CN106883217B - 一种核苷碱基异羟肟酸衍生化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类具有DNA甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制活性的核苷碱基异羟肟酸类化合物及其制备方法与应用。该核苷碱基异羟肟酸类化合物的结构式如式Ⅰ所示，其中，R为DNA和/或RNA里的核苷碱基、带取代基团的核苷碱基或核苷碱基类似物；Linker为连接R与异羟肟酸官能团的连接链，连接链包括但不限于烷基链、带杂原子的烷基链、带芳香环的烷基链、带杂环的烷基链。体外细胞增殖实验表明，式Ⅰ所示化合物可以很好地抑制白血病细胞K562以及组织细胞淋巴瘤细胞U937增殖。DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制实验表明式Ⅰ所示化合物是对DNA甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶有抑制活性的化合物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有DNMT和HDAC抑制活性的核苷碱基异羟肟酸衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的发生和发展既与基因异常密切相关，也与表观遗传改变有着紧密的关系。基因异常包括癌基因或抑癌基因的扩增、易位、删除及点突变等。表观遗传修饰主要包括DNA的修饰和组蛋白的修饰，如DNA甲基化、组蛋白乙酰化、去乙酰化、泛素化等。表观遗传的改变不涉及DNA序列的变化，能在细胞***中保持亲本的遗传信息，但一定条件下可以发生逆转，使恶性细胞群体转变为正常的细胞。因此在表观遗传中起调控作用的酶被认为是抗肿瘤药物研发的新一代靶点。
研究表明，肿瘤细胞中高表达的DNA甲基转移酶(DNMT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)分别催化DNA CpG岛的甲基化和组蛋白的去乙酰化，促使染色质收缩形成核小体，使抑癌基因不能正常表达，促进了肿瘤的发生和发展。当前，许多以DNMT或HDAC为靶点的小分子抑制剂被研发出来。
DNA甲基转移酶(DNMT)在哺乳动物体内主要有3个亚型。其中DNMT1主要在复制过程中发挥维持亲本甲基化状态的作用；DNMT3A和DNMT3B则发挥从头甲基化的作用，即能使子代DNA获得新的甲基化模式。以DNMTs为靶点研发的小分子抑制剂根据其结构以及作用机制的不同，可以分为核苷类DNMT抑制剂和非核苷类DNMT抑制剂。核苷类DNMT抑制剂主要是胞嘧啶核苷类似物以及s-腺苷甲硫氨酸(SAM)类似物，比如已经上市的阿扎胞苷和地西他滨。核苷类DNMT抑制剂需要并入DNA后与DNMT的半胱氨酸残基形成不可逆的共价键发挥作用，毒副作用比较大。为此，越来越多的非核苷类DNMT抑制剂被研发出来。这一类抑制剂获得的方式包括虚拟筛选(如RG108，NSC319745，SGI-1027)、天然产物(如EGCG)、老药新用(如普鲁卡因和普鲁卡因胺)以及优化改造已知抑制剂。它们通过竞争性地结合DNMT的活性结构位点或阻碍DNMT与DNA的结合抑制DNMT发挥作用。虽然非核苷类DNMT抑制剂可能能减少因并入DNA而产生的毒副作用，但目前该类抑制剂抑制活性还有待提高，目前也还没有这一类DNMT抑制剂进入临床研究。我们推测，能与DNMT活性位点产生不可逆共价键的非核苷类抑制剂或许既能具有良好的DNMT抑制活性，且可以避免核苷类DNMT抑制剂并入DNA所产生的毒副作用。
组蛋白上的赖氨酸残基具有多种表观修饰方式，如甲基化、乙酰化、脱乙酰化、泛素化、巴豆酰化等。其中，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)催化乙酰化的赖氨酸脱去乙酰基，使带正电荷的赖氨酸残基与带负电荷的DNA磷酸骨架紧密缠绕，因而抑制抑癌基因表达。在哺乳动物体内已发现HDAC共18种，根据其与酵母的同源性分为四个亚型，其中I型(HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8)、II A型(HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9)、II B型(HDAC6，HDAC10)和IV型(HDAC11)属于Zn2+离子依赖型HDAC；III型HDAC包含去乙酰化酶SIRT1-SIRT7，属NAD+依赖的酶。作为抗肿瘤药物研发成熟的靶点，已有许多HDAC抑制剂进入临床研究，且五个HDACs抑制剂(Vorinostat,Romidepsin,Belinostat,Panobinostat,Chidamide)已经上市。根据结构不同，HDAC抑制剂通常可以分为四类：短链脂肪酸类，包括丁酸、丙戊酸等；异羟肟酸类，包括Vorinostat(SAHA)和曲古霉素A(TSA)、Belinostat等；环四肽类，包括Apicidin和罗咪肽酯等；苯甲酰胺类，包括Chidamide和MS-275等。当前，根据HDAC蛋白的亚型差异研发HDAC亚型选择性抑制剂以及基于HDAC与其他靶点(如EGFR、Her2、拓扑异构酶等)抑制剂的协同效应研发多靶点抑制剂是HDAC抑制剂研发的两个主要方向。
研究表明表观遗传酶的抑制剂能使肿瘤细胞对某些化疗药物更加敏感。在一些报道中，DNMT抑制剂、HDAC抑制剂分别与一些化疗药物联合使用显示出明显的协同效应。
DNMT和HDAC在生理功能上具有紧密的联系，一起影响抑癌基因的表达。一方面，研究表明低剂量的DNMT抑制剂和HDAC抑制剂联合使用具有协同效应。另一方面，研究发现单用DNMTs或HDACs的抑制剂时，另一个酶的高表达仍能导致肿瘤抑癌基因的沉默，这样的代偿机制使得肿瘤细胞产生耐药性，降低了治疗效果。联合使用虽然具有协同效应的优势，但也存在一些缺点，如使药代动力学更加复杂、产生药物相互作用、引发更多毒副作用等。而具有多靶点抑制活性的单个小分子能有效避免这些问题，研发多靶点抑制剂已成为一个常用的药物研发策略。
综上所述，同时靶向DNMT和HDAC的抑制剂可能能更有效地使沉默的抑癌基因重新表达，且使肿瘤细胞更难以产生耐药性，从而发挥更好的抗肿瘤效果。为此我们致力于开发同时具有DNMT和HDAC抑制活性的多靶点抑制剂。在核苷类DNMT抑制剂和异羟肟酸类HDAC抑制剂的结构基础上，我们采用药物分子片段组合的方法，开发了一类具有DNMT和HDAC抑制活性的核苷碱基异羟肟酸类多靶点抑制剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类具有DNMT和HDAC抑制活性的核苷碱基异羟肟酸类多靶点抑制剂及其制备方法。
本发明提供了式Ⅰ所示的异羟肟酸类化合物：
上述式I中，R为DNA和/或RNA里的核苷碱基、带取代基团的核苷碱基或核苷碱基类似物。
其中，所述核苷碱基选自下述任意一种：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶；
所述带取代基团的核苷碱基中，取代基团选自下述任意一种：卤素(氟，氯，溴，碘等)、烷基(甲基、乙基等)、硝基、乙酰基、丙烯酰基、巴豆酰基；
所述核苷碱基类似物选自下述任意一种：5-氮杂胞嘧啶、2-羟基嘧啶、6-甲基腺嘌呤；
优选地，R选自
上述式I中，Linker为连接R与异羟肟酸官能团的连接链。连接链包括但不限于C1-C20直链烷基链、C1-C20带支链的烷基链、带杂原子的烷基链、带芳香环的烷基链、带杂环的烷基链。
上述式I中，当R为胞嘧啶、尿嘧啶或它们的衍生物或类似物时，Linker连接在R的1号位氮原子上；当R为腺嘌呤、鸟嘌呤或它们的衍生物或类似物时，Linker连接在R的9号位氮原子上。
本发明也提供了上述式I所示化合物药学上可接受的盐或互变异构体。
其中，所述盐为无机酸盐或有机酸盐。
所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸或磷酸。
所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸。
本发明也提供了式II所示的异羟肟酸类化合物：
其中，R如上所述；
t是0、1、2或3；
m是2、3、4、5、6、7或8；
n是0、1、2或3；
在一些实施例中，t是1；
在一些实施例中，m是5或6；
在一些实施例中，n是0；
在一些实施例中，m、n和t的和是2～10的值；
本发明也提供了上述式II所示化合物药学上可接受的盐或互变异构体。
本发明也提供了式III所示的异羟肟酸类化合物：
其中，R和t如上所述；
m是2、3、4、5或6；
在一些实施例中，t是1；
在一些实施例中，m是3、4、5或6；
在一些实施例中，m和t的和是3～8的值；
本发明也提供了上述式II所示化合物药学上可接受的盐或互变异构体。
本发明也提供了式IV所示的异羟肟酸类化合物：
其中，R如上所述；
y是0、1、2或3；
z是1、2或3；
g是2、3、4、5、6、7或8；
X是氮或碳；
在一些实施例中，y是1；
在一些实施例中，z是2；
在一些实施例中，X是氮；
在一些实施例中，g是4、5或6；
在一些实施例中，y、z和g的和是3～8的值；
本发明也提供了上述式IV所示化合物药学上可接受的盐或互变异构体。
本发明也提供了式V所示的异羟肟酸类化合物：
其中，R、y、z、X如上所述；
s是0、1、2或3；
Y是链接苯环与异羟肟酸官能团的连接链，包括但不限于化学键、烷基、亚甲基、乙撑基、乙烯基、烷氧基、卤代烷基；
在一些实施例中，y是1；
在一些实施例中，z是2；
在一些实施例中，X是氮；
在一些实施例中，s是1；
在一些实施例中，Y是亚甲基、乙撑基或乙烯基；
本发明也提供了上述式V所示化合物药学上可接受的盐或互变异构体。
本发明也提供了上述式VI所示化合物药学上可接受的盐或互变异构体。
化合物可以以不同的多晶型物形式存在。
上述式I所示的异羟肟酸类化合物优选为下述任意一种：
本发明也提供了式I所示化合物的制备方法。
上述式I所示的异羟肟酸类化合物可以通过式IA所示化合物与羟胺或盐酸羟胺反应来制备；
其中R和Linker如上所述。反应一般是在缩合剂如苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)以及碱如三乙胺存在下、在溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中、在大约0℃至80℃温度下进行的。
或者，式I所示化合物可以通过式IA所示化合物与羟基带保护基团的羟胺如O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺在缩合剂作用下先反应生成式IB所示化合物，再由式IB所示化合物脱除保护基团后得到；
其中，R和Linker如上所述；P为羟胺中羟基的保护基团。制备式IB的反应一般是在缩合剂如苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)存在下、在溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中、在大约0℃至80℃温度下进行的。式IB脱除保护基团一般是在酸性条件下如加入盐酸、三氟乙酸或在碱性条件下如加入氢氧化钠、在溶剂如四氢呋喃中、在大约0℃至80℃温度下进行的。
或者，式I所示化合物可以通过式IC所示化合物与羟胺或盐酸羟胺在碱性溶液中反应来制备；
其中，R和Linker如上所述；A为烷基如甲基、乙基或异丙基。反应在水溶液或有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自下述至少一种：二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、氯仿、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、乙腈等。所述碱选自下述至少一种：氨水、三乙胺、二异丙基乙基胺、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等。所述反应的反应温度可为20-80℃，反应时间可为0.5-10小时。
在不描述中间体和起始原料合成的情况下，这些化合物是可商业购买的，或可以利用标准方法或利用本文实施例的扩展方法、由可商业化购买的化合物来制备。
本发明制备的化合物经过高分辨质谱，核磁共振，熔点等测试，证明所制备的化合物正确无误，为通式Ⅰ所示化合物。
本发明的再一个目的是提供式Ⅰ所示化合物及其药学上可接受的盐的应用。
本发明式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐的用途是其在下述方面的应用：
1)在制备DNA甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用；
2)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；
3)在制备预防和/或***药物中的应用。
所述DNA甲基转移酶(DNMTs)包括在哺乳动物细胞中已知的亚型(DNMT1，DNMT3A，DNMT3B)；所述组蛋白去乙酰化酶(HDACs)包括在哺乳动物细胞中已知的亚型，主要包括但不限于HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8，HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9，HDAC6，HDAC10，HDAC11。
所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为白血病癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞；优选为为人慢性髓原白血病细胞和人组织细胞淋巴瘤细胞。
所述白血病癌细胞具体为人慢性粒细胞白血病(CML)细胞系K562，所述淋巴瘤细胞具体为人组织细胞淋巴瘤细胞U937，所述肺癌细胞具体为人肺癌细胞NCI-H520，所述人脑胶质瘤细胞具体为U251，所述黑色素癌细胞具体为A375，所述胶质母细胞瘤细胞具体为人胶质母细胞瘤细胞A172和人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-118MG，所述***细胞具体为人***细胞系Hela，所述鼻咽癌细胞具体为鼻咽癌细胞株CNE-2，所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞株HepG2，所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。
所述肿瘤为癌；所述癌为白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、***、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
本发明式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐也可用于制备预防和/或***的药物。
以式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的预防和/或***的药物，也属于本发明的保护范围。
用式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐制备的DNA甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂以及预防和/或***的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
用式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐制备的预防和/或***药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供的化合物经过多种肿瘤细胞系测试(包括白血病细胞、淋巴瘤细胞等)以及DNA甲基转移酶，组蛋白去乙酰化酶抑制活性测试，证明式Ⅰ所示化合物是一种潜在的对DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶有抑制活性的抗肿瘤药物。本发明提供的化合物原料易得，制备方法简单，实验证明其有良好的抗癌效果，在抗肿瘤药物设计研发领域有着良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明的范围并不限定于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为有机合成的常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1
6-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例1A
6-叠氮己酸乙酯
将6-溴己酸乙酯(1eq)溶于DMF中，加入叠氮化钠(3eq)，由室温缓慢升温至80℃并在此温度下反应过夜。之后加入乙酸乙酯，过滤除去过量的叠氮化钠，加入水并以乙酸乙酯萃取。有机相经水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。过滤并用旋转蒸发仪旋除溶剂得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.05(q,J＝7.1Hz,2H),3.31(t,J＝6.8Hz,2H),2.29(t,J＝7.3Hz,2H),1.60–1.47(m,4H),1.38–1.27(m,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ173.26,60.18,51.05,33.91,28.46,26.16,24.52,14.64.
实施例1B
4-氨基-1-(丙-2-炔-1-烷)嘧啶-2(1H)-酮
将胞嘧啶(1eq)、3-溴丙炔(3eq)溶于无水DMF中，加入无水碳酸铯(2eq)，加热至80℃并反应过夜。反应结束后加入水并以乙酸乙酯萃取。有机相经水、饱和食盐水洗涤后以无水硫酸镁干燥。除去有机相的溶剂后以色谱柱分离得标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝7.7Hz,1H),6.64(d,J＝7.8Hz,1H),4.77(d,J＝2.5Hz,2H),3.49(t,J＝2.5Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.55,155.61,145.26,94.61,79.96,75.79,37.84.
实施例1C
6-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)己酸乙酯
将实施例1B(1eq)、实施例1A(1.2eq)溶于水和叔丁醇的混合溶液(体积比1:1)中，加入抗坏血酸钠(0.1eq)和五水硫酸铜(0.02eq)，在氮气保护下于60℃反应4h。经薄层色谱法(TLC)确认1B反应完全后加入适量的水，过滤得标题化合物。以水洗涤进一步纯化化合物或以柱色谱分离纯化化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(s,1H),7.67(d,J＝7.1Hz,1H),7.08(br,2H),5.68(s,1H),4.87(s,2H),4.30(t,J＝7.1Hz,2H),4.03(q,J＝7.1Hz,2H),2.26(t,J＝7.3Hz,2H),1.84–1.70(m,2H),1.59–1.46(m,2H),1.32–1.20(m,2H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ173.25,146.27,123.98,60.19,49.66,33.83,29.86,25.84,24.34,14.65.
实施例1D
6-(4-((4-氨基-2-氧络嘧啶-1(2H)-烷基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-烷基)-N-羟基己酰胺
将实施例1C(1eq)溶于甲醇或DMF中，加入盐酸羟胺(5eq)和叔丁醇钠(10eq)，室温下反应8h。经TLC确认1C反应完全后旋除溶剂。以柱色谱分离或于盐酸水溶液中结晶(pH值＝3)得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H),10.12(s,1H),9.59(s,1H),8.56(s,1H),8.14(s,1H),8.08(d,J＝7.5Hz,1H),6.12(d,J＝7.5Hz,1H),5.03(s,2H),4.33(t,J＝7.1Hz,2H),2.19(t,J＝7.3Hz,2H),1.89–1.69(m,2H),1.63–1.43(m,2H),1.39–1.10(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ174.80,149.75,141.92,124.28,94.22,49.84,44.22,34.00,29.92,25.94,24.38.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+322.1628,实测值322.1622.
实施例2
6-(4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例2A
4-氨基-5-氟-1-(丙-2-炔-1-基)嘧啶-2(1H)-酮
合成方法同实施例1B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(br,2H),4.44(d,J＝2.5Hz,2H),3.36(d,J＝2.5Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ158.31,158.18,153.91,137.54,135.14,129.87,129.57,79.62,76.02,38.14.
实施例2B
6-(4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)己酸乙酯
合成方法同实施例1C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.13–7.98(m,2H),7.67(s,1H),7.45(s,1H),4.85(s,2H),4.30(t,J＝7.1Hz,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.25(t,J＝7.3Hz,2H),1.79–1.75(m,2H),1.52(p,J＝7.4Hz,2H),1.26–1.18(m,2H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H).
实施例2C
6-(4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.47(s,1H),10.33(s,1H),10.27(s,1H),9.56(s,1H),8.67(d,J＝1.7Hz,1H),7.88(s,1H),4.95(s,2H),4.26(t,J＝7.2Hz,2H),1.92(t,J＝7.3Hz,2H),1.85–1.68(m,2H),1.57–1.43(m,2H),1.26–1.13(m,2H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ171.92,169.45,149.24,146.82,144.11,144.11,139.33,122.98,49.67,37.96,32.55,29.94,26.02,25.01,0.63.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+340.1533,实测值322.1529.
实施例3
6-(4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例3A
4-氨基-5-甲基-1-(丙-2-炔-1-基)嘧啶-2(1H)-酮
合成方法同实施例1B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.47(s,1H),7.02(br,2H),4.45(d,J＝2.5Hz,2H),3.31(t,J＝2.5Hz,1H),1.83(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.22,155.61,142.51,101.92,80.16,75.59,37.53,13.50.
实施例3B
6-(4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)己酸乙酯
合成方法同实施例1C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(s,1H),7.53(s,1H),4.87(s,2H),4.29(t,J＝7.1Hz,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.25(t,J＝7.4Hz,2H),1.81(s,3H),1.77–1.69(m,2H),1.52(p,J＝7.5Hz,2H),1.33–1.18(m,2H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).
实施例3C
6-(4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(s,1H),7.93(br,2H),7.81(s,1H),4.94(s,2H),4.31(t,J＝7.0Hz,2H),1.92(t,J＝7.3Hz,2H),1.88(s,3H),1.82–1.72(m,2H),1.56–1.44(m,2H),1.27–1.16(m,2H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+336.1784,实测值336.1782.
实施例4
6-(4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例4A
9-(丙-2-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺
合成方法同实施例1B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.20(s,1H),8.17(s,1H),7.32(s,2H),5.03(d,J＝2.5Hz,2H),3.49(t,J＝2.5Hz,1H).
实施例4B
6-(4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)己酸乙酯
合成方法同实施例1C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.22(br,2H),8.11(s,1H),7.24(br,2H),5.42(s,2H),4.30(t,J＝7.1Hz,2H),4.01(q,J＝7.1Hz,2H),2.24(t,J＝7.3Hz,2H),1.88–1.68(m,2H),1.62–1.41(m,2H),1.33–1.02(m,5H).
实施例4C
6-(4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.19(s,1H),8.14(s,1H),8.09(s,1H),7.24(s,2H),5.42(s,2H),4.30(t,J＝7.1Hz,2H),2.17(t,J＝7.3Hz,2H),1.85–1.70(m,2H),1.58–1.42(m,2H),1.26–1.13(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ174.85,156.50,153.08,149.85,142.96,141.16,123.95,119.11,49.79,38.58,33.98,29.91,25.92,24.37.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+346.1740,实测值346.1750.
实施例5
6-(4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例5A
1-(丙-2-炔-1-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
合成方法同实施例1B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H),7.70(d,J＝7.9Hz,1H),5.63(d,J＝7.8Hz,1H),4.51(d,J＝2.5Hz,2H),3.45(t,J＝2.5Hz,1H).
实施例5B
6-(4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)己酸乙酯
合成方法同实施例1C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.31(s,1H),8.07(s,1H),7.73(d,J＝7.8Hz,1H),5.58(dd,J＝7.9,2.2Hz,1H),4.92(s,2H),4.32(t,J＝7.1Hz,2H),4.03(q,J＝7.1Hz,2H),2.26(t,J＝7.4Hz,2H),1.88–1.72(m,2H),1.59–1.45(m,2H),1.30–1.18(m,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ173.24,164.18,151.26,145.95,142.78,123.93,101.78,60.19,49.75,42.90,33.82,29.82,25.82,24.33,14.65.
实施例5C
6-(4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),8.08(s,1H),7.73(d,J＝7.9Hz,1H),5.59(dd,J＝7.8,2.1Hz,1H),4.92(s,2H),4.32(t,J＝7.1Hz,2H),2.19(t,J＝7.4Hz,2H),1.90–1.70(m,2H),1.61–1.41(m,2H),1.33–1.18(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ174.83,164.20,151.26,145.97,142.77,123.93,101.78,49.79,42.91,33.98,29.92,25.95,24.38.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+323.1468,实测值323.1461.
实施例6
4-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基丁酰胺
实施例6A
甲基磺酸-4-乙炔基苄甲基酯
步骤1：将对碘苯甲酸甲酯(1eq)溶于适量THF中，加入催化量的二三苯基磷二氯化钯和碘化亚铜，以及三乙胺(2eq)和三甲基硅乙炔(2eq)，以氮气置换的方法除去溶剂中的氧气后，在氮气保护下于70℃反应过夜。以硅藻土过滤除去反应生成的沉淀物，往滤液中加入1M的四叔丁基氟化铵的THF溶液(2eq)并在室温下反应约1h。旋除THF并以水和乙酸乙酯萃取，保留有机相，旋除乙酸乙酯后得4-乙炔基苯甲酸甲酯。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.99(d,J＝8.7Hz,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),3.92(s,3H),3.23(s,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.45,132.12,130.22,129.50,126.81,82.85,80.05,52.30.
步骤2：将4-乙炔基苯甲酸甲酯(1eq)溶于THF中，冰浴下缓慢加入2.5M的氢化铝锂的THF溶液(2eq)，氮气保护下室温反应2h。反应结束后往反应体系中缓慢加入冰水以除去过量的氢化铝锂，之后以3M的盐酸水溶液将反应体系调至弱酸性。以***萃取得到4-乙炔基苯甲醇。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.49(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),4.70(s,2H),3.07(s,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ141.65,132.36,126.77,121.38,83.52,64.91,50.90.
步骤3：将4-乙炔基苯甲醇溶于DCM中，在-5℃下缓慢加入三乙胺(2eq)和甲基磺酰氯(1.2eq)并于此温度下反应30分钟，之后缓慢升温至室温反应2h。以饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，并以DCM萃取产物。有机相经无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂得标题化合物。不需进一步纯化而直接用于后续反应。
实施例6B
4-氨基-1-(4-乙炔基苄基)嘧啶-2(1H)-酮
将胞嘧啶(1eq)、实施例6A(1.2eq)、无水碳酸铯(1.5eq)溶于无水DMF中，室温下反应过夜。TLC确认胞嘧啶反应完全后加入水，并以DCM萃取。除去有机相中溶剂后得标题化合物。可通过在***中重结晶或通过柱色谱分离进一步纯化。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.69(d,J＝7.2Hz,1H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.24(d,J＝8.1Hz,2H),7.09(d,J＝31.1Hz,2H),5.67(d,J＝7.2Hz,1H),4.85(s,2H),4.18(s,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.50,156.23,146.51,139.49,132.31,128.20,121.15,94.24,83.78,81.28,51.62.
实施例6C
4-叠氮基丁酸乙酯
合成方法同实施例1A。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.15(q,J＝7.1Hz,2H),3.36(t,J＝6.7Hz,2H),2.41(t,J＝7.2Hz,2H),2.00–1.82(m,2H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.73,60.61,50.69,31.23,24.31,14.25.
实施例6D
4-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)丁酸乙酯
由实施例6B和实施例6C合成。反应条件为有机合成工艺中常用的Click反应所采用的反应条件。具体地，合成方法可参考实施例1C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.57(s,1H),7.80(d,J＝7.8Hz,2H),7.71(d,J＝7.1Hz,1H),7.33(d,J＝7.9Hz,2H),7.10(br,2H),5.71(br,1H),4.88(s,2H),4.42(t,J＝7.0Hz,2H),4.04(q,J＝7.1Hz,2H),2.34(t,J＝7.3Hz,2H),2.21–2.01(m,2H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.89,145.98,145.82,137.45,129.84,127.99,125.13,121.25,59.86,48.65,48.49,30.32,24.96,13.95.
实施例6E
4-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基丁酰胺
以实施例6D为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.43(s,1H),8.75(s,1H),8.59(s,1H),8.11(s,1H),7.89(d,J＝7.3Hz,1H),7.82(d,J＝8.0Hz,2H),7.60(s,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),5.87(s,1H),4.93(s,2H),4.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.16–2.04(m,2H),1.99(t,J＝7.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ173.54,167.95,164.14,146.91,145.90,136.70,130.08,128.07,125.18,121.26,51.14,48.97,28.91,25.66.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+370.1628,实测值368.1471.
实施例7
5-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1，2，3-***-1-基)-N-羟基戊酰胺
实施例7A
5-叠氮戊酸乙酯
合成方法同实施例1A。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.06(q,J＝7.1Hz,2H),3.22(t,J＝6.6Hz,2H),2.26(t,J＝7.2Hz,2H),1.68–1.48(m,4H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).
实施例7B
5-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)戊酸乙酯
合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(s,1H),7.79(d,J＝7.3Hz,2H),7.74(s,1H),7.34(d,J＝7.7Hz,2H),7.10(s,1H),4.94(s,2H),4.39(t,J＝6.9Hz,2H),4.03(q,J＝7.1Hz,2H),2.33(t,J＝7.4Hz,2H),1.95–1.73(m,2H),1.54–1.42(m,2H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.44,145.89,137.39,129.89,128.03,125.10,121.16,59.64,49.07,32.66,28.85,21.33,13.99.
实施例7C
5-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基戊酰胺
以实施例7B为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.39(s,1H),8.70(s,1H),8.55(s,1H),7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.71(d,J＝7.2Hz,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(s,1H),7.03(s,1H),5.68(d,J＝7.1Hz,1H),4.87(s,2H),4.39(t,J＝7.0Hz,2H),1.99(t,J＝7.3Hz,2H),1.93–1.76(m,2H),1.58–1.40(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.56,165.86,155.72,145.87,145.83,137.43,129.87,127.99,125.10,121.15,93.55,50.99,49.12,31.46,29.10,22.02.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+384.1784,实测值384.1779.
实施例8
6-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例8A
6-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)己酸乙酯
以实施例1A和实施例6B为原料，合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(s,1H),7.79(d,J＝7.9Hz,2H),7.71(d,J＝7.1Hz,1H),7.33(d,J＝7.9Hz,2H),7.09(br,2H),5.78(br,1H),4.88(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),1.97–1.78(m,2H),1.69–1.50(m,2H),1.31–1.21(m,2H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.61,145.88,145.81,137.40,129.91,127.99,125.09,121.11,59.55,49.24,33.18,29.13,25.20,23.73,13.99.
实施例8B
6-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基己酰胺
以实施例8A为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),8.70(s,1H),8.56(s,1H),7.80(d,J＝7.8Hz,2H),7.71(d,J＝7.2Hz,1H),7.33(d,J＝7.8Hz,2H),7.11(s,1H),7.03(s,1H),5.68(d,J＝7.2Hz,1H),4.87(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,2H),1.93(t,J＝7.3Hz,2H),1.89–1.72(m,2H),1.60–1.45(m,2H),1.32–1.16(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.77,165.87,155.72,145.88,145.83,137.42,129.90,127.99,125.09,121.12,93.55,51.00,49.28,31.93,29.21,25.36,24.37.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+398.1941,实测值398.1940.
实施例9
7-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
实施例9A
7-叠氮庚酸乙酯
合成方法同实施例1A。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.11(q,J＝7.1Hz,2H),3.25(t,J＝6.9Hz,2H),2.29(t,J＝7.5Hz,2H),1.72–1.50(m,4H),1.47–1.29(m,4H),1.24(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.70,60.29,51.41,34.24,28.72,28.68,26.44,24.82,14.30.
实施例9B
7-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)庚酸乙酯
合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.56(s,1H),7.79(d,J＝7.4Hz,2H),7.75(s,1H),7.34(d,J＝7.7Hz,2H),7.12(s,1H),4.93(s,2H),4.37(t,J＝7.1Hz,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.25(t,J＝7.3Hz,2H),1.84(t,J＝7.1Hz,2H),1.50(t,J＝7.2Hz,2H),1.37–1.20(m,4H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.68,145.87,137.35,129.94,128.02,125.10,121.10,59.52,49.33,33.28,29.29,27.66,25.39,24.11,14.01.
实施例9C
7-(4-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
以实施例9B为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),8.69(s,1H),8.57(s,1H),7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.71(d,J＝7.2Hz,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(s,1H),7.03(s,1H),5.68(d,J＝7.2Hz,1H),4.86(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,2H),1.92(t,J＝7.3Hz,2H),1.88–1.76(m,2H),1.54–1.38(m,2H),1.37–1.13(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.89,165.86,155.72,145.88,145.83,137.41,129.90,127.99,125.10,121.09,93.55,50.99,49.36,32.05,29.37,27.85,25.47,24.80.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+412.2097,实测值412.2090.
实施例10
7-(4-(4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
实施例10A
4-氨基-1-(4-乙炔基苄基)-5-氟代嘧啶-2(1H)-酮
合成方法同实施例6B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10(d,J＝6.7Hz,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.29(d,J＝8.2Hz,2H),4.81(s,2H),4.18(s,1H).
实施例10B
7-(4-(4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)庚酸乙酯
合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.57(s,1H),8.11(d,J＝6.6Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,2H),7.67(s,1H),7.44(s,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),4.83(s,2H),4.38(t,J＝7.0Hz,2H),4.03(q,J＝7.1Hz,2H),2.26(t,J＝7.3Hz,2H),1.92–1.74(m,2H),1.61–1.42(m,2H),1.36–1.20(m,4H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ173.30,158.12,157.99,154.60,146.46,137.56,131.06,130.75,130.62,128.70,125.71,121.74,60.13,51.82,49.94,33.88,29.89,28.27,25.99,24.72,14.62.19F NMR(376MHz,DMSO)δ-169.55.
实施例10C
7-(4-(4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
以实施例10B为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,1H),8.66(s,1H),8.57(s,1H),8.11(d,J＝6.7Hz,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,2H),7.67(s,1H),7.44(s,1H),7.36(d,J＝8.2Hz,2H),4.83(s,2H),4.37(t,J＝7.1Hz,2H),1.92(t,J＝7.4Hz,2H),1.88–1.76(m,2H),1.57–1.39(m,2H),1.33–1.19(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.56,158.14,158.02,154.62,146.50,137.58,137.44,135.04,131.08,130.78,130.65,128.72,125.74,121.73,51.85,49.99,32.68,30.00,28.48,26.10,25.43.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+430.2003,实测值430.2010.
实施例11
7-(4-(4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
实施例11A
4-氨基-1-(4-乙炔基苄基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮
合成方法同实施例6B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.55(s,1H),7.44(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝8.1Hz,2H),4.83(s,2H),4.17(s,1H),1.81(s,3H).
实施例11B
7-(4-(4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)庚酸乙酯
合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.56(s,1H),7.79(d,J＝7.9Hz,2H),7.58(s,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,2H),4.86(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,2H),4.03(q,J＝7.1Hz,2H),2.26(t,J＝7.3Hz,2H),1.95–1.69(m,5H),1.56–1.45(m,2H),1.32–1.21(m,4H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.68,165.38,155.56,145.89,143.16,137.48,129.90,128.02,125.09,121.08,59.52,50.81,49.33,33.28,29.29,27.66,25.39,24.11,14.00,12.89.
实施例11C
7-(4-(4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
以实施例11B为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,1H),8.66(s,1H),8.56(s,1H),7.79(d,J＝7.8Hz,2H),7.56(s,1H),7.33(d,J＝7.9Hz,2H),7.21(s,1H),6.72(s,1H),4.85(s,2H),4.37(t,J＝7.1Hz,2H),1.92(t,J＝7.3Hz,2H),1.90–1.74(m,5H),1.54–1.41(m,2H),1.35–1.19(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.56,166.17,156.28,146.53,143.72,138.17,130.51,128.65,125.72,121.69,51.45,49.99,32.68,30.00,28.48,26.10,25.43,13.56.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+426.2254,实测值426.2254.
实施例12
7-(4-(4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1H-1，2，3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
实施例12A
9-(4-乙炔基苄基)-9H-嘌呤-6-胺
合成方法同实施例6B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26(s,1H),8.13(s,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),7.26(br,2H),5.39(s,2H),4.19(s,1H).
实施例12B
7-(4-(4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)庚酸乙酯
合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(s,1H),8.29(s,1H),8.16(s,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.29(s,2H),5.39(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.25(t,J＝7.3Hz,2H),1.94–1.74(m,2H),1.59–1.43(m,2H),1.31–1.21(m,4H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.68,155.79,152.39,149.40,145.73,140.75,136.40,130.29,128.04,125.28,121.20,59.52,49.34,45.88,33.27,29.27,27.65,25.36,24.10,14.00.
实施例12C
7-(4-(4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
以实施例12B为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.32(s,1H),8.65(s,1H),8.55(s,1H),8.28(s,1H),8.15(s,1H),7.80(d,J＝7.9Hz,2H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.25(s,2H),5.39(s,2H),4.36(t,J＝7.1Hz,2H),1.91(t,J＝7.2Hz,2H),1.88–1.72(m,2H),1.58–1.39(m,2H),1.38–1.09(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.90,155.91,152.54,149.41,145.74,140.67,136.43,130.29,128.04,125.28,121.18,118.61,49.36,45.87,32.04,29.36,27.84,25.46,24.79.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+436.2209,实测值436.2203
实施例13
7-(4-(4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
实施例13A
1-(4-乙炔基苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
合成方法同实施例6B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(s,1H),7.77(d,J＝7.8Hz,1H),7.47(d,J＝7.8Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),5.61(d,J＝7.9Hz,1H),4.88(s,2H),4.20(s,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ163.51,150.89,145.45,137.66,131.87,127.55,120.91,101.35,83.03,80.87,49.96.
实施例13B
7-(4-(4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)庚酸乙酯
合成方法同实施例6D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.35(s,1H),8.57(s,1H),7.82(d,J＝7.9Hz,2H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(d,J＝7.9Hz,2H),5.61(d,J＝7.9Hz,1H),4.89(s,2H),4.37(t,J＝7.0Hz,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.25(t,J＝7.2Hz,2H),1.94–1.76(m,2H),1.56–1.45(m,2H),1.34–1.22(m,4H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.67,163.52,150.93,145.77,145.44,136.19,130.27,127.97,125.27,121.20,101.28,59.52,49.99,49.35,33.27,29.29,27.66,25.38,24.11,14.01.
实施例13C
7-(4-(4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-***-1-基)-N-羟基庚酰胺
以实施例13B为反应原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.35(s,1H),10.33(s,1H),8.66(s,1H),8.58(s,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,2H),7.79(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),5.61(d,J＝7.8Hz,1H),4.89(s,2H),4.38(t,J＝7.0Hz,2H),1.92(t,J＝7.3Hz,2H),1.89–1.75(m,2H),1.56–1.40(m,2H),1.38–1.16(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.92,163.53,150.93,145.78,145.46,136.20,130.26,127.97,125.28,121.19,101.29,49.99,49.38,32.05,29.37,27.85,25.47,24.80.高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+413.1937,实测值413.1945.
实施例14
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
实施例14A
4-((对甲苯磺酸酯)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
将4-(羟甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1eq)溶于无水吡啶中，在0℃条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯(1.1eq)。之后升温至室温并在此温度下搅拌反应16h。反应结束后往反应体系中加入水，并以乙酸乙酯萃取。有机相依次以5％的盐酸水溶液、水、饱和食盐水洗涤。之后以无水硫酸钠干燥有机相。过滤除去干燥剂后，除去有机相的溶剂得到标题化合物。无需纯化而直接用于后续反应。
实施例14B
4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶1-甲酸叔丁酯
将胞嘧啶(1eq)、实施例14A(1.1eq)、无水碳酸铯(1.1eq)溶于无水DMF中，80°下反应过夜。反应结束后过滤除去碳酸铯，并旋除DMF。加入水和乙酸乙酯萃取。有机相经除去溶剂后得到标题化合物。于***中重结晶或以柱色谱分离进一步纯化目标化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.51(d,J＝4.4Hz,1H),6.97(d,J＝32.6Hz,2H),5.60(d,J＝7.1Hz,1H),3.97–3.82(m,2H),3.53–3.47(m,2H),2.64(br,2H),1.93–1.81(m,1H),1.53–1.20(m,11H),1.12–0.94(m,2H).
实施例14C
4-氨基-1-(哌啶-4-亚甲基)嘧啶-2(1H)-酮盐酸盐
将实施例14B(1eq)溶于THF中，加入3M的盐酸水溶液(10eq)并于室温反应3h。反应结束后旋除反应体系中的溶剂。重新加入甲醇溶解产品，之后将甲醇旋除。重复2～3此后得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.72(s,1H),9.02(br,1H),8.82(br,1H),8.63(s,1H),8.01(d,J＝7.6Hz,1H),6.10(d,J＝7.6Hz,1H),3.68(d,J＝7.2Hz,2H),3.24(d,J＝12.5Hz,2H),2.79(q,J＝11.9Hz,2H),2.07–1.87(m,1H),1.74(d,J＝13.4Hz,2H),1.38(q,J＝10.9Hz,2H).
实施例14D
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酸甲酯
将实施例14C(1eq)溶于DMF或乙腈中，加入三乙胺(3eq)和对溴甲基肉桂酸甲酯(1.1eq)。室温反应过夜。旋除溶剂后柱色谱分离得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89–7.55(m,3H),7.51(d,J＝7.1Hz,1H),7.33(d,J＝7.8Hz,2H),6.95(br,2H),6.61(d,J＝16.0Hz,1H),5.59(d,J＝7.1Hz,1H),3.72(s,3H),3.50(d,J＝7.1Hz,2H),3.46(s,2H),2.77(d,J＝10.9Hz,2H),1.86(t,J＝11.3Hz,2H),1.77–1.57(m,1H),1.46(d,J＝12.6Hz,2H),1.31–1.09(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.22,166.36,156.40,146.99,144.91,129.59,128.75,117.78,93.19,62.39,54.52,53.28,51.94,35.29,29.76.
实施例14E
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
以实施例14D为原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.75(s,1H),9.04(s,1H),7.80–7.46(m,3H),7.43(d,J＝15.7Hz,1H),7.39–7.12(m,2H),7.00(s,1H),6.91(s,1H),6.44(d,J＝15.7Hz,1H),5.59(d,J＝7.1Hz,1H),3.50(d,J＝7.0Hz,2H),3.44(br,2H),2.78(br,2H),1.86(br,2H),1.69(br,1H),1.46(br,2H),1.22(br,2H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+384.2036,实测值384.2028。
实施例15
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
实施例15A
4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶1-甲酸叔丁酯
合成方法同实施例14B。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.40(d,J＝5.2Hz,1H),4.11(s,2H),3.74–3.57(m,2H),2.76–2.54(m,2H),2.11–1.90(m,1H),1.68–1.55(m,2H),1.43(s,9H),1.25–1.06(m,2H).
实施例15B
4-氨基-5-氟-1-(哌啶-4-亚甲基)嘧啶-2(1H)-酮盐酸盐
合成方法同实施例14C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.18(s,1H),9.04(br,1H),8.94–8.62(m,2H),8.41(d,J＝6.6Hz,1H),3.60(d,J＝7.2Hz,2H),3.28–3.15(m,2H),2.91–2.70(m,2H),2.09–1.90(m,1H),1.83–1.65(m,2H),1.49–1.30(m,2H).
实施例15C
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酸甲酯
合成方法同实施例14D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,J＝6.7Hz,1H),7.81–7.47(m,4H),7.34(s,2H),6.62(d,J＝16.1Hz,1H),3.72(s,3H),3.62–3.35(m,4H),2.96–2.63(m,2H),1.96–1.78(m,2H),1.77–1.61(m,1H),1.57–1.39(m,2H),1.36–1.06(m,2H).
实施例15D
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
以实施例15C为原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.74(s,1H),9.04(s,1H),7.91(d,J＝6.8Hz,1H),7.74–7.47(m,3H),7.43(d,J＝15.8Hz,1H),7.40–7.11(m,3H),6.43(d,J＝15.8Hz,1H),3.63–3.37(m,4H),2.88–2.68(m,2H),1.97–1.73(m,2H),1.73–1.58(m,1H),1.58–1.33(m,2H),1.33–1.06(m,2H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+402.1941,实测值402.1942.
实施例16
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
实施例16A
4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶1-甲酸叔丁酯
合成方法同实施例14B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.39(s,1H),7.11(br,1H),6.65(br,1H),3.91(d,J＝13.1Hz,2H),3.48(d,J＝7.2Hz,2H),2.70–2.56(m,2H),1.90–1.83(m,1H),1.80(s,3H),1.49–1.42(m,2H),1.39(s,9H),1.11–0.92(m,2H).
实施例16B
4-氨基-5-甲基-1-(哌啶-4-亚甲基)嘧啶-2(1H)-酮盐酸盐
合成方法同实施例14C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.81(s,1H),8.65(s,2H),7.87(s,1H),3.62(d,J＝7.2Hz,2H),3.24(d,J＝12.6Hz,2H),2.79(q,J＝11.7Hz,2H),2.05–1.96(m,1H),1.90(s,3H),1.72(dd,J＝13.7,3.4Hz,2H),1.50–1.31(m,2H).
实施例16C
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酸甲酯
合成方法同实施例14D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.84–7.58(m,3H),7.46–7.26(m,3H),7.08(s,1H),6.62(d,J＝16.0Hz,2H),3.72(s,3H),3.57–3.37(m,4H),2.88–2.69(m,2H),2.04–1.82(m,2H),1.79(s,3H),1.75–1.59(m,1H),1.56–1.38(m,2H),1.31–1.12(m,2H).
实施例16D
(E)-3-(4-((4-((4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
以实施例16C为原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.76(s,1H),9.04(s,1H),7.83–7.17(m,6H),7.09(s,1H),6.65(s,1H),6.44(d,J＝15.7Hz,1H),3.73–3.36(m,4H),2.91–2.68(m,2H),2.06–1.72(m,5H),1.72–1.61(m,1H),1.56–1.35(m,2H),1.31–1.05(m,2H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+398.2192,实测值398.2193.
实施例17
(E)-3-(4-((4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
实施例17A
4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
合成方法同实施例14B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.13(s,1H),8.10(s,1H),7.21(s,2H),4.04(d,J＝7.1Hz,2H),3.91(d,J＝13.0Hz,2H),2.78–2.55(m,2H),2.15–1.96(m,1H),1.45(d,J＝12.8Hz,2H),1.38(s,9H),1.17–0.99(m,2H).
实施例17B
9-(哌啶-4-亚甲基)-9H-嘌呤-6-胺盐酸盐
合成方法同实施例14C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.69(s,1H),9.20(s,1H),9.15–8.86(m,2H),8.58(s,1H),8.57(s,1H),4.20(d,J＝7.1Hz,2H),3.38–3.09(m,2H),2.86–2.66(m,2H),2.23–2.03(m,1H),1.76–1.58(m,2H),1.54–1.35(m,2H).
实施例17C
(E)-3-(4-((4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酸甲酯
合成方法同实施例14D。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.19(s,1H),8.11(s,1H),7.68(d,J＝16.1Hz,1H),7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),6.53(d,J＝16.0Hz,1H),4.14(d,J＝7.1Hz,2H),3.78(s,3H),3.61(br,2H),3.08–2.86(m,2H),2.24–2.03(m,2H),2.03–1.89(m,1H),1.70–1.53(m,2H),1.50–1.35(m,2H).
实施例17D
(E)-3-(4-((4-((6-氨基-9H-嘌呤-9-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
以实施例17C为原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.19(s,1H),8.10(s,1H),7.55(d,J＝15.9Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,2H),7.35(d,J＝7.9Hz,2H),6.45(d,J＝15.7Hz,1H),4.13(d,J＝7.1Hz,2H),3.56(s,2H),2.93(d,J＝11.5Hz,2H),2.05(t,J＝11.7Hz,2H),2.01–1.89(m,1H),1.64–1.50(m,2H),1.48–1.31(m,2H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+408.2148,实测值408.2146.
实施例18
(E)-3-(4-((4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
实施例18A
4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
合成方法同实施例14B。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),7.61(d,J＝7.8Hz,1H),5.53(d,J＝7.8Hz,1H),3.93(d,J＝13.0Hz,2H),3.54(d,J＝7.3Hz,2H),2.66(br,2H),1.96–1.77(m,1H),1.52(d,J＝12.9Hz,2H),1.39(s,9H),1.17–0.89(m,2H).
实施例18B
1-(哌啶-4-亚甲基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮盐酸盐
合成方法同实施例14C。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.29(s,1H),8.84(s,1H),8.56(s,1H),7.65(d,J＝7.8Hz,1H),5.57(dd,J＝7.8,2.3Hz,1H),3.59(d,J＝7.1Hz,2H),3.24(d,J＝12.8Hz,2H),2.93–2.68(m,2H),2.10–1.83(m,1H),1.70(d,J＝13.1Hz,2H),1.47–1.20(m,2H).
实施例18C
(E)-3-(4-((4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)丙烯酸甲酯
合成方法同实施例14D。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),7.73–7.56(m,4H),7.33(d,J＝7.9Hz,2H),6.61(d,J＝16.1Hz,1H),5.52(d,J＝7.8Hz,1H),3.72(s,3H),3.54(d,J＝7.1Hz,2H),3.46(s,2H),2.87–2.69(m,2H),1.97–1.81(m,2H),1.75–1.58(m,1H),1.58–1.43(m,2H),1.29–1.12(m,2H).
实施例18D
(E)-3-(4-((4-((2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺
以实施例18C为原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.24(s,1H),10.76(s,1H),9.04(s,1H),7.61(d,J＝7.8Hz,1H),7.52(d,J＝7.6Hz,2H),7.44(d,J＝15.8Hz,1H),7.35(s,2H),6.44(d,J＝15.9Hz,1H),5.53(dd,J＝7.8,2.2Hz,1H),3.84–3.36(m,4H),3.03–2.69(m,2H),2.13–1.78(m,2H),1.78–1.63(m,1H),1.62–1.37(m,2H),1.37–1.02(m,2H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+385.1876实测值385.1871.
实施例19
6-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)-N-羟基己酰胺
实施例19A
6-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)己酸乙酯
将实施例14C(1eq)、6-溴己酸乙酯(2eq)、碘化钾(0.5eq)溶于无水乙醇中，回流反应过夜。TLC确认14C反应完全后旋除有机溶剂并柱色谱分离得标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.56(d,J＝7.1Hz,1H),7.05(br,2H),5.64(d,J＝7.1Hz,1H),4.06(q,J＝7.1Hz,2H),3.54(d,J＝6.9Hz,2H),3.51–3.40(m,2H),3.07–2.91(m,2H),2.90–2.71(m,2H),2.34(t,J＝7.1Hz,2H),2.01–1.86(m,1H),1.80–1.59(m,4H),1.60–1.36(m,4H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).
实施例19B
6-(4-((4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)甲基)哌啶-1-基)-N-羟基己酰胺
以实施例19A为原料，合成方法同实施例1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.52(d,J＝7.1Hz,1H),7.08(s,1H),6.90(s,1H),5.62(d,J＝7.0Hz,1H),3.49(d,J＝7.2Hz,2H),2.80(d,J＝10.9Hz,2H),2.18(t,J＝7.3Hz,2H),1.88(t,J＝7.4Hz,2H),1.73(t,J＝10.9Hz,2H),1.69–1.59(m,1H),1.56–1.28(m,6H),1.28–0.99(m,4H).高分辨质谱(HRMS)(ESI)m/z计算值[M+H]+338.2192,实测值338.2190.
实施例20、MTT法细胞增殖抑制活性测试
体外细胞增殖抑制实验采用MTT法，采用以下两种细胞系：人慢性粒细胞白血病(CML)细胞系K562，人组织细胞淋巴瘤细胞U937。
K562和U937为悬浮细胞，用含体积分数为10％胎牛血清的RPIM-1640培养液，在37℃、体积分数为5％的CO2条件下常规培养。
具体操作如下：
首先，将实施例1-19制备获得的化合物(即样品)分别配制成化合物浓度为5mM/L的DMSO(二甲基亚砜)溶液，然后将获得的溶液经梯度稀释，得到一系列浓度梯度的样品溶液。
接着，取对数生长期的K562细胞或者U937细胞，以1.5×105个/mL的的细胞密度接种于96孔板中，99μL/孔，接着每孔加入样品溶液1μL，使样品作用终浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，25，50μM。每种样品、每个浓度设三个复孔，并且设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组分别加入阳性对照药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA和DNA甲基转移酶抑制剂SGI-027，阴性对照组加入与样品溶液同浓度的DMSO，空白对照组不加细胞。作用72h后加入MTT溶液，10μL/孔，继续培养4小时后，于2000rpm、4℃下离心5分钟，吸去上清后加入二甲基亚砜(DMSO)，100μL/孔，于37℃保温约10分钟，然后用微量振荡器振荡约5分钟，使结晶溶解完全，用酶标仪于490nm处测量OD值。
细胞增殖抑制率(Inhibition Rate，IR％)按如下公式计算：
IR％＝(阴性对照OD－样品OD)/(阴性对照OD-空白对照OD)×100％，
经过计算，得到本发明所制备的化合物的体外细胞增殖抑制活性，结果见表1。其中，IC50大于50μM以“-”表示，IC50大于10μM并小于50μM以“+”表示，IC50大于5μM并小于10μM以“++”表示，IC50大于1μM小于5以“+++”表示，小于1以“++++”表示。结果表明大部分化合物对U937增殖的抑制作用好于对K562的增殖抑制作用。其中化合物10、11、13和15对U937的IC50小于5μM，化合物12和17对U937的IC50小于1μM，表现出良好的抗肿瘤增殖效果。
表1实施例1～19制备的化合物的体外肿瘤细胞增殖抑制活性
注：IC50表示半数抑制浓度。
实施例21、DNA甲基转移酶抑制活性试验
使用同位素标记的S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)测试化合物在50μM时对DNA甲基转移酶(DNMT1，DNMT3A，DNMT3B)的抑制活性,并以S-腺苷高半胱氨酸(SAH)做对照。预先将化合物和相应的一定量的DNA甲基转移酶亚型混合，室温下孵育15min后，加入人工合成的生物素标记的寡核苷酸底物和3H-SAM并于室温下反应4h。接着将反应体系转移到链霉亲和素包被的高通量孔板中，室温反应1h。放射性活性通过液体闪烁计数法得到。通过和阴性对照组(无抑制剂组)比较得到化合物对酶的抑制活性。化合物在50μM条件下对DNMT的抑制率如表2所示。其中抑制率小于20％以“-”表示，抑制率大于20％且小于50％以“+”表示，抑制率大于50％小于80％以“++”表示，抑制率大于80％以“+++”表示。测试结果表明大部分化合物对DNA甲基转移酶具有抑制作用，且对DNA甲基转移酶的不同亚型抑制率不同。其中，化合物6、7、8、9和11对DNMT1的抑制作用大于对DNMT3A/3B的抑制作用，而化合物16和17对DNMT3A/B的抑制活性则强于对DNMT1的抑制活性。
表2实施例1～19制备的化合物的DNA甲基转移酶抑制活性
实施例22、组蛋白去乙酰化酶抑制活性试验
以组蛋白去乙酰化酶家族的两个亚型HDAC1和HDAC6为研究对象，测试化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性，每个化合物设十个浓度梯度，三个复孔，并以已上市的HDAC抑制剂SAHA做对照。首先将化合物溶解到反应缓冲液中，之后加入一定体积的含组蛋白去乙酰化酶的缓冲溶液，室温孵育15分钟后加入胰蛋白酶和乙酰化的肽缓冲溶液作为反应底物以启动脱乙酰化反应，同时使化合物浓度和酶含量达到设定值，轻轻混合60秒后室温孵育，记录1个小时内一定激发光和发射光波长下反应的动力参数。通过和阴性对照组(无抑制剂组)比较得到化合物对酶的抑制活性，并计算得到化合物对组蛋白去乙酰化酶的半数抑制浓度(IC50)。结果如表3所示，其中，IC50大于1000nM以“-”表示，IC50大于100nM且小于1000nM以“+”表示，IC50大于50小于100nM以“++”表示，IC50大于10小于50nM以“+++”表示，IC50小于10nM以“++++”表示。由测试结果可知大部分化合物抑制HDAC1/6的IC50值小于100nM，其中化合物9、10、11、12和13具有个位数纳摩尔级别活性，与已上市药物SAHA活性相当。
表3实施例1～19制备的化合物的组蛋白去乙酰化酶抑制活性
注：IC50表示半数抑制浓度。
Claims (6)
1.式Ⅰ所示核苷碱基异羟肟酸类化合物或其可药用盐或互变异构体,
其中：
R为核苷碱基、带取代基团的核苷碱基或核苷碱基类似物；
Linker为连接R与异羟肟酸官能团的连接链，
Linker选自：
其中
t为1、2或3；
m为1、2、3、4、5、6、7或8；
y为0、1、2或3；
z为1、2或3；
g为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
X选自氮或碳；
Y为链接苯环与异羟肟酸官能团的连接链，选自烷基、亚甲基、烯基、乙撑基、乙烯基、烷氧基、卤代烷基；
核苷碱基类似物选自下述任意一种：5-氮杂胞嘧啶、2-羟基嘧啶、6-甲基腺嘌呤；
所述式I所示化合物选自下述任意一种：
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐；
所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸和磷酸；
所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸。
3.权利要求1-2任一项中式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐或互变异构体在制备下述产品中的应用：
1)DNA甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂；
2)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；
3)预防和/或***药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述DNA甲基转移酶包括在哺乳动物细胞中已知的亚型,DNMT1，DNMT3A和DNMT3B；
所述组蛋白去乙酰化酶包括在哺乳动物细胞中已知的亚型HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8，HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9，HDAC6，HDAC10和HDAC11；
所述真核生物为哺乳动物；
所述肿瘤细胞为癌细胞；
所述癌细胞为白血病癌细胞、淋巴瘤细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、***细胞、鼻咽癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞；
所述白血病癌细胞为人慢性粒细胞白血病(CML)细胞系K562；
所述淋巴瘤细胞为人组织细胞淋巴瘤细胞U937；
所述肺癌细胞为人肺癌细胞NCI-H520和A549；
所述人脑胶质瘤细胞为U251；
所述黑色素癌细胞为A375；
所述胶质母细胞瘤细胞为人胶质母细胞瘤细胞A172或人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-118MG；
所述***细胞为人***细胞系Hela；
所述鼻咽癌细胞为人鼻咽癌细胞株CNE-2；
所述肝癌细胞为人肝癌细胞株HepG2；
所述乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231；
所述肿瘤为癌；
所述癌为白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、***、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
5.一种产品，其活性成分为权利要求1-2任一项中式I所示化合物或其药学上可接受的盐或互变异构体；
其中，所述产品为：
1)DNA甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂；
2)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；
3)预防和/或***药物。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：
所述DNA甲基转移酶包括在哺乳动物细胞中已知的亚型DNMT1，DNMT3A和DNMT3B；
所述组蛋白去乙酰化酶包括在哺乳动物细胞中已知的亚型HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8，HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9，HDAC6，HDAC10和HDAC11；
所述真核生物为哺乳动物；
所述肿瘤细胞为癌细胞；
所述癌细胞为白血病癌细胞、淋巴瘤细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、***细胞、鼻咽癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞；
所述白血病癌细胞为人慢性粒细胞白血病细胞系K562；
所述淋巴瘤细胞为人组织细胞淋巴瘤细胞U937；
所述肺癌细胞为人肺癌细胞NCI-H520和A549；
所述人脑胶质瘤细胞为U251；
所述黑色素癌细胞为A375；
所述胶质母细胞瘤细胞为人胶质母细胞瘤细胞A172或人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-118MG；
所述***细胞为人***细胞系Hela；
所述鼻咽癌细胞为人鼻咽癌细胞株CNE-2；
所述肝癌细胞为人肝癌细胞株HepG2；
所述乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231；
所述肿瘤为癌；
所述癌为白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、***、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
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