CN101825640A - 一种胶体金免疫层析定性定量两用检测hcg试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶体金免疫层析定性定量两用HCG检测试纸,包括:散布有胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物的结合垫;和分析膜,所述的分析膜上按层析流向依次定点分布有含HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体的定性线、质控线和定量线。不仅能够实现定性检测,灵敏度达25IU/L,而且具有定量功能,克服了现有检测试纸因HCG含量过高而产生的倒钩现象,在不稀释待测样品的情况下,通过配套相应的定量检测仪进行检测,线性范围可达到100~15000IU/L,这有效避免了对样品进行预先稀释可能带来的不便和差错,检测精度高、准确度好,满足临床检验的要求。
Description
技术领域
本发明属体外免疫诊断试剂领域。
背景技术
人绒毛膜***(HCG)是由绒毛合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素,囊胚期着床后即开始产生。于***受精的7-10天即可在孕妇的尿液中检测出HCG,此后随着孕期的增加HCG的浓度将迅速增高,倍增时间为1.98天。异位妊娠尿HCG上升较缓慢,若怀孕的最初3-6周,HCG不能持续以每天66%的速度递增,应考虑异位妊娠或先兆流产的可能性。故尿HCG动态定量检测可作为异位妊娠随访监控指标,对早期异位妊娠的诊断具有重要意义。
目前,临床上主要通过超声波检查、HCG放射免疫测定、后穹窿穿刺、诊断性***、腹腔镜等技术对异位妊娠进行诊断,但上述方法都需要特殊的仪器设备,对操作人员和环境也有一定的要求,普遍应用受限。现有的胶体金免疫层析技术以其简便、快速的优势已经在临床医学检验中占据一席之地,通过该方法测定HCG也早已广泛应用于早孕的检查及异位妊娠的诊断。常规HCG定性检测卡由两条线组成,由下至上分别为检测线、质控线。测定时,若检测线和质控线均出现红色可判定为阳性,若仅质控线出现红色为阴性,质控线不显色则为无效。
但是,目前的胶体金免疫层析技术定性检测HCG也有其局限性,典型的如,文献《尿HCG动态定量测定的临床意义》(中国当代医学,2005年3月第3卷第3期,第20-21页)和文献《尿HCG动态定量监测早孕的临床意义》(武警医学,2003年9月第14卷第9期,第543-545页)使用了一种GuanGoldTM检测板及稀释液,其检测HCG的反应原理是基于免疫层析夹心原理的一种快速一步法免疫检测,该法采用纯化的单一克隆抗体以胶体金标记成金标联结物和包被到膜基上的多克隆抗体作为夹心捕捉物,标本加入检测板,若标本中含有HCG,那么这些抗原与金标联结物结合,该结合物沿膜基迁移通过测定时,被多克隆抗体捕获,而在膜基上形成一条暗红色线条;若标本中不含HCG或HCG含量不同,所产生的暗红色线条的色泽亦不同。随着HCG含量的增加,暗红色的色泽愈深。免疫反应后利用SC一1金标试条定量测定仪来测定检测板检线的色泽密度,能够定量测定出标本中的HCG含量。试剂的最低检出浓度为10IU/L,最高检出浓度为800IU/L。然而,由于HCG变化相当大,故两篇现有技术文献均指出该试剂在使用中必须先对检测样品进行一定的稀释。现有技术的最高检测范围有限的原因是,在高浓度HCG样品的检测结果中,容易出现“倒钩效应(hook effect)”,即样品HCG检测浓度在达到最高检测范围的上限后,HCG的测得值反而随浓度上升而下降,在临床诊断上,造成血中HCG低水平的误判,而当这种病人的血清稀释后进行检测,则会发现其HCG水平实际很高,使对病人的治疗出现意想不到的问题。这种倒钩效应的存在,使“高浓度HCG样品的检测必须通过稀释实现”成为本领域的一种共识。
由于试纸设计中必须考虑使定量检测的上限尽量提高,故常常会使检测下限相应提高而牺牲了试纸的灵敏度,而这对在同一张试纸上实现定性检测是不利的,因为定性试纸着重于要求比较低的检测下限,如:25IU/L,以保证灵敏度。所以,现有技术中的检测试纸难以在同一种试纸上实现定性和定量检测。
发明内容
本发明所解决的技术问题
本发明在上述现有HCG试纸定量检测试纸的基础上,提供一种胶体金免疫层析定性、定量两用HCG检测试纸,不但克服现有定量检测试纸因HCG含量过高而产生的倒钩现象,而且检测范围达到100~15000IU/L,避免了对检测样品进行预先稀释所可能带来的不便和差错,检测精度高、变异系数小。在实现定性检测的同时,通过配套相应的定量检测仪实现定量检测。
技术方案
本发明的第一个方面是提供一种胶体金免疫层析定性定量两用HCG检测试纸,包括:
散布有胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物的结合垫;和
分析膜,所述的分析膜上按层析流向依次定点分布有含HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体的定性线、质控线和定量线;
其中,所述的HCG检测试纸在用于定性检测时灵敏度可达25IU/L,且在不稀释待测样品下定量检测线性范围为100~15000IU/L。
如本文所述,本发明中的“胶体金”是指特定粒径的纳米金颗粒,其一种实现方式是制备氯金酸的水溶液,在还原剂的作用下,聚合成粒径为3nm-80nm的纳米金颗粒,并由于静电的作用而成为一种稳定的胶体状态。所述纳米金颗粒对绿光具有较强的吸收特性,因此用作表示生物免疫反应的标记物。据推测但不限定所述“胶体金”的情形下,所述纳米金颗粒标记参与了蛋白等高分子被吸附到金颗粒表面的包被过程,其吸附机理可能是利用它在碱性条件下带负电荷的性质,与蛋白质分子的正电荷基团靠静电吸引而牢固结合,因而金标抗体或第二抗体(二抗,如羊抗鼠IgG抗体)具有良好的稳定性。
上述的HCG检测试纸的一种优选方案为,所述的试纸还包括底板、吸水垫和样品垫,且相互次序依次为底板、吸水垫、分析膜、结合垫和样品垫。
上述的HCG检测试纸的另一种优选方案为,所述的底板材料为PVC塑料,所述的吸水垫材料为植物纤维滤纸,所述的分析膜材料为硝酸纤维素膜,所述的结合垫材料为玻璃纤维素膜,以及,所述的样品垫的材料为玻璃纤维素膜。
如本文所述,本发明中的“样品垫”是检测过程中滴加被检样品的部位;
如本文所述,本发明中的“结合垫”中固定有胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物,在加入被检样品后,其可在试纸条上发生免疫反应;
如本文所述,本发明中的“分析膜”是免疫层析试纸条的关键和核心,HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体被固定于膜的具***置,而形成定性或定量检测带和质控带;
如本文所述,本发明中的“吸水垫”在整个检测过程中,通过虹吸作用提供液体流过整个试纸条的动力。
如本文所述,本发明中的“底板”为整个试纸条提供固定形状的支撑和其他试纸部件的附着。
上述的HCG检测试纸的又一种优选方案为,所述的胶体金颗粒的平均粒径为3nm-80nm,优选10nm-50nm,更优选20nm-40nm。
本发明的试纸条的再一种优选方式为,所述免疫层析试纸置于试纸条外壳中。试纸条外壳上有加样孔和结果扫描窗,两者分别对应于试纸条的样品垫和分析膜上定性线、质控线盒定量线的部分。样品溶液从加样孔滴加于试纸条上,经过一定时间,一般为3-5分钟,也能够是10分钟以上的反应后,即可定性观测结果或用免疫层析定量仪定量测量。
本发明的第二个方面是提供一种本发明第一个方面所述的检测试纸的制备方法,包括如下步骤:
a)所述胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物的制备:将HCG单克隆抗体标记于平均粒径为3nm-80nm胶体金颗粒表面,用硼酸缓冲液离心洗涤,浓缩至原体积的1/2-1/50,冷藏保存;
b)所述样品垫的制备:将样品垫材料浸入含BSA和表面活性剂的PBS处理缓冲液,取出30-42℃烘干;
c)所述结合垫的制备:将步骤a)制备的胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物分散于含蔗糖和BSA的PBS缓冲液中,并均匀分散于结合垫材料上,30-42℃烘干;
d)所述分析膜的制备:将所述HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体定点涂在分析膜材料的不同位置,依次作为定性线、质控线、定量线,30-42℃烘干;和
e)所述检测试纸的组装:将吸水垫和步骤a)-d)所制备的分析膜、结合垫、样品垫依照重叠关系固定于底板上,并切成试纸条。
上述的检测试纸的制备方法的一种优选方案为,所述步骤e)中的重叠关系为:所述底板在最底下,其上为所述的分析膜,在所述分析膜上靠近定量线的一端重叠所述吸水垫,在所述分析膜上靠近定性线的一端重叠所述结合垫,在所述结合垫上重叠样品垫。
本发明的第三个方面是提供一种定性检测HCG的方法,依次包括如下步骤:将待测样品与本发明的第一个方面所述的HCG检测试纸的样品垫接触,待所述待测样品浸润吸水垫后静置并判断检测结果:定性线和质控线出现红色为阳性;定性线、质控线、定量线三条线均出现红色为强阳性;仅质控带出现红色为阴性;质控带不显色为试纸失效。
在本发明的一种实施方式中,将检测样品滴加到样品垫上,样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫,使其中的纳米金颗粒-抗原抗体结合物重新溶解游离,并在吸水垫的虹吸作用下,离开结合垫进入分析膜,在分析膜内部向吸水垫方向流动。此过程中纳米金颗粒-抗原抗体结合物、第二抗体、检测带(包括定性带和定量带)、质控带之间将发生特异的免疫反应,将纳米金颗粒固定于检测带和质控带上,从而产生可定量检测的信号,如绿光。检测带上固定的纳米金颗粒数量与样品中的抗原的含量有关。
本发明的第四个方面是提供一种定量检测HCG的方法,依次包括如下步骤:
1)将HCG抗原标准品稀释,配置成系列浓度标准品,将所述标准品与本发明的第一个方面所述的HCG检测试纸的样品垫接触,待所述待测样品浸润吸水垫后静置并通过免疫层析定量仪测定获得定量线与质控线信号强度的比值,绘制相应的标准曲线;
2)按照标准1)的方法检测待测样品,获得定量线与质控线信号强度的比值,并利用标准曲线求得所述待测样品的HCG浓度。
在上述步骤1)的免疫反应过程中,待测样品中目标被检物HCG抗原的存在与否以及存在量决定了通过免疫反应结合于检测带上的纳米金颗粒的量,从而建立了目标被检物浓度与纳米金颗粒产生信号强度之间的线性对应关系;通过免疫层析定量仪对免疫层析试纸条纳米金颗粒信号的测量而实现微观免疫反应的精确定量检测。
如本文所述,本发明的“免疫层析定量仪”是一种基于反射光度计法的,通过反射光度计法检测免疫层析试纸条(或金标条)上标记有纳米金颗粒的抗原或抗体的分布状态,并进行分析和处理,给出样品中目标被检物的浓度的光电检测仪器。
本发明所述的免疫层析定量仪的工作原理之一,但不仅限于此原理,是利用贵金属金在尺寸减小到纳米量级时表现出强烈的吸收特性。例如,本发明的纳米金颗粒对绿光具有较强的吸收特性,免疫层析定量仪通过测量纳米金颗粒标记的免疫层析试纸条表面的漫反射光,分别计算出其上检测带,如定量线的吸收光密度(T_OD)和质控线的吸收光密度(C_OD),通过T_OD/C_OD比值得到最终检测结果。
上述的定量检测HCG的方法的一种优选方案为,所述免疫层析定量仪测定获得定量线与质控线信号强度的比值的方法为:所述免疫层析定量仪中的核心控制板根据所得到的信号分布曲线分别计算出定量线的光密度T_OD和质控线的光密度C_OD,并利用公式T/C=T_OD/C_OD计算,获得定量线与质控线信号强度的比值。
在本发明的一种实施方式中,通过对系列浓度的标准样品进行检测,得到一系列的T/C值。把纵坐标Y作为标准样品浓度,横坐标X作为仪器检测得到的响应值T/C,以基于最小二乘原理的线性回归分析法拟合出免疫层析定量仪器的线性标准工作曲线Y=kX+b。在对实际样品进行检测时,只要得到响应值T/C即可依据标准工作曲线计算出样品中被检物的浓度值。
本发明的第五个方面是提供一种定量检测HCG的装置,包括本发明的第一个方面所述的HCG检测试纸和一种免疫层析定量仪,其中,所述免疫层析定量仪由光学***、检测平台、数据采集***及控制***组成;所述免疫层析定量仪工作时,光源发出的光,例如,采用发光二极管作为照明光源,典型的如中心波长为525nm,对试纸条照明,光信号接收器将试纸条成像于CCD图像传感器光敏面上,CCD图像传感器输出的图像信号经数据采集***进入核心控制板,在核心控制板中对图像信号进行分析与处理,获得试纸条上的信号分布曲线,所述信号分布曲线包括对应于定性线、质控线、定量线的峰。
在本发明的另一种实施方式中,所述的免疫层析定量仪用于测量标记有纳米胶体金颗粒的免疫层析试纸条上检测带与质控带对绿光的吸收程度,是一种基于反射光度计原理的光学生物传感器。
在本发明的又一种实施方式中,所述的免疫层析定量仪的内部集成了可充电电池、微型打印机等部件,是一种便携式的快速检测仪器。同时它还带有USB接口,可将数据输入电脑并联网。
有益效果
本发明的检测试纸可供医学临床机构和家庭个人进行HCG的定性、定量测定,其定性检测灵敏度为25IU/L,同时在不稀释检测样品(如尿液)的前提下,通过配套相应的定量检测仪可实现定量检测,线性范围达100~15000IU/L,克服了现有定量检测试纸因HCG含量过高而产生的倒钩现象,避免了对样品进行预先稀释所可能带来的不便和差错。
附图说明
图1本发明的免疫层析试纸的一种表现形式是由底板1、吸水垫2、分析膜3、结合垫4和样品垫5按照一定的重叠关系固定于粘性底板上而制成,分析膜上按层析流向依次定点分布有定性线6、质控线7和定量线8,结合垫上散布有胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物9。
图2免疫层析定量仪由光学***10、检测平台11、数据采集***12及控制***13组成,在核心控制板中对图像信号进行分析与处理,获得试纸条上的信号分布曲线14,信号分布曲线包括对应于质控线7、定量线8的峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1人绒毛膜***(HCG)免疫层析试纸的制备
1、胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物的制备
将HCG单克隆抗体标记于制备好的平均粒径为3nm-80nm的胶体金颗粒表面,用0.002M硼酸缓冲液(含1.0%蔗糖,1%BSA)离心洗涤,浓缩至原体积的1/2-1/50,一般为1/10,4℃保存。
2、免疫层析试纸的制备
2.1样品垫的制备:选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料,将其放入样品垫处理液(0.01mol/LPBS(pH=7.4),含有1%BSA,0.1%Triton X-100)中浸泡,于30-42℃,一般于37℃烘干备用。
2.2结合垫的制备:选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料,将上述制备的胶体金-HCG抗体复合物重新分散于0.01mol/L PBS(pH=7.4,含5%蔗糖,1%BSA)中,并喷于结合垫上,于30-42℃,一般于37℃烘干备用。
2.3分析膜(硝酸纤维素膜或NC膜)的制备:用点膜仪在NC膜的定性线、质控线、定量线的不同位置喷点HCG单抗或羊抗鼠IgG抗体,自下至上依次为定性线、质控线、定量线,于30-42℃,一般于37℃烘干备用。
2.4检测试纸的组装:步骤2.1-2.3所制备的分析膜、结合垫、样品垫依照图1的重叠关系将吸水垫、NC膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上,并切成4cm宽的试纸条,装在试纸条外壳中,制成带结果扫描窗和加样孔的检测卡。
实施例2定性检测60份临床病人尿液样品及结果判断
将50份阳性尿液样品和10份阴性尿液样品作为待测样品,分别滴加到检测卡的加样孔中,静置10min,观察结果有23份在定性线和质控线出现红色,为阳性样品;有27份在定性线、质控线、定量线三条线均出现红色,为强阳性样品;10份样品仅质控带出现红色,为阴性样品(HCG浓度小于25IU/L)。在试验中,质控带不显色为无效。
实施例3定量检测25份临床病人样品
1、将HCG抗原的标准品溶液用正常人尿液作为稀释液,配置系列浓度标准品如下:0IU/L,25IU/L,100IU/L,300IU/L,500IU/L,800IU/L,1000IU/L,3000IU/L,5000IU/L,8000IU/L,10000IU/L,和15000IU/L。
2、将待测标准品滴加到检测卡的加样孔中,10min后通过定量检测仪读出定量线与质控线信号强度的比值(每个样品分别用3个检测卡测定3次,取平均值),绘制相应的标准曲线。
3、利用上述标准曲线设置免疫层析定量检测仪的内置标准曲线。
4、按照上述步骤2的方法检测25份临床病人样品,求得临床样品中HCG的含量。
Claims (10)
1.一种胶体金免疫层析定性定量两用HCG检测试纸,包括:
散布有胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物的结合垫;和
分析膜,所述的分析膜上按层析流向依次定点分布有含HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体的定性线、质控线和定量线;
其中,所述的HCG检测试纸在用于定性检测时灵敏度为25IU/L,且在不稀释待测样品下定量检测线性范围为100~15000IU/L。
2.如权利要求1所述的HCG检测试纸,其特征在于,所述的试纸还包括底板、吸水垫和样品垫,且相互次序依次为底板、吸水垫、分析膜、结合垫和样品垫。
3.如权利要求1所述的HCG检测试纸,其特征在于,所述的底板材料为PVC塑料,所述的吸水垫材料为植物纤维滤纸,所述的分析膜材料为硝酸纤维素膜,所述的结合垫材料为玻璃纤维素膜,以及,所述的样品垫的材料为玻璃纤维素膜。
4.如权利要求1所述的HCG检测试纸,其特征在于,所述的胶体金颗粒的平均粒径为3nm-80nm。
5.一种权利要求1所述的检测试纸的制备方法,包括如下步骤:
a)所述胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物的制备:将HCG单克隆抗体标记于平均粒径为3nm-80nm胶体金颗粒表面,用硼酸缓冲液离心洗涤,浓缩至原体积的1/2-1/50,冷藏保存;
b)所述样品垫的制备:将样品垫材料浸入含BSA和表面活性剂的PBS处理缓冲液,取出30-42℃烘干;
c)所述结合垫的制备:将步骤a)制备的胶体金标记的HCG单克隆抗体复合物分散于含蔗糖和BSA的PBS缓冲液中,并均匀分散于结合垫材料上,30-42℃烘干;
d)所述分析膜的制备:将所述HCG单克隆抗体或羊抗鼠IgG抗体定点涂在分析膜材料的不同位置,依次作为定性线、质控线、定量线,30-42℃烘干;和
e)所述检测试纸的组装:将吸水垫和步骤a)-d)所制备的分析膜、结合垫、样品垫依照重叠关系固定于底板上,并切成试纸条。
6.权利要求5所述的检测试纸的制备方法,其特征在于,所述步骤e)中的重叠关系为:所述底板在最底下,其上为所述的分析膜,在所述分析膜上靠近定量线的一端重叠所述吸水垫,在所述分析膜上靠近定性线的一端重叠所述结合垫,在所述结合垫上重叠样品垫。
7.一种定性检测HCG的方法,依次包括如下步骤:将待测样品与权利要求1所述的HCG检测试纸的样品垫接触,待所述待测样品浸润吸水垫后静置并判断检测结果:定性线和质控线出现红色为阳性;定性线、质控线、定量线三条线均出现红色为强阳性;仅质控带出现红色为阴性;质控带不显色为试纸失效。
8.一种定量检测HCG的方法,依次包括如下步骤:
1)将HCG抗原标准品稀释,配置成系列浓度标准品,将所述标准品与权利要求1所述的HCG检测试纸的样品垫接触,待所述待测样品浸润吸水垫后静置,并通过免疫层析定量仪测定获得定量线与质控线信号强度的比值,绘制相应的标准曲线;
2)按照标准1)的方法检测待测样品,获得定量线与质控线信号强度的比值,并通过内置工作曲线直接读取所述待测样品的HCG浓度。
9.如权利要求8所述的定量检测HCG的方法,其特征在于,所述免疫层析定量仪测定获得定量线与质控线信号强度的比值的方法为:所述免疫层析定量仪中的核心控制板根据所得到的信号分布曲线分别计算出定量线的光密度T_OD和质控线的光密度C_OD,通过T_OD/C_OD比值得到最终检测结果。
10.一种定量检测HCG的装置,包括权利要求1所述的HCG检测试纸和一种免疫层析定量仪,其中,所述免疫层析定量仪由光学***、检测平台、数据采集***及控制***组成;所述免疫层析定量仪工作时,光源发出的光对试纸条照明,光信号接收器将试纸条成像于CCD图像传感器光敏面上,CCD图像传感器输出的图像信号经数据采集***进入核心控制板,在核心控制板中对图像信号进行分析与处理,获得试纸条上的信号分布曲线,所述信号分布曲线包括对应于定性线、质控线、定量线的峰。
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