CN102636646A

CN102636646A - 快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法

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Publication number: CN102636646A
Application number: CN2012101522902A
Authority: CN
Inventors: 秦爱建; 钱琨; 梁有志; 尹丽萍; 邵红霞; 金文杰
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明提供了一种快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法。所说的试纸条由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫、吸水滤纸和PVC底板构成。其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗禽白血病抗原的单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。上述试纸条包括胶体金标记抗体、喷金、制作硝酸纤维素膜和组装的步骤。本发明的试纸条用于检测样本中的禽白血病抗原，从而可以用于禽白血病检测和诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，3-10分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门和出入境禽白血病的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

Description

快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法。

背景技术：

1.胶体金快速诊断技术的原理

胶体金（Colloidal gold），是由金离子还原而成的许多单个金颗粒组成的悬乳液，胶体金颗粒是有一个基础的晶核（原子金周围包含有11个金原子的二十面体）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl₂ ^-），外层离子层H⁺则分散在胶体间溶液（见图1）。金颗粒表面所包围的阴性电荷层，叫做zata电位，可以使胶体金颗粒之间相互排斥而使悬浮液保持稳定。

胶体金颗粒可以从5-150nm不等，制备胶体金仍基于还原法，常用的有鞣酸、柠檬酸三钠、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等各种有机或无机化合物。还原剂的浓度和还原力越高，那么所合成的胶体金颗粒就越小。胶体金2-5nm是桔黄色，10-20nm是酒红色，大颗粒30-64nm是深红色。小分子的胶体金颗粒基本上是圆球形，30-80nm为偏心圆形。

胶体金标记，实质上就是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的过程。蛋白质与金颗粒的结合机制大概有以下几个方面：带负电荷的金颗粒与蛋白质上的带正电的一些带正电荷的氨基酸反应，如赖氨酸；其次，蛋白质通过疏水作用吸附于金颗粒表面；通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。在标记后需要加入一定量的稳定剂，常用的稳定剂有牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、明胶和干酪素等封闭金颗粒未被占据的位点以减少非特异性反应并稳定悬胶溶液。

胶体金免疫快速诊断技术是在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、层析分析技术、胶体金标记技术和新材料技术基础上完善起来的一项固相标记新型免疫检测技术。胶体金快速诊断技术是以胶体金作为示踪物或显色剂，将胶体金标记在抗体上，再利用抗原抗体的血清学反应原理，把金颗粒连接到抗原上，当抗原抗体反应处达到一定密度时（即金颗粒10⁷个/mm²），出现肉眼可见的红色斑点。胶体金标记抗体实质是抗体被吸附到胶体金颗粒表面的过程，且这种吸附属于物理吸附，对抗体的生物活性影响很小，易获得较高的标记率；另外胶体金不属于生物活性物质，干扰检测结果的因素大大减少。目前在检验中的应用主要有2种形式：穿流形式，又称为胶体金免疫渗滤试验(Dot-immunogoldfiltration assay，DIGFA)；另一种为侧向横流形式，又称为胶体金免疫层析试验(Gold immunochromatography assay，GICA)。胶体金免疫渗滤试验始于1985年，最初以酶作为标记物。1989年Splelberg以胶体金为标记物成功检测了艾滋病病毒(HIV)抗体，确立了免疫渗滤试验的基本技术，即主要以层析微孔膜(硝酸纤维素膜，称NC膜)为固相载体，在NC膜上固定已知的抗原或抗体，封闭包被后，将其装入免疫渗滤装置(塑料小盒)中，加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。塑料小盒一般为扁平形，里面装满吸水材料，盒分为底和盖两部分，盖的中央有一直径0.4~0.8cm孔，小孔下紧贴吸水垫料放置硝酸纤维素膜。

胶体金免疫层析技术原理与免疫渗滤技术基本一致，只是将原来的渗滤改为层析。它同样以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上移动，并同时使样品中的待测物质与层析材料上待测物的受体发生高特异高亲和性的免疫反应。层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过直接可目测的标记物胶体金而得到直观的实验现象（如显色），而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。

2.禽白血病

禽白血病病毒可引起禽类各种良性和恶性肿瘤，为反转录病毒科。依据病毒囊膜糖蛋白的抗原性差异、病毒干扰实验、宿主范围和基因组的特性，禽白血病病毒已分类至10个亚群，分别命名为A至J亚群。本病尚无切实可行的治疗方法，也没有有效的疫苗。因此对本病最理想的防制措施是培育无ALV感染鸡群。

禽白血病由Roloff于1868年首次报道，之后很快蔓延至世界许多国家，我国于二十世纪五十年代在甘肃首次发现，此后几乎蔓延到了每个省份。近年来，禽白血病在肉仔鸡群中的流行逐渐减少，而在蛋鸡和地方品种中的流行有加重趋势，发病率在5%-20%，给养鸡业带来了极大经济损失和威胁。目前，国内外已经建立了很多禽白血病的检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、PCR及RT-PCR、原位杂交（ISH）、间接免疫荧光（IFA）等，这些方法各有优缺点。本专利应用两株抗ALV P27蛋白的特异性单克隆抗体5D3和4F12研制了ALV快速检测试纸条，证明该试纸条能够快速、准确地检测ALV病毒抗原，具有良好的特异性和较高的灵敏性。

培育无ALV感染鸡群时，首先对母鸡检测其蛋清中的P27抗原，选择不***ALV的母鸡的种蛋孵化，然后对孵出的仔鸡检测其泄殖腔拭子中的P27抗原。淘汰抗原和抗体阳性鸡，集中抗原和抗体阴性鸡于洁净的环境中饲养，并在生长期中及性成熟时，再对所有ALV亚群进行病毒抗原和抗体的检查，这样可逐步建立起无ALV感染鸡群。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种快速检测禽白血病抗原的试纸条：由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸和PVC底板构成，依次将NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸依次粘贴在PVC底板上，并且它们的接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗禽白血病抗原的单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。

上述的试纸条可以和塑料卡组成更便于使用的试纸条，所说的塑料卡分为底座和面盖两部分；底座上有一个放试纸条的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿；面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿；观察窗旁边分别印有字母T和C,T表示检测线，在近加样孔一侧，C表示对照线，在远加样孔一侧。

本发明的快速检测禽白血病抗原的试纸条可通过以下步骤制备：

（1）胶体金标记抗体：在胶体金上标记抗禽白血病抗原特异性单克隆抗体5D3；

（2）喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

（3）制作硝酸纤维素膜：将兔抗鼠IgG和抗禽白血病抗原的单克隆抗体4F12分别喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；

（4）将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装在PVC底板上，然后切条得试纸条。

上述方法中，所说的抗禽白血病抗原的单克隆抗体为筛选优化后的特异性单克隆抗体5D3和4F12。

本发明的试纸条能用于检测泄殖腔棉试、病料悬液、蛋清、细胞培养等材料样本中的病毒抗原，从而对禽白血病进行诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，3-10分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门、家禽育种公司和出入境禽白血病的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

附图说明

图1.胶体金颗粒结构。

图2.试纸条组装示意图；

1-PVC底板；2-样品垫；3-免疫金垫；4-NC膜；5-吸水垫；T-检测线；C-对照线。

图3.试纸条检测结果图解。

图4.试纸条特异性试验。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明中抗禽白血病抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株5D3和4F12由扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室保存。（尹丽萍等，《禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体的研制及其双夹心ELISA方法的建立》；中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集，2012.4）

一、主要材料制备方法概述

1.1抗禽白血病抗原的单克隆抗体的制备

以原核表达的禽白血病抗原免疫8周龄Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选和建立稳定分泌高亲和力、高特异性的抗禽白血病抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(5D3，4F12)。采用体内诱生腹水法进行单克隆抗体制备，并用GE公司HiTrap Protein G预装柱进行纯化。以高亲和力和高特异性的单克隆抗体为基础，保证了检测试纸的敏感性与特异性。

1.2兔抗鼠IgG的制备

将小鼠IgG免疫2kg左右家兔，3次足底和皮下注射免疫后，当血清琼脂凝胶沉淀试验(AGP)效价≥1:40时采血，分离血清。然后以饱和硫酸盐盐析法和凝胶层析法提取兔抗鼠IgG。

1.3胶体金的制备

用柠檬酸三钠还原法制备粒径约为15nm的胶体金，4℃保存。

1.4检测方法的建立

采用细胞工程技术和现代免疫学技术制备、筛选、纯化高亲和力特异的单克隆抗体，以柠檬酸三钠还原法制备优选标准的胶体金，将纯化的单抗和胶体金按比例进行标记。以高亲和力特异的单克隆抗体和胶体金技术为基础，根据双抗体夹心层析原理进行设计，将胶体金标记单抗吸附于实验筛选的玻璃纤维，将检测线(抗禽白血病抗原的单克隆抗体)和对照线(兔抗鼠IgG)固化于筛选的硝酸纤维素膜，而后连同其它所需的吸水纤维、支撑材料、覆盖材料等按照设计工艺进行制作和组装，制成快速检测试纸，并进行严格的质量检验合格后，用于快速检测。

二、快速检测试纸生条产工艺

2.1生产过程

2.1.1抗禽白血病抗原的单克隆抗体的制备

2.1.1.1制备

将抗禽白血病抗原的单克隆抗体5D3和4F12杂交瘤细胞系分别置5%二氧化碳培养箱内37℃培养。Balb/c小鼠(接种细胞前10日注射灭菌液体石蜡0.5m1)腹腔内注射杂交瘤细胞10⁶-10⁷个，1周后抽取腹水，ELISA效价应≥1:10⁴。用饱和硫酸铵盐析法提纯单抗，用PB 4℃透析24-48小时，然后用GE公司的HiTrapProtein G纯化，透析后置-20℃保存。

2.1.1.2检验

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测蛋白纯度应>90%，用分光光度计法检测蛋白含量应不低于1.5mg/ml，用间接ELISA法检测效价应>1:10⁵

2.1.2兔抗鼠IgG的制备及检验

2.1.2.1制备

将小鼠IgG与福氏完全佐剂乳化后，对2kg左右家兔进行脚掌皮内注射；两周后弗氏不完全佐剂乳化后背部皮下注射；最后腘***内注射加强免疫。当血清AGP效价≥1:40时采血，分离血清。然后用饱和硫酸盐盐析法和凝胶层析法提取兔抗鼠IgG。

2.1.2.2检验

用AGP法检测效价应≥1:40。

2.1.3检测线和对照线的制备及检验

2.1.3.1硝酸纤维素膜(NC膜)印迹(简称NC印膜)，购自上海杰一生物技术有限公司。

2.1.3.1.1NC膜

宽度为2.5cm，（不确定为5um）流速101-169s/4cm。

2.1.3.1.2制备

将NC膜放Bio-Dot三维喷点平台上展平，并放上压条，分别将抗禽白血病抗原的单克隆抗体4F12和兔抗鼠IgG放在两个贮存池中。开机后，抗禽白血病抗原的单克隆抗体4F12及兔抗鼠IgG分别呈线条状喷于NC膜上形成检测线和对照线。置室温自然干燥后，用BSA-PB溶液37℃温育2小时，然后用PBT洗涤三次，每次10min，待室温干燥后再抽真空。

2.1.4胶体金标记的单克隆抗体玻璃棉的制备及检验

2.1.4.1胶体金的制备及检验

2.1.4.1.1制备

各取200m1去离子水置于1000m1洁净的锥形瓶中煮沸，弃去沸水，以预热***，重新加入400ml，加入4ml 1%氯金酸溶液，待煮沸后加入8mL新鲜配制的1%柠檬酸三钠,混匀，煮沸，当颜色由黄色变为黑色，再变为酒红色时，继续煮沸10min，取下搅拌冷却至室温。胶体金溶液用铝箔包裹避光，4℃保存。

2.1.4.1.2检验

肉眼观察应为酒红色、无沉淀、透明状，或用电镜观测胶体金粒径应为15nm左右，且胶体金为圆形，大小均一。

2.1.4.2胶体金标记单克隆抗体的制备及检验

2.1.4.2.1制备

2.1.4.2.1.1胶体金最佳pH的摸索

取不同pH胶体金各1mL，加入20uL 2.0mg/mL的单抗5D3，充分混匀，静置15min，再加入100uL10%Nacl，混匀，静置20min后，观察颜色变化，同时将标记好的胶体金溶液添加到酶标板中，150uL/孔，每个pH做2个重复孔，测定其OD520值，并以OD值为纵坐标，pH值为横坐标绘制曲线，找出标记时的最佳pH。

2.1.4.2.1.2最佳标记蛋白量的确定

将胶体金溶液的pH调到最佳，在每1mL胶体金中分别加入待标记的抗禽白血病抗原的5D3株单抗0ug，5ug，10ug，15ug，20ug，25ug，30ug，35ug，40ug，45ug，50ug不同梯度，充分混匀后静置15min后，各加入100ul 10%NaCl溶液，混匀静置20min后观察颜色变化，取颜色刚刚不再变蓝色管的蛋白量为最适标记量，标记时增加10%蛋白用量。

2.1.4.2.1.3单抗的胶体金标记

以标记100ml胶体金为例，在200ml体积烧杯中（经过泡酸，干烘处理过）加入100ml胶体金溶液，置于磁力搅拌器上搅拌，待其温度升为室温时，逐滴加入与之标记的单抗，搅拌30min，加入5ml 10%BSA溶液，继续搅拌30min，然后逐滴加入2ml 10%PEG-20000，搅拌30min后，置4℃静置2h。1500rpm 4℃离心20min分钟，弃去底部未结合的杂质成分，然后10000rpm 4℃离心60min，弃去上清。用适量体积（我们用的5mL）的0.01MPB溶液（含0.5%BSA,0.2%PEG20000）重新悬浮胶体金沉淀。贴标签，置4℃保存。

2.1.4.3胶体金标记的单克隆抗体玻璃棉的制备及检验

2.1.4.3.1制备

用含0.1%Tween-20，0.3%BSA，4%蔗糖的PB溶液处理玻璃纤维素膜后，将胶体金标记抗体作1:1倍稀释。然后用BIO-DOT三维喷点仪将标记抗体喷射在规格为lcm×30cm玻璃棉上制成胶体免疫金垫，自然干燥后，抽真空，置4℃保存。

2.1.4.3.2检验

玻璃棉上的胶体金着色均匀为合格。

2.1.5试纸芯制备及检验

2.1.5.1NC膜粘贴

将NC膜4平贴于6x30cm PVC支持板1的中央，应注意伸展平贴，贴后不能有空隙或气泡。

2.1.5.2试纸芯样品端的制备及检验

2.1.5.2.1制备

2.1.5.2.1.1胶体金抗体玻璃棉（免疫金垫）粘贴

将1x30cm的胶体金抗体玻璃棉（免疫金垫）3平贴于NC膜4检测线T端的上方，重叠膜0.25cm；然后均匀平压即可。

2.1.5.2.1.2聚酯膜(样品垫)粘贴

将1.5×30cm的聚酯膜2，平贴于金标垫胶体金抗体玻璃棉3的上方，重叠胶体金抗体玻璃棉0.2cm，然后均匀平压即可。

2.1.5.2.2检验

粘贴后的试纸芯样品端应为边沿整齐、平展、无空隙。

2.1.5.3试纸芯吸水端的制备及检验

2.1.5.3.1制备

吸水滤纸5的粘贴：将2x30cm吸水滤纸5平放于NC膜4对照线C端的上方，重叠NC膜0.2cm，平放后均匀平压即可。

2.1.5.3.2检验粘贴后试纸芯手柄端应为边沿整齐、平展、无空隙。

2.1.6切割

将标记好C、T线的NC膜4、制备好的免疫金垫3、样品垫2和吸水滤纸5先后粘贴在PVC底板1上（见图2），调整NC膜的粘贴位置及相互间重叠长度，然后启动CM4000型BIO-DOT切割机，选择设定试纸芯宽度及切割速度，进行切割。切条机切割成3~5mm宽的试纸条。

2.1.7试纸装配

试纸由塑料卡和试纸芯组成，塑料卡分为底座和面盖两部分。底座上有一个放试纸芯的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿。面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿。观察窗旁边分别印有字母T和C,T表示检测线，在近加样孔一侧，C表示对照线，在远加样孔一侧。

将试纸芯固定在底座固定槽中，再将底座和面盖嵌合在一起即成试纸盒。注意加样孔与试纸芯的样品垫相对应，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，其旁边印有的T和C分别与包被膜上的检测线和对照线相对应。

2.1.8试纸条检测

2.1.8.1特异性的检测

分别用试纸条检测禽白血病病毒（ALV），H9亚型禽流感病毒（AIV-H9），马立克氏病病毒（MDV），新城疫病毒（NDV），小鹅瘟病毒（GPV）和鸡贫血病病毒（CAV），同时用PB缓冲液做阴性对照。结果试纸条只与ALV抗原反应，证明试纸条具有良好的特异性。

2.1.8.2灵敏性的检测

分别用原核表达的ALV-P27蛋白（仇钰.禽白血病病毒衣壳蛋白的表达及其单克隆抗体的研制[D].扬州大学,2010,16-25.）和培养的ALV细胞毒对试纸条进行检测，观察试纸条的检测下限。结果检测ALV细胞毒时可达到2⁶；用0.7mg/mL P27蛋白检测试纸条灵敏性，检测P27蛋白的下线为70ng/ml。

2.1.8.3阳性样本的处理

取原核表达的禽白血病病毒p27抗原（仇钰.禽白血病病毒衣壳蛋白的表达及其单克隆抗体的研制[D].扬州大学,2010,16-25.），经亲和纯化后每毫升含0.7mg作为对照，分装于1.5mL的指形管，-20℃保存备用。

2.1.8.4阴性检测液的处理

阴性样本为PB缓冲液，分装于1.5mL的指形管。

2.1.8.5待检检测液的处理

采集待检鸡的泄殖腔棉试至0.01moLPB缓冲液（含适量NP-40，BSA）中，混匀，或细胞培养物，取上清即为待检样品。

2.1.8.6试纸条检测结果判定

用移液器吸取60μL待检样品直接滴加到试纸条的样品垫上，可见样品通过层析作用向前移行，在移行过程中NC膜上会出现肉眼可见的红色条带，于加样后3~10min观察结果，目测结果的阴性和阳性（如图3）。

若C、T线同时出现，说明样品中含有待检抗原，判定为阳性；若C线出现而T线未出现，说明样品中不含待检抗原，判定为阴性；若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效，说明试纸条出现质量问题或操作不当，应重新检测或更换试纸条。

2.1.9半成品检验

2.1.9.1物理性状

试纸条外观呈长方形，外层为环保性质的塑料外壳，中间为试纸芯。外壳面盖上有一个加样孔和一个观察窗，观察窗两端分别印有字母T和C，T在近加样孔一侧，C在远加样孔一侧。试纸芯宽度均匀一致，材料粘贴规范，附着牢固，NC膜无损伤。

2.1.9.2检测线和对照线检验

用移液器吸取60μL待检样品直接滴加到试纸条的样品垫上，可见样品通过层析作用向前移行，在移行过程中NC膜上会出现肉眼可见的红色条带，于加样后3~10min肉限观察其测试结果，3-10分钟检测线(T线)和对照线(C线)两条线一并出现，为阳性；用PBS检测，只有C线出现条带,T线无条带，判为阴性。且显色均匀一致、线形规则。若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效，说明试纸条出现质量问题或操作不当，应重新检测或更换试纸条。

2.1.9.3试纸条质量鉴定

用试纸分别对禽白血病抗原阳性检测液、禽白血病抗原阴性检测液进行检测，其中检测禽白血病抗原阳性检测液试纸的检测线(T线)对照线(C线)同时出现，判定为阳性；而其他样品检测试纸T线无条带，判定为阴性；若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效，说明试纸条出现质量问题或操作不当，应重新检测或更换试纸条。

Claims

1.一种快速检测禽白血病抗原的试纸条，由标记好对照线和检测线的NC膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸和PVC底板构成，依次将NC膜、样品垫、免疫金垫、样品垫NC膜和吸水滤纸依次设置粘贴在PVC底板上，并且它们的接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所说的对照线的成分是抗鼠IgG，检测线的成分是抗禽白血病抗原的单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。

2.根据权利要求1所述的快速检测禽白血病抗原的试纸条，其特征在于：所说的抗禽白血病抗原的单克隆抗体是抗禽白血病病毒P27抗原的单克隆抗体5D3和4F12。

3.一种快速检测禽白血病抗原的试纸条，其特征在于，由权利要求1所述的试纸条和塑料卡组成，所说的塑料卡分为底座和面盖两部分；底座上有一个放试纸条的固定槽以及与面盖嵌合的卡齿；面盖有一个加样孔和一个观察窗以及与底座嵌合的卡齿；观察窗旁边分别印有字母T和C, T表示检测线，在近加样孔一侧，C表示对照线，在远加样孔一侧。

4.一种制备权利要求1所说的快速检测禽白血病抗原试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1) 胶体金标记抗体：在胶体金上标记抗禽白血病抗原的特异性单克隆抗体5D3;

2) 喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成免疫胶体金垫;

3) 制作硝酸纤维素膜：将抗鼠IgG和抗禽白血病抗原的单克隆抗体4F12分别喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；

4) 将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装在PVC底板上，然后切条获得试纸条。