CN106908599A - 检测葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素a的免疫层析试纸条 - Google Patents

检测葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素a的免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明属检测领域，公开了基于银纳米粒子与Ru(phen)3 2+荧光微球间消光作用的免疫层析试纸条，用于快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的赭曲霉毒素A。以Ru(phen)3 2+荧光微球作为荧光背景信号，其最大激发波长为450nm，将其与OTA检测抗原混匀喷涂在试纸条检测区域；采用SPR吸收峰450nm的球形银纳米粒子与OTA单克隆抗体的复合物作为消光探针。在阳性样品检测时，样品中游离的OTA与固定在检测线上的检测抗原竞争与银探针结合，样品中OTA的含量与结合在检测线上银探针的数量成反比，而与荧光信号强度成正比。本发明方法在定性检测OTA时更灵敏。

Description

检测葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条
技术领域
本发明涉及小分子快速检测技术领域，具体涉及一种针对葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条检测方法，即基于银纳米粒子对Ru(phen)3 2+荧光微球的消光作用构建免疫层析试纸条快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的赭曲霉毒素A。
技术背景
赭曲霉毒素是由纯绿青霉、炭黑曲霉及赭曲霉等真菌产生的次级代谢产物，分为A、B、C三种，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)污染最普遍，毒性最强。OTA具有很强的肾毒性，对动物的肾脏和肝脏危害最大。除特异性肾毒性以外，OTA还具有致畸、致突变、致癌作用和免疫毒性，也可造成肠炎、淋巴坏疽、肝肿大等疾病。OTA可污染各种粮食作物和水果，特别是葡萄污染较为严重。1996年，Zimmerli和Dick首次报道了在红葡萄汁中检出OTA(0.235μg/L)，接着Miraglia等人在德国某葡萄汁样品中检出OTA含量高达5.26μg/L，引起了广泛重视，因为葡萄酒和葡萄汁在世界范围有很大的消费量，而葡萄汁的主要摄入人群为少年儿童，OTA通过葡萄汁进入儿童体内毒性危害的后果更为严重。考虑到OTA污染的普遍性和毒性，欧盟将其在葡萄酒和葡萄汁中最高允许检出含量定为2μg/L。
由于葡萄酒或葡萄汁中酒精或糖分、色素和丹宁类物质的存在，对常规的胶体金免疫层析试纸条检测有较大影响，亟需一种灵敏度高(样品可以多倍稀释)、不受颜色干扰的检测方法。
通常检测小分子物质的免疫层析试纸条采用竞争反应模式，将检测抗原固定在试纸条的检测线上，胶体金等信号物质上标记相应的抗体，样液中游离的小分子待测物与检测线上的检测抗原共同竞争信号物质上的抗体，结合在检测线上的信号物质数量与待测物含量成反比，定性分析时以裸眼判读检测线上信号消失做为检测限。此判读模式需要浓度较高的待测物才能使信号物质上标记的抗体全部饱和而不与检测线上检测抗原结合。基于贵金属纳米粒子对荧光材料的消光作用的试纸条可将检测小分子物质的反读模式转化为正读模式，其原理为荧光材料的激发光或发射光被对应的贵金属纳米粒子吸收而导致荧光信号减弱或消失。荧光材料和检测抗原固定在检测线，贵金属纳米粒子标记待测物特异性抗体(消光探针)固定在结合垫上，样液中的待测小分子与检测线上的检测抗原共同竞争消光探针上的抗体，待测物含量越多，结合在检测线上的消光探针越少，荧光信号越强，即荧光信号与待测物含量成正比，待测物痕量存在时即可在检测线上出现裸眼可见的荧光，进而提高定性分析的灵敏度。
Ru(phen)3 2+荧光微球具有较大的斯托克斯位移(最大激发波长450nm，最大发射波长590nm)及稳定的荧光信号。粒径60nm的银纳米粒子(silver nanoparticles,简称AgNPs)其表面等离激元共振(surface plasma resonance,简称SPR)吸收峰在450nm，构建基于AgNPs对Ru(phen)3 2+的消光免疫层析试纸条检测葡萄酒和葡萄汁中OTA，既可以避免葡萄中含有的与胶体金颜色相近的色素对检测结果造成的干扰，又有效的提高了检测灵敏度，为解决葡萄酒和葡萄汁中OTA的现场快速检测难题具有积极的作用。
发明内容
本发明旨在针对现有胶体金免疫层析试纸条因灵敏度偏低和颜色干扰等原因不适合快速检测葡萄酒和葡萄汁样品中OTA含量的技术缺陷，提出一种基于银纳米粒子特定吸收Ru(phen)3 2+荧光微球的激发光而导致荧光消减的试纸条用于快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的OTA，将传统的小分子检测反读模式转化为正读模式，提高定性分析灵敏度，并且避免了样品颜色背景干扰的问题。
本发明一种快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的OTA的试纸条，包括以下技术方案：
(1)Ru(phen)3 2+-牛血清白蛋白复合物的制备
1)Ru(phen)3 2+荧光微球合成：在100mL乙醇中加入4mL氨水、2.5mL水和8mL正硅酸乙酯，室温搅拌0.5h，加入10mL浓度为2mg/mL的Ru(phen)3 2+乙醇溶液，室温搅拌过夜，8000转离心10min，弃上清，沉淀用乙醇洗涤3次，得到的Ru(phen)3 2+荧光微球粒径55nm±5nm，最大激发波长450nm，最大发射波长590nm；
2)荧光微球表面氨基化修饰：用微球质量20倍的乙醇、与微球等质量的水和微球质量25％的氨水分散微球，室温下搅拌30min，然后加入微球质量1.2倍的氨基硅烷，室温搅拌过夜，8000转离心10min，沉淀复溶于水中；
3)荧光微球与牛血清白蛋白(简称BSA)结合：25mL磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 6.0)中，加入20mg氨基修饰荧光微球，5mg BSA，200μg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)，室温搅拌45min后，再加入200μg EDC，25mg BSA，室温搅拌1h，8000转离心10min，沉淀复溶于2mL水中，4℃保存待用。
(2)OTA检测抗原的制备
1mg OTA溶解于500μL无水四氢呋喃中，加入2mg N-羟基琥珀酰亚胺和4mg N,N'-二环己基碳二亚胺，室温避光反应1h；OTA活化产物经氮气吹干后溶于200μL二甲基甲酰胺中；缓慢滴加于2mL牛血清白蛋白(简称BSA)溶液中(0.13M NaHCO3溶液)，其中OTA与BSA摩尔比为15:1；室温避光反应过夜，转入0.01M、pH 6.0的磷酸盐缓冲盐水中透析72h，-20℃保存待用。(3)银消光探针合成
1)银纳米粒子合成：在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM，单宁酸(TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，加入1mL AgNO3(25mM)，溶液马上变成亮黄，得到种子大小约15nm。合成种子银后移除19.5mL反应液，在剩余反应液中加入16.5mL水，温度设定到90℃，加入0.5mL SC(25mM)、1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO3(25mM)，补足100mL体积，待银粒子生长30min后，重复“移除19.5mL反应液，补加16.5mL水、0.5mL SC(25mM)、1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO3(25mM)，补足100mL体积，90℃生长30min”这一过程10次。获得SPR吸收峰为450nm的银纳米粒子，与荧光微球激发光一致。
2)银纳米粒子与抗OTA单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约1011个)，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含OTA单抗腹水(IgG含量5μg)的0.1M硼酸溶液(NaOH调pH至7.5)；20℃磁力搅拌器上搅动2h，离心10min，弃上清；重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液(NaOH调pH至7.5)中，5min后，7000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液(pH 7.5)中，4℃保存备用。
(4)试纸条的组装
试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成。其中，样品垫用50mMpH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(包含1％的BSA，0.5％的吐温20和0.05％的叠氮钠)浸润，并于60℃干燥2h；结合垫为玻璃纤维膜，用0.01M的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，于60℃干燥4h，上述银消光探针稀释6倍后以1.25μL/cm喷涂在结合垫上；将检测抗原OTA-BSA(1.2mg/mL)与荧光微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠IgG抗体(0.2mg/mL)与荧光微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的对照线(质控线)上，设置各线喷涂量均为0.75μL/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用。按照附图1的方式组装试纸条，切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。试纸条卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口。
(5)试纸条使用：
1)定性检测葡萄酒中OTA：1体积葡萄酒加入3体积包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***激发光450nm的试纸条荧光检测盒中，如葡萄酒样品中OTA含量大于等于0.4μg/L，则检测线出现肉眼可见荧光，即葡萄酒中OTA定性检测限为0.4μg/L。
2)定性检测葡萄汁中OTA：1体积葡萄汁加入等体积包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***激发光450nm的荧光试纸条检测盒中，如葡萄汁样品中OTA含量大于等于0.2μg/L，则检测线出现肉眼可见荧光，即葡萄汁中OTA定性检测限为0.2μg/L。
3)定量检测葡萄酒中OTA：在对葡萄酒中OTA含量进行定量检测时，首先制作标准曲线，选取一种已知不含OTA的葡萄酒样品作为阴性基质，在8份阴性基质中分别掺入不同浓度的OTA标准物质，制成8份梯度加标样品，分别是：20、10、5、2.5、1.25、1、0.4和0.2μg/L。上述各1体积加标样品加入3倍体积包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值设为纵坐标，OTA浓度的对数值设为横坐标，绘制标准曲线，即得到定量检测的标准方程。将待检葡萄酒样本1体积加入3倍体积包含40mMNaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值带入标准方程，即得到样本中OTA含量。定量检测葡萄酒中OTA浓度的线性范围0.4至20μg/L，最低检测限0.2μg/L。
4)定量检测葡萄汁中OTA：在对葡萄汁中OTA含量进行定量检测时，首先制作标准曲线，选取一种已知不含OTA的葡萄汁样品作为阴性基质，在8份阴性基质中分别掺入不同浓度的OTA标准物质，制成8份梯度加标样品，分别是：10、5、2.5、1.25、1、0.4、0.2和0.1μg/L。上述各1体积加标样品加入等体积包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值设为纵坐标，OTA浓度的对数值设为横坐标，绘制标准曲线，即得到定量检测的标准方程。将待检葡萄汁样本1体积加入等体积包含40mMNaHCO3和0.5％PEG的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值带入标准方程，即得到样本中OTA含量。定量检测葡萄汁中OTA的浓度范围0.2至10μg/L，最低检测限0.1μg/L。
本发明方法适用于葡萄酒和葡萄汁中污染的OTA定性和定量快速检测，样品不需脱色等复杂前处理步骤，只需要简单的一步稀释即可加入试纸条检测，大大缩短了检测时间。本发明方法通过银纳米粒子对Ru(phen)3 2+荧光微球的消光作用将试纸条检测小分子待测物的反读模式转化为正读模式，从而将定性分析的信号消失判读模式转化为信号出现判读模式，在OTA痕量存在时即可裸眼观测到荧光信号出现，大大提高了定性检测的灵敏度。
附图说明
图1本发明方法试纸条结构示意图；最底层为粘性卡纸，其中间部位粘贴Nc膜，Nc膜预先在检测线位置喷涂OTA检测抗原和Ru(phen)3 2+荧光微球-BSA，在对照线(质控线)位置喷涂驴抗鼠IgG抗体和Ru(phen)3 2+荧光微球-BSA。Nc膜左边的粘性卡纸上依次粘贴结合垫(喷涂有银消光探针)、样本垫和滤纸，结合垫右侧边缘与Nc膜左侧边缘层叠1至2mm，样本垫层叠在结合垫上面，左侧错开1至2mm粘贴在卡纸上，滤纸层叠在样本垫上，同样左侧错开1至2mm粘贴在卡纸上。Nc膜右边粘贴吸水纸，吸水纸左侧边缘与Nc膜右侧边缘层叠1至2mm，检测时待测葡萄酒或葡萄汁样品溶液经滤纸、样本垫、结合垫，在吸水纸毛细作用下进入Nc膜，自左向右流动；
图2本发明方法中银纳米粒子透射电镜图；按照本发明方法制备的银纳米粒子平均粒径为60nm；
图3本发明方法中Ru(phen)3 2+荧光微球透射电镜图；，按照本发明方法制备的Ru(phen)3 2+荧光微球平均粒径55nm；
图4银纳米粒子紫外吸收光谱与Ru(phen)3 2+荧光微球激发、发射光谱整合图；由图可知，银纳米粒子紫外吸收光谱完全覆盖了Ru(phen)3 2+荧光微球的激发光谱，因此可产生最佳的消光效率，是本发明试纸条高灵敏度的基础保证；
图5本发明方法对葡萄酒和葡萄汁中OTA定量检测标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所涉及的抗OTA单克隆抗体腹水及驴抗鼠IgG抗体由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供；本实验所涉及的OTA标准物质、Ru(phen)3 2+、正硅酸乙酯、N-羟基琥珀酰亚胺、EDC、BSA、SC、TA、N,N'-二环己基碳二亚胺和AgNO3等购买自Sigma公司；所涉及的化学试剂购买自Aladdin公司；本实验所涉及的试纸条荧光读卡仪(HG-F450/590)和试纸条荧光检测盒(Micro-F450)由上海互帼科学仪器有限公司提供。
化合物缩略名及其中文全称：OTA/赭曲霉毒素A、SC/柠檬酸钠、TA/鞣酸、BSA/牛血清白蛋白、EDC/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、IgG/免疫球蛋白G、PEG/聚乙二醇
实施例1基于银纳米粒子与Ru(phen)3 2+间消光作用的快速检测葡萄酒和葡萄汁中污染的OTA的试纸条的制作步骤
(1)Ru(phen)3 2+荧光微球-牛血清白蛋白复合物的制备：为使荧光微球固定在Nc膜的检测线上，需要将其与牛血清白蛋白(简称BSA)形成共价结合物。
1)Ru(phen)3 2+荧光微球合成：在100mL乙醇中加入4mL氨水、2.5mL水和8mL正硅酸乙酯，室温搅拌0.5h，加入10mL浓度为2mg/mL的Ru(phen)3 2+乙醇溶液，室温搅拌过夜，8000转离心10min，弃上清，沉淀用乙醇洗涤3次，得到的Ru(phen)3 2+荧光微球粒径55nm±5nm，最大激发波长450nm，最大发射波长590nm；
2)荧光微球表面氨基化修饰：用微球质量20倍的乙醇、与微球等质量的水和微球质量25％的氨水分散微球，室温下搅拌30min，然后加入微球质量1.2倍的氨基硅烷，室温搅拌过夜，8000转离心10min，沉淀复溶于水中；
3)荧光微球与牛血清白蛋白(简称BSA)结合：25mL磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 6.0)中，加入20mg氨基修饰荧光微球，5mg BSA，200μg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)，室温搅拌45min后，再加入200μg EDC，25mg BSA，室温搅拌1h，8000转离心10min，沉淀复溶于2mL水中，4℃保存待用。
(2)OTA检测抗原的制备
1mg OTA溶解于500μL无水四氢呋喃中，加入2mg N-羟基琥珀酰亚胺和4mg N,N'-二环己基碳二亚胺，室温避光反应1h；OTA活化产物经氮气吹干后溶于200μL二甲基甲酰胺中；缓慢滴加于2mL BSA溶液中(0.13M NaHCO3溶液)，其中OTA与BSA摩尔比为15:1；室温避光反应过夜，转入0.01M、pH 6.0的磷酸盐缓冲盐水中透析72h，-20℃保存待用。
(3)银消光探针合成
1)银纳米粒子合成：在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM，单宁酸(TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，加入1mL AgNO3(25mM)，溶液马上变成亮黄，得到种子大小约15nm。合成种子银后移除19.5mL反应液，在剩余反应液中加入16.5mL水，温度设定到90℃，加入0.5mL SC(25mM)、1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO3(25mM)，补足100mL体积，待银粒子生长30min后，重复“移除19.5mL反应液，补加16.5mL水、0.5mL SC(25mM)、1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO3(25mM)，补足100mL体积，90℃生长30min”这一过程10次。获得SPR吸收峰为450nm的银纳米粒子，与荧光微球激发光一致。
2)银纳米粒子与抗OTA单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约1011个)，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含OTA单抗腹水(IgG含量5μg)的0.1M硼酸溶液(NaOH调pH至7.5)；20℃磁力搅拌器上搅动2h，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液(NaOH调pH至7.5)中，5min后，7000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液(pH 7.5)中，4℃保存备用。
(4)试纸条的组装
试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成。其中，样品垫用50mMpH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(包含1％的BSA，0.5％的吐温20和0.05％的叠氮钠)浸润，并于60℃干燥2h；结合垫为玻璃纤维膜，用0.01M的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，于60℃干燥4h，上述银消光探针稀释6倍后以1.25μL/cm喷涂在结合垫上；将检测抗原OTA-BSA(1.2mg/mL)与荧光微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠IgG抗体(0.2mg/mL)与荧光微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的对照线(质控线)上，设置各线喷涂量均为0.75μL/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用。按照附图1的方式组装试纸条，切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。试纸条卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口。
图2本发明方法中银纳米粒子透射电镜图；
图3本发明方法中Ru(phen)3 2+荧光微球透射电镜图；
图4银纳米粒子紫外吸收光谱与Ru(phen)3 2+荧光微球激发、发射光谱整合图。
实施例2定量检测葡萄酒中OTA
在对葡萄酒中OTA含量进行定量检测时，首先制作标准曲线，选取一种已知不含OTA的葡萄酒样品作为阴性基质，在8份阴性基质中分别掺入不同浓度的OTA标准物质，制成8份梯度加标样品，分别是：20、10、5、2.5、1.25、1、0.4和0.2μg/L。上述各1体积加标样品加入3倍体积包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值设为纵坐标，OTA浓度的对数值设为横坐标，绘制标准曲线，即得到定量检测的标准方程：y＝0.202ln(x)+0.516，其中y为检测线和质控线上荧光值的比值，x即为葡萄酒中OTA浓度，单位为μg/L。
1mL待检葡萄酒样品加入3mL包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪中，激发光450nm，发射光590nm，读取检测线和质控线上荧光值，带入上面的标准方程，即得到待检葡萄酒中OTA浓度。本方法检测葡萄酒中OTA浓度的标准方程线性范围是0.4μg/L至20μg/L(图5)，即y值范围在0.33至1.12之间时OTA含量符合本方程关系。
实施例3定量检测葡萄汁中OTA
在对葡萄汁中OTA含量进行定量检测时，首先制作标准曲线，选取一种已知不含OTA的葡萄汁样品作为阴性基质，在8份阴性基质中分别掺入不同浓度的OTA标准物质，制成8份梯度加标样品，分别是：10、5、2.5、1.25、1、0.4、0.2和0.1μg/L。上述各1mL加标样品加入1mL包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值设为纵坐标，OTA浓度的对数值设为横坐标，绘制标准曲线，即得到定量检测的标准方程：y＝0.202ln(x)+0.616，其中y为检测线和质控线上荧光值的比值，x为葡萄汁中OTA浓度，单位为μg/L。
1mL待检葡萄汁样品加入1mL包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***荧光读卡仪，激发光450nm，发射光590nm，读取检测线和质控线上荧光值，带入上述标准方程。本方法检测葡萄汁中OTA含量的标准方程线性范围是0.2μg/L至10μg/L(图5)，即y值范围在0.29至1.08之间时OTA含量符合本方程关系。
实施例4定性检测葡萄酒中OTA
1mL待检葡萄酒加入3mL包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***激发光450nm的试纸条荧光检测盒中，如葡萄酒样品中OTA含量大于等于0.4μg/L，则检测线出现裸眼可见荧光，如葡萄酒样品中OTA含量小于0.4μg/L，则检测线无可见荧光，即葡萄酒中OTA定性检测限为0.4μg/L。
实施例5定性检测葡萄汁中OTA
1mL待检葡萄汁加入1mL包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***激发光450nm的荧光试纸条检测盒中，如葡萄汁样品中OTA含量大于等于0.2μg/L，则检测线出现裸眼可见荧光，如葡萄汁样品中OTA含量小于0.2μg/L，则检测线无可见荧光，即葡萄汁中OTA定性检测限为0.2μg/L。

Claims (1)

1.检测葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，其特征是制备方法为：
(1)Ru(phen)3 2+-牛血清白蛋白复合物的制备：
1)Ru(phen)3 2+荧光微球合成：在100mL乙醇中加入4mL氨水、2.5mL水和8mL正硅酸乙酯，室温搅拌0.5h，加入10mL浓度为2mg/mL的Ru(phen)3 2+乙醇溶液，室温搅拌过夜，8000转离心10min，弃上清，沉淀用乙醇洗涤3次，得到的Ru(phen)3 2+荧光微球粒径55nm±5nm，最大激发波长450nm，最大发射波长590nm；
2)Ru(phen)3 2+荧光微球表面氨基化修饰：用荧光微球质量20倍的乙醇、与荧光微球等质量的水和荧光微球质量25％的氨水分散荧光微球，室温下搅拌30min，然后加入荧光微球质量1.2倍的氨基硅烷，室温搅拌过夜，8000转离心10min，沉淀复溶于水中得氨基修饰荧光微球；
3)氨基修饰荧光微球与牛血清白蛋白(简称BSA)结合：25mL磷酸盐缓冲液(0.01M，pH6.0)中，加入20mg氨基修饰荧光微球，5mg BSA，200μg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)，室温搅拌45min后，再加入200μg EDC，25mg BSA，室温搅拌1h，8000转离心10min，沉淀复溶于2mL水中，得荧光微球-BSA，4℃保存待用；
(2)OTA检测抗原的制备：1mg OTA溶解于500μL无水四氢呋喃中，加入2mg N-羟基琥珀酰亚胺和4mg N,N'-二环己基碳二亚胺，室温避光反应1h；OTA活化产物经氮气吹干后溶于200μL二甲基甲酰胺中，缓慢滴加于2mL BSA溶液中(0.13M NaHCO3溶液)，其中OTA与BSA摩尔比为15:1；室温避光反应过夜，转入0.01M、pH 6.0的磷酸盐缓冲盐水中透析72h，-20℃保存待用；
(3)银消光探针合成：
1)银纳米粒子合成：在100mL体系中调整柠檬酸钠(SC)浓度至5mM，单宁酸(TA)0.1mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，加入1mL AgNO3(25mM)，溶液马上变成亮黄，得到种子大小约15nm；合成种子银后移除19.5mL反应液，在剩余反应液中加入16.5mL水，温度设定到90℃，加入0.5mL SC(25mM)、1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO3(25mM)，补足100mL体积，待银粒子生长30min后，重复“移除19.5mL反应液，补加16.5mL水、0.5mL SC(25mM)、1.5mL TA(2.5mM)和1mL AgNO(25mM)3，补足100mL体积，90℃生长30min”这一过程10次，获得SPR吸收峰为450nm的银纳米粒子，与荧光微球激发光一致；
2)银纳米粒子与抗OTA单克隆抗体结合：取1mL银纳米粒子溶液(粒子数约1011个)，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于1mL含OTA单抗腹水(IgG含量5μg)的0.1M pH 7.5硼酸溶液；20℃磁力搅拌器上搅动2h，7000转离心10min，弃上清；沉淀重悬于含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.5硼酸溶液中，5min后，7000转离心10min，沉淀重悬于0.25mL含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.5硼酸溶液中，得银消光探针，4℃保存备用；
(4)试纸条的组装：试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸等五部分组成；其中，样品垫用50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(包含1％的BSA，0.5％的吐温20和0.05％的叠氮钠)浸润，并于60℃干燥2h；结合垫为玻璃纤维膜，用0.01M的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，包含0.2％吐温20和2％蔗糖)浸润，于60℃干燥4h，上述银消光探针稀释6倍后以1.25μL/cm喷涂在结合垫上；将检测抗原OTA-BSA(1.2mg/mL)与荧光微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的检测线，驴抗鼠IgG抗体(0.2mg/mL)与荧光微球-BSA(80μg/mL)混合后喷涂于NC膜的对照线(质控线)上，设置各线喷涂量均为0.75μL/cm，将喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商业化的滤纸和吸水纸不经特殊处理，直接使用；按照附图1的方式组装试纸条，切割成宽度3.8mm每条，装入试纸条卡盒中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；试纸条卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在Nc膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；得试纸条；
(5)试纸条使用：
1)定性检测葡萄酒中OTA：1体积葡萄酒加入3体积包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***激发光450nm的试纸条荧光检测盒，如葡萄酒样品中OTA含量大于等于0.4μg/L，则检测线出现肉眼可见荧光，即葡萄酒中OTA定性检测限为0.4μg/L；
2)定性检测葡萄汁中OTA：1体积葡萄汁加入等体积包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后***激发光450nm的荧光试纸条检测盒中，如葡萄汁样品中OTA含量大于等于0.2μg/L，则检测线出现肉眼可见荧光，即葡萄汁中OTA定性检测限为0.2μg/L；
3)定量检测葡萄酒中OTA：在对葡萄酒中OTA含量进行定量检测时，首先制作标准曲线，选取一种已知不含OTA的葡萄酒样品作为阴性基质，在8份阴性基质中分别掺入不同浓度的OTA标准物质，制成8份梯度加标样品，分别是：20、10、5、2.5、1.25、1、0.4和0.2μg/L；上述各1体积加标样品加入3倍体积包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***激发光450nm、发射光590nm的荧光读卡仪，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值设为纵坐标，OTA浓度的对数值设为横坐标，绘制标准曲线，即得到定量检测的标准方程；将待检葡萄酒样本1体积加入3倍体积包含40mM NaHCO3和1％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***激发光450nm、发射光590nm的荧光读卡仪，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值带入标准方程，即得到样本中OTA含量；定量检测葡萄酒中OTA浓度的线性范围0.4至20μg/L，最低检测限0.2μg/L；
4)定量检测葡萄汁中OTA：在对葡萄汁中OTA含量进行定量检测时，首先制作标准曲线，选取一种已知不含OTA的葡萄汁样品作为阴性基质，在8份阴性基质中分别掺入不同浓度的OTA标准物质，制成8份梯度加标样品，分别是：10、5、2.5、1.25、1、0.4、0.2和0.1μg/L；上述各1体积加标样品加入等体积包含40mM NaHCO3和0.5％PEG8000的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值设为纵坐标，OTA浓度的对数值设为横坐标，绘制标准曲线，即得到定量检测的标准方程；将待检葡萄汁样本1体积加入等体积包含40mM NaHCO3和0.5％PEG的水溶液，混匀后取出70μL加入试纸条加样孔，20min后将试纸条***荧光读卡仪(激发光450nm，发射光590nm)，读取检测线和质控线上荧光值，将二者比值带入标准方程，即得到样本中OTA含量；定量检测葡萄汁中OTA的浓度范围0.2至10μg/L，最低检测限0.1μg/L。
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