CN106916743A - 一体化核酸提取与扩增检测*** - Google Patents

一体化核酸提取与扩增检测*** Download PDF

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Abstract

一体化核酸提取与扩增检测***，该***包括一次性微流控芯片及配套检测装置。其中微流控芯片包括反应单元和废液存储单元，芯片工作时，借助振动模块实现反应试剂之间、反应试剂与磁珠之间的相互混合，依靠磁珠驱动模块，依次完成核酸吸附、纯化等步骤；通过流体驱动模块让PCR扩增试剂冲洗磁珠，洗脱磁珠上的扩增模板，进入由垂直通道构建的对流PCR反应器中，通过加热模块及荧光采集模块实现CPCR扩增反应和检测。本发明装置将核酸提取和CPCR扩增与检测相互集成，在一个芯片上即可自动完成核酸提取与实时CPCR扩增及检测，能够显著提高核酸诊断分析效率，且装置具有体积小、自动化程度高、方便快捷、操作简单、成本低等特点。

Description

一体化核酸提取与扩增检测***
技术领域
本发明涉及生命医学检测、诊断领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的一体化核酸提取与扩增检测***。
背景技术
微流控芯片技术由于其独到的技术特点与优势，正日益受到世界各国研究人员的重视，在生命科学、医学诊断、食品安全、动植物检验检疫等各领域均展示了潜在的应用前景。对于生物医学诊断领域，微流控芯片的显著优势在于：通过自动化、流水式的工作模式，大幅缩短样品处理时间，提高检测效率，降低反应试剂和样品消耗，最终实现自动化、低成本、智能化的快速医学检测。
作为一种具有高灵敏度与高特异性的检测方法，以PCR技术为基础的核酸诊断分析方法是分子诊断中的核心技术之一。近年来，基于微流控芯片的核酸诊断分析方法也受到了广泛关注。一方面，研制基于微流控芯片的核酸自动提取***，则可以通过微流控芯片实现传统核酸提取各个手工操作步骤的自动化，显著提高核酸诊断分析效率；另一方面，研制基于微流控芯片的PCR扩增检测***，则可以提高PCR扩增效率、减少检测时间，并通过降低试剂用量、减少人工操作等手段来降低检测成本。将核酸自动提取过程与PCR扩增检测过程相互集成，构建一体化的核酸提取与扩增检测***，对于进一步提高核酸诊断分析效率，实现整个核酸诊断分析过程的自动化具有重要的现实意义。尤其是，基于新型的实时对流PCR技术，将自动核酸提取与实时对流PCR扩增检测相结合，与基于传统PCR的核酸诊断分析方法相比，借助更加高效的实时对流PCR，能够进一步提升全自动核酸诊断分析***的整体性能。
发明内容
本发明目的在于设计一种一体化核酸提取与扩增检测***，该***可以对原始样品，如血液、唾液中的病毒颗粒进行裂解、纯化和洗脱，并对洗脱得到的核酸模板进行CPCR扩增反应，同时实现扩增产物的实时荧光检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种一体化核酸提取与扩增检测***，包括一次性微流控芯片和配套的检测装置。通过微流控芯片与检测装置的相互配合，依次完成裂解、核酸吸附、纯化、洗脱、核酸扩增等步骤，最终实现样品进-结果出的检测过程。
该***包括微流控芯片和检测装置，微流控芯片固定在检测装置的废液芯片固定模块上；其中，微流控芯片包括反应单元和废液存储单元；检测装置包括振动模块、流体驱动模块、磁珠驱动模块、废液芯片固定模块、加热模块和荧光检测模块。反应单元固定在废液存储单元上面，废液存储单元固定在废液芯片固定模块上，振动模块位于反应单元底部，流体驱动模块通过软管连接至废液存储单元气孔处，加热模块位于微流控芯片的中部位置，荧光检测模块位于加热模块的上端，磁珠驱动模块位于振动模块的前端顶部。
具体而言，振动模块包括振动池2、缓冲棉、振动电机固定环3、振动电机4、芯片槽5、弹簧a6、限位销钉7和卡扣8；所述振动电机固定环3位于振动池2上，缓冲棉置于振动电机固定环3和振动池2之间，振动电机4内嵌于振动电机固定环3中，芯片槽5通过弹簧a6和限位销钉7固定于振动电机固定环3上表面，卡扣8安装在芯片槽5的上表面。
流体驱动模块包括真空泵9、真空泵固定座10、软管11、吸盘固定架12和吸盘13；真空泵9固定在真空泵固定座10上，吸盘13固定在吸盘固定架12上，吸盘固定架12固定在废液芯片槽17上，软管11连接真空泵9的进气口和吸盘13的内孔；
磁珠驱动模块包括直流电机运动平台14、磁铁转接架15和磁铁16；磁铁转接架15固定在直流电机运动平台14上，磁铁16固定在磁铁转接架15上；
废液芯片固定模块包括废液芯片槽17、底座18、弹簧b19和限位销钉20；底座18设在废液芯片槽17内，底座18通过弹簧b19与限位销钉20固定；
加热模块包括导热块21、加热膜22、加热膜固定片23和测温元件24；导热块21通过隔热材料固定于底板1上，加热膜22固定于导热块21与加热膜固定片23之间；导热块21顶部前端孔为扩增管加热槽，后端孔为测温元件24的固定槽；
荧光检测模块包括激发光路和接收光路，其中，激发光路由LED板25、LED固定件26、LED散热片27、激发固定架28、第一滤光片29和光纤30构成，接收光路由接收固定架31、第二滤光片32、光纤33组成；LED板25固定在LED固定件26上，散热片27固定在LED板25背面，LED固定件26、第一滤光片29和光纤30固定在激发固定架28上，第二滤光片32和光纤33固定在接收固定架31上；
微流控芯片中，反应单元包括盖片34、提取腔35和扩增管36，废液存储单元包括废液腔37和密封圈38；盖片34固定在提取腔35上，盖片34上设有圆形注样孔，提取腔35的底部包含有圆孔通道，扩增管36位于提取腔35底部圆孔通道正下方，与圆孔通道连通，扩增管36顶部为软性材料制作。废液腔37顶部包含有圆形凹槽，圆形凹槽内嵌有密封圈38，圆形凹槽内包含有通道孔并与废液腔37连通，废液腔37顶部包含有气孔与吸盘13连通。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
1、本发明设计了一种一体化核酸提取与扩增检测***，通过微流控芯片与检测装置之间的相互配合，依次完成裂解、核酸吸附、纯化、洗脱、核酸扩增等步骤，最终实现样品进-结果出的检测过程。本装置具有体积小、自动化程度高、方便快捷、操作简单、成本低等特点。
2、本发明提出了一体化的核酸提取和扩增检测方法，将提取的核酸模板直接在同一个芯片上进行核酸扩增，并采用CPCR扩增反应方式，反应速度快。
3、本发明提出了振动的试剂混合方式，不仅实现反应试剂之间的快速混合，还有助于磁珠吸附DNA。
4、本发明提出了通过PCR扩增试剂冲洗磁珠，使得磁珠表面吸附的核酸模板被溶解进入PCR扩增试剂，两者相互混合后，停留在扩增管内，简化操作步骤，加快检测过程。
5、本发明提出了扩增管既是连接通道，也是扩增反应器的设计，简化了微流控芯片的结构。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：为本发明一体化核酸提取与扩增检测***的一个实施例示意图。
图2：为本发明振动模块结构示意图。
图3：为本发明流体驱动模块结构示意图。
图4：为本发明磁珠控制模块结构示意图。
图5：为本发明废液芯片固定模块结构示意图。
图6：为本发明加热模块结构示意图。
图7：为本发明荧光检测模块结构示意图。
图8：为本发明微流控芯片整体结构示意图。
图中：1、底板，2、振动池，3、振动电机固定环，4、振动电机，5、芯片槽，6、弹簧a，7、限位销钉，8、卡扣，9、真空泵，10、真空泵固定架，11、软管，12、吸盘固定架，13、吸盘，14、直流电机运动平台，15、磁铁转接架，16、磁铁，17、废液芯片槽，18、底座，19、弹簧b，20、限位销钉，21、导热块，22、加热膜，23、加热膜固定，24、测温文件，25、LED板，26、LED固定件，27、LED散热片，28、激发固定架，29、第一滤光片，30、光纤，31、接收固定架，32、第二滤光片，33、光纤，34、盖片，35、提取腔，36、扩增管，37、废液腔，38、密封圈。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。
在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
如图1至图8所示，该检测装置操作过程为：反应前，将废液存储单元***废液芯片槽17内，通过底座18的弹性结构，使得废液存储单元与吸盘13紧密对接，将反应单元从上往下***到芯片槽5内，通过卡扣8固定住反应单元，扩增管36底部通过密封圈38与废液存储单元紧密结合。
通过加样孔将待测样本和裂解液混合液注入到提取腔35内，同时将磁珠注入到提取腔35内。振动模块带动提取腔35快速振动，使得提取腔35内的裂解液与样品、磁珠与液体试剂充分混合，磁珠吸附核酸。混合完成后，控制磁铁16向下移动至提取腔35前侧，磁珠在磁铁16的磁场作用下聚集到提取腔35的前侧内壁并被吸附住，启动真空泵9，提取腔35内的废液在负压作用下通过扩增管36向下转移到废液腔37内，待废液完全移除后，关闭真空泵9和复位磁铁16，完成核酸裂解过程。
然后，通过加样孔将洗涤液注入到提取腔35内，与裂解过程进行同样操作，完成核酸提取的洗涤过程。
通过加样孔注入PCR扩增试剂，启动真空泵9并控制流速，PCR扩增试剂在负压作用下冲洗磁珠，将得磁珠表面吸附的核酸模板被溶解进入PCR扩增试剂，两者相互混合后，停留在扩增管36内，关闭真空泵9。紧接着用石蜡油密封住扩增管36上入口处，与此同时，通过磁铁16将磁珠转移到提取腔35内，使得磁珠与PCR扩增试剂完全分离。
开启加热膜22使温度升至95℃，开始PCR扩增反应，在扩增反应过程中通过荧光检测模块对扩增管36中的扩增产物荧光信号进行实时检测并显示结果，至此，完成核酸提取与扩增检测的全过程。
本发明是一种一体化核酸提取与扩增检测***，将核酸自动提取过程与CPCR扩增检测过程相互集成，进一步提高核酸诊断分析效率，实现整个核酸诊断分析过程的自动化。通过微流控芯片与检测装置的相互配合，完成了裂解、核酸吸附、纯化、洗脱、核酸扩增等步骤，实现了样本进-结果出的检测过程。
将核酸提取功能和CPCR扩增检测功能集成在一个微流控芯片上，自动完成核酸分析过程。振动模块、流体驱动模块、磁珠驱动模块、加热模块、荧光检测模块的控制全部通过一个微控制器实现。
核酸提取过程中，提取腔35内反应试剂的混合、反应试剂与磁珠之间的相互混合通过振动方式实现。各步产生的废液通过提取腔35与废液腔37之间的等效连接通道，扩增管36，排放到废液腔37中。废液腔37气孔通过吸盘13与真空泵9相连，实现提取腔35内反应试剂的反应停留和废液的排放控制。
通过调整磁铁16的位置，对提取腔35内磁珠施加有效的磁场控制，避免废液排放过程中的磁珠流失。通过再次调整磁铁16的位置，将磁珠转移到扩增管36入口处，由磁铁16固定磁珠，且使磁珠平铺散开。
通过PCR扩增试剂冲洗磁珠，使得磁珠表面吸附的核酸模板被溶解进入PCR扩增试剂，两者相互混合后，停留在扩增管36内。
带扩增模板的PCR扩增试剂进入扩增管36后，用石蜡油封闭其上部的入口，通过磁铁16将磁珠转移到提取腔35内，使得磁珠与PCR扩增试剂完全分离。
扩增管36通过底部的毛细管通道与废液腔37相连，由于表面张力作用，PCR扩增试剂能够停留在扩增管36中。扩增管36底部固定有加热模块，通过加热膜22为扩增反应提供所需的稳定温度。
在扩增管36中间位置固定有荧光检测模块，激发光路和接收光路成90度方向，对扩增管36中的扩增产物荧光信号进行实时采集。
上述附图及具体实施例仅用于说明本发明的技术方案，本发明并不局限于此。在由本发明权利要求所限定的发明实质和范围内对本发明进行细微的改变均落在本发明的保护范围内。如加热器类型、各功能性气孔、通道、反应腔的形状、尺寸以及数量等。
本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分步骤可以通过硬件来完成，也可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。
本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims (9)

1.一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：该***包括微流控芯片和检测装置，微流控芯片固定在检测装置的废液芯片固定模块上；其中，微流控芯片包括反应单元和废液存储单元；检测装置包括振动模块、流体驱动模块、磁珠驱动模块、废液芯片固定模块、加热模块和荧光检测模块；反应单元固定在废液存储单元上面，废液存储单元固定在废液芯片固定模块上，振动模块位于反应单元底部，流体驱动模块通过软管连接至废液存储单元气孔处，加热模块位于微流控芯片的中部位置，荧光检测模块位于加热模块的上端，磁珠驱动模块位于振动模块的前端顶部；
具体而言，振动模块包括振动池(2)、缓冲棉、振动电机固定环(3)、振动电机(4)、芯片槽(5)、弹簧a(6)、限位销钉(7)和卡扣(8)；所述振动电机固定环(3)位于振动池(2)上，缓冲棉置于振动电机固定环(3)和振动池(2)之间，振动电机(4)内嵌于振动电机固定环(3)中，芯片槽(5)通过弹簧a(6)和限位销钉(7)固定于振动电机固定环(3)上表面，卡扣(8)安装在芯片槽(5)的上表面；
流体驱动模块包括真空泵(9)、真空泵固定座(10)、软管(11)、吸盘固定架(12)和吸盘(13)；真空泵(9)固定在真空泵固定座(10)上，吸盘(13)固定在吸盘固定架(12)上，吸盘固定架(12)固定在废液芯片槽(17)上，软管(11)连接真空泵(9)的进气口和吸盘(13)的内孔；
磁珠驱动模块包括直流电机运动平台(14)、磁铁转接架(15)和磁铁(16)；磁铁转接架(15)固定在直流电机运动平台(14)上，磁铁(16)固定在磁铁转接架(15)上；
废液芯片固定模块包括废液芯片槽(17)、底座(18)、弹簧b(19)和限位销钉(20)；底座(18)设在废液芯片槽(17)内，底座(18)通过弹簧b(19)与限位销钉(20)固定；
加热模块包括导热块(21)、加热膜(22)、加热膜固定片(23)和测温元件(24)；导热块(21)通过隔热材料固定于底板1上，加热膜(22)固定于导热块(21)与加热膜固定片(23)之间；导热块(21)顶部前端孔为扩增管加热槽，后端孔为测温元件(24)的固定槽；
荧光检测模块包括激发光路和接收光路，其中，激发光路由LED板(25)、LED固定件(26)、LED散热片(27)、激发固定架(28)、第一滤光片(29)和光纤(30)构成，接收光路由接收固定架(31)、第二滤光片(32)、光纤(33)组成；LED板(25)固定在LED固定件(26)上，LED散热片(27)固定在LED板(25)背面，LED固定件(26)、第一滤光片(29)和光纤(30)固定在激发固定架(28)上，第二滤光片(32)和光纤(33)固定在接收固定架(31)上；
微流控芯片中，反应单元包括盖片(34)、提取腔(35)和扩增管(36)，废液存储单元包括废液腔(37)和密封圈(38)；盖片(34)固定在提取腔(35)上，盖片(34)上设有圆形注样孔，提取腔(35)的底部包含有圆孔通道，扩增管(36)位于提取腔(35)底部圆孔通道正下方，与圆孔通道连通，扩增管(36)顶部为软性材料制作；废液腔(37)顶部包含有圆形凹槽，圆形凹槽内嵌有密封圈(38)，圆形凹槽内包含有通道孔并与废液腔(37)连通，废液腔(37)顶部包含有气孔与吸盘(13)连通。
2.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：振动模块、流体驱动模块、磁珠驱动模块、加热模块、荧光检测模块的控制全部通过一个微控制器实现。
3.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：核酸提取过程中，提取腔(35)内反应试剂的混合、反应试剂与磁珠之间的相互混合通过振动方式实现；各步产生的废液通过提取腔(35)与废液腔(37)之间的等效连接通道，扩增管(36)，排放到废液腔(37)中；废液腔(37)气孔通过吸盘(13)与真空泵(9)相连，实现提取腔(35)内反应试剂的反应停留和废液的排放控制。
4.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：通过调整磁铁(16)的位置，对提取腔(35)内磁珠施加有效的磁场控制，避免废液排放过程中的磁珠流失；通过再次调整磁铁(16)的位置，将磁珠转移到扩增管(36)入口处，由磁铁(16)固定磁珠，且使磁珠平铺散开。
5.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：通过PCR扩增试剂冲洗磁珠，使得磁珠表面吸附的核酸模板被溶解进入PCR扩增试剂，两者相互混合后，停留在扩增管(36)内。
6.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：带扩增模板的PCR扩增试剂进入扩增管(36)后，用石蜡油封闭其上部的入口，通过磁铁(16)将磁珠转移到提取腔(35)内，使得磁珠与PCR扩增试剂完全分离。
7.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：扩增管(36)通过底部的毛细管通道与废液腔(37)相连，由于表面张力作用，PCR扩增试剂能够停留在扩增管(36)中；扩增管(36)底部固定有加热模块，通过加热膜(22)为扩增反应提供所需的稳定温度。
8.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：在扩增管(36)中间位置固定有荧光检测模块，激发光路和接收光路成90度方向，对扩增管(36)中的扩增产物荧光信号进行实时采集。
9.根据权利要求1所述的一体化核酸提取与扩增检测***，其特征在于：该检测装置操作过程为：反应前，将废液存储单元***废液芯片槽(17)内，通过底座(18)的弹性结构，使得废液存储单元与吸盘(13)紧密对接，将反应单元从上往下***到芯片槽(5)内，通过卡扣(8)固定住反应单元，扩增管(36)底部通过密封圈(38)与废液存储单元紧密结合；
通过加样孔将待测样本和裂解液混合液注入到提取腔(35)内，同时将磁珠注入到提取腔(35)内；振动模块带动提取腔(35)快速振动，使得提取腔(35)内的裂解液与样品、磁珠与液体试剂充分混合，磁珠吸附核酸；混合完成后，控制磁铁(16)向下移动至提取腔(35)前侧，磁珠在磁铁(16)的磁场作用下聚集到提取腔(35)的前侧内壁并被吸附住，启动真空泵(9)，提取腔(35)内的废液在负压作用下通过扩增管(36)向下转移到废液腔(37)内，待废液完全移除后，关闭真空泵(9)和复位磁铁(16)，完成核酸裂解过程；
然后，通过加样孔将洗涤液注入到提取腔(35)内，与裂解过程进行同样操作，完成核酸提取的洗涤过程；
通过加样孔注入PCR扩增试剂，启动真空泵(9)并控制流速，PCR扩增试剂在负压作用下冲洗磁珠，将得磁珠表面吸附的核酸模板被溶解进入PCR扩增试剂，两者相互混合后，停留在扩增管(36)内，关闭真空泵(9)；紧接着用石蜡油密封住扩增管(36)上入口处，与此同时，通过磁铁(16)将磁珠转移到提取腔(35)内，使得磁珠与PCR扩增试剂完全分离；
开启加热膜(22)使温度升至95℃，开始PCR扩增反应，在扩增反应过程中通过荧光检测模块对扩增管(36)中的扩增产物荧光信号进行实时检测并显示结果，至此，完成核酸提取与扩增检测的全过程。
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