CN102851375A - 检测egfr基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法。本发明的试剂盒能检出含0.1-1％EGFR基因突变DNA的样本、对含10％EGFR19号外显子基因突变DNA样本，通过测序能准确分型；本发明的试剂盒灵敏度高，最低检出限为5拷贝基因，并能对EGFR基因突变的定性检测，给出不同的灵敏度参考范围，以帮助临床判断突变量的多少，确定最终诊疗方案能对不同突变。

Description

检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法。

背景技术

传统化疗主要针对细胞的DNA，这种作用往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也“错杀”了很多正常细胞。靶向治疗和以前的化疗完全不同。肿瘤的发病有多种机制参与，而这些机制往往是肿瘤细胞所特有的。靶向治疗就是针对肿瘤发病机制中某特有的信号传导通路或者某一发病机制，采用单克隆抗体、小分子物质将它打断，从而达到***的目的，而对正常细胞作用却很轻微。

靶向治疗的特异性很强，只针对癌细胞，没有化疗常见的副作用，不会引起患者掉头发，不会引起恶心、呕吐。常见的副作用是皮疹和腹泻，患者大多可以耐受。靶向治疗多数只需每天口服治疗一粒，患者可以在家里进行，安全性较好，有望恢复往日的生活，部分患者甚至能重返工作岗位。

靶向药与常规化疗药的另一个不同在于其用药的判断上。医生在给病人使用常规药物时，一般是根据病人的身体状况、症状等条件选择用药，而药物的有效性要通过一段时间的治疗观察才能判定。而靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路；而肿瘤细胞是有多样性的，并非所有肿瘤细胞都具有一样的特征性位点，具有个体差异，因此对于某些特定的靶向药物，在使用前检测患者体内是否有符合条件的基因，判断其肿瘤细胞上是否有符合条件的位点，就可以预知该药物是否会奏效，这从临床上节省了金钱和时间。这样的诊断模式被称为“个体化诊断”。对于靶向药物来说，使用前进行“个体化诊断”是保证安全、有效用药的必要步骤。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增值、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR信号转导通路上的基因发生体细胞突变及表达异常，从而导致肿瘤细胞无限制的扩增和迁移。因此，近年以EGFR和EGFR信号通路中关键的组分为靶标的分子靶标检测及靶向治疗成为国际肿瘤界个体化医疗关注的焦点。

EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，吉非替尼和厄罗替尼已被FDA批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。这些靶向药物已应用于晚期和不适宜传统治疗方案的NSCLC患者的临床治疗。在这类药的早期使用过程中，曾发现其有效率并不高，甚至因此而被FDA叫停；对临床资料的统计表明，这两种靶向药物更适合东方人、不吸烟者、女性和腺癌/肺泡癌患者。随后，进一步研究结果表明，EGFR基因外显子的突变(体细胞突变)是患者对此类靶向药物有效的必要前提。

美国国家癌症综合网络(NCCN)2009年版的临床指南中明确指出：EGFR突变，尤其是外显子19缺失突变与肿瘤对TKIs如吉非替尼的敏感度有重要关系，所以EGFR基因突变的检测有利于为这些患者选择最好的治疗方法。如图1所示。

目前认为EGFR突变的位点主要集中在18、19、20和21外显子，其中19号外显子和21号外显子的突变最常见，占整个突变的90％左右，21号外显子主要集中在第858为密码子的改变，但19号外显子存在多种缺失突变，而且不同的突变，病人对TKI的疗效是不同的。

此外，最新的研究也表明，TKI的疗效不仅与是否有EGFR基因19号外显子突变相关，还与基因突变的量有密切关系。广州的吴一龙教授利用两种敏感度不同的检测方法，一种是用测序检测EGFR突变，另一种是用荧光定量PCR检测EGFR突变，分别筛查出两组肺癌病人，都给予靶向药物治疗。结果发现，第一组即基因突变量大的肺癌病人，疗效特别好，而第二组即突变量小的病人疗效则很一般，差别非常明显。这个研究将改变肺癌治疗策略。目前，对肺癌病人，一般先查有没有EGFR突变，如果有突变，就建议吃靶向药物。今后要对有突变的病人进一步分类，根据突变量的大小，决定是否先服用靶向药物，制定个性化治疗方案。

专利ZL200910111499.2公开了一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针，还公开了含有该引物、探针的试剂盒，该试剂盒仅能检测出以下29种EGFR突变，并不能对突变的类型，尤其是EGFR基因第19号外显子的突变类型进行分析。此外，也不能对基因突变的量的多少进行判别。

为此，本发明提出了一种检测EGFR基因突变检测试剂盒，不仅能检测出31种EGFR基因相关的突变，而且能通过对内参反应液后续的测序反应，在不经过电泳分析的情况下，对EGFR基因19号外显子不同的突变类型进行判别，并有可能发现新的突变。更重要的是，本发明提出了一种新型的对突变量的判断标准，通过检测的突变反应液和内参反应液的差值，对突变的量进行半定量的判断，从而指导临床用药。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种检测EGFR基因突变的引物和探针。

本发明的第二发明目的在于提出含有该引物和探针的试剂盒。

本发明的首要发明目的在于提出该试剂盒的使用方法。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种检测人EGFR基因突变的引物和探针，其中，所述引物和探针的核苷酸序列为：

(1)用于检测18号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶1所示的上游引物，由SEQ ID NO∶2所示的下游引物和由SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶27所示的探针；

(2)用于检测19号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶4所示的上游引物，由SEQ ID NO∶5～SEQ ID NO∶13所示的下游引物，由SEQ ID NO∶14所示的探针；

(3)用于检测20号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶15～SEQ ID NO∶17所示的上游引物，由SEQ ID NO∶18所示的下游引物，由SEQ ID NO∶19所示的探针；

(4)用于检测21号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶20所示的上游引物，由SEQ ID NO∶21所示的下游引物，由SEQ ID NO∶22～SEQ ID NO∶23所示的探针；

(5)作为内参的引物和探针：由SEQ ID NO∶24所示的上游引物，由SEQ ID NO∶25所示的下游引物，由SEQ ID NO∶26所示的探针；

其中，所述探针的核苷酸链的5’端标记有FAM，3’端标记有TAMRA。

本发明的第一优选技术方案为：所述的试剂盒的组成为：所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和测序试剂，其中，所述的核酸扩增试剂包括：

表1：

序号	组份	组份中的主要成份
			1	EGFR(exon18)PCR反应液	用于检测18号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer
2	EGFR(exon19)PCR反应液	用于检测19号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer
			3	EGFR(exon20)PCR反应液	用于检测20号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer
4	EGFR(exon21)PCR反应液	用于检测21号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer
			5	EGFR内参基因PCR反应液	作为内参的引物、探针、dNTPs、buffer
6	EGFR酶液	Taq酶、UNG酶

其中，管1～6各1管，管1～5的标示量为420ul，管6的标示量为100ul。

本发明的第二优选技术方案为：所述各组核酸扩增试剂中各成分的含量为：含有6mmol/L引物各1ul、4mmol/L探针各1ul、5mM的dNTPs0.5ul、10×buffer2.5ul，加水至21μl；所述的EGFR酶液中含有Taq酶5u/管、UNG0.5u/管。

本发明的第三优选技术方案为，所述的对照品包括：

表2：

序号	组份	组份中的主要成份
			7	EGFR阴性对照	工艺用水
8	EGFR阳性对照	质粒混合液。

其中，管7、管8各1管，管7的标示量为100ul，管8的标示量为30ul。

其中，所述的EGFR阳性对照的质粒混合液中含有：

EGFR(exon18)突变阳性质粒：G719C、G719S两种点突变质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶27～由SEQ ID NO∶28所示；

EGFR(exon19)突变阳性质粒：EGFR19-A1～EGFR19-A24突变质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶29～由SEQ ID NO∶52所示；

EGFR(exon20)突变阳性质粒：H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV三种质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶53～由SEQ lD NO∶55所示；

EGFR(exon21)突变阳性质粒：L858R(2573T＞G)、L861Q(2582T＞A)两种质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶56～由SEQ ID NO∶57所示。

本发明的第四优选技术方案为，所述的测序试剂包括：

表3：

序号	组份	组份中的主要成份
			9	测序试剂	Bigdye及缓冲液
10	SAPMIX	外切酶和SAP酶
			11	EGFR测序引物	引物。

其中，管9～11各1管，管9的标示量为20ul，管10、管11的标示量为40ul。

其中，测序引物为公知测序方法制备。

本发明的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)PCR荧光检测：

a.样本处理：提取人类基因组DNA；提取完的DNA-20℃保存；

可从新鲜病变组织、冰冻病理切片、石蜡包埋病理组织或切片等提取；

b.扩增试剂准备：从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s；按每管21ul反应液和1ul酶液，分装于PCR反应管中；

c.加样：从对照品或样本处理液中分别取3ul，加至装有上述PCR反应混合液的离心管中，盖紧管盖、将其移至检测区；

d.PCR扩增：

ABI PRISM荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；94℃，15sec；60℃，60sec；共40个循环；反应体系为25ul；在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号；检测通道为FAM-TAMRA，参比荧光设定为none；

Stratagene荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；94℃，45sec；60℃，80sec；共40个循环；反应体系为25ul；在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号；检测通道为FAM；

e.检测：用chromas2.23软件自动处理和分析数据；

(2)EGFR基因19外显子测序检测：对EGFR(exon19)为阳性的突变标本，并且满足内参基因的C_T值≤30、且相关基因与内参基因C_T值差值≤1，对该标本进行测序。

采用本发明试剂盒检测后，检测结果的判定方法为：

(1)、有效性判定：

A.阴性对照有效性判定：

对于EGFR(exon18)PCR反应液管、EGFR(exon20)PCR反应液管、EGFR(exon21)PCR反应液管、内参基因PCR反应液管：C_T值均≥38或显示“Undet”判定为有效；

对于EGFR(exon19)PCR反应液管：C_T值≥38或显示“Undet”判定为有效；或相关检测基因与内参基因C_T值差值≥10判定为有效；

B.阳性对照有效性判定

对于EGFR(exon18)反应液管、EGFR(exon20)反应液管、EGFR(exon21)反应液管：C_T值均＜36判定为有效；

对于EGFR(exon19)反应液管、内参基因反应液管：C_T值＜36，且相关检测基因与内参基因C_T值差值≤1，判定为有效；内参基因测序图清晰，判定enon19为纯合缺失突变；

(2)结果判定：

A.PCR检测结果判定：

对于EGFR(exon18)反应液管、EGFR(exon20)反应液管、EGFR(exon21)反应液管：

a)相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值≤1；判定该相关检测基因中有突变；

b)相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值＞1；判定存在少量EGFR突变；

c)相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值＜38.0；判定该相关检测基因中无突变或突变低于最低检出限；

d)相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值≥38或显示“Undet”；需增加取样量重新抽提后进行检测；

对于EGFR(exon19)反应液管：

a)相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值＜38.0；或标本的相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值≥10；判定该相关检测基因中无突变或突变低于最低检出限；

b)相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值≤1；判定该相关检测基因中有突变；

c)相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值在1～10之间；判定存在少量EGFR(exon19)突变；

d)相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值≥38或显示“Undet”；判定为需增加取样量重新抽提后进行检测；

B.EGFR基因19号外显子突变测序检测结果判定：

运行Chromas程序，对测序得到的序列进行分析：首先删除不稳定的测序区域及内含子区域，然后将测序得到的序列与正常19外显子的氨基酸序列K745～P753进行对比，如果不存在缺失，则为野生型；反之，则为突变型。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本公司生产的EGFR基因突变检测试剂盒由EGFR相关基因特异性引物、荧光探针以及Taq酶等成分组成，采用PCR体外扩增的方法，利用实时荧光Taqman探针法，通过荧光信号的变化，检测标本中人的EGFR(exon18)、EGFR(exon19)、EGFR(exon20)、EGFR(exon21)基因常见的31种突变，因为不同的19号缺失突变，对TKI的治疗效果是不同的，因此本试剂盒还可以通过后续PCR产物直接测序分析，进一步明确EGFR第19外显子突变的类型，从而正确地指导医生用药。此外，最新的研究也表明，TKI的疗效不仅与是否有EGFR基因19号外显子突变相关，还与基因突变的量有密切关系。因此，本试剂盒对EGFR基因突变的定性检测，给出不同的灵敏度参考范围，以帮助临床判断突变量的多少，确定最终诊疗方案。

本发明的引物、探针的核苷酸序列为：

表4：

一、EGFR(exon18)突变阳性质粒：G719C、G719S两种点突变质粒DNA液各1份，

1.G719C点突变(EGFR18-719C)质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶27所示：

2.G719S点突变(EGFR18-719S)质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶28所示：

二、EGFR(exon19)突变阳性质粒：EGFR19-A1～EGFR19-A24突变质粒DNA液各1份；

1.EGFR19-A1质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶29所示：

2.EGFR19-A2质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶30所示：

3.EGFR19-A3质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶31所示：

4.EGFR19-A4质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶32所示：

5.EGFR19-A5质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶33所示：

6.EGFR19-A6质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶34所示：

7.EGFR19-A7质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶35所示：

8.EGFR19-A8质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶36所示：

9.EGFR19-A9质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶37所示：

10.EGFR19-A10质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶38所示：

11.EGFR19-A11质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶39所示：

12.EGFR19-A12质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶40所示：

13.EGFR19-A13质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶41所示：

14.EGFR19-A14质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶42所示：

15.EGFR19-A15质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶43所示：

16.EGFR19-A16质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶44所示：

17.EGFR19-A17质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶45所示：

18.EGFR19-A18质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶46所示：

19.EGFR19-A19质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶47所示：

20.EGFR19-A20质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶48所示：

21.EGFR19-A21质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶49所示：

22.EGFR19-A22质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶50所示：

23.EGFR19-A23质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶51所示：

24.EGFR19-A24质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶52所示：

三、EGFR(exon20)突变阳性质粒：H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV三种质粒DNA液各1份；

1.EGFR20-Ins770质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶53所示：

2.EGFR20-Ins771质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶54所示：

3.EGFR20-Ins774质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶55所示：

四、EGFR(exon21)突变阳性质粒：L858R(2573T＞G)、L861Q(2582T＞A)两种质粒DNA液各1份；

1.EGFR21-L858R质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶56所示：

2.EGFR21-L861Q质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO∶57所示。

根据本发明的试剂盒进行检测后，检测结果的判定方法为：

(1)、有效性判定：

A.阴性对照有效性判定EGFR(exon18)：

表5：

B.阳性对照有效性判定

表6：

(2)结果判定：

A.PCR检测结果判定：

表7：

B.EGFR基因19号外显子突变测序检测结果判定：

运行Chromas程序，对测序得到的序列进行分析：首先删除不稳定的测序区域及内含子区域，然后将测序得到的序列与正常19外显子的氨基酸序列K745～P753进行对比，如果不存在缺失，则为野生型；反之，则为突变型。

本发明的试剂盒所检测的突变位点为：

表8：

本发明突破了现有技术中对基因突变检测方法的局限性，构建了一种采用实时定量PCR技术(RQ-PCR)的基因突变检测技术，其反应速度快、灵敏度高、特异性强、可重复性好；闭管操作，适用于临床应用。

本发明的有益效果为：

1.本发明的试剂盒能检出含0.1～1％EGFR基因突变DNA的样本；

2.本发明的试剂盒对含10％EGFR19号外显子基因突变DNA样本，通过测序能准确分型；

3.本发明的试剂盒特异性高：能从新鲜病变组织、冰冻病理切片、石蜡包埋病理组织或切片、外

周血及外周血浆等提取的基因组DNA中检测(exon18)、EGFR(exon19)、EGFR(exon20)、EGFR(exon21)基因的相关突变；

4.本发明的试剂盒灵敏度高，最低检出限为5基因拷贝。

5.本发明的试剂盒能对EGFR基因突变的定性检测，给出不同的灵敏度参考范围，以帮助临床判断突变量的多少，确定最终诊疗方案能对不同突变。

附图说明：

图1为EGFR基因突变示意图。

本发明的具体实施方式仅限于对本发明做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1：

试剂盒组成：

表9：

实施例2采用实施例1的试剂盒进行检测：

A.PCR荧光检测：

1.样本处理：

取样本1～12，采用QIAGEN石蜡组织DNA提取试剂盒或QIAGEN全血DNA提取试剂盒，进行提取，-20℃冻存。

标本1-3：石蜡标本；

标本4-6：新鲜标本；

标本7-9：外周血标本；

标本10-12：外周血浆标本；

2.扩增试剂准备：

从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s。

按每管21ul反应液和1ul酶液，分装于PCR反应管中；注意各反应液PCR管数应为样本数、一个阴性对照及一个阳性对照管数之和；

3.加样：从对照品或样本处理液中分别取3ul，加至装有上述PCR反应混合液的离心管中，盖紧管盖、将其移至检测区；

4.PCR扩增：采用ABI PRISM荧光PCR检测仪，扩增条件为：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，15sec；60℃，60sec)40个循环。反应体系为25ul。在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号；检测通道为：FAM-TAMRA，参比荧光设定为none；

5.检测：

(1)基线的确定：软件默认设定3-15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。依据实验曲线走势的不同，一般start值可选择在3-12之间；stop值选择以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则，以更好满足统计基线标准偏差的数学要求；

(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，也即以高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值；

(3)注意：不同的反应液应分别单独确定各自的基线和阈值后，再进行各自分析；

计算机自动处理和分析数据。

得到实验结果：

A.阴性对照有效性判定

表10：

B.阳性对照有效性判定

表11：

结果如表12和13所示：

表12：

编号	1	2	3	4	5	6
							标本类型	石蜡	石蜡	石蜡	新鲜	新鲜	新鲜
E19反应液(CT值)	25.31	No Ct	35.13	23.17	No Ct	31.29
							内参反应液(CT值)	29.94	25.47	25.73	25.73	26.36	25.56
E19-内参(CT值)	-4.63	/	9.4	-2.56	/	5.73
							结论	突变	野生型	少量突变	突变	野生型	少量突变

表13：

经DNA测序实验验证，本发明的检测结果与DNA测序结果完全一致。并经灵敏度分析，将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释，每次反应加入5μIDNA。结果表明本发发明的荧光PCR方法的灵敏度很高，5拷贝DNA基因组即可检出。

B.对样本1的EGFR基因19外显子测序检测

1.PCR产物的酶解：

取其EGFR内参基因PCR反应液的扩增产物1μl，再加入2μl SAPMIX，混匀；37℃60分钟，80℃15分钟，最后4℃保存；

阳性对照的EGFR内参基因PCR反应液的扩增产物与其一起处理及并一同进行以后相应的测序处理，以作为测序的阳性对照；

2.测序PCR反应：

选取阳性PCR酶解产物3μl、测序试剂(bigdye)1μl和测序引物2μl进行PCR扩增，具体条件：

表11：

3.测序产物纯化：

(1)96孔板整板离心方法：

a、在每孔内加入16μl醋酸钠-乙醇混合物(3MNaAc：无水乙醇＝1：15)，剧烈振荡，避光静置15分钟；3500g以上4℃℃离心半小时；倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心；

b、加入70μl70％预冷乙醇，剧烈振荡，3500g以上4℃离心15分钟。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心；

c、加入70μl70％乙醇，温和颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，3500g以上4℃离心5分钟。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心；

d、让酒精在室温挥发干净，加入10μl Hi-Di Formamide溶解DNA；

e、在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟；上机电泳；

(2)单个0.2mL离心管离心方法：

a、在每孔内加入16μl醋酸钠-乙醇混合物(3M NaAc：无水乙醇＝1：15)，剧烈振荡，避光静置15分钟。12000g4℃离心半小时，吸去上层液体。

b、加入70μl70％预冷乙醇，剧烈振荡，12000g以上4℃离心15分钟，吸去上层液体。

c、加入70μl70％乙醇，温和颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，12000g4℃离心5分钟，吸去上层液体。

d、让酒精在室温挥发干净，加入10μl Hi-Di Formamide溶解DNA。

e、在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。上机电泳。

4.检测：

在自动化的基因分析仪上进行测序；

4.EGFR基因19号外显子突变测序检测结果判定：

运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：

(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域.(注意：此步骤决不能省略)

按Find快捷键，找到序列“TCGCTAT”，移动光标至“C”与“G”之间，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“Delete CutoffSequences”删除以上区域；

(2)检测耐药突变：

缺失突变：按快捷键Alt+T，显示氨基酸序列，对比正常19外显子的氨基酸序列(K745～P753)，看其是否存在缺失，样本1为19号外显子L747_P753＞S缺失突变。

Claims (7)

1.一种检测人EGFR基因突变的引物和探针，其中，所述引物和探针的核苷酸序列为：

(1)用于检测18号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶1所示的上游引物，由SEQ ID NO∶2所示的下游引物，由SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶27所示的探针；

(2)用于检测19号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶4所示的上游引物，由SEQ ID NO∶5～SEQ ID NO∶13所示的下游引物，由SEQ ID NO∶14所示的探针；

(3)用于检测20号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶15～SEQ ID NO∶17所示的上游引物，由SEQ ID NO∶18所示的下游引物，由SEQ ID NO∶19所示的探针；

(4)用于检测21号外显子突变的引物和探针为：由SEQ ID NO∶20所示的上游引物，由SEQ ID NO∶21所示的下游引物，由SEQ ID NO∶22～SEQ ID NO∶23所示的探针；

(5)作为内参的引物和探针：由SEQ ID NO∶24所示的上游引物，由SEQ ID NO∶25所示的下游引物，由SEQ ID NO∶26所示的探针；

其中，所述探针的核苷酸链的5’端均标记有FAM，3’端均标记有TAMRA。

2.一种含有权利要求1所述检测人EGFR基因突变的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的组成为：所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和测序试剂，其中，所述的核酸扩增试剂包括：

  序号   组份   组份中的主要成份   1   EGFR(exon18)PCR反应液  用于检测18号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer   2   EGFR(exon19)PCR反应液  用于检测19号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer   3   EGFR(exon20)PCR反应液  用于检测20号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer   4   EGFR(exon21)PCR反应液  用于检测21号外显子突变的引物、探针、dNTPs、buffer   5   EGFR内参基因PCR反应液   作为内参的引物、探针、dNTPs、buffer   6   EGFR酶液   Taq酶、UNG酶。

3.根据权利要求2所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述各组核酸扩增试剂中各成分的含量为：含有6mmol/L引物各1ul、4mmol/L探针各1ul、5mM的dNTPs0.5ul、10×buffer2.5ul，加水至21μl；所述的EGFR酶液中含有Taq酶5u/管、UNG0.5u/管。

4.根据权利要求2所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的对照品包括：

  序号   组份   组份中的主要成份   7   EGFR阴性对照   工艺用水   8   EGFR阳性对照   质粒混合液。

其中，所述的EGFR阳性对照的质粒混合液中含有：

EGFR(exon18)突变阳性质粒：G719C、G719S两种点突变质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶27～由SEQ ID NO∶28所示；

EGFR(exon19)突变阳性质粒：EGFR19-A1～EGFR19-A24突变质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶29～由SEQ ID NO∶52所示；

EGFR(exon20)突变阳性质粒：H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV三种质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶53～由SEQ ID NO∶55所示；

EGFR(exon21)突变阳性质粒：L858R(2573T＞G)、L861Q(2582T＞A)两种质粒DNA液各1份，其核苷酸序列由SEQ ID NO∶56～由SEQ ID NO∶57所示。

5.根据权利要求2所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的测序试剂包括：

  序号   组份   组份中的主要成份   9   测序试剂   Bigdye及缓冲液   10   SAPMIX   外切酶和SAP酶   11   EGFR测序引物   引物。

6.一种权利要求2～5所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于，

(1)PCR荧光检测：

a.样本处理：提取人类基因组DNA；提取完的DNA-20℃保存；

b.扩增试剂准备：从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s；按每管21ul反应液和1ul酶液，分装于PCR反应管中；

c.加样：从对照品或样本处理液中分别取3ul，加至装有上述PCR反应混合液的离心管中，盖紧管盖、将其移至检测区；

d.PCR扩增：

ABI PRISM荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；94℃，15sec；60℃，60sec；共40个循环；反应体系为25u1；在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号；检测通道为FAM-TAMRA，参比荧光设定为none；

Stratagene荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；94℃，45sec；60℃，80sec；共40个循环；反应体系为25ul；在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号；检测通道为FAM；

e.检测：用chromas2.23软件自动处理和分析数据；

(2)EGFR基因19外显子测序检测：对EGFR(exon19)为阳性的突变标本，并且满足内参基因的C_T值≤30、且相关基因与内参基因C_T值差值≤1，对该标本进行测序。

7.根据权利要求6所述的检测EGFR基因突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的检测结果的判定方法为：

(1)、有效性判定：

A.阴性对照有效性判定：

对于EGFR(exon18)PCR反应液管、EGFR(exon20)PCR反应液管、EGFR(exon21)PCR反应液管、内参基因PCR反应液管：C_T值均≥38或显示“Undet”判定为有效；

对于EGFR(exon19)PCR反应液管：C_T值≥38或显示“Undet”判定为有效；或相关检测基因与内参基因C_T值差值≥10判定为有效；

B.阳性对照有效性判定

对于EGFR(exon18)反应液管、EGFR(exon20)反应液管、EGFR(exon21)反应液管：C_T值均＜36判定为有效；

对于EGFR(exon19)反应液管、内参基因反应液管：C_T值＜36，且相关检测基因与内参基因C_T值差值≤1，判定为有效；内参基因测序图清晰，判定enon19为纯合缺失突变；

(2)结果判定：

A.PCR检测结果判定：

对于EGFR(exon18)反应液管、EGFR(exon20)反应液管、EGFR(exon21)反应液管：

①相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值≤1；判定该相关检测基因中有突变；

②相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值＞1；判定存在少量EGFR突变；

③相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值＜38.0；判定该相关检测基因中无突变或突变低于最低检出限；

④相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值≥38或显示“Undet”；需增加取样量重新抽提后进行检测；

对于EGFR(exon19)反应液管：

①相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值＜38.0；或标本的相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值≥10；判定该相关检测基因中无突变或突变低于最低检出限；

②相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值≤1；判定该相关检测基因中有突变；

③相关检测基因C_T值＜38，且相关基因与内参基因C_T值差值在1～10之间；判定存在少量EGFR(exon19)突变；

④相关检测基因C_T值≥38或显示“Undet”，且内参基因C_T值≥38或显示“Undet”；判定为需增加取样量重新抽提后进行检测；

B.EGFR基因19号外显子突变测序检测结果判定：

运行Chromas程序，对测序得到的序列进行分析：首先删除不稳定的测序区域及内含子区域，然后将测序得到的序列与正常19外显子的氨基酸序列K745～P753进行对比，如果不存在缺失，则为野生型；反之，则为突变型。

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