CN106701756A - microRNA172在调控水稻株高、穗型和叶片大小中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及microRNA172在调控水稻株高、穗型和叶片大小中的应用。本发明还提供了miR172的拮抗剂MIM172基因片段在水稻遗传改良的应用方法。miR172b是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；pri-miR172b是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。超量表达pri-miR172b，导致水稻叶片变小、穗部枝梗和穗粒数减少。拮抗剂MIM172是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，通过拮抗剂MIM172降低miR172的表达量会导致水稻株高变矮、叶片变大、穗部枝梗和穗粒数增加。这些结果表明miR172可以调节水稻的株型，具有重要的应用价值。

Description

microRNA172在调控水稻株高、穗型和叶片大小中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种microRNA172b(下文简写为miR172b)及其前体基因pri-microRNA172b(下文简写为pri-miR172b)、microRNA172(下文简写为miR172)拮抗剂MIM172在调控水稻株高、穗型和叶片大小中的应用。通过基因工程技术增加miR172b的表达量，会导致水稻穗部枝梗减少、穗粒数减少、叶片变短、叶片变窄；而使用拮抗剂MIM172(该拮抗剂是一段人工设计和合成的24bp长的基因片段，可以用来降低miR172的表达量)，则会导致水稻株高变矮、穗部枝梗增多、穗粒数增多、叶片变长、叶片变宽，这些结果表明通过操控miR172的表达量可以为改良水稻的株型提供一种方法。

背景技术

随着全球人口的不断增长以及人类消费方式的改变，全球的粮食危机日益严峻。水稻是全球最重要的粮食作物之一，我国有超过一半的人口以稻谷为主粮，因此提高水稻的产量对保障国家的粮食安全具有重要的战略意义。上个世纪，因为矮化育种和杂种优势的利用，水稻的产量发生了两次质的飞越。但是近几十年来，水稻的产量却长期停滞不前，日益难以满足社会经济发展的需要，因此亟需新的技术和遗传资源用于改良水稻的产量、抗性、品质等重要农艺性状。

水稻的产量与其株型密切相关，以理想株型为改良目标的育种模式在农业生产上受到高度的重视。水稻的株型主要包含株高、分蘖、穗型、根形态以及器官的大小和角度等内容(Wang and Li，Molecular basisof plant architecture.Annu Rev Plant Biol,2008,59:253-279)。其中株高、分蘖、穗型和粒重长期以来都是遗传改良的重要目标性状。株高是与水稻产量、光合作用以及与抗倒伏性密切相关的性状，上个世纪以降低株高为育种目标的第一次“绿色革命”极大的提高了全球农作物的产量。随着遗传学和分子生物学的发展，现已阐明激素特别是赤霉素和油菜素甾醇在调节植物的株高中发挥关键的作用(Wang and Li,Molecularbasis of plant architecture.Annu Rev Plant Biol,2008,59:253-279)。

水稻的穗是农业生产上收获的目的器官，其形态和组成直接决定了水稻的产量。水稻的穗是一种圆锥花序，由花序分生组织发育而来，其一般可以产生一次枝梗和二次枝梗，在少数情况下也可以产生更高级的枝梗，枝梗会进一步的发育成为小穗进而产生花，花器官开花受精以后就会形成稻米。与拟南芥等植物不同，水稻穗型的发育过程是由一系列分生组织命运转变决定的。在合适的内外环境条件下，水稻由营养生长进入生殖生长，与此同时，顶端分生组织也会转变为花序分生组织，由花序分生组织产生一次枝梗分生组织，在产生一定数量的一次枝梗分生组织以后，花序分生组织会发生退化。而一次枝梗分生组织会产生更高级的二次枝梗分生组织，也会直接分化出小穗分生组织，而二次枝梗分生组织会重复一次枝梗分生组织的发育模式，最终枝梗分生组织都转变为小穗分生组织。而小穗分生组织则会产生花分生组织，进而产生花器官的分化。不同分生组织的转变时间在很大程度上决定了水稻的穗型(Kyozuka et al.,Control ofgrass inflorescence form by the fine-tuning of meristem phase change.Curr Opin Plant Biol,2014,17:110-115)。如果花序分生组织维持的时间较长，就会产生更多的一次枝梗；而如果小穗分生组织分化被推迟的话，就可能产生更多的二次枝梗甚至三次枝梗，从而产生更多的穗粒数。鉴于穗型在农业生产上的重要意义，科学家已经发现了大量的控制穗型发育的基因，并且一些基因已经在育种实践中得到了应用(Zhang and Yuan,Molecular control of grass inflorescence development.Annu Rev Plant Biol,2014,65:553-578)。

植物的生长发育需要消耗大量的能量，而光合作用是植物最主要的能量来源。叶是植物进行光合作用最主要的器官，其生长发育不仅决定了植物的株型，同时也决定了植物进行光合作用，同化碳水化合物的能力。水稻的叶包括叶片和叶鞘，在二者的连接处还会形成叶枕，并且叶枕往往会分化出叶耳和叶舌。叶是由营养生长期的顶端分生组织发育而来的，由于生长素的极性运输会导致在分生组织的边缘处形成一个局部的生长素最大浓度的区域，在此区域中分生组织特异表达基因OSH1会被抑制，从而使得该区域的细胞最终分化为叶原基细胞，启动叶的发育程序。随着叶原基的发育，会逐步形成顶基极性、腹背极性和中边极性，从而决定叶的空间格局。叶片的最终尺寸则取决于细胞***和细胞延展的综合作用。

microRNA(miRNA)是一类长度大约在20-24个核苷酸的内源性非编码的RNA分子，在几乎所有研究过的高等生物中都发现了大量的编码miRNA的基因存在。miRNA往往通过调节mRNA的稳定性或者调控蛋白质翻译过程来控制靶基因mRNA的活性，从而调节包括生长、发育、代谢、响应环境等在内的各个生命活动过程。因为其强大的生物学功能和复杂的调控机制，miRNA相关的研究已经成为当今生命科学的热门领域之一，并且有可能在农作物的遗传改良中发挥重要的作用。

水稻体内编码多个miRNAs，但是绝大部分的生物学功能依然是未知的，亟需更多的工作来阐述这些小RNA的作用以及在水稻遗传改良中的利用价值。此外鉴于同一种miRNA往往是由多个前体基因编码的，因此获得特定miRNA的丧失功能突变体是非常困难的。有研究报道利用一种称为target mimicry的技术可以有效的降低植物体内miRNA的表达量(Franco-Zorrilla et al.,Target mimicry provides a new mechanism forregulation of microRNA activity.Nat Genet,2007,39:1033-1037)。该技术通过设计一种与目标miRNA部分匹配的模拟靶RNA，其可以与miRNA结合，但是不能被miRNA剪切。在植物体内超量表达这种模拟靶RNA就可以同目标miRNA结合，而阻止了miRNA对植物体内真正的靶基因的作用；同时模拟靶RNA还可以通过一种未知的机制导致目标miRNA被降解。虽然该技术可以用于干扰miRNA的活性，但是它还很少被用于水稻的遗传改良。

本发明通过植物基因工程的手段，在水稻中研究miRNAs的功能，挖掘在农业生产上可能用于改变水稻株型的miRNAs，以便为水稻育种提供新的基因资源；并且利用target mimicry的技术干扰这些miRNA的活性来改良水稻的农艺性状。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种miR172b及前体基因pri-miR172b、miR172拮抗剂MIM172在调控水稻株型中的应用。本发明的另外一个目的是提供一种超量表达miR172b和MIM172的载体，以及该载体在转基因水稻中的应用。同时本发明还提供一种通过调节miR172的表达量来改变水稻株型的方法。miR172b具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，也包括与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因***、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明还包括编码miR172b的前体基因pri-miR172b，该pri-miR172b具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因***、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体的等位基因或其衍生物。同时本发明还包括miR172的拮抗剂MIM172，该拮抗剂MIM172具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，以及包含有MIM172的DNA片段，和/或含有MIM172的表达载体，以及与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有不多于6个碱基区别的衍生物。

本发明通过增加miR172b的表达量，会导致水稻穗部枝梗减少、穗粒数减少、叶片变短、叶片变窄；而使用拮抗剂MIM172来降低miR172的表达量，则会导致水稻株高变矮、穗部枝梗增多、穗粒数增多、叶片变长、叶片变宽，这些结果表明通过操控miR172的表达量可以为改良水稻的农艺性状提供一种新的育种方法。miR172b及其前体基因pri-miR172b可用于与其它调控元件，如组成型启动子或器官特异性启动子融合构建基因表达载体；也可通过转基因技术、反义RNA、RNAi、锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和CRISPR(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)/Cas9等技术对其操控以调控植物的株型；而拮抗剂MIM172则可以用于与其它调控元件，如组成型启动子或器官特异性启动子融合构建基因表达载体，从而可以通过基因工程的手段改变植物的株型。

实现本发明的具体技术方案如下：

1、根据水稻基因组注释的结果，从水稻中分离出包含有编码miR172b前体基因pri-miR172b的DNA片段，具体的分离方法在实施例1中有详细描述。

2、将上述包含有pri-miR172b的DNA片段连接到pCAMBIA1301S载体上，构建miR172b的超量表达载体，我们将该载体命名为35S:miR172bOE；具体构建方法在实施例2中有详细描述。

3、采用target mimciry的方法(Franco-Zorrilla et al.,Target mimicry provides a new mechanism forregulation of microRNA activity.Nat Genet,2007,39:1033-1037)，设计可以干扰miR172活性的人工拮抗剂MIM172，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；并且通过重叠延伸PCR的方法，将MIM172融合到来自拟南芥的非编码蛋白质的基因AtIPS1中以便于构建用于遗传转化的表达载体；具体方法在实施例3中有详细描述。

4、将融合有拮抗剂MIM172的AtIPS1连接到pCAMBIA1301S载体上，构建超量表达拮抗剂MIM172的载体35S:MIM172。具体方法在实施例4中有详细描述。

5、利用优化过的农杆菌介导的转基因方法(Lin and Zhang,Optimising the tissue culture conditions forhigh efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)将表达载体35S:miR172bOE和35S:MIM172导入水稻受体中花11(中国农业科学院作物科学研究所)，获得转化植株；具体方法在实施例5中有详细描述。

6、借助PCR的方法分析鉴定阳性转基因植株；并在T1代鉴定转基因植株的基因型和表型，进行共分离检测，并对相关表型进行统计分析；具体方法在实施例6中有详细描述。

7、利用stem-loop RT-PCR的方法(Shen et al.,Global expression profiling of rice microRNAs by one-tubestem-loop reverse transcription quantitative PCR revealed important roles of microRNAs in abiotic stressresponses.Mol Genet Genomics,2010,284:477-488)分析转基因植株中miR172的表达量；具体方法在实施例7中又有详细描述。

8、通过杂交的方法分析MIM172是否拮抗miR172超量表达的效应；具体方法在实施例8中由详细描述。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、本发明发现超量表达miR172b可以降低叶片的长度和宽度；

2、本发明首次在水稻中利用拮抗剂MIM172来调节miR172的表达量；

3、本发明在水稻中发现利用拮抗剂MIM172降低miR172的表达量可以导致水稻株高变矮、穗部枝梗和穗粒数上升、叶片变大，而这些性状的改变，尤其是穗部性状的改变，正符合水稻遗传改良的需要；

4、本发明利用调节miR172的活性为水稻株型和叶片的遗传改良提供了一种方法。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是miR172b的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是miR172b的前体pri-miR172b的核苷酸序列，其第208-228位核苷酸序列编码miR172b。

序列表SEQ ID NO:3是人工设计的miR172的拮抗剂MIM172的核苷酸序列。

图1：miR172b的前体基因pri-miR172b的RNA二级结构。附图标记说明：

该二级结构是利用公开的软件包ViennaRNA Package(http://www.tbi.univie.ac.at/RNA/)按照最小自由能计算而来，红色字母所示部分即为miR172b的序列。

图2：表达载体35S:miR172bOE构建过程示意图。附图标记说明：

图2中的A图：***表达载体35S:miR172bOE的包含有pri-miR172b的DNA片段示意图。

图2中的B图：用于构建表达载体35S:miR172bOE的空载体pCAMBIA1301S的结构示意图。本发明将图2中的A图所示的片段通过KpnI和BamHI双酶切***图2中的B图所示的载体pCAMBIA1301S的KpnI和BamHI酶切位点中间形成转化用的表达载体35S:miR172bOE。

图3：本发明构建的表达载体35S:miR172bOE的图谱。

图:4：人工拮抗剂MIM172与miR172b核苷酸配对示意图。附图标记说明：

红色字母A表示miR172b的第10位核苷酸；蓝色字母U表示miR172b的第11位核苷酸；紫色的四个字母表示MIM172中与miR172不匹配的核苷酸而形成的小的环状突起，该结构是MIM172发挥作用的关键所在。

图5：利用重叠延伸PCR方法将拮抗剂MIM172融合进入拟南芥AtIPS1基因的过程示意图。附图标记说明：

红色、蓝色、绿色和紫色片段代表AtIPS1中用于设计引物的区段，而橙色的片段代表拮抗剂MIM172。在合成引物MIM172F和MIM172R时，直接将MIM172的序列融合于AtIIPS1的序列中间。

图6：表达载体35S:MIM172构建过程示意图。附图标记说明：

图6中的A图：***表达载体35S:MIM172的包含有拮抗剂MIM172的DNA片段示意图。

图6中的B图：用于构建表达载体35S:MIM172的空载体pCAMBIA1301S的结构示意图。

本发明将图6中的A图所示的片段通过KpnI和BamHI双酶切***图6中的B图所示的载体pCAMBIA1301S的KpnI和BamHI酶切位点中间形成转化用的表达载体35S:MIM172。

图7：本发明构建的表达载体35S:MIM172的图谱。

图8：野生型中花11(WT)与35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株的表型比较。附图标记说明：

图8中的A图：是野生型中花11(WT)与35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株的株高和分蘖的形态比较。

图8中的B图：是野生型中花11(WT)与35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株的穗型比较。

图8中的C图：是野生型中花11(WT)与35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株的一次枝梗形态

比较。

图9：野生型中花11(WT)与35S:MIM172(MIM172)转基因植株的表型比较。附图标记说明：

图9中的A图：是野生型中花11(WT)与35S:MIM172(MIM172)转基因植株的株高和分蘖的形态比较。

图9中的B图：是野生型中花11(WT)与35S:MIM172(MIM172)转基因植株的穗型比较。

图9中的C图：是野生型中花11(WT)与35S:MIM172(MIM172)转基因植株的一次枝梗形态比较。

图10：野生型中花11(WT)、35S:miR172bOE(miR172OE)和35S:MIM172(MIM172)转基因植株的剑叶形态比较。

图11：利用实时定量PCR检测野生型中花11(WT)与35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株中的miR172b的表达量。数据显示的是3个重复的平均值±标准误。

图12：利用实时定量PCR检测野生型中花11(WT)与35S:MIM172(MIM172)转基因植株中的miR172b的表达量。数据显示的是3个重复的平均值±标准误。

图13：MIM172对miR172的拮抗作用。附图标记说明：

图13中的A：是野生型中花11(WT)、35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株、35S:MIM172(MIM172)转基因植株以及miR172OE和MIM172杂种的穗型比较。

图13中的B：是野生型中花11(WT)、35S:miR172bOE(miR172OE)转基因植株、35S:MIM172(MIM172)转基因植株以及miR172OE和MIM172杂种的每穗一次枝梗、每穗二次枝梗和每穗颖花数的统计。数据显示的是来自10个单株的平均值±标准误。

具体实施方式

实施例1：分离包含有miR172b的前体基因pri-miR172b的DNA片段

利用Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)和miRBase(http://www.mirbase.org/)两个网站进行检索，得到miR172b(miRBase数据库的基因登录号是MIMAT0001070)及其前体基因pri-miR172b(miRBase数据库的基因登录号是MI0001140)的核苷酸序列。miR172b成熟体序列如SEQ ID NO:1所示，其前体基因pri-miR172b的序列如SEQ ID NO:2所示，其二级结构如图1所示。

根据数据库序列的分析结果，为扩增pri-miR172b的基因片段，设计如下引物：

MiR172bOEF(正向引物):5'-GGTACCCAGTAGAGAGTGTGATGCCGCAGCT-3'(下划线序列为KpnI识别位点)；

MiR172bOER(反向引物):5'-GGATCCGCGGCGTTGGTACAATTAAGCTGATG-3'(下划线序列为BamHI识别位点)。

抽提水稻品种中花11(中国农业科学院作物科学研究所)叶片总DNA。DNA抽提方法为CTAB法(Zhang et al.,Genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis.TheorAppl Genet,1992,83:495-499)。以中花11叶片总DNA为模板，用引物MiR172bOEF和MiR172bOER进行PCR扩增。PCR反应总体积为20μl，包含DNA模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物MiR172bOEF和MiR172bOER各0.3μl，rTaq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCRbuffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃1min，⑤从②－④循环38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测，回收长度为317bp(305bp的目标DNA区段加上引物上附加的两个限制性酶切位点12bp)的DNA片段。将回收的PCR产物利用T4DNA连接酶连接到T-A克隆载体pGEMT-vector上(T4DNA连接酶和载体pGEMT-vector，均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加400μl LB培养基复苏45min，涂于含有氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16h(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取呈现蓝色的单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过KpnI和BamHI双酶切筛选阳性克隆，并且利用载体上T7和SP6引物对***的PCR产物进行测序验证。该PCR产物包含有如SEQ ID NO:2所示的pri-miR172b的序列。将包含该PCR产物的重组质粒命名为质粒TA-miR172b。

实施例2：miR172b的超表达载体的构建

用KpnI和BamHI双酶切质粒TA-miR172b(所述的KpnI和BamHI购买自宝生物工程大连有限公司，具体用法与用量参考该公司相应产品的说明书，质粒TA-miR172b来自实施例1，如图2中的A图所示)，回收包含pri-miR172b的317bp的DNA片段，然后与经过KpnI和BamHI双酶切的载体质粒pCAMBIA1301S[该载体被公开报道：Zhou et al.,Over-expression of aspartate aminotransferase genes in riceresulted in altered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds.Theor Appl Genet,2009,118:1381-1390；其基本骨架起源于澳大利亚CAMBIA实验室(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的pCAMBIA1301，通过加入35S启动子实现对转化基因的表达调控；其结构如图2中的B图所示]利用T4DNA连接酶(购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加400μl LB培养基复苏45min，涂于含50mg/L的卡那霉素的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16h(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过KpnI和BamHI双酶切筛选阳性克隆，并将所得的表达载体命名为35S:miR172bOE，其结构如图3所示。

实施例3：拮抗剂MIM172的设计

根据公开报道的文献(Franco-Zorrilla et al.,Target mimicry provides a new mechanism for regulation ofmicroRNA activity.Nat Genet,2007,39:1033-1037)，利用target mimicry的方法可以干扰植物miRNA的活性，由此设计出可以拮抗miR172活性的拮抗剂MIM172序列，该序列特征如SEQ ID NO:3所示。MIM172为24个核苷酸长度，比21个核苷酸的miR172多出3个核苷酸，二者可以互补配对，但是在与miR172的第10和第11位碱基匹配序列的中间，MIM172多出3个核苷酸形成一个小的环状突起。因为植物中受miRNA调控的mRNA一般都是从与miRNA第10和第11位碱基匹配的中间位置被切割的(Schwab et al.,Specificeffects of microRNAs on the plant transcriptome.Dev Cell,2005,8:517-527)，因此拮抗剂MIM172中的3个核苷酸形成的小的环状突起破坏了miR172的剪切作用，是MIM172发挥作用过的关键。水稻体内的miR172是由4个前体基因编码的(分别是pri-miR172a，pri-miR172b，pri-miR172c和pri-miR172d)，所形成的四个miR172成熟体序列是高度一致，彼此之间最多在头或者尾相差不超过2个碱基，因此本发明所设计的MIM172是可以拮抗水稻体内所有形式的miR172的，其与miR172b的匹配情况如图4所示。

申请人进一步通过重叠延伸PCR的方法将MIM172的序列(重叠延伸PCR方法参考萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年；基本流程如图5所示)连接到拟南芥非编码蛋白质的基因AtIPS1(数据库TAIR地址:http://www.arabidopsis.org；基因登录号：At3g09922)中间去以便构建载体进行转基因。为实现上述目标，设计如下引物：

IPS1OEF(正向引物):

5'-ACGGGTACCTGGCCATCCCCTAGCTAGGT-3'(下划线序列为KpnI识别位点)；

IPS1OER(反向引物):

5'-TACGGATCCCGGAAGCAAATTTACATGCACT-3'(下划线序列为BamHI识别位点)；

MIM172F(正向引物):

5'-TTATGCAGCATCGAGTTCAAGATTCCAGCTTCGGTTCCCCTCGGAATCA-3'(下划线序列为编码MIM172的序列)；

MIM172R(反向引物):

5'-CTGGAATCTTGAACTCGATGCTGCATAATTTCTAGAGGGAGATAAACA-3'(下划线序列为编码MIM172的互补序列)；

抽提Col型拟南芥(来源于中国科学院植物研究所)的叶片总DNA，DNA抽提方法同实施例1。以该DNA为模板，分别以引物IPS1OEF和MIM172R，MIM172F和IPS1OER为组合进行两组PCR，PCR体系及程序与实施例1中所述的PCR体系及程序一致。从以上2组PCR反应产物中各取0.5μl混合后作为下一轮重叠延伸PCR的模板，以引物IPS1OEF和IPS1OER为组合进行PCR扩增，PCR体系及程序与实施例1中所述的PCR体系及程序一致。最终得到中间融合有MIM172的重组AtIPS1片段。将PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测，并将回收的PCR产物连接到T-A克隆载体pGEMT-vector上(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，利用载体上T7和SP6引物对该PCR产物进行测序验证。将包含该PCR产物的重组质粒命名为质粒TA-MIM172。

实施例4：拮抗剂MIM172超表达载体的构建

用KpnI和BamHI双酶切质粒TA-MIM172(所述的KpnI和BamHI购买自宝生物工程大连有限公司，具体用法与用量参考该公司相应产品的说明书，质粒TA-MIM172来自实施例3，如图6中的A图所示)，回收包含MIM172的515bp的DNA片段，然后与经过KpnI和BamHI双酶切的载体质粒pCAMBIA1301S[该载体已公开报道：Zhou et al.,Over-expression of aspartate aminotransferase genes in rice resulted in alterednitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds.Theor Appl Genet,2009,118:1381-1390；其基本骨架起源于购买自澳大利亚CAMBIA公司(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的pCAMBIA1301，通过加入35S启动子实现对转化基因的表达调控；其结构如图6中的B图所示]利用T4DNA连接酶(购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加400μl LB培养基复苏45min，涂于含50mg/L的卡那霉素的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16h(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过KpnI和BamHI双酶切筛选阳性克隆，并将所得的表达载体命名为35S:MIM172，其结构如图7所示。

实施例5：转基因水稻的获得

将表达载体35S:miR172bOE(来自实施例2)和35S:MIM172(来自实施例4)通过农杆菌EHA105介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购买自丹麦的罗氏制药有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田，得到转基因植株。农杆菌遗传转化的方法和所用的试剂及配方是根据Hiei等人的报道优化而来(Hiei et al.,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282；Lin and Zhang,Optimising the tissue cultureconditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

室温下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂-EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)

2,4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾(KOH) 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlAS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化的步骤如下：

(1)愈伤诱导

1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(HgCl₂)15min

2)灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

(2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

(3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4d，温度26±1℃。

(4)农杆菌培养

1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA1052d，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3h。

(5)农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2d，温度19-20℃。

(6)愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30min；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

(7)分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7d；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5－7周。

(8)生根

1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载至大田。

实施例6：转基因水稻的鉴定与表型观察

抽提T0代35S:miR172bOE和35S:MIM172转化植株(来自实施例5)叶片的总DNA，然后用PCR方法对T0代转化植株进行阳性检测。DNA抽提和PCR的方法体系同实施例1。

利用β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)引物进行阳性检测，GUS引物的序列如下：

GUS-F(正向引物):5'-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3'

GUS-R(反向引物):5'-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC-3'

PCR检测结果表明，对表达载体35S:miR172bOE转基因而来的GUS阳性的植株相对于阴性植株而言，全部表现为穗部枝梗减少、穗粒数减少、叶片宽度降低、叶片长度降低，其表型变化见图8和图10；而对表达载体35S:MIM172转基因而来的GUS阳性的植株相对于阴性植株而言全部表现为株高变矮，每穗一次枝梗数、每穗二次枝梗数、每穗颖花数、叶片长度和叶片宽度都明显增加，其表型变化见图9和图10。

对T0代阳性植株分单株收种子，并且继续种植T1代的转基因材料，对T1代的植株也进行GUS基因的PCR扩增以检测分离单株的阴阳性，进行转基因事件和表型变化的共分离检测，以及统计表型数据。

为了进行表型分析，申请人将表达载体35S:miR172bOE和35S:MIM172各3个独立转化而来的T0植株的种子(来实施例5)经过浸种、催芽后播种于秧田，20d以后移栽至大田获得T1代转基因植株。种植密度为15cm×24cm，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，在一个有安全防护设施条件下按常规的水稻种植方法进行田间管理。利用PCR的方法检测GUS基因进行阴阳性鉴定，并且分析PCR检测结果与表型的对应关系。结果表明在T1代，载体35S:miR172bOE转基因后代分离出来的所有GUS阳性单株相对于阴性单株而言，都表现为穗部枝梗减少、穗粒数减少、叶片宽度降低、叶片长度降低，表明miR172b的转基因事件同这些表型的变化是共分离的。而对载体35S:MIM172转基因后代分离出来的所有GUS阳性单株相对于阴性单株而言，都表现为株高变矮，每穗一次枝梗数、每穗二次枝梗数、每穗颖花数、叶片长度和叶片宽度都明显增加，表明MIM172的转基因事件同这些表型的变化也是共分离的。

考察和记录T1代相关植株的表型变化和数据，包括株高、每穗一次枝梗数、每穗二次枝梗数、每穗颖花数、剑叶长度和宽度，并以每个家系分离出来的的GUS阴性单株为对照，分别进行统计学分析。

表1 35S:miR172bOE(miR172OE)和35S:MIM172(MIM172)转基因T1代阳性和阴性单株的表型统计值。

表1的说明：(+)和(-)分别表示转基因阳性和阴性单株。利用t测验进行统计学分析，^a,b,c分别表示P<0.05,0.01和0.001的显著水平。

实施例7：转基因水稻中miR172的表达量分析

为分析35S:miR172bOE和35S:MIM172转基因事件对内源miR172表达量的影响，申请人进一步利用stem-loop RT-PCR的方法(Shen et al.,Global expression profiling of rice microRNAs by one-tube stem-loopreverse transcription quantitative PCR revealed important roles of microRNAs in abiotic stress responses.MolGenet Genomics,2010,284:477-488)检测了转基因植株中miR172的表达量。其具体的操作方法如下所述：

(1)抽提来自35S:miR172bOE和35S:MIM172的转化植株分蘖期叶片的RNA，RNA抽提用的试剂是购买自Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；

(2)反转录合成cDNA第一链，步骤如下：

1)取抽提的总RNA 200ng，加入DNaseI 1μl,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂，工作浓度为0.01％)处理过的水到10μl，混匀后于室温放置15min以去除残留的基因组DNA；2)15min后加入0.2M EDTA 1μl，并于65℃水浴中孵育10min以去除DNaseI的活性；3)加入1μl引物miR172stemloopR(浓度为10mM，序列为:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCAG-3')，或者1μl引物U6R(浓度为10mM，序列为:5'-GGACCATTTCTCGATTTGTACGTG-3')，并于65℃水浴中孵育10min以破坏RNA的二级结构，然后冰上放置5min；4)加入5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1μl，反转录酶1μl，混匀后置于42℃水浴锅内温浴1.5h；5)反应结束后将反转录产物置于90℃干浴3min以灭活反转录酶；6)向反转录产物中加入120μl水，混匀后-20℃保存反应最终产物。反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

(3)实时荧光定量PCR，步骤如下：

对得到的反转录产物用实时荧光定量PCR的方法检测miR172的表达量(使用的引物组合是172QRTF和miRUniverseR)，并且利用U6的表达量(使用的引物组合是U6F和U6R)为内参进行平衡化。实时荧光定量PCR相关试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10s，进入循环后95℃变性5s，60℃退火延伸40s，45个循环。实时荧光定量PCR所用引物序列为：

172QRTF(正向引物):5'-GGCGCAGAATCTTGATGATG-3'

miRUniverseR(反向引物):5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'

U6F(正向引物):5'-TACAGATAAGATTAGCATGGCCCC-3'

U6R(反向引物):5'-GGACCATTTCTCGATTTGTACGTG-3'

水稻体内的miR172是由4个前体基因编码的，鉴于这4个前体基因所形成的miR172成熟体序列的高度一致性(分别是miR172a，miR172b，miR172c和miR172d，彼此之间最多只有2个碱基的区别)，以上实时荧光定量PCR的结果无法区别这些不同的miR172成员，检测的是体内所有miR172的整体结果。实时荧光定量PCR的结果表明在35S:miR172bOE转基因植株中，miR172被上调，其结果如图11所示；而在35S:MIM172转基因植株中，miR172则被下调，其结果如图12所示。

实施例8：MIM172拮抗miR172效应的检测

为了进一步分析MIM172是否可以拮抗miR172的作用，申请人将35S:miR172bOE和35S:MIM172的转基因植株相互杂交，并且以穗型为代表分析杂种相对于野生型、35S:miR172bOE转基因植株和35S:MIM172转基因植株的表型变化，结果表明杂种的穗型与35S:MIM172转基因植株类似，穗部枝梗和颖花数相对于野生型上升，因此35S:miR172bOE转基因导致的穗部枝梗和穗粒数减少等表型被35S:MIM172转基因所恢复，即MIM172可以拮抗miR172的作用，其结果见图13。

Claims (7)

1.一种microRNA172b的基因在调控水稻的株高、穗型和叶片尺寸中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码microRNA172b的前体基因pri-microRNA172b的基因片段在调控水稻的株高、穗型和叶片尺寸中的应用，其特征在于，该片段是SEQ ID NO:2所述的序列。

3.一种microRNA172的拮抗剂MIM172的基因片段，其特征在于，该基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

4.权利要求3所述的microRNA172拮抗剂MIM172基因片段在在水稻改良中的应用。

5.权利要求4所述的的应用，其中包括在调控水稻的株高、穗型和叶片尺寸中的应用。

6.一种包含有SEQ ID NO:2所示序列的植物表达载体。

7.一种包含有SEQ ID NO:3所示序列的植物表达载体。