优选的，所述免疫毒素为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。

所述生物标记包括但不限于生物素、亲和素或酶标记。

优选的，所述酶标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

优选的，所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述抗人VEGFR2单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物。

在一些实施方案中，所述试剂盒，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。

在一些实施方案中，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，所述洗涤液中包括PBS、Tween、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中至少一种。

在一些实施方案中，所述封闭液中包括PBS和BSA中至少一种。

在一些实施方案中，所述显色液包括TMB溶液、底物缓冲液和终止液中至少一种。

其中，在一些实施方案中，所述底物缓冲液包括柠檬酸和磷酸氢二钠，所述终止液为过氧化氢水溶液。

进一步，在一些实施方案中，所述试剂盒还包括PBS、羊抗鼠IgG Fc和TITC二抗。

本发明所述阻断IL-1β与IL-1RA结合的制剂和预防或治疗冷吡啉相关周期性综合征的药物可以为注射液或注射粉针剂。本领域技术人员可将抗IL-1β单克隆抗体、所述结合物和/或所述偶联物按照现有技术加入制备注射液或注射粉针剂时所需的药学上可接受的各种常用辅料制成注射液或注射粉针剂。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂及仪器均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1抗原蛋白的制备

1、抗原及阳性抗体基因合成及表达载体构建：

融合人源IL-1β成熟蛋白氨基酸序列与连接肽-mIgG1Fc的氨基酸序列设计如SEQID NO:25所示。融合人源IL-1β成熟蛋白氨基酸序列与连接肽-6his氨基酸序列设计如SEQID NO:26所示。

上述设计的人IL-1β成熟蛋白融合蛋白(IL-1β-连接肽-mIgG1Fc或IL-1β-连接肽-6his)所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，密码子优化后的序列如SEQ ID NO:27或28在5’端加上Hind Ⅲ酶切位点和Kozak序列GCCGCCACC，3’端加上终止密码子TAG和EcoR I酶切位点，并委托苏州泓迅公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(苏州泓迅公司提供)载体中，获得人pUC57simple-IL-1β-连接肽-mIgG1Fc和pUC57simple-IL-1β-连接肽-6his质粒。

酶切(HindⅢ和EcoR I)人的质粒pUC57simple-IL-1β-连接肽-mIgG1Fc、pUC57simple-IL-1β-连接肽-6his和载体pGS003，电泳回收得到的融合基因片段IL-1β-连接肽-mIgG1Fc和IL-1β-连接肽-6his，并与pGS003载体进行连接反应重组构建获得表达质粒：pGS003-人IL-1β-连接肽-mIgG1Fc和pGS003-人IL-1β-连接肽-6his。

阳性抗体基因合成及表达载体构建：

pAb抗体序列如下：PABH，如SEQ ID NO:29所示；PABL，如SEQ ID NO:30所示。

将上述的抗体序列所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，在5’端加上HindⅢ酶切位点和Kozak序列GCCGCCACC，3’端加上终止密码子TAG和EcoR I酶切位点，并委托金斯瑞公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL质粒，将质粒pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL进行酶切后(HindⅢ和EcoR I)，电泳回收得到的基因片段PCABH和PCABL，并与pGS003载体进行连接反应重组构建获得pGS003-PCABH和pGS003-PCABL。

2、瞬转表达

对pGS003-PCABH、pGS003-PCABL、pGS003-人IL-1β-连接肽-mIgG1Fc和pGS003-人IL-1β-连接肽-6his进行瞬时表达。

使用FreeStyle^TM 293F细胞在Freestyle培养基中进行瞬转表达。转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种0.6×10⁶细胞/ml的293F细胞，37℃5％CO₂温箱中130rpm摇床培养。转染时先取30μl的293fectin加入到1ml的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育5分钟；同时将重组载体和293fectin按1:1的比例，即1μl 293fectin对应加1μg质粒，取总DNA的量为30μg，溶于1ml的OPtiMEM中。然后将DNA稀释液和293fectin稀释液充分混合，总体积为2ml，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞培养孔中，混匀，37℃5％CO₂温箱中130rpm摇床培养7天。将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤。

3、蛋白纯化

根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱(蛋白纯化液相色谱***/AKTAPurifier 100,GE)进行纯化，得到纯化的人IL-1β-mIgG1Fc融合蛋白。AKTA用超纯水冲洗干净连接1ml rProtianA Fast Flow预装柱到AKTA上。清洗：用1M HAC清洗5个柱体积。平衡：20mM PB 0.15M NaCl(pH 7.0)平衡5个柱体积。

上样：将细胞表达上清样品1000rpm×5min离心，取上清，8000rpm×30min离心，取20ml离心后上清上样，流速0.2ml/min。平衡：20mM PB 0.15M NaCl(pH 7.0)平衡5个柱体积，0.2ml/min。清洗：20mM PB 1M NaCl(pH 7.0)清洗5个柱体积。平衡：20mM PB 0.15MNaCl(pH 7.0)平衡5个柱体积。

洗脱：20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱，流速0.2ml/min。UV280至100mAu时开始收集，降至100mAu时停止收集。用1M Tris将样品pH调节至pH6～8，SDS-PAGE电泳检测，结果如图1。

实施例2：天然人源单链抗体噬菌体展示文库的构建

1、噬菌粒载体的构建

选择pCANTAB5E作为噬菌体展示载体，根据克隆及噬菌体展示需要进行载体改造，改造结果如图2。将SfiI-NcoI-XhoI+Linker+NheI-NotI序列(SEQ ID NO:31)进行基因合成，然后用SfiI和NotI进行酶切，并与pCANTAB5E载体进行连接反应重组构建获得改造后载体pCANTAB5E-SF。

2、PBMC分离及mRNA抽提

无菌抽取健康志愿者新鲜外周血，使用淋巴细胞分离液(GE)分离出其中的淋巴细胞，用Invitrogen公司的 reagent(15596-026)提取100×10⁶个细胞的总RNA，结果如图3所示。

3、抗体库引物设计、合成及RT-PCR

根据Kabat、V-base2及IMGT网站公布的抗体基因序列信息，设计用于扩增人抗体重链和轻链的引物以及正确的酶切位点，苏州泓迅生物科技有限公司合成引物，PAGE纯化，引物序列见表1和表2：

表1扩增重链可变区的引物

R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T

表2扩增轻链可变区的引物

引物名称	序列(5’→3’)
		h-k_F1	ggtggcggtggtagtgctagcGAWAYWGTGATGACMCAGYMTC
h-k_F2	ggtggcggtggtagtgctagcGAAGTTATGTTGATGCAGTCTCT
		h-k_F3	ggtggcggtggtagtgctagcGAWGTTGTGMTGACAYRGTC
h-k_F4	ggtggcggtggtagtgctagcRHCATCYRGATGACCCAGTCTSCA
		h-k_F5	ggtggcggtggtagtgctagcRACATCCAGATGAATTCAGTCTCC
h-k_F6	ggtggcggtggtagtgctagcGAMATYGTRHTGACMCAGTCTCCA
		h-k_F7	ggtggcggtggtagtgctagcRATWTCCAGATGACYCAGTCTCCA
h-k_F8	ggtggcggtggtagtgctagcGATRTTGTGATGACTSAGYCTCCA
		h-k_F9	ggtggcggtggtagtgctagcGAAATWGTGWTGAYGCAGTCTCCA
h-k_F10	ggtggcggtggtagtgctagcGAAACGACACTCACGCAGTCTCCA
		h-k_F11	ggtggcggtggtagtgctagcGAMATTSTGYTGACHCAGWCTCCA
h-k_F12	ggtggcggtggtagtgctagcGABAYTGTGATSRCCCAGACTCCA
		h-k_F13	ggtggcggtggtagtgctagcRMCATCCAGDTGAYBCAGYCTCC
h-k_F14	ggtggcggtggtagtgctagcGATGCTGYGAWGACCCAACCTCCA
		h-k_R1	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTGATHTCCASYTTGGTCCCH
h-k_R2	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCT
		h-λ_F1	ggtggcggtggtagtgctagcCAGYCTGYKCTGACYCAGV
h-λ_F2	ggtggcggtggtagtgctagcCAGGCAGGGCWGACTCAGCMMC
		h-λ_F3	ggtggcggtggtagtgctagcCAGCYTGTGCTGACTCARTCRYCC
h-λ_F4	ggtggcggtggtagtgctagcCACGTTATACTGACTCAACCGCCC
		h-λ_F5	ggtggcggtggtagtgctagcCRGCCYGTGCTGACTCARCYGCC
h-λ_F6	ggtggcggtggtagtgctagcCTGSCTGTGCTRACTCAGGCCCC
		h-λ_F7	ggtggcggtggtagtgctagcCAGBCTGTGCTGACTCAGCCR
h-λ_F8	ggtggcggtggtagtgctagcCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC
		h-λ_F9	ggtggcggtggtagtgctagcCAGDCTGTGRTGACYCAGGARCC
h-λ_F10	ggtggcggtggtagtgctagcCARTCTGCCCTGAYTCAGCCTS
		h-λ_R1	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCKAGGACGGTSACCTTGGTSCCAST
h-λ_R2	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTAGGACGGTCAGCTCSGTCCCCTC
		h-λ_R3	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCKAGGRCGGTCAGCTKGGTSCCTCC
h-λ_R4	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCC

采用Takara公司的PrimeScript^TM II第一链cDNA合成试剂盒(6210A)中的OligodT引物，以从PBMC中抽提的总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，使用上述表1和表2的引物通过PCR技术扩增得到抗体基因的重链可变区VH和轻链可变区VL，PCR扩增的条件为95℃5min，按下列参数循环25次：95℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸3min。扩增完成后电泳检测，见图4。

4、人源VH和VL单链抗体库的构建

先将VL通过NheI和NotI克隆到pCANTAB5E-SF载体上，然后将VH通过NcoI和XhoI克隆到上一步的载体上。具体操作如下：

将pCANTAB5E-SF载体及扩增纯化好的人轻链可变区PCR产物用NheI和NotI进行酶切。将酶切好的4.4μg载体与1μg片段进行连接，连接产物经纯化后电转到10支200μl TG1电转感受态细胞(2.5kV，2cm规格电击杯)中，加入SOC后37℃培养1h，取少量复苏菌梯度稀释涂平板计算库容，剩余菌液涂布到10个Φ15cm平板上，过夜培养；第二天计算库容量为2.02×10⁸单个克隆，用50ml 2YT刮洗Φ15cm平板获取轻链抗体库，取部分菌液制备小提质粒，剩余文库菌液加入终浓度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。

将上述轻链抗体库质粒及扩增纯化好的人重链可变区PCR产物用NcoI和XhoI进行酶切。将酶切好的5.8μg载体与1.2μg片段进行连接，连接产物经纯化后电转到20支200μlTG1电转感受态细胞(2.5kV，2cm规格电击杯)中，加入SOC后37℃培养1h，取部分复苏菌梯度稀释涂平板计算库容，剩余菌液涂布到20个Φ15cm平板上，过夜培养；第二天计算库容量为5.31×10⁸单个克隆，用50ml 2YT刮洗Φ15cm平板获取人源VH和VL单链抗体库，取部分菌液制备小提质粒，剩余文库菌液加入终浓度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。

实施例3：人源抗体库的噬菌体展示及筛选

1、抗体库的噬菌体展示和淘选

取100倍库容量的上述人源VH和VL单链抗体库菌液接种880ml 2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，侵染1.5h，离心收集菌体，用400ml 2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、200rpm培养过夜。

将上一步培养物10000g、4℃离心20min，收集上清加入1/4体积的PEG/NaCl，混匀，冰上静置1h；12000g、4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用2ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g、4℃离心10min；转移上清到新的15ml离心管中，加入终浓度为3％BSA，即获得第一轮起始噬菌体。以IL-1β-His为抗原包被免疫管，采用2％的M-PBS封闭；然后加入10¹³的第一轮起始噬菌体进行抗体抗原结合，用PBST洗去未结合的噬菌体，用1ml Glycine-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体，将洗脱下来的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。

2、单克隆的诱导表达及ELISA筛选

将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝0.5～0.6，3000g离心收集菌体，用2YT-AI培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，加入终浓度为3％BSA，获得单克隆噬菌体样品。

以IL-1β-His为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆噬菌体样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗体PBS稀释液50μl，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μl TMB显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl 1M H₂SO₄终止显色；使用酶标仪测定OD450值。依据单克隆噬菌体ELISA数据选定860个ELISA测定阳性样品，进行竞争性ELISA筛选，将阳性对照抗体稀释至200μg/ml，取50μl稀释液与50μl单克隆噬菌体样品混合后，进行上面步骤的ELISA，结果显示其中有18个单克隆与阳性对照抗体存在表位竞争，选定这些克隆进行测序；取上述在96孔板深孔板2YT-AG培养基中的过夜培养菌液，进行测序分析，最终获得独特的单克隆抗体的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～12所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:13～24。

实施例4：全长抗体制备

1、全长抗体瞬时转染表达载体的构建

分别选择pGS003-hIgG4CH和pGS003-hIgλCL作为构建抗人IL-1β全长抗体的重链和轻链的表达载体，其中hIgG4CH和hIgλCL已提前构建到pGS003载体中。根据VH、VL的基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。经PCR扩增后，使用体外重组的方法(苏州泓迅，iMulli多片段重组克隆试剂盒)将6个VH和6个VL抗体基因分别克隆到pGS003-hIgG4CH和pGS003-hIgλCL，如表3。测序鉴定抗体基因正确***后，将重组表达载体转化大肠杆菌TOP10F’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时。使用Zymo Research的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和OD260/280。OD260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒DNA。

表3重链和轻链瞬时转染表达载体列表

重链表达载体名称	重链可变区序列	轻链表达载体名称	轻链可变区序列
				H1	SEQ NO:1	L1	SEQ NO:7
H2	SEQ NO:2	L2	SEQ NO:8
				H3	SEQ NO:3	L3	SEQ NO:9
H4	SEQ NO:4	L4	SEQ NO:10
				H5	SEQ NO:5	L5	SEQ NO:11
H6	SEQ NO:6	L6	SEQ NO:12

2、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测

将上述6个重链表达载体和6个轻链表达载体两两组合(共36种组合)后进行2ml293E体系的瞬时转染表达评估，检测表达量及抗体与IL-1β结合的ELISA检测值，结果见表4。根据表达量及抗体与IL-1β结合的ELISA检测值，选择相对低的EC50值、相对高的ELISARmax值，优选H1L4、H1L5、H2L5、H2L6、H3L6、H4L5这6个全长抗体，命名为048Ab-1、048Ab-2、048Ab-3、048Ab-4、048Ab-5、048Ab-6。

表4 6×6组合全长抗体小体系瞬时转染表达的表达量、EC50值及ELISA Rmax值

使用293E在Freestyle培养基中进行6个优选抗体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞300ml，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各150μg使用OPtiMEM稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养7天。

3、抗体的纯化及检测

2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，用Octet检测上清中抗体表达量，见表5。

表5 6个优选抗体300ml瞬时转染表达的表达量检测

抗体名称	重链序列	轻链序列	瞬时转染表达量(mg/L)
				048Ab-1	SEQ NO:1	SEQ NO:10	115.9
048Ab-2	SEQ NO:1	SEQ NO:11	186.8
				048Ab-3	SEQ NO:2	SEQ NO:11	171.2
048Ab-4	SEQ NO:2	SEQ NO:12	232.7
				048Ab-5	SEQ NO:3	SEQ NO:12	184.6
048Ab-6	SEQ NO:4	SEQ NO:11	38.5

将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过MabSelect SuRe亲和层析柱(GE)，20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性，加入10xPBS调节成等渗溶液。4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图5泳道7～12。取纯化后抗体，采用还原条件的SDS-PAGE分析纯化产物，鉴定了抗体的性质和纯度，还原条件下重链为50KD，轻链为25KD，结果如图5泳道1～6。

实施例5：优选抗体亲和力测定

使用Biacore T200仪器检测抗IL-1β全长抗体的亲和力。具体方法如下：使用GEHealthcare公司的人抗体捕获试剂盒将人的抗体偶联在CM5生物传感芯片(GE Healthcare公司)上，芯片上的抗人Fc抗体捕获候选抗体或阳性对照，不同浓度的人IL-1β以30μl/min流速流过芯片上的候选抗体，人IL-1β与候选抗体进行结合，结合时间为120S，解离时间为300S。用BIAevalution软件(GE Healthcare公司)进行动力学拟合，获得亲和力常数结果如下表6，结果表明6个优选抗体均与人IL-1β有良好的结合活性。

表6候选抗体与人IL-1β的亲和力测定结果

抗体名称	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				048Ab-1	5.93E+04	7.66E-05	1.29E-09
048Ab-2	5.75E+04	6.04E-05	1.05E-09
				048Ab-3	5.68E+04	5.92E-05	1.04E-09
048Ab-4	4.84E+04	7.15E-05	1.48E-09
				048Ab-5	5.51E+04	9.67E-05	1.76E-09
048Ab-6	4.90E+04	6.00E-05	1.23E-09
				阳性对照(卡那单抗)	2.23E+04	1.02E-04	4.56E-09

阳性对照为抗IL-1β的卡那单抗。

实施例6：优选抗体细胞活性检测

人肺纤维细胞MRC-5含有IL-1受体，被IL-1β识别并激活，诱导IL-6的表达。IL-1β抗体中和IL-1β后，IL-6表达降低，因此通过检测IL-6的表达量来评估IL-1β抗体的活性。在96孔板每孔接种5000MRC-5细胞，于37℃、5％CO₂培养过夜后，4nM IL-1β(R&D system)刺激24h，IL-6ELISA试剂盒(R&D system)检测上清IL-6水平。对照和刺激组IL-6蛋白量分别是47.16±18.91和10571±174pg/mL。用50nM IL-1β抗体处理几乎完全抑制了IL-1β诱导IL-6表达，IL-1β抗体中和后IL-6表达＜1％，(图6A)。对于优选的6个候选抗体，使用50nM至0.0025nM 3倍稀释10个梯度产生剂量反应曲线，从该6个候选抗体的曲线计算该IL-1β抗体活性IC₅₀(图6B)，结果显示，6个候选抗体的IC₅₀分别为2200pM，2103pM，1254pM,1106pM,7343pM，2597pM，都显示了良好的中合活性，根据细胞活性结果选择048Ab-4进行动物体内活性检测。

实施例7：小鼠体内IL-1β抗体活性检测:

人源IL-1β(R&D system)能够激活小鼠体内IL-6的表达，IL-1β抗体中和IL-1β降低mIL-6的表达。mIL-6的表达量变化反应IL-1β抗体活性高低。选用8周龄、体重18-20g的BALB/C雌鼠，每组7只，实验组每只鼠腹腔注射75ng IL-1β，随后立即尾静脉注射75μg IL-1β抗体，2h后摘眼球取血，分离血清，用鼠源IL-6ELISA试剂盒(R&D system)检测血清中mIL-6的表达。根据细胞活性结果选择最优的048Ab-4进行动物体内活性检测，注射IL-1β抗体048Ab-4显著抑制mIL-6表达(图7)，mIL-6表达量由1411±428.3pg/mL降到了34.13±9.93pg/Ml，表明IL-1β抗体具有很高体内生物活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 长春金赛药业有限责任公司

<120> 抗IL-1β单克隆抗体及其应用

<130> MP1705733

<160> 31

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Leu Ile Arg Gly Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Asn Arg Glu Val Glu Tyr Cys Lys Ser Ser Gln Asn Tyr Cys

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Leu Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Gly Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Asn Arg Glu Val Glu Tyr Cys Arg Ser Ser Glu Asn Tyr Cys

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ser Arg Gly Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Ser Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Asn Arg Glu Val Glu Phe Cys Arg Ser Pro Glu Asn Tyr Cys

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Leu Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Arg Gly Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Ala Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Thr Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Asn Arg Glu Val Glu Tyr Cys Lys Ser Pro Glu Asn Tyr Cys

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Thr Arg Gly Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Ser Val Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Asn Arg Glu Val Glu Tyr Cys Lys Ser Pro Gln Asn Tyr Cys

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Glu Tyr

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Arg Gly Lys Ala Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Arg Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Arg Met Asn Gly Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Asn Arg Glu Val Glu Tyr Cys Lys Ser Pro Glu Asn Tyr Cys

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Met Gly Asp Lys Phe Ala

20 25 30

Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Thr Lys Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ala Trp Asp Asn Ser Ser Val Ile

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Leu Gly Asp Lys Phe Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ile Met Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ala Trp Asp Asn Asn Ser Val Ile

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Met Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ile Lys Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ala Trp Asp Ser Asn Ser Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Leu Gly Asp Lys Phe Ala

20 25 30

Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ile Lys Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys His Ala Trp Asp Ser Asn Thr Val Ile

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Arg Met Gly Asp Lys Phe Ala

20 25 30

Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ile Lys Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ala Trp Asp Ser Asn Ser Val Ile

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 12

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala

20 25 30

Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Asn Thr Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 13

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaggc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt caccttaggt gattatacca tgaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggtttg atcagaggca aagcctatgg tgggagcagc 180

gaatacgccg cgtctgtgaa agatagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240

gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaataga 300

gaggtagagt attgcaaatc gtcgcaaaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 384

<210> 14

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt cacctttggt gattatgctt tgaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggtttc attagaggca aagcctatgg tgggacaaca 180

gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240

gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaataga 300

gaggtagagt attgcaggtc gtccgagaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 384

<210> 15

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt caccttaggt gattatgcca tgaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggttcg agcagaggca aagcctatgg tgggaccagc 180

gaatacgccg cgtctgcgaa aggtagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240

gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaatagg 300

gaggtagagt tttgcagatc gccggaaaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 384

<210> 16

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt caccttaggt gattatgcca tgaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggttcg atcagaggca aggcctatgg tgggagcagc 180

gaatacgccg cgtctgcgat aggtagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240

acctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaataga 300

gaggtagagt attgcaaatc gccggaaaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 384

<210> 17

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt cacctttggt gattatgcca tgaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggttcc accagaggca aagcctatgg tgggagcagc 180

gtatacgccg cgtctgcgaa aggtagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240

gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaataga 300

gaggtagagt attgcaaatc gccgcaaaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 384

<210> 18

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt cacctttggt gaatatgcca taaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggttcc atcagaggca aagcctatgg tgggagcagc 180

gaatacgccg cgtctgcgaa aggtagattc accatctcaa gagatgattc caaaaggatc 240

gcctatctgc gaatgaacgg cctgaaaacc gaagacacag ccgtgtatta ctgtaataga 300

gaggtagagt attgcaaatc gccggaaaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 384

<210> 19

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcctatgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagatagaat gggggataaa tttgctggct ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat accaagcggc ccaccgggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actattactg tcacgcgtgg gacaacagca gcgtgatttt cggcggaggg 300

accaagctga ccgtccta 318

<210> 20

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcctatgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagatagact gggggataaa tttgctagct ggtatcggca gaagccaggc 120

cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat atcatgcggc ccagcgggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactccgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actattactg tcacgcgtgg gacaacaaca gcgtgatttt cggcggaggg 300

accaagctga ccgtccta 318

<210> 21

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tcctatgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagatagaat gggggataaa tatgctggct ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat atcaagcggc ccaccgggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actattactg tcacgcgtgg gacagcaaca gcgtggtttt cggcggaggg 300

accaagctga ccgtccta 318

<210> 22

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcctatgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagatagact gggggataaa tttgctggct ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat atcaagcggc ccaccgggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg agtattactg tcacgcgtgg gacagcaaca ccgtgatttt cggcggaggg 300

accaagctga ccgtccta 318

<210> 23

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcctatgagt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagatagaat gggggataaa tttgctggct ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat atcaagcggc ccaccgggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actattactg tcacgcgtgg gacagcaaca gcgtgatttt cggcggaggg 300

accaagctga ccgtccta 318

<210> 24

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgtacag gttctggatt cacctttggt gattatgctt tgaactggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg ggctggagtg ggtaggtttc attagaggca aagcctatgg tgggacaaca 180

gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240

gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaataga 300

gaggtagagt attgcaggtc gtccgagaac tactgctacg gtatggacgt ctggggccaa 360

gggaccacgg tcaccgtctc ctc 383

<210> 25

<211> 404

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser

20 25 30

Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu

35 40 45

His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser

50 55 60

Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly

65 70 75 80

Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys

85 90 95

Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys

100 105 110

Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys

115 120 125

Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser

130 135 140

Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln

145 150 155 160

Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

180 185 190

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

195 200 205

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

210 215 220

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

225 230 235 240

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

245 250 255

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

260 265 270

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

275 280 285

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

290 295 300

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

305 310 315 320

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

325 330 335

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

340 345 350

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

355 360 365

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

370 375 380

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

385 390 395 400

Ser Pro Gly Lys

<210> 26

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser

20 25 30

Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu

35 40 45

His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser

50 55 60

Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly

65 70 75 80

Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys

85 90 95

Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys

100 105 110

Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys

115 120 125

Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser

130 135 140

Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln

145 150 155 160

Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser His His His His His His

180

<210> 27

<211> 1238

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aagcttaatt gccgccacca tgggatggtc ttgtattatt ctgtttctgg tcgctaccgc 60

tactggcgtc cactctgcac ctgtacgatc actgaactgc acgctccggg actcacagca 120

aaaaagcttg gtgatgtctg gtccatatga actgaaagct ctccacctcc agggacagga 180

tatggagcaa caagtggtgt tctccatgtc ctttgtacaa ggagaagaaa gtaatgacaa 240

aatacctgtg gccttgggcc tcaaggaaaa gaatctgtac ctgtcctgcg tgttgaaaga 300

tgataagccc actctacagc tggagagtgt agatcccaaa aattacccaa agaagaagat 360

ggaaaagcga tttgtcttca acaagataga aatcaataac aagctggaat ttgagtctgc 420

ccagttcccc aactggtaca tcagcacctc tcaagcagaa aacatgcccg tcttcctggg 480

agggaccaaa ggcggccagg atataactga cttcaccatg caatttgtgt cttccggggg 540

tggaggctct gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt 600

atcatctgtc ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc 660

taaggtcacg tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg 720

gtttgtagat gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa 780

cagcactttc cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa 840

ggagttcaaa tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc 900

caaaaccaaa ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca 960

gatggccaag gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat 1020

tactgtggag tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat 1080

catggacaca gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg 1140

ggaggcagga aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac 1200

tgagaagagc ctctcccact ctcctggtaa atgaattc 1238

<210> 28

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aagcttaatt gccgccacca tgggatggtc ttgtattatt ctgtttctgg tcgctaccgc 60

tactggcgtc cactctgcac ctgtacgatc actgaactgc acgctccggg actcacagca 120

aaaaagcttg gtgatgtctg gtccatatga actgaaagct ctccacctcc agggacagga 180

tatggagcaa caagtggtgt tctccatgtc ctttgtacaa ggagaagaaa gtaatgacaa 240

aatacctgtg gccttgggcc tcaaggaaaa gaatctgtac ctgtcctgcg tgttgaaaga 300

tgataagccc actctacagc tggagagtgt agatcccaaa aattacccaa agaagaagat 360

ggaaaagcga tttgtcttca acaagataga aatcaataac aagctggaat ttgagtctgc 420

ccagttcccc aactggtaca tcagcacctc tcaagcagaa aacatgcccg tcttcctggg 480

agggaccaaa ggcggccagg atataactga cttcaccatg caatttgtgt cttccggggg 540

tggaggctct caccatcacc accatcattg aattc 575

<210> 29

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggcccagccg gccatggcct aaggatccta aaccgtctcg agcggtggtg gcggtagtgg 60

cggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgc tagcgacatc ctgcagtgaa aggcggccgc 120

Claims

1.一种抗IL-1β单克隆抗体，其特征在于，其具有重链可变区和轻链可变区：

和/或

2.根据权利要求1所述的抗IL-1β单克隆抗体，其特征在于，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

3.根据权利要求1所述的抗IL-1β单克隆抗体，其特征在于，其具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：

(ⅰ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示；

(ⅱ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:11所示；

(ⅲ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:11所示；

(ⅳ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:12所示；

(Ⅴ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:12所示；

(Ⅵ)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:11所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的抗IL-1β单克隆抗体，其特征在于，其重链类型为IgG1，IgG2，IgG3或Ig4，优选为IgG4；其轻链类型为κ，λ，优选为λ。

5.根据权利要求1～4任一项所述的抗IL-1β单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体还包括恒定区，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种。

6.编码如权利要求1～5任一项所述的抗IL-1β单克隆抗体的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的DNA分子，其特征在于，具有

和/或

8.一种表达载体，其特征在于，包括编码如权利要求1～5任一项所述的抗IL-1β单克隆抗体的DNA分子。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞经由权利要求8所述的表达载体转化或转染而来，为原核细胞或真核细胞。

10.一种抗原，其特征在于，具有如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。

11.一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1～5任一项所述的抗IL-1β单克隆抗体。

12.根据权利要求11所述的结合物，其特征在于，所述化学标记为同位素标记、免疫毒素标记和/或化学药物标记；所述生物标记为生物素标记、亲和素标记或酶标记。

13.一种偶联物，其由权利要求1～5任一项所述的抗IL-1β单克隆抗体和/或权利要求11～12任一项所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

14.一种药物组合物，包括权利要求1～5任一项所述的抗人IL-1β单克隆抗体和/或所述权利要求11～12任一项所述的结合物和/或权利要求13所述的所述偶联物。

15.权利要求1～5任一项所述抗IL-1β单克隆抗体、权利要求11～12任一项所述的结合物和/或权利要求13所述的偶联物在制备检测IL-1β表达的产品中的应用。

16.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述抗IL-1β单克隆抗体、权利要求11～12任一项所述的结合物和/或权利要求13所述的偶联物。

17.权利要求1～5任一项所述抗IL-1β单克隆抗体、权利要求11～12任一项所述的结合物和/或权利要求13所述的偶联物在制备阻断IL-1β与IL-1RA结合的制剂中的应用。

18.权利要求1～5任一项所述抗IL-1β单克隆抗体、权利要求11～12任一项所述的结合物和/或权利要求13所述的偶联物在制备预防或治疗冷吡啉相关周期性综合征的药物中的应用。

19.根据权利要求18所述应用，其特征在于，所述冷吡啉相关周期性综合征为家族性寒冷型自身炎症性综合征与穆-韦综合征、肿瘤坏死因子受体相关性周期发热综合征、高免疫球蛋白D综合征/甲羟戊酸激酶缺乏症和/或家族性地中海热。