CN106755343A - 胰腺癌预后诊断分子标记物 - Google Patents
胰腺癌预后诊断分子标记物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106755343A CN106755343A CN201611088201.7A CN201611088201A CN106755343A CN 106755343 A CN106755343 A CN 106755343A CN 201611088201 A CN201611088201 A CN 201611088201A CN 106755343 A CN106755343 A CN 106755343A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cancer
- pancreas
- pi4kap1
- kit
- prognosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Abstract
本发明公开了用于胰腺癌预后诊断的分子标记物,所述分子标记物选自LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因。本发明进一步公开了所述的分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用,所述试剂盒包括特异性扩增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一组或多组的引物序列。利用本发明的分子标记物监测胰腺癌预后,不仅精确度大大提高,同时对后续临床研究的开展具有指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物在预后诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种消化道常见肿瘤,是预后最差的恶性肿瘤之一。根据最新流行病学调查,胰腺癌位居欧美等发达国家恶性肿瘤死亡率第四位,全球每年约250万人死于胰腺癌。近20年来我国胰腺癌的发病率持续增高,目前胰腺癌位居恶性肿瘤死亡率第五位。在胰腺癌的治疗中,早期诊断困难,其起病隐匿,缺乏典型临床症状,且预后极差,胰腺癌侵袭性强,恶性度高,外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人意,其术后1年生存率不到20%,5年生存率仅为4%,早期确诊率低和术后转移是胰腺癌死亡率高的主要原因。因此,胰腺癌的早期诊断和早期治疗是提高和改善胰腺癌预后的关键,尤其是发现一种特有的、可用于早期诊断和预后的标记物和靶向分子,对于战胜胰腺癌具有重要意义,成为目前国内外肿瘤专家的研究热点。
近年来,随着分子生物学技术的发展,在癌症疾病的相关研究中,越来越多的非编码基因或非编码RNA被报道,如lncRNA、micRNA、假基因等。
非编码RNA(ncRNAs)是一类具有重要生物学功能的RNA,参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程,在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。越来越多的权威研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用。目前己有较多lncRNAs被证实在包括乳腺癌、***、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。
假基因则是一段具有与正常功能基因相似的序列,但是与正常的基因存在结构上的差异。这些差异包括在不同部位上程度不等的核苷酸缺失或***,在基因内含子和外显子连接区发生序列变化,在编码序列当中含有终止密码子,或在转录启动区出现缺陷等。这些变化使此类基因不能转录翻译,或者产生有缺陷的蛋白质从而失去原有的生物学功能。长期以来,人们认为假基因是貌似正常、却没有功能的“死亡基因”,是基因组进化的“化石记录”。但是近年来,关于假基因的讨论日益增多,越来越多的试验证实假基因能够转录并且表达。假基因在基因表达调控、基因组进化等方面发挥着重要作用。
对于胰腺癌这类发病隐匿、进展快且预后极差的疾病,更需要使用准确、灵敏、特异性强的标记物来辅助胰腺癌的诊断或预后,lncRNAs或者假基因表达分析研究或许可以帮助我们发现一些新的生物标记物。
发明内容
为了实现胰腺癌的早期发现,早期干预,本发明的目的在于提供用于胰腺癌预后诊断的分子标记物。
本发明的还一目的是提供所述的胰腺癌预后诊断分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。
为实现上述目的,本发明首先提供用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物,所述分子标记物为LOC100271722(NR_027036.1,lncRNA)、LOC100302650(NR_028308.1,lncRNA)和PI4KAP1(NR_003563.1,pseudogene)中的一种或多种基因。
进一步地,本发明提供了所述的分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。
优选的,所述预后为监测、疗效评估或转移复发监控。
优选的,所述试剂包括检测所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量的寡聚核苷酸片段;所述试剂盒为检测所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量的试剂盒。
进一步地,本发明提供了一种用于胰腺癌预后诊断的试剂盒,所述试剂盒包括特异性扩增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因的引物序列。
优选的,所述引物序列包括:
LOC100271722的引物对:SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;
LOC100302650的引物对:SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
PI4KAP1的引物对:SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中的一组或多组。
优选的,所述试剂盒的组分包括:
(1)组织样本或血液中总RNA提取试剂:Trizol、氯仿、异丙醇和75%乙醇等。
(2)反转录试剂:逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、热稳定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制剂和T重复寡核苷酸Oligo dT。
(3)定量PCR试剂:PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs组成的SYBR Green聚合酶链式反应体系,引物和RNase Free H2O。
进一步地,本发明提供了检测受试者样本中LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量的寡聚核苷酸片段在制备胰腺癌预后试剂盒中的应用。
优选的,利用所述的寡聚核苷酸片段检测LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量来进行受试者预后评估的方法为:确定来自受试者治疗前的样本中所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量以获得第一值,对受试者施用癌症治疗,确定在其后由受试者获得的后续样品中所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因的表达量以获得治疗值,将所述第一值与所述治疗值相比较,当所述治疗值低于第一值时,指示所述受试者预后不良。优选的,当所述治疗值低于第一值35%以上时,指示所述受试者胰腺癌转移复发。
优选的,所述样本选自组织、血液、血浆、血清、胰腺分泌物和胰腺细胞。
本发明的有益效果如下:
本发明公开了与胰腺癌相关的基因LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1,并进一步证实上述的一种或多种基因可以作为胰腺癌预后诊断的分子标记物。利用本发明的分子标记物监测胰腺癌预后,不仅精确度大大提高,同时对后续临床研究的开展具有指导意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法,通常为本领域常规方法,如按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆,实验手册(第三版)(科学出版社,2002)中的所述条件,或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析,筛选3个候选基因:LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1,现有研究中并没有关于上述基因和胰腺癌相关的报道。进一步,发明人对于从确诊的胰腺癌患者采集的血液样本作为待测样品进行研究,通过使用RNA提取和定量PCR对胰腺癌患者血液中上述基因的表达水平进行检测,结合胰腺癌患者的跟踪随访资料,采用统计学分析,显示上述基因与胰腺癌患者预后有密切的关系。上述基因的表达与胰腺癌患者的生存状况有一定的相关性。提示上述基因可能具有很好的辅助诊断价值,可成为胰腺癌标志物。
LOC100271722(long intergenic non-protein coding RNA 899,长链非编码蛋白RNA 899,lncRNA,又名LINC00899),位于第22号染色体上。
LOC100302650(又名BRE-AS1,全称BRE antisense RNA 1,lncRNA),位于第2号染色体上。
PI4KAP1(phosphatidylinositol 4-kinase alpha pseudogene 1,磷脂酰肌醇4-激酶α假基因1,假基因),位于第22号染色体上。PI4KA(phosphatidylinositol 4-kinasealpha磷脂酰肌醇4-激酶α)为一种编码蛋白,催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸合成的第一个关键步骤,是一种不被腺苷抑制的Ⅲ型酶,与其相关的途径有代谢和皮代谢。
本发明所述的基因是在本发明之前的已知基因,其基本信息可以在Genbank中查到,来源于人类基因组。
本发明采用RT-PCR方法检测上述基因在胰腺癌患者生物学样品中的表达情况。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现,极大地简化了定量检测的过程,而且真正实现了绝对定量。多种检测***的出现,使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率,反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
在本发明中,“预后”是指癌症患者在通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。预后可以是通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查标志物来评估,所述的标记物选自LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因。预后评估可以这样进行:根据标志物的有或无,或者升高或降低,确定患者的预后是良好还是不良,或者确定良好预后或不良预后的概率。
实施例1基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因
1、临床信息筛选
检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息,截至2015年12月10日,TCGA数据库中总共记载了185例胰腺癌临床病例。对这些数据进行筛选,共有160例患者纳入研究。筛选时排除具有其他恶性肿瘤病史、曾接受过放疗或化疗的患者,同时纳入研究的患者需含临床信息和mRNA数据。
2、生存期研究样本统计
160例胰腺癌患者生存时间的统计结果如下表所示:
表1 160例胰腺癌患者生存时间统计
生存期时间t(年) | 期初进入研究人数 | 期内死亡人数 | 期内失访人数 |
t<1 | 160 | 27 | 74 |
1≤t<2 | 59 | 22 | 15 |
2≤t<3 | 22 | 10 | 2 |
3≤t<4 | 10 | 2 | 2 |
4≤t<5 | 6 | 0. | 1 |
5≤t | 5 | 4 | 1 |
3、mRNA表达数据生存分析研究方案
(1)对胰腺癌高通量mRNA转录组数据检索、数据下载及样本挑选和归类。由下载的转录组数据通过生物信息学分析筛选得出与胰腺癌生存时间相关的mRNA。
(2)用Cytoscape软件构建由mRNAs组成的生物信息网络,通过DAVID对生物信息网络中与胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO分析和Pathway分析。
4、胰腺癌mRNA表达数据的生存分析结果
将胰腺癌组织的转录组数据下载后,去除read count=0小于20%的mRNA后用做下一步分析,包括17100个mRNA。提取mRNA基因表达量和胰腺癌TCGA数据库生存时间数据,采用survival包的coxph函数完成,经单因素Cox回归分析,筛选得到单因素Cox回归中p值<0.05的mRNA有580个,包括328个风险性mRNA和252个保护性mRNA。
为了更好的研究与生存时间相关的mRNA的功能,我们通过GORILLA和GeneCodis软件对胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO功能富集合KEGG通路富集,筛选标准皆为FDR<0.05。筛选出3个基因LOC100271722(P=0.040,HR=0.68,95%CI=0.47-0.98),LOC100302650(P=0.027,HR=0.78,95%CI=0.62-0.97)和PI4KAP1(P=0.008,HR=0.70,95%CI=0.53-0.91),均为保护性mRNA(HR<1)。
实施例2胰腺癌临床预后诊断分子标记物的鉴定
1、研究对象
收集50例经病理学检查确诊为胰腺癌的患者,并对其进行跟踪随访。所有患者在经过有效治疗后均未再进行任何其他辅助治疗。患者样本来源于北京协和医院就诊的胰腺癌患者,所有收集的患者均经过有效治疗,临床资料及随访资料完整。
首先采集50例胰腺癌患者治疗前的血液,检测血液中基因的相对表达量,结合跟踪随访的预后信息研究LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的表达与胰腺癌患者预后的关系。然后选取其中5例在有效治疗后的第三年转移复发的胰腺癌患者,研究其在治疗前后以及治疗后三年中相应基因表达量的变化情况。对该5例胰腺癌患者需在其治疗结束后的每年定期采集血液一次。本研究的所有临床样本,均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。
2、试验方法
2.1对血液样本进行RNA提取
采用Trizol LS(Invitrogen:10296-010)对采集的血液样本进行RNA提取,实验操作按产品说明书进行,每组实验的具体操作如下:
取收集到的新鲜血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10分钟,10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清,收集白细胞沉淀。
(1)入1mLTrizol,室温保存5分钟;
(2)加氯仿0.2mL,用力振荡离心管,充分混匀,室温放置3-5分钟;
(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70%)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的界面。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀,置于冰上10分钟;
(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液,按1mL/mL Trizol的比例加入75%DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存),洗漆沉淀物,振荡混合,4℃下8000rpm离心2分钟;
(5)弃去乙醇液体,室温下放置2分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀;
(6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-80℃。RNA质量判定标准:RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间;总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带;70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2 RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳,从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否,是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen,货号18080-044)进行cDNA反转录,具体操作为:使用逆转录试剂盒,用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系,每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.4 Real-Time PCR
2.4.1引物设计
采用在线引物设计软件,基因序列参照LOC100271722(NR_027036.1,lncRNA)、LOC100302650(NR_028308.1,lncRNA)和PI4KAP1(NR_003563.1,pseudogene),内参选GAPDH,引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表2所示:
表2引物序列
2.4.3具体操作过程
(一)反应体系:用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen,货号4367659)进行扩增,实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95℃预变性5min,(95℃变性15sec,Tm退火45sec,72℃延伸35sec)×40个循环,具体Tm参照表2。
表3 RealTime反应体系
组分 | 加入量 |
2×mix | 10μL |
上游引物(10μM) | 0.5μL |
下游引物(10μM) | 0.5μL |
模板 | 2μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至25μL |
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后,以此为模板进行5倍梯度稀释,稀释后样品各取2μL作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增,同时在60-95℃进行融解曲线分析,根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTime-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板,分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
3、数据处理
ABI 7500型荧光定量PCR仪,采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析。实时定量PCR扩增曲线拐点清楚,扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线都是单峰,说明扩增产物只有一条,为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2-ΔΔCt×100%,计算基因在胰腺癌患者血液样本中的相对表达量。数据应用采用统计学软件SPSS 17.0,计量资料以表示,采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
4、结果分析
4.1LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1表达与胰腺癌预后
通过对50例胰腺癌患者的跟踪随访发现,预后>1年和预后≤1年的患者LOC100271722平均表达水平分别为(5.72±0.76)和(4.34±0.21),平均生存时间分别为(23.12±2.13)个月、(10.23±1.32)个月,差异有统计学意义(P<0.05)。预后>1年和预后≤1年的患者LOC100302650平均表达水平分别为(7.67±0.84)和(3.78±0.63),平均生存时间分别为(21.24±1.83)个月、(9.28±1.47)个月,差异有统计学意义(P<0.05)。预后>1年和预后≤1年的患者PI4KAP1平均表达水平分别为(8.84±0.94)和(6.49±0.23),平均生存时间分别为(22.12±2.53)个月、(9.48±1.52)个月,差异有统计学意义(P<0.05)。说明LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1表达水平高的患者平均生存时间明显高于LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1表达水平低的患者。提示LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1可以作为判断胰腺癌预后的重要参考指标。
4.2 5例胰腺癌转移复发患者血液中基因的表达量变化
LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1在5例胰腺癌转移复发患者血液中的表达量变化结果如表4和表5所示。从表中的数据可以看出,LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1在治疗后表达水平均显著升高,同时在治疗后的三年内LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1的表达水平每年均在下降。治疗后第3年5例胰腺癌患者均出现转移复发的情况,该年LOC100271722、LOC100302650、PI4KAP1的表达水平显著下降并且均低于治疗前的表达水平。
表4 LOC100271722在胰腺癌患者血液中的表达量变化
表6 LOC100302650在胰腺癌患者血液中的表达量变化
表7 PI4KAP1在胰腺癌患者血液中的表达量变化
实施例3试剂盒的制备
基于实施例2得到的引物组,组装本发明所述用于胰腺癌预后诊断的试剂盒,所述试剂盒包括特异扩增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种的引物对如表2所示,具体为:
1、试剂盒1包括特异性扩增LOC100271722的引物对;
2、试剂盒2包括特异性扩增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的引物对。
和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系,如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl,2.5mM MgCl2,200mM(NH4)2SO4;试剂盒还包括RNA提取试剂和反转录试剂。
通过对引物浓度和退火温度的优化,最终确定反应体系如表7所示:
表7 PCR反应体系
组分 | 加入量 |
SYBR Green聚合酶链式反应体系 | 12.5μL |
上游引物(10μM) | 0.5μL |
下游引物(10μM) | 0.5μL |
模板cDNA | 2.0μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至25μL |
最佳反应条件为:
95℃预变性5min,(95℃变性15sec,55℃退火45sec,72℃延伸35sec)×40个循环,72℃延伸15min。
实施例4试剂盒监控胰腺癌转移复发
选取10例经病理学检查确诊为胰腺癌的患者,对其进行跟踪随访。患者样本来源于北京协和医院就诊的胰腺癌患者,所有收集的患者均经过有效治疗,临床资料及随访资料完整。首先采集10例胰腺癌患者治疗后六周首次采集患者血液,检测血液中相应基因的表达量,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。
利用实施例3所述的两种试剂盒检测10例胰腺癌患者血液中相应基因的相对表达量。具体实施方法同实施例2。根据胰腺癌患者治疗后6周、3个月、6个月、9个月时血液样本中相应基因的相对表达量与治疗前相比变化的水平来判断胰腺癌患者是否发生转移复发。判断标准定为:治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降大于或等于35%时,判断为转移复发;治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降小于35%时,判断为无进展生存。
两种试剂盒的检测判断结果如表8和表9所示。同时,医生根据临床症状判断这10例患者治疗9个月后是否转移复发的结果也列在表8和表9中。如下表所示:试剂盒1为包括特异性扩增LOC100271722的试剂盒;试剂盒2为包括特异性扩增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的试剂盒。试剂盒2中基因的相对表达量为LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1相对表达量的平均值。
表8试剂盒1监控胰腺癌转移复发结果
患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
1 | 升高23% | 升高20% | 升高22% | 升高19% | 无进展生存 |
2 | 升高20% | 升高12% | 下降17% | 下降47% | 转移复发 |
3 | 升高24% | 升高20% | 升高21% | 升高18% | 无进展生存 |
4 | 升高17% | 升高15% | 升高8% | 升高2% | 转移复发 |
5 | 升高25% | 升高23% | 升高20% | 升高19% | 无进展生存 |
6 | 升高19% | 升高17% | 升高10% | 下降3% | 无进展生存 |
7 | 升高21% | 升高10% | 升高2% | 下降50% | 转移复发 |
8 | 升高20% | 升高18% | 升高15% | 升高12% | 无进展生存 |
9 | 升高22% | 升高9% | 下降22% | 下降62% | 转移复发 |
10 | 升高23% | 升高6% | 升高3% | 下降45% | 转移复发 |
表9试剂盒2监控胰腺癌转移复发结果
患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
1 | 升高18% | 升高16% | 升高12% | 升高11% | 无进展生存 |
2 | 升高15% | 升高12% | 下降23% | 下降37% | 转移复发 |
3 | 升高19% | 升高17% | 升高19% | 升高18% | 无进展生存 |
4 | 升高13% | 升高10% | 下降13% | 下降38% | 转移复发 |
5 | 升高17% | 升高13% | 升高8% | 下降5% | 无进展生存 |
6 | 升高16% | 升高14% | 升高10% | 升高9% | 无进展生存 |
7 | 升高17% | 升高10% | 下降12% | 下降54% | 转移复发 |
8 | 升高14% | 升高15% | 升高13% | 升高10% | 无进展生存 |
9 | 升高18% | 升高13% | 下降2% | 下降52% | 转移复发 |
10 | 升高12% | 升高7% | 下降3% | 下降40% | 转移复发 |
由表8和表9可知,临床诊断结果显示10例胰腺癌患者中有5例治疗后出现转移复发,5例无进展生存。试剂盒1检测的结果显示10例胰腺癌患者中有4例治疗后出现转移复发,6例无进展生存。其中编号为4的患者试剂盒检测结果与临床诊断结果有误;试剂盒2检测结果显示10例胰腺癌患者中有5例治疗后出现转移复发,其余5例无进展生存,试剂盒检测结果与临床诊断一致。据此推断,试剂盒2比试剂盒1检测准确性更高。并且使用本发明的试剂盒监控胰腺癌,可早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供参考。综上所述,LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1的一种或多种基因可以作为诊断和预示胰腺癌的标记物,并且同时检测多个标记物的准确性高于检测单一标志物。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京致成生物医学科技有限公司
<120> 胰腺癌预后诊断分子标记物
<130> P16yxa70
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaagaatg acccagcac 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catcccggtt cccacgaa 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgttacgt gaggctgtg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaggtgctg ctgtccaa 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggctgcgtg aagacata 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caaactcccg ctggtaaaa 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggagtccact ggcgtctt 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggagtccact ggcgtctt 18
Claims (10)
1.用于胰腺癌预后诊断的分子标记物,其特征在于,所述的分子标记物为LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因。
2.如权利要求1所述的分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述预后为监测、疗效评估或转移复发监控。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂包括检测所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因表达量的寡聚核苷酸片段;所述试剂盒为检测所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因表达量的试剂盒。
5.一种用于胰腺癌预后诊断的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括特异性扩增LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因的引物序列。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述引物序列包括:
LOC100271722的引物对:SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;
LOC100302650的引物对:SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
PI4KAP1的引物对:SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的一组或多组。
7.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。
8.检测受试者样本中LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因表达量的寡聚核苷酸片段在制备胰腺癌预后试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,利用所述的寡聚核苷酸片段检测LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量进行受试者预后评估的方法为:确定来自受试者治疗前的样本中所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一种或多种基因表达量以获得第一值,对受试者施用癌症治疗,确定在其后由受试者获得的后续样品中所述LOC100271722、LOC100302650和PI4KAP1中的一个或多个基因的表达量以获得治疗值,将所述第一值与所述治疗值相比较,当所述治疗值低于第一值时,指示所述受试者预后不良;当所述治疗值低于第一值35%以上时,指示所述受试者胰腺癌转移复发。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述样本选自组织、血液、血浆、血清、胰腺分泌物和胰腺细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611088201.7A CN106755343A (zh) | 2016-12-01 | 2016-12-01 | 胰腺癌预后诊断分子标记物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611088201.7A CN106755343A (zh) | 2016-12-01 | 2016-12-01 | 胰腺癌预后诊断分子标记物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106755343A true CN106755343A (zh) | 2017-05-31 |
Family
ID=58915140
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611088201.7A Withdrawn CN106755343A (zh) | 2016-12-01 | 2016-12-01 | 胰腺癌预后诊断分子标记物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106755343A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109115736A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-01-01 | 复旦大学附属中山医院 | 一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒 |
CN109371133A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-02-22 | 江苏大学附属医院 | 一组与胰腺癌相关的LncRNA分子标记物及其应用 |
CN109402254A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-03-01 | 复旦大学附属华山医院 | 一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒 |
CN116949180A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-27 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 用于胰腺导管腺癌的诊断、治疗和预后预测的产品及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102625708A (zh) * | 2009-09-09 | 2012-08-01 | 阿维拉制药公司 | Pi3激酶抑制剂及其用途 |
CN104080907A (zh) * | 2011-11-30 | 2014-10-01 | 日本国立癌症研究中心 | 诱导恶性干细胞 |
WO2014205555A8 (en) * | 2013-06-28 | 2015-01-29 | British Columbia Cancer Agency Branch | Methods and uses for diagnosis and treatment of prostate cancer |
CN105981026A (zh) * | 2014-02-06 | 2016-09-28 | 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 | 生物标志标识方法及用于其的装置和试剂盒 |
-
2016
- 2016-12-01 CN CN201611088201.7A patent/CN106755343A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102625708A (zh) * | 2009-09-09 | 2012-08-01 | 阿维拉制药公司 | Pi3激酶抑制剂及其用途 |
CN104080907A (zh) * | 2011-11-30 | 2014-10-01 | 日本国立癌症研究中心 | 诱导恶性干细胞 |
WO2014205555A8 (en) * | 2013-06-28 | 2015-01-29 | British Columbia Cancer Agency Branch | Methods and uses for diagnosis and treatment of prostate cancer |
CN105981026A (zh) * | 2014-02-06 | 2016-09-28 | 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 | 生物标志标识方法及用于其的装置和试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ADEODAT ILBOUDO等: "Overexpression of phosphatidylinositol 4-kinase type III alpha is associated with undifferentiated status and poor prognosis of human hepatocellular carcinoma", 《BMC CANCER》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109115736A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-01-01 | 复旦大学附属中山医院 | 一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒 |
CN109402254A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-03-01 | 复旦大学附属华山医院 | 一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒 |
CN109402254B (zh) * | 2018-09-04 | 2024-03-08 | 复旦大学附属华山医院 | 一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒 |
CN109371133A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-02-22 | 江苏大学附属医院 | 一组与胰腺癌相关的LncRNA分子标记物及其应用 |
CN109371133B (zh) * | 2018-12-03 | 2021-11-30 | 江苏大学附属医院 | 一组与胰腺癌相关的LncRNA分子标记物及其应用 |
CN116949180A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-27 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 用于胰腺导管腺癌的诊断、治疗和预后预测的产品及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6246845B2 (ja) | 遺伝子発現を用いた前立腺癌の予後を定量化する方法 | |
US20180251853A1 (en) | Biomarkers in Peripheral Blood Mononuclear Cells for Diagnosing or Detecting Lung Cancers | |
US20210130905A1 (en) | Micro-rna biomarkers and methods of using same | |
CN106755344A (zh) | 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用 | |
CN106893784A (zh) | 用于预测肝癌预后的lncRNA标志物 | |
BRPI0709397A2 (pt) | propagação de células primárias | |
CN108949992B (zh) | 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物 | |
CN106350600A (zh) | Loc80054在胰腺癌诊断或预后中的用途 | |
CN106755343A (zh) | 胰腺癌预后诊断分子标记物 | |
CN106399569A (zh) | C21orf82在制备胰腺癌预后评估产品中的应用 | |
CN115992229B (zh) | 一种胰腺癌预后风险评估的lncRNA标记物、模型及其应用 | |
CN106381342A (zh) | 用于胰腺癌诊断或预后的生物标记 | |
CN111187840A (zh) | 一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物 | |
CN108866187A (zh) | 一种与肺癌辅助诊断相关的长链非编码rna标志物及其应用 | |
CN106755309A (zh) | 分子标记物在制备胰腺癌预后评估产品中的应用 | |
CN110331207A (zh) | 肺腺癌生物标志物及相关应用 | |
CN110023510A (zh) | 作为卵巢癌预后诊断标志物的mmp1基因转录产物和检测方法 | |
US20160304961A1 (en) | Method for predicting the response to chemotherapy treatment in patients suffering from colorectal cancer | |
CN110358829A (zh) | 检测重组人肽基脯氨酰顺反异构酶-h表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
CN112877435B (zh) | 口腔鳞癌生物标志物及其应用 | |
CN109762897B (zh) | 一种骨肉瘤生物标记物环状RNA-circ_0006633及其应用 | |
CN106566884A (zh) | C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用 | |
CN106566886A (zh) | 一种胰腺癌预后评估的试剂及其应用 | |
CN106282374A (zh) | Fam13aos作为检测***癌的分子标记物及其应用 | |
Kolbert et al. | Microarray technologies for gene transcript analysis in pancreatic cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20170531 |
|
WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |