CN106872694A - 一种血红蛋白的检测方法及血红蛋白检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血红蛋白的检测方法及血红蛋白检测试剂盒，利用样本中血红蛋白浓度达到一定量时，会形成HOOK效应，随着浓度继续增高，HOOK效应增强，形成反向抑制效应，反向抑制效应在一定范围呈规律递增，通过研究血红蛋白双抗体夹心HOOK效应的“钩状”区域，优化样本稀释，创新突破了免疫层析技术因HOOK效应而无法直接检测的难点，从而准确快速的检测血红蛋白的含量，弥补该领域的空缺，为现场检测及家庭检测提供便捷；所述检测方法通过一步稀释并裂解血液样本法，良好的控制了在人体可获得范围内血红蛋白含量在HOOK效应区呈良好的剂量曲线规律。

Description

一种血红蛋白的检测方法及血红蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术分析检测领域，尤其是一种血红蛋白的检测方法及血红蛋白检测试剂盒。
背景技术
现阶段，血红蛋白的检测方法包括：硫酸铜滴定法进行血红蛋白测定，或者采用进口大型生化分析仪进行测定。前者存在自行配制误差大、易受环境温度影响等缺点,后者仪器价格昂贵,测试成本高。国外常用的测试方法为试剂盒和干式生化分析法,试剂盒法需要大型生化分析仪,干式生化分析法产品主要有德国的Re-flotronⅣ型全血干式生化分析仪和瑞典的SWELAB血液分析仪,采用的均是波长比色法,所需采血量较大,测试时间长,成本高。
免疫层析胶体金技术的优点是微创取样，取样量少，成本低，检测快，准确度高，适用于现场及家庭检测，而目前市场上未出现免疫层析技术检测血红蛋白含量的产品，其技术难点在于血红蛋白双抗体夹心存在HOOK效应，因此目前免疫层析双抗体技术还是主要集中在潜血，隐血的检测项目中。
Hook效应是指在双位点夹心免疫试验中，其剂量反应曲线的高剂量区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，此现象称之为HOOK效应。目前对于血红蛋白的免疫学检测，一般需要多步稀释才能使其处于线性范围内，但这样造成的误差势必会加大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种血红蛋白的检测方法。
本发明所要解决的技术问题在于提供一种实现上述检测方法的血红蛋白检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种血红蛋白的检测方法，采用免疫夹心法进行检测，具体步骤如下：标记有胶体金颗粒的第一抗体结合血液中释放的血红蛋白后，借助毛细作用力向前层析，层析至硝酸纤维素膜包被的第二抗体(即固相载体)时，形成“胶体金颗粒-抗体-抗原-抗体”的复合体系，并且聚集于硝酸纤维素膜上，胶体金颗粒大量聚集时可形成***的信号，通过仪器能够准确定量判读检测信号的强度，从而实现定量检测,所述第一抗体为抗人血红蛋白抗体，第二抗体为配对的血红蛋白抗体，所述第一抗体和第二抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，从而形成复合体系。
在低剂量范围内，随着血红蛋白含量增多，检测信号增强，呈正相关性，当样本中血红蛋白超过一定量时，便不可避免的发生HOOK效应，即随着血红蛋白浓度的增加，检测信号递减，在一定范围呈负相关性。
一种实现上述检测方法的血红蛋白检测试剂盒，包括由血红蛋白检测试纸、外置卡壳、样本裂解液以及内设了相应标准曲线和判定方法的IC卡，其中，
所述血红蛋白检测试纸，宽度为3-5mm，长度为7-8cm，所述检测试纸由含有胶体金标记的抗人血红蛋白抗体的胶体金垫、包被有T线和C线(即包被有配对的血红蛋白抗体和抗鼠IgG)的硝酸纤维素膜(NC膜，为多孔结构膜，孔径为8-15um)、样品垫、吸样垫和塑料底板组成，所述T线为配对的血红蛋白抗体，C线为抗鼠IgG，所述抗人血红蛋白抗体作为第一抗体标记有胶体金颗粒，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端；
所述外置卡壳，包含上盖和下盖，两条所述血红蛋白检测试纸平行放置于所述下盖内部，所述上盖对应样品垫部分设置有样品孔，用于加入样本和 稀释液，上盖对应硝酸纤维素膜中部位置设置有视窗口，用于观察硝酸纤维素膜上的C线、T线，判定结果。
所述样本裂解液，主要配方为：0.02M Tris-HCL，0.15molNaCL，1％Triton100调节PH至7.4。
所述IC卡，内置了标准曲线和判定方法，标准曲线通过多次试验结果绘制得到,该IC卡配套使用NS3001B型免疫层析结果判读记录仪(天津中新科炬生物制药有限公司产品)使用，用于对检测结果的定量判定，具体来说,血红蛋白试纸判读测定得到信号值,利用IC卡将信号值与浓度值进行转换从而得到浓度值,对血红蛋白检测范围为50-250g/L。
优选的，上述血红蛋白检测试剂盒，所述吸样垫为吸水滤纸。
优选的，上述血红蛋白检测试剂盒，所述包被有配对抗体的硝酸纤维素膜的制备方法为：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将配对的血红蛋白抗体配制成终浓度1-2mg/mL，将喷膜仪在硝酸纤维素膜上以1.2-1.4ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在硝酸纤维素膜上部包被1-2mg/ml的抗鼠IgG，作为C线，干燥，备用。
优选的，上述血红蛋白检测试剂盒，所述胶体金垫的制备方法为：取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.0-8.0，再加入1-2mg标记用血红蛋白抗体，室温搅拌1小时，封闭，12000rpm离心30分钟，弃上清，用工作液复溶至60ml，然后用喷金机分别均匀地喷涂在无纺布或玻纤上，干燥备用。
试纸盒装配方法为：在相对湿度小于30％的条件下，取塑料底板，将已包被血红蛋白配对抗体的NC膜粘贴在底板的中部，在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴样品垫；在NC膜C线一侧粘贴吸样垫；各粘贴组分接口相互叠压1-2mm，粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条。然后将试纸条分别放置于塑料卡壳下盖的槽中，然后盖上上盖，压紧，形成试纸盒。
上述血红蛋白检测试剂盒的操作方法为：检测时将10ul的血液样本加入到1ml样本裂解液中，混匀，等待2分钟，从样本裂解液中取100μL加入血红蛋白检测试剂卡中的加样端，在15-20分钟内，用NS3001B型免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。
本发明的有益效果是：
所述血红蛋白检测试剂盒及方法，用来检测人全血样本中的血红蛋白含量,具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、适合现场检测等优点。利用样本中血红蛋白浓度达到一定量(1g/L)时，会形成HOOK效应，随着浓度继续增高，HOOK效应增强，形成反向抑制效应，反向抑制效应在一定范围呈规律递增，通过研究血红蛋白双抗体夹心HOOK效应的“钩状”区域，优化样本稀释，创新突破了免疫层析技术因HOOK效应而无法直接检测的难点，从而准确快速的检测血红蛋白的含量，弥补该领域的空缺，为现场检测及家庭检测提供便捷；所述检测方法通过一步稀释并裂解血液样本法，良好的控制了在人体可获得范围内(50-250g/L)血红蛋白含量在HOOK效应区呈良好的剂量曲线规律，将50-250g/L进行logistic四参数曲线拟合，求得线性回归方程，相关系数|r|值良好。
附图说明
图1为血红蛋白含量与检测信号值剂量关系计量曲线图；
图2为血红蛋白含量与检测信号值剂量关系线性分析图(1-250g/L)；
图3为血红蛋白含量与检测信号值剂量关系线性分析图(50-250g/L)图；
图4为血红蛋白检测试纸的结构示意图，图中，1-胶体金垫 2-T线 3-C线 4-硝酸纤维素膜 5-样品垫 6-吸样垫；
图5为外置卡壳的结构示意图，图中，S-上盖 A-样品孔 B-视窗口。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
一种实现上述检测方法的血红蛋白检测试剂盒，包括由血红蛋白检测试纸(如图4所示)、外置卡壳(如图5所示)、样本裂解液以及内设了相应标准曲线和判定方法的IC卡，其中，
所述血红蛋白检测试纸，宽度为3-5mm，长度为7-8cm，所述检测试纸由含有胶体金标记的抗人血红蛋白抗体的胶体金垫1、包被有T线2和C线3(即包被有配对的血红蛋白抗体和抗鼠IgG)的硝酸纤维素膜4(NC膜，为多孔结构膜，孔径为8-15um)、样品垫5、吸样垫6和塑料底板(图略)组成，所述T线为配对的血红蛋白抗体，C线为抗鼠IgG，所述抗人血红蛋白抗体作为第一抗体标记有胶体金颗粒，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端，其中，
所述吸样垫为吸水滤纸，
所述硝酸纤维素膜包被有配对抗体的的方法为：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将配对的血红蛋白抗体配制成终浓度1-2mg/mL，将喷膜仪在硝酸纤维素膜上以1.2-1.4ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在硝酸纤维素膜上部包被1-2mg/ml的抗鼠IgG，作为C线，干燥，备用，
所述胶体金垫的制备方法为：取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.0-8.0，再加入1-2mg标记用血红蛋白抗体，室温搅拌1小时，封闭，12000rpm离心30分钟，弃上清，用工作液复溶至60ml，然后用喷金机分别均匀地喷涂在无纺布(也可以是玻纤)上，干燥备用；
所述外置卡壳，包含上盖S和下盖(图略)，两条所述血红蛋白检测试纸平行放置于所述下盖内部，所述上盖对应样品垫部分设置有样品孔A，用于加入样本和稀释液，上盖对应硝酸纤维素膜中部位置设置有视窗口B，用于观察硝酸纤维素膜上的C线、T线，判定结果。
所述样本裂解液，主要配方为：0.02M Tris-HCL，0.15molNaCL， 1％Triton100调节PH至7.4。
所述IC卡，内置了标准曲线和判定方法，标准曲线通过多次试验结果绘制得到,该IC卡配套使用NS3001B型免疫层析结果判读记录仪(天津中新科炬生物制药有限公司产品)使用，用于对检测结果的定量判定，具体来说,血红蛋白试纸判读测定得到信号值,利用IC卡将信号值与浓度值进行转换从而得到浓度值,对血红蛋白检测范围为50-250g/L。
上述试纸盒装配方法为：在相对湿度小于30％的条件下，取塑料底板，将已包被血红蛋白配对抗体的NC膜粘贴在底板的中部，在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴样品垫；在NC膜C线一侧粘贴吸样垫；各粘贴组分接口相互叠压1-2mm，粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条。然后将试纸条分别放置于塑料卡壳下盖的槽中，然后盖上上盖，压紧，形成试纸盒。
上述血红蛋白检测试剂盒的操作方法为：检测时将10ul的血液样本加入到1ml样本裂解液中，混匀，等待2分钟，从样本裂解液中取100μL加入血红蛋白检测试剂卡中的加样端，在15-20分钟内，用NS3001B型免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。
实施例2
1材料
1.1本发明实施例1所述血红蛋白检测试剂盒
1.2 Hb企业内控品：人血红蛋白干粉，购自Sigma，产品货号：H7379，称取干粉由纯水稀释为高浓度后，再由过滤羊血清按梯度稀释至0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、20g/L。企业内控品50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L为人定值全血。
1.3临床样本：由公司在相关医院获得，共120份，其中确诊为贫血病人全血样本60份，Hb检测值从60-90g/L。正常人血清样本60份，Hb检测值从110-160g/L。
1.3实验仪器：天津中新科炬生物制药有限公司NS3001B型免疫层析结果判读记录仪。
2方法
Hb企业内控品浓度0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、20g/L、50g/L、100g/L、200g/L、250g/L，各浓度点吸取10μL，分别加入1mL样本裂解液中，混匀，2分钟后，吸取100μL加入到试剂卡的加样端，每个浓度点设三个重复，15-20分钟内，使用NS3001B型免疫层析结果判读记录仪分别记录检测结果。
3结果
检测结果见下表1。
表1血红蛋白内控品的检测结果
根据上表1所得数据，以浓度值为X轴，所得信号值的平均值为Y轴，做剂量曲线，如图1所示，0.05-0.5g/L浓度范围内，随血红蛋白浓度增加检测信号值增强；0.5-1g/L附近，随血红蛋白浓度增加，检测信号值变化不 显著；1-250g/L浓度范围内，随血红蛋白浓度增加检测信号减弱。表明：1-250g/L浓度范围内，处于显著地“HOOK”效应负相关区，且呈一定的相关性。
根据以上所述，将1-250g/L的剂量曲线利用ELISACalc软件做logistic四参数曲线拟合分析。如图2所示，根据曲线拟合方程分析，如表2所示，相关系数r^2值为0.999.表明利用HOOK效应区1-250g/L检测血红蛋白含量，存在良好的剂量曲线规律。
表2四参数Logistic曲线拟合
由于正常人血红蛋白含量在110-160g/L范围内，对于严重贫血患者，血红蛋白含量不低于30g/L，因此鉴于临床意义及样本的可获得性，采用本方法发明的试剂装置用于检测50-250g/L范围内血红蛋白含量，对贫血患者的筛查提供科学依据。根据表1所得数据，将50-250g/L的剂量曲线利用ELISACalc软件做logistic四参数曲线拟合分析。如图3所示，根据曲线拟合方程分析，如表3所示，相关系数r^2值为0.999.表明在50-250g/L范围内检测血红蛋白含量，存在良好的剂量曲线规律。
表3四参数Logistic曲线拟合
临床样本检测：对120份临床全血进行检测，加样方式同上所述，其中57例检测为贫血，58例检测为正常值。和临床相比，阳性、阴性预期值为100％，另5例为可疑结果。综合结果的一致率为95.8％。定量检测效果较好。通过以上结果可以判定本方法应用于免疫层析夹心法检测血红蛋白含量结果可信，实现了现场、家庭快速、便捷检测等优点。
上述参照实施例对该一种血红蛋白的检测方法及血红蛋白检测试剂盒进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种血红蛋白的检测方法，其特征在于：采用免疫夹心法进行检测，具体步骤如下：标记有胶体金颗粒的第一抗体结合血液中释放的血红蛋白后，借助毛细作用力向前层析，层析至硝酸纤维素膜包被的第二抗体时，形成“胶体金颗粒-抗体-抗原-抗体”的复合体系，并且聚集于硝酸纤维素膜上，胶体金颗粒大量聚集时可形成***的信号，通过仪器能够准确定量判读检测信号的强度，从而实现定量检测,所述第一抗体为抗人血红蛋白抗体，第二抗体为配对的血红蛋白抗体，所述第一抗体和第二抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，从而形成复合体系。
2.一种实现权利要求1所述检测方法的血红蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括由血红蛋白检测试纸、外置卡壳、样本裂解液以及内设了相应标准曲线和判定方法的IC卡，其中，
所述血红蛋白检测试纸，宽度为3-5mm，长度为7-8cm，所述检测试纸由含有胶体金标记的抗人血红蛋白抗体的胶体金垫、包被有T线和C线的硝酸纤维素膜、样品垫、吸样垫和塑料底板组成，所述T线为配对的血红蛋白抗体，C线为抗鼠IgG，所述抗人血红蛋白抗体作为第一抗体标记有胶体金颗粒，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端；
所述外置卡壳，包含上盖和下盖，两条所述血红蛋白检测试纸平行放置于所述下盖内部，所述上盖对应样品垫部分设置有样品孔，用于加入样本和稀释液，上盖对应硝酸纤维素膜中部位置设置有视窗口，用于观察硝酸纤维素膜上的C线、T线，判定结果；
所述样本裂解液，主要配方为：0.02M Tris-HCL，0.15molNaCL，1％Triton100调节PH至7.4；
所述IC卡，为内置了标准曲线和判定方法的IC卡，该IC卡配套使用NS3001B型免疫层析结果判读记录仪使用，用于对检测结果的定量判定，对血红蛋白检测范围为50-250g/L。
3.根据权利要求2所述的血红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述吸样垫为吸水滤纸。
4.根据权利要求2所述的血红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述包被有配对抗体的硝酸纤维素膜的制备方法为：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液将配对的血红蛋白抗体配制成终浓度1-2mg/mL，将喷膜仪在硝酸纤维素膜上以1.2-1.4ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在硝酸纤维素膜上部包被1-2mg/ml的抗鼠IgG，作为C线，干燥，备用。
5.根据权利要求2所述的血红蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金垫的制备方法为：取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH7.0-8.0，再加入1-2mg标记用血红蛋白抗体，室温搅拌1小时，封闭，12000rpm离心30分钟，弃上清，用工作液复溶至60ml，然后用喷金机分别均匀地喷涂在无纺布或玻纤上，干燥备用。
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