BRPI0709397A2 - propagação de células primárias - Google Patents

Abstract

PROPAGAçãO DE CéLULAS PRIMáRIAS. A presente invenção refere-se a um método de propagar as células de interesse, obtidas de amostra biológica, por a) enriquecimento das células sob condições que mantenham uma viabilidade suficiente das células, e b) propagação das células sob condições efetivas para permitir a viabilidade, a proliferação e a integridade das células.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROPAGA-ÇÃO DE CÉLULAS PRIMÁRIAS".

Antecedentes da Invenção

Metástases são a causa de morte principal em pacientes diag-nosticados com um tumor primário. As metástases de câncer ocorrem quan-do células se irradiam a partir do tumor primário e se disseminam para par-tes distantes do corpo através da corrente sangüínea periférica ou da drena-gem linfática. Foi mostrado que a presença de CTCs no sangue periféricoestá associada com reduzida sobrevida livre de progressão e reduzida so-brevida global em pacientes tratados por câncer de mama metastático. Em-bora forças mecânicas ou uma reação imune do indivíduo mate uma sériedestas células tumorais que penetram na corrente sangüínea, é sabido queuma percentagem das células tumorais sobrevivem e podem ser analisadas.A presença, enumeração e caracterização destas raras células epiteliais nosangue total pode proporcionar valiosas informações diagnosticas e clínicas.Cerca de 70 a 80% de todos os tumores sólidos se originam de células epi-teliais, as quais normalmente não são encontradas na circulação. As exten-sivas análises de RNAm de células epiteliais circulantes no sangue periféricopodem proporcionar informações valiosas sobre o prognóstico da carga tu-moral e a eficácia do tratamento. Por exemplo, o Her-2 receptor é superex-pressado em somente 30% dos pacientes com câncer de mama, o que su-gere que Herceptina seria uma terapia ineficaz para todos os pacientes. Por-tanto, o perfil molecular de CTCs deve levar a caracterização aprimorada deCTCs e essencialmente ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuti-cas personalizadas e mais eficazes.

A detecção precoce de câncer e seu status metastático são cru-ciais para o tratamento eficaz de cânceres levando a taxa de sobrevida glo-bal e aprimorada qualidade de vida. As metástases resultam da dissemina-ção de células tumorais irradiadas a partir do tecido primário atingindo dife-rentes tecidos através do sangue periférico freqüentemente referidas comocélulas tumorais circulantes (CTCs). Foi demonstrado que a presença destasCTCs no sangue conforme detectado por tecnologia CelISearch® está asso-ciada com reduzida da taxa de sobrevida deste modo servindo como "mar-cadores" prognosticáveis para a progressão do câncer (metástase). EstasCTCs podem ser usadas usadas potencialmente para estudos farmacoge-nômicos (por exemplo, quimossensibilidade). Adicionalmente, estudos deperfil molecular podem ser realizados sobre as CTCs o que adicionalmentenos leva a melhor entendimento dos mecanismos subjacentes do potencialmetastático/da progressão, do prognóstico e ainda da utilidade terapêutica.Os desafios são múltiplos: recuperação de ácidos nucléicos de qualidadedas CTCs; sua disponibilidade em quantidade muito limitada; limitações desensibilidade das provas existentes; aplicação/validação de séries de mar-cador existentes para as CTCs. Além disso, o estudo do perfil molecular po-de não levar a resultados precisos devido à contaminação das CTCs captu-radas com leuócitos cujo perfil de expressão pode interferir com os resulta-dos. A adaptação das CTCs para crescer in vitro pode resultar em propaga-ção das células para níveis suficientes e aliviar os desafios mencionadosacima. As células propagadas deste modo podem ser usadas para váriasaplicações incluindo avaliar a clonalidade de diferentes populações celula-res, descoberta de assinaturas, desenvolvimento de provas usando as assi-naturas referidas, hibridização de fluorescente in situ (FISH) e imunoistoquí- mica (IHC).

A detecção precoce de câncer e seu status metastático são cru-ciais para o tratamento eficaz de cânceres levando ao aumento da taxa desobrevida dramaticamente e aprimorada qualidade de vida. As metástasesresultam da disseminação de células tumorais irradidas a partir de tecidoprimário atingindo diferentes tecidos através do sangue periférico freqüen-temente referidas como células tumorais circulantes (CTCs). Foi demonstra-do que a presença destas CTCs no sangue conforme detectado por tecnolo-gia CelISearch® está associada com reduzida da taxa de sobrevida destemodo servindo como "marcadores" prognosticáveis para a progressão docâncer (metástase). Estas CTCs podem ser usadas usadas potencialmentepara estudos farmacogenômicos (por exemplo, quimossensibilidade).

A expressão genética no câncer pode ser rompida ou através dealteração genética ou alteração epigenética, as quais alteram o status here-ditário da expressão genética. A principal modificação epigenética do geno-ma human é metilação de resíduos citosina dentro do contexto do dinucleo-tídeo CpG. A metilação de DNA é interessante de um ponto de vista diag-nóstico porque pode ser facilmente detectada em células liberadas a partirde lesões neoplásicas e pré-neoplásicas em soro, urina ou escarro. E de umponto de vista terapêutico porque genes silenciados epigeneticamente po-dem ser reativados por inibidores de metilação de DNA e/ou histona deaceti-lase.

Recentemente, foi publicado um estudo envolvendo caracteriza-ção molecular das CTCs que utilizou perfis de expressão tanto por análiseGeneChip® quanto por PCR de transcrição reversa quantitativa. As amos-tras usadas neste estudo tinham > 100 CTCs o que é muito mais do que oque é tipicamente visto em triagem precoce (< 10 CTCs). Há a busca pelatecnologia de PCR Específico por Metilação Múltipla Quantitativa (QMSP)para realizar pré-amplificação (PCR nidificado) para obter suficiente de DNAalvo a partir de pequena quantidade de CTCs capturada por DNA (<5 célu-las).

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona métodos, aparelhos e kits paraprocessamento de amostras de células tumorais circulantes (CTC) dentro dosangue periférico e avaliar seus perfis de expressão genética enquanto pro-porcionando suporte para a plataforma CelISearch® para testar a recorrên-cia de doença. O kit CelISearch® Profile Kit é pretendido para o isolamentode CTCs de origem epitelial no sangue total em combinação com o sistemaCelISearch® AutoPrep System. O kit CelISearch® Profile Kit contém um re-agente de captura à base de ferrofluido, o qual consiste em nanopartículascom um núcleo magnético circundado por uma camada polimérica revestidacom anticorpos tendo por alvo o antígeno de molécula de adesão de célulaepitelial (EpCAM) para capturar CTCs. O sistema CelITracks® AutoPrepSystem automatiza e padroniza o processamento por uma precisa dispersãodos reagentes e cronometragem das etapas de incubação magnética, ofere-cendo aos cientistas ferramentas avançadas para isolar de modo reproduzí-vel e eficiente CTCs para importante estudo em uma variedade de carcino-mas. A grande maioria de leucócitos e outros componentes do sangue sãodepletados da amostra enriquecida, deste modo minimizando o fundo. Análi-se adicional é realizada usando técnicas de biologia estabelecidas incluindoRT-PCR e RT-PCR múltiplo. O ensaio de caracterização molecular é umteste diagnóstico molecular que é pretendido para uso depois de enriqueci-mento de CTC. Este teste incorpora tanto marcadores epiteliais quanto detecido de origem para confirmar que as células circulantes em um pacientepreviamente diagnosticado e tratado por câncer de mama são de fato deorigem mamária.Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um gráfico representando a estabilidade de RNAcom o tempo.

A Figura 2 é um gráfico representando mRNA próstata-especí-fico obtido a partir de células tumorais circulantes.

A Figura 3 é um gráfico representando mRNA próstata-especí-fico obtido a partir de células tumorais circulantes.

A Figura 4 representa os resultados de A) 100 ng de Spiking deDNA de PBL; ou B) em 500 ng de Spiking de DNA de PBL.

Descrição Detalhada

Um Biomarcador é quaisquer indícios de um ácido nucléico/ pro-teína Marcador indicado. Ácidos nucléicos podem ser quaisquer conhecidosna técnica incluindo, sem limitação, nuclear, mitocondrial (homeoplasmia,heteroplasmia), viral, bacteriano, fúngico, de micoplasma, e etc. Os indíciospodem ser diretos ou indiretos e medir a super- ou subexpressão do genedados os parâmetros fisiológicos e em comparação com um controle interno,placebo, tecido normal ou outro carcinoma. Biomarcadores incluem, semlimitação, ácidos nucléicos e proteínas (tanto super e subexpressão e diretae indireta). Usar ácidos nucléicos como Biomarcadores pode incluir qualquermétodo conhecido na técnica incluindo, sem limitação, medir amplificação deDNA, eliminação, inserção, duplicação, RNA1 micro RNA (miRNA), perda dêheterozigosidade (LOH), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, Brookes(1999)), número de cópias de polimorfismos (CNPs) quer diretamente ou naamplificação de genoma, DNA microssatélite, alterações epigenéticas taiscomo hipo- ou hipermetilação e DNA e FISH. O uso de proteínas como Bio-marcadores inclui qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limi-tação, medir a quantidade, atividade, modificações tais como glicosilação,fosforilação, ribosilação de ADP, ubiquitinação, e etc, ou imunoistoquímica(IHC) e "turnover". Outros Biomarcadores incluem estudo por imagens, estu-do do perfil molecular, contagem de células e Marcadores de apoptose.

Origem" conforme referido em 'tecido de origem' significa ou otipo de tecido (pulmão, cólon, e etc) ou o tipo histológico (adenocarcinoma,carcinoma de células escamosas, e etc) dependendo das circunstânciasmédicas particulares e serão entendidos por qualquer um com conhecimentoda técnica.

Um gene Marcador corresponde à seqüência designada poruma SEQ ID NO quando contém esta seqüência. Um segmento genético oufragmento corresponde à seqüência de gene similar quando contém umaporção da seqüência referida ou seu complemento suficiente para distinguiresta como sendo a seqüência do gene. Um produto de expressão genéticacorresponde a seqüência similar quando seu RNA, mRNA, ou cDNA hibridi-za à composição tendo a seqüência referida (por exemplo, uma sonda) ou,no caso de um peptídeo ou proteína, é codificado por um mRNA similar. Umsegmento ou fragmento de um produto de expressão genética correspondeà seqüência gene similar ou produto de expressão genética quando contémuma porção do produto de expressão genética referido ou seu complementosuficiente para distinguir esta como sendo a seqüência do gene ou produtode expressão genética.

Os métodos, composições, artigos, e kits da invenção descritose reivindicados nesta especificação incluem um ou mais genes Marcadores."Marcador" ou "gene Marcador" é usado do início ao fim desta especificaçãopara se referir a genes e produtos de expressão genética que correspondemcom qualquer gene cuja super- ou subexpressão está associada com umaindicação ou tipo de tecido.

Métodos preferenciais para estabelecer perfis de expressão ge-nética incluem determinar a quantidade de RNA que é produzida por um ge-ne que pode codificar para uma proteína ou peptídeo. Isto é realizado porPCR de transcriptase reversa (RT-PCR)1 RT-PCR competitivo, RT-PCR emtempo real, RT-PCR de display diferencial, análise Northern Blot e outrostestes relacionados. Apesar de ser possível conduzir estas técnicas usandoreações de PCR individuais, é melhor para amplificar DNA complementar(cDNA) ou RNA complementar (cRNA) produzido a partir de RNAm e anali-sar este através de microensaio. Uma série de diferentes configurações deensaio e métodos para sua produção são de conhecimento daqueles versa-dos na técnica e são descritos, por exemplo, em 5445934; 5532128

555675254363275571639

5242974; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 54298075472672; 5527681; 5529756; 5545531; 5554501; 55610715593839; 5599695; 5624711; 5658734; e 5700637.

Tecnologia de microarray permite a medição do nível de RNAmem status estável de milhares de genes simultaneamente deste modo apre-sentando uma ferramenta poderosa para identificar efeitos tais como o início,parada, ou modulação de proliferação celular descontrolada. Duas tecnolo-gias de microarray estão atualmente em amplo uso. A primeira são testes decDNA e a segunda são testes de oligonucleotídeo. Embora existam diferen-ças na construção destes chips, essencialmente toda a análise de dados ajusante e o resultado são os mesmos. O produto destas análises são tipica-mente medições da intensidade do sinal recebido a partir de uma sondamarcada usada para detectar uma seqüência de cDNA da amostra que hi-bridiza a uma seqüência de ácido nucléico em uma localização conhecidasobre o microarray. Tipicamente, a intensidade do sinal é proporcional àquantidade de cDNA, e portanto RNAm, expressada nas células da amostra.Estão disponíveis e são úteis um grance número de técnicas similares. Mé-todos preferenciais para determinar a expressão genética podem ser encon-trados em 6271002; 6218122; 6218114; e 6004755.

A análise dos níveis de expressão é conduzida comparando asintensidades de sinal referidas. Isto é melhor feito gerando uma matrizda proporção das intensidades da expressão de genes em uma amostra deteste versus estas em uma amostra controle. Por exemplo, as intensidadesda expressão genética de um tecido doente podem ser comparadas comas intensidades de expressão geradas a partir de tecido benigno ou normaldo mesmo tipo. Uma proporção destas intensidades de expressão indica aalteração múltipla na expressão genética entre as amostras de teste e con-trole.

A seleção pode ser baseada em testes estatísticos que produ-zem listas classificadas relacionadas com a evidência de significância paracada expressão genética diferencial entre fatores relacionados com o sítiode origem original do tumor. Exemplos de similares testes incluem ANOVA eKruskal-Wallis. As classificações podem ser usadas como pesagens em ummodelo designado para interpretar a soma de pesos similares, até um corte,como a preponderância de evidência em favor de uma classe sobre a outra.Evidência prévia conforme descrito na literatura também pode ser usada pa-ra ajustar as pesagens.

Uma modalidade preferencial é normalizar cada medição identi-ficando uma série controle estável e escalonando esta série para variânciazero através de todas as amostras. Esta série controle é definida como qual-quer único transcripto endógeno ou série de transcriptos endógenos afeta-dos por erro sistemático no teste, e não conhecidos por alteração indepen-dentemente deste erro. Todos os Marcadores são ajustados pelo fator espe-cífico da amostra que gera variância zero para qualquer estatística descritivada série controle, tal como média ou mediana, ou para uma medição direta.Alternativamente, se a premissa de variação de controles relacionada so-mente a erro sistemático não for verdadeira, não obstante o erro de classifi-cação resultante é menor quando é realizada normalização, a série controleainda será usada conforme determinado. Controles de spike não-endógenostambém podem ser úteis, mas não são preferenciais.

Perfis de expressão genética podem ser apresentados em umasérie de modos. O mais comum é arranjar intensidades de fluorescência bru-ta ou matriz de proporção em um dendograma gráfico onde colunas indicamamostras de teste e linhas indicam genes. Os dados são arranjados de mo-do que genes que têm perfis de expressão similares fixam proximais uns aosoutros. A taxa de expressão para cada gene é visualizaada como uma cor.

Por exemplo, uma taxa menor do que um (regulação para baixo) aparece naporção azul do espectro enquanto uma taxa maior do que um (regulaçãopara cima) aparece na porção vermelha do espectro. Programas de softwarede computador disponíveis comercialmente estão disponíveis para apresen-tar dados semelhantes incluindo "Genespring" (Silicon Genetics, Inc.) e "Dis- covery" e "Infer" (Partek, Inc.).

No caso de medir níveis de proteína para determinar expressãogenética, quaquer método conhecido na técnica é adequado contanto queresulte em adequada especificidade e sensibilidade. Por exemplo, os níveisde proteína podem ser medidos por ligação a um anticorpo ou fragmento deanticorpo específico para a proteína e medir a quantidade de proteína ligadaa anticorpo. Anticorpos podem ser marcados por radioativos, fluorescentesou outros reagentes detectáveis para facilitar detecção. Métodos de detec-ção incluem, sem limitação, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)e técnicas de immunoblot.

Genes modulados usados nos métodos da invenção são descri-tos nos Exemplos. Os genes que são expressados diferencialmente são ouregulados para cima ou regulados para baixo em pacientes com carcinomade uma origem particular em relação aos pacientes com carcinomas de ori-gens diferentes. A regulação para cima e regulação para baixo são termosrelativos significando que uma diferença detectável (além da contribuição deruído no sistema usado para medir esta) é encontrada na quantidade de ex-pressão dos genes relativa a alguma linha basal. Neste caso, a linha basal édeterminada com base no algoritmo. Os genes de interesse nas células do-entes são então ou regulados para cima ou regulados para baixo em relaçãoao nível basal usando o mesmo método de medição. Doente, neste contex-to, refere-se a uma alteração do status de um corpo que interrompe ou per-turva, ou tem o potencial de perturbar, o desempenho adequado de funçõesdo corpo conforme ocorre com a proliferação descontrolada de células. Al-guém é diagnosticado com uma doença quando algum aspecto do genótipoou fenótipo desta pessoa é consistente com a presença da doença. No en-tanto, o ato de conduzir um diagnóstico ou prognóstico pode incluir a deter-minação de doença/decisões de status tais como determinar a probabilidadede recaída, tipo de terapia e monitoramento da terapia. No monitoramentoda terapia, os juícos clínicos são feitos com relação ao efeito de um dadocurso de terapia comparando a expressão de genes durante o tempo paradeterminar se os perfis de expressão genética mudaram ou estão mudandopara padrões mais consistentes com tecido normal.

Genes podem ser agrupados de modo que informação obtidasobre a série de genes no grupo proporciona uma base de confiança parafazer um juízo clinicamente relevante tal como um diagnóstico, prognóstico,ou escolha de tratamento. Estas séries de genes compõem os portfolios dainvenção. Assim como com a maioria dos Marcadores diagnósticos, freqüen-temetne é desejável usar o menor número de Marcadores suficiente parafazer um juízo médico correto. Isto evita um atraso no tratamento pendentede análise posterior bem como uso improdutivo de tempo e recursos.

Um método para estabelecer portfolios de expressão genética éatravés do uso de algoritmos de otimização tais como o algoritmo de variân-cia média amplamente usado para estabelecer portfolios de estoque. Estemétodo é descrito em detalhes na publicação no 2003/0194734. Essencial-mente, o método exige o estabelecimento de uma série de inputs (estoquesem aplicações financeiras, expressão como medida por intensidade aqui)que otimizarão o retorno (por exemplo, sinal que é gerado) que se recebepara usar este ao mesmo tempo que minimizando a variabilidade do retorno.Muitos programas de software comercial estão disponíveis para conduzir asoperações referidas. "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Ap-plication," referido como "Software de Wagner" do início ao fim desta especi-ficação, é preferencial. Este software usa funções da "Wagner AssociatesMean-Variance Optimization Library" para determinar uma fronteira eficaz eportfolios otimizados no sentido de Markowitz é preferencial. Markowitz(1952). O uso deste tipo de software requer que dados de microarray sejamtransformados de modo que possam ser tratados como uma entrada noretorno de estoque intermediário (way stock) e medições de risco são usa-das quando o software é usado para seus fins de análise financeira preten-didos.

O processo de selecionar um portfolio também pode incluir a a-plicação de regras heurísticas. Preferencialmente, as regras referidas sãoformuladas com base na biologia e em um entendimento da tecnologia usa-da para produzir resultados clínicos. Mais preferencialmente, são aplicadasao resultado do método de otimização. Por exemplo, o método de variânciamédia para seleção de portfolio pode ser aplicado a dados de microarraypara uma série de genes expressados diferencialmente em sujeitos comcâncer. O resultado do método seria uma série otimizada de genes que podeincluir alguns genes que são expressados no sangue periférico bem comoem tecido doente. Se as amostras usadas no método de experimentaçãoforem obtidas a partir de sangue periférico e alguns genes expressados dife-rencialmente em casos de câncer também podem ser expressados diferen-cialmente no sangue periférico, então pode ser aplicada uma regra heurísti-ca na qual um portfolio é selecionado entre a fronteira eficaz excluindo aque-les que são expressados diferencialmente no sangue periférico. Logicamen-te, a regra pode ser aplicada antes da formação da fronteira eficaz, por e-xemplo, aplicando a regra durante pré-seleção de dados.

Podem ser aplicadas outras regras heurísticas que não são re-lacionadas necessariamente com a biologia em questão. Por exemplo, pode-se aplicar uma regra que somente uma percentagem prescrita do portfoliopode ser representada por um gene em particular ou grupo de genes. Soft-ware disponível comercialmente tal como o Software Wagner prontamenteconciliam estes tipos de heurísticas. Isto pode ser útil, por exemplo, quandofatores diferentes de acurácia e precisão (por exemplo, taxas de Iicencia- mento previstas) têm um impacto sobre a vontade de incluir um ou mais ge-nes.

Os perfis de expressão genética desta invenção também podemser usados em combinação com outros métodos diagnósticos não-genéticosúteis em diagnóstico de câncer, prognóstico, ou monitoração de tratamento.Por exemplo, em algumas circunstâncias é benéfico combinar a potênciadiagnostica dos métodos à base de expressão genética descritos acima comdados de Marcadores convencionais tais como Marcadores de proteína séri-cos (por exemplo, Câncer Antigen 27.29 ("CA 27.29")). Existe uma faixa deMarcadores similares incluindo os referidos analytes como CA 27.29. Em ummétodo similar, o sangue é periodicamente colhido de um paciente tratado eem seguida submetido a um imunoensaio enzimático para um dos Marcado- res séricos descritos acima. Quando a concentração do Marcador sugere oretorno dos tumores ou o fracasso da terapia, é colhida uma fonte de amos-tra suscetível a análise da expressão genética. Onde existe uma massa sus-peita, é colhido um aspirado de agulha fina (FNA) e perfis de expressão ge-nética de células tiradas da massa são então analisados conforme descrito acima. Alternativamente, amostras de tecido podem ser tiradas de áreas ad-jacentes ao tecido do qual um tumor foi previamente removido. Esta aborda-gem pode ser particularmente útil quando outra experimentação produz re-sultados ambíguos.

A presente invenção proporciona um método para propagar cé-lulas de interesse obtidas a partir de uma amostra biológica a) enriquecendoas células sob condições que mantêm suficiente viabilidade celular; e b) pro-pagando as células sob condições eficazes para possibilitar viabilidade celu-lar, proliferação e integridade.

A amostra biológica pode ser qualquer uma conhecida na técni-ca incluindo, sem limitação, urina, sangue, soro, plasma, linfa, escarro, sê-men, saliva, lágrimas, fluido pleural, fluido pulmonar, lavagem bronquial, flui-do sinovial, fluido peritoneal, ascite, fluido amniótico, medula óssea, aspiradoda medula óssea, fluido cerebrospinal, Iisado ou homogenado tecidual ouum pélete celular. Vide, por exemplo, 20030219842.

A indicação pode incluir qualquer uma conhecida na técnica in-cluindo, sem limitação, câncer, avaliação de risco de pré-disposição genéticahereditária, identificação de tecido de origem de uma célula cancerígena talcomo uma CTC 60/887,625, identificar mutações em doenças hereditárias,status da doença (estagiamento), prognóstico, diagnóstico, monitoramento,resposta ao tratamento, escolha de tratamento (farmacológico), infecção (vi-ral, bacteriana, de micoplasma, fúngica), quimossensibilidade 7112415, sen-sibilidade ao fármaco, potencial metastático ou identificar mutações em do-enças hereditárias.

Enriquecimento das células pode ser qualquer método conheci-do na técnica incluindo, sem limitação, por separação de anticor-pos/magnética, (Immunicon, Miltenyi, Dynal) 6602422, 5200048, separaçãocelular ativada por fluorescência, (FACs) 7018804, filtração ou manualmen-te. O enriquecimento manual pode ser, por exemplo, por massagem da prós-tata. Goessl et al. (2001) Urol 58:335-338.

Ácido nucléico pode ser qualquer um conhecido na técnica in-cluindo, sem limitação, nuclear, mitocondrial (homeoplasmia e heteroplasmi-a), viral, bacterial, fúngico ou micoplasmal.

Métodos de isolamento de ácido nucléico e proteínas sãobem conhecidas na técnica. Vide por exemplo 6992182, RNAwww.ambion.com/techlib/basics/maisol/index.html e 20070054287.

Análises de DNA podem ser qualquer uma conhecida na técnicaincluindo, sem limitação, metilação-desmetilação, cariótipo, PLOIDIA (Aneu-ploidia, poliploidia), integridade de DNA (por meio de géis ou espectrofoto-metria), translocações, mutações, fusões gênicas, ativàção-desativação, po-limorfismo de nucleotídeo singular (SNPs), número de cópia ou toda amplifi-cação genômica para detectar constituição genérica. Análises de RNA inclu-em qualquer uma conhecida na técnica incluindo, sem limitação, q-RT-PCR,miRNA ou modificações pós-transcrição. Análises de proteínas incluemqualquer uma conhecida na técnica incluindo, sem limitação, detecção deanticorpos, modificações pós-transição ou "tumover". As proteínas podemser marcadores de superfície celular, preferencialmente epiteliais, endoteli-ais, viral ou tipo celular. O marcador biológico pode estar relacionado a in-fecção viral/bacterial, expressão do antígeno.

A invenção reivindicada pode ser usada, por exemplo, para de-terminar o potencial metastático de uma célula de uma amostra biológicaisolando ácido nucléico e/ou proteína das células; e analisar o ácido nucléicoe/ou proteína para determinar a presença, nível de expressão ou status deum Biomarcador específico para potencial metastático.

As células da invenção reivindicada podem ser usadas, por e-xemplo, para identificar mutações em doenças hereditárias célula de umaamostra biológica isolando ácido nucléico e/ou proteína das células; e anali-sar o ácido nucléico e/ou proteína para determinar a presença, nível de ex-pressão ou status de um Biomarcador específico para específico para umadoença hereditária.

As células da invenção reivindicada podem ser usadas, por e-xemplo, para obter e preservar material celular e partes constituintes domesmo tais como ácido nucléico e/ou proteína. As partes constituintes po-dem ser usadas, por exemplo, para preparar vacinas de células tumorais ouem imunoterapia celular. 20060093612, 20050249711

Kits preparados de acordo com a invenção incluem ensaios for-matados para determinar os perfis de expressão genética. Estes podem in-cluir todos ou alguns dos materiais necessários para conduzir os ensaios taiscomo reagentes e instruções e um meio através do qual Biomarcadores sãotestados.

Artigos desta invenção incluem representações dos perfis deexpressão genética úteis para tratar, diagnosticar, prognosticar, e avaliardoenças de modo diverso. Estas representações de perfis são reduzidaspara um meio que pode ser lido automaticamente por uma máquina tal comomeios legíveis por computador (magnéticos, óticos, e similares). Os artigostambém podem incluir instruções para avaliar os perfis de expressão genéti-ca em tais meios. Por exemplo, os artigos podem compreender um CD ROMtendo instruções de computador para comparar perfis de expressão genéticados portfolios de genes descritos acima. Os artigos também podem ser per-fis de expressão genética registrados digitalmente nos mesmos de modoque possam ser comparados com dados de expressão genética das amos-tras dos pacientes. Alternativamente, os perfis podem ser registrados emformato representacional diferente. Um registro gráfico é um formato similar.Algoritmos de agrupamentos (clustering) tais como os incorporados no pro-grama "DISCOVERY" e "INFER" da Partek1 Inc. mencionados acima podemauxiliar melhor na vizualização de similares dados.

Diferentes tipos de artigos de fabricação de acordo com a in-venção são meios ou testes formatados usados para revelar perfis de ex-pressão genética. Estes podem compreender, por exemplo, microensaiosnos quais sondas ou complementos de seqüências são afixados a uma ma-triz à qual as seqüências indicativas dos genes de interesse combinam cri-ando um determinante legível de sua presença. Alternativamente, artigos deacordo com a invenção podem ser modelados em kits de reagentes paraconduzir hibridização, amplificação, e produção de sinal indicativa do nívelde expressão dos genes de interesse para detectar câncer.

A presente invenção define portfolios de marcadores específicosque foram caracterizados para detectar uma única célula de tumor de mamacirculante em um fundo de sangue periférico. O portfolio do teste múltiplo decaracterização molecular foi otimizado para uso como um teste múltiplo deQRT-PCR onde o múltiplo de caracterização molecular contém 2 marcado-res do tecido de origem, 1 marcador epitelial e um marcador doméstico.QRT-PCR pode ser realizado no Smartcycler Il para o teste múltiplo de ca-racterização molecular. O portfolio do teste único de caracterização molecu-lar toi otimizado para uso como um teste de QRT-PCR onde cada marcadoré rodado em uma única reação que utiliza 3 marcadores do status do cân-cer, 1 marcador epitelial e um marcador doméstico. Diferentemente do testemúltiplo de RPA o teste único de caracterização molecular será rodado noApplied Biosystems (ABI) 7900HT e usará uma lâmina de 384 cavidadescomo sua plataforma. Os portfolios de teste múltiplo e de teste único de ca-racterização molecular detectam de modo preciso uma única célula epitelialcirculante possibilitanto que o médico prognostique a recorrência. O testemúltiplo de caracterização molecular utiliza DNA polimerase de Thermusthermophilus (TTH) devido a sua capacidade para realizar tanto reação detranscriptase reversa quanto de cadeia polimerase em uma única reação.Em contraste, o teste único de caracterização molecular utiliza a Applied Bi-osystems One-Step Master Mix a qual é uma reação de duas enzimas incor-porando MMLV para transcrição reversa e Taq polimerase para PCR. Osdesenhos de teste são específicos para RNA pela incorporação de uma jun-ção éxon-íntron de modo que o DNA genômico não é amplificado e detecta-do de modo eficaz.

A presente invenção demonstra o método para capturar asCTCs e cultivar as mesmas in vitro. O experimento e os resultados são des-critos abaixo.

Há vários aspectos novos desta invenção. Primeiro, a invençãoé a primeira demonstração a combinação de testes de qRTPCR múltiplo e atecnologia CeIISearch para enriquecimento de células epiteliais circulantes.Nós proporcionamos descrição detalhada sobre novos métodos desenvolvi-dos para isolar o RNA depois de enriquecimento e uso do RNA em uma pro-va de qRTPCR. Em segundo lugar, a invenção pode ser usada como umsubstituto para as próprias células. Isto é, em situações clínicas onde núme-ros muito pequenos de células circulantes são encontrados ou em situaçõesonde muito poucas células circulantes intactas são encontradas (uma vezque células danificadas não são reconhecidas pelo algoritmo de enumeração CeIISearch), o uso da prova de qRTPCR pode proporcionar uma enumera-ção mais sensível de células tumorais circulantes porque o RNA seria iso-lado tanto de células tumorais circulantes intactas quanto danificadas, au-mentando a sensibilidade de detecção, e as provas de qRTPCR altamentesensíveis podem adicionalmente aumentar a sensibilidade. Um aspectochave final da invenção é que, usando um teste múltiplo quantitativa, pode-se ser capaz de gerar um algoritmo à base de dois ou mais genes para ge-rar informação de prognóstico sobre pacientes dos quais se tenha isoladocélulas tumorais circulantes. De modo importante, a informação molecularpode proporcionar informação adicional ou ainda novas informações deprognóstico quando combinada com a enumeração de células epiteliaiscirculantes.

Em uma modalidade, o teste único de caracterização molecularse baseia em reação de cadeia polimerase de transcriptase reversa quantita-tiva (QRT-PCR) onde cada marcador é rodado em uma reação individual. Apresente invenção descreve o uso de 3 marcadores do tecido de origem,1 marcador epitelial para confirmação de que células tumorais circulantesestão presentes de câncer de mama e um marcador controle para verifica-ção da qualidade da amostra. Combinações específicas de primer/sondapara cada marcador são designadas para resultar em alta análise de especi-ficidade e sensibilidade para prognosticar recorrência em pacientes de cân-cer de mama. Estas combinações de primer/sonda para marcadores especí- ficos são otimizadas para a plataforma da Applied Biosystems (ABI) 7900HTpara detectar uma única célula de tumor de mama circulante em um fundode sangue periférico. Os resultados deste teste mostram que pode ser usadoem paralelo com o kit de enumeração CelISearch® CTC Kit e deste modo ébenéfico tanto para o médico quanto para o paciente para prognosticar re-corrência.

Em uma segunda modalidade, o teste múltiplo de mama de ca-racterização molecular também se baseou em ORT^PCR, no entanto emcontraste com o teste único apresentado acima, a amostra do paciente éanalisada em uma única reação com 3 marcadores diagnósticos possibili-tando uma maior percentagem de detecção. A presente invenção descreve ouso de 2 marcadores do tecido de origem, 1 marcador epitelial para confir-mação de que células tumorais circulantes estão presentes de câncer demama e um marcador controle para verificação da qualidade da amostra.Combinações específicas de primer/sonda para cada marcador são desig- nadas para resultar em alta sensibilidade enquanto muito específicas em umfundo de leucócitos do sangue periférico PBLs. A viabilidade destas aplica-ções é demonstrada pela capacidade deste teste para detectar <5 célulasSKBR3 fincado em 7,5 ml de sangue periférico. Estas combinações de pri-mer/sonda para marcadores específicos são otimizadas para a plataformaSmartcycler II. Os resultados desta prova apresentam um método para de-tecção de células tumorais circulantes de mama que é não-combinadoquando comparado com métodos disponíveis correntes devido à sensibilida-de do teste e ao uso simultâneo de 4 genes. Será nossa intenção tornar esteteste disponível para uso comercial em combinação com o kit de enumera-ção de CTCs CelISearch®.

Em uma terceira modalidade, o teste de caracterização molecu-lar se baseou em qRTPCR para a caracterização de células de próstata cir-culantes. Neste exemplo, um teste múltiplo muito sensível incorpora 1 mar-cador epitelial (CK19), um marcador de tecido de origem de próstata (PSA,também conhecido como calicreína 3), e um gene controle (PBGD). Esteteste também pode ser usado para a detecção altamente sensível de células de próstata.

A presente invenção proporciona um método para cultivar CTCsdo sangue. O processo envolve o uso de tecnologia CelISearch® e seus sis-tema associado CelITracks® AutoPrep e kit o CelISearch® Profile Kit. Estascélulas propagadas podem ser usadas em estudos farmacogenômicos etambém para extrair os ácidos nucléicos em quantidades suficientes parauso em estudos do perfil molecular. Finalmente, este teste também pode serusado como uma ferramenta confirmatória em combinação com os resulta-dos de enumeração de CTCs.

A presente invenção proporciona um método para detectar mar-cadores de metilação em DNA de <5 equivalentes celulares (3 células nesteestudo) depois da conversão por bissulfito de sódio. O processo envolveuma pré-amplificação da região alvo seguida por um QMSP múltiplo. Há vá-rios novos aspectos desta invenção. Primeiro, a invenção é a primeira de-monstração da combinação de testes de QMSP múltiplo (envolvendo PCR nidificado) e sua extensão para a tecnologia CelISearch® que enriquece ascélulas tumorais circulantes (CTCs). Em segundo lugar, o teste QMSP podeproporcionar informação útil sobre vários marcadores moleculares destemodo tornando este mais sensível quando combinados com tecnologia CelI-Search®. Em terceiro lugar, teste de QMSP múltiplo também pode ser capazde proporcionar um novo método prognóstico para múltipla detecção de cé-lulas tumorais, por exemplo, cânceres de próstata e de mama. Finalmente,este teste também pode ser usado como uma ferramenta confirmatória emcombinação com o resultado de enumeração de CTCs.

A presente invenção define portfolios de Marcadores específicosde metilação que foram caracterizados para detectar < 20 pg de DNA depoisde conversão por bissulfito de sódio, equivalente a 3 células tumorais circu-lantes, em um fundo de leucócito do sangue periférico (PBL), equivalente a10.000 a 100.000 PBL. Atualmente, o teste múltiplo de caracterização mole-cular contém 1 DNA de Marcador específico de metilação e um marcadordoméstico (2 adicionais de DNA de Marcadores específicos de metilaçãoserão acrescentados em breve). DNA genômico será submetido a conversãopor bissulfito de sódio e purificação usando o kit ZymoResearch Kit. Umapré-amplificação de regiões alvo usando séries de primers nidificado (pri-mers externos) será realizada em um thermocycler. Em uma reação deQMSP subseqüente, um sinal fluorescente será gerado usando primers in-ternos com um design de sonda de Scorpion no SmartcyclertB) da Cepheidou plataforma equivalente.

Tabela I. Seqüências de Primers por PCR

<table>table see original document page 19</column></row><table>Estrutura Experimental:

As primeiras formulações de reagente de reação de PCR (pré-amplificação) e condições de ciclagem como se segue:

Tabela II. Reaaentes para PCR por pré-amplificacão

Tampão da Reação (NH4)2SO4 Tris (pH 8,8) MgCI2 β-mercaptoetanol Concentração Final 16,6 mM 67 mM 6,7 mM 10mMMistura de enzima Taq/Ag Taq Polimerase Anticorpo TP6-25 5 U/μΙ 0,65 mg/mlMistura de primers externos GSTP1 Actina 0,25 μΜ 0,15 μΜMistura de DNTPs 1,25 mM

Tabela III. Condições de ciclagem para pré-amplificacão

<table>table see original document page 20</column></row><table>

6 a 10% do primeiro produto de PCR, como é sem purificação,de acima será transferido para um tubo fresco para 2o PCR com a adiçãodos seguintes reagentes (Tabela IV) e submetido às condições de ciclagemna Tabela V.

As segundas formulações de reagente de reação de PCR e con-dições de ciclagem como se segue:Tabela IV. Reaaentes para a 2a PCR

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Tabela V. Condições de ciclaqem para 2° PCR

<table>table see original document page 21</column></row><table>

As seguinges amostras de DNA foram usadas neste estudo:DNA metilado CpGenome Universal (CpG M), DNA de Adeno-carcinoma de Próstata (PC) ou DNA de Próstata Normal (PN) em um fundode DNA fincado (100 ng ou 500 ng) de linfócitos do sangue periférico (PBL).Reações de QMSP foram realizadas depois de conversão com bissulfito desódio. Os seguintes exemplos pretendem ilustrar mas não limitar a invenção.

Exemplo N9 1

Análise da Expressão Genética de RNA de Mama Diluído Serialmente Fin-cada Em Um Fundo de RNA de Leucócitos

Os testes do portfolio de teste único de caracterização molecularincluem uma sonda de PCR junção-específica que elimina amplificação deDNA genômico. As seqüências de primer e sonda de hidrólise com duplaetiqueta testadas para esta amostra são mostradas abaixo:Testes de RPA Unico Testes Seqüência SEQ ID NO:B305D-RPAU22 AATG G CC AAAG CACTG CTCTTA 9B305D-RPAL21 ACI IGCIG I I I I IGCICATGT 10 FAM-ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCT B305D-RPAFAMP30 CACA-BHQ1-TT 11CK19-RPAU22 CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT 12CK19-RPAL20 TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC 13 FAM-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT- CK19-RPAFAMP24 BHQ1-TT 14PBGD-RPAU22 CC AC AC AC AG CCTACTTTCC AA 15PBGD-RPAL21 TACCCACGCGAATCACTCTCA 16 FAM- AACG G CAATG CGG CTG CAACG G CGGAA- PBGD-RPAP27FAM BHQ1-TT 17MG-RPAU21 AGTTGCTGATGGTCCTCATGC 18MG-RPAL24 CACTTGTGGATTGATTGTCTTGGA 19 FAM-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA- MG-RPAP23FAM BHQ1-TT 20P1B289U21 G AGT ACGTG G G CCTGTCTG CA 21P1B360L21 TTGCACTCCTTGGGGGTGACA 22 FAM-ACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAG Ρ1B311FAMP25 GA-BHQ1-TT 23

Cada reação única foi realizada nos Applied Biosystems7900HT usando as seguintes condições de ciclagem e formulações de rea-gente como se segue:

Condições de Ciclagem 48°C χ 30 min 95°C χ 10 min40 ciclos de 95°C por 15 seg 60°C por 1 min<table>table see original document page 23</column></row><table>

Depois de isolamento de RNA de linhagens celulares de câncerde mama SKBR3 e MCF7 o RNA total foi diluído serialmente para represen-tar 1 a 400 equivalentes celulares (CE). O RNA diluído serialmente foi emseguida fincado em um RNA total de leucócitos de fundo equivalente a50.000 CE. Foi aplicado PCR Quantitativo em Tempo Real e os resultadosde provas otimizadas corroborando esta invenção são mostrados abaixo.

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Exemplo Ng 2

Análise da Expressão Genética de Marcadores ou Provas Alternativos

Designs adicionais testados incluem uma sonda de PCR junção-específica que elimina a amplificação de DNA genômico. As seqüências deprimer e de sondas de hidrólise com dupla etiqueta testadas para esta amos-tra são mostradas abaixo:Testes de RPA Múltiplos

<table>table see original document page 24</column></row><table>

As amostras foram preparadas e os transcriptos amplificados namesma maneira conforme descrito no Exemplo N9 1. Os resultados destasprovas alternativas corroborando esta invenção são mostrados abaixo.Quando comparada com a performance de marcadores no Exemplo Nq 1 osresultados seguintes demonstram que as provas que têm performance infe-rior contribuíram principalmente para falta de especificidade do marcadore/ou sensibilidade e design pobre de primer ou sonda.<table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo N9 3

Análise por QRT-PCR de células SKBR3 e MCF7 enriquecidas

O ensaio de caracterização molecular combinará a porção decaptura celular da tecnologia CeIISearch com uma prova de detecção mole-cular. A sensibiliade da prova CeIISearch pode ser aprimorada utilizandouma tecnologia de detecção molecular capaz de detectar a expressão demarcadores tanto em células intactas quanto em fragmentos celulares tipi-camente não denominados positivos pela prova CeIISearch. O isolamento deRNA usando células SKBR3 e MCF7 imunomagneticamente enriquecidasfincado em sague de doadores saudáveis colhido em tubos de sangue comanticoagulante EDTA foi realizado conforme mosrado abaixo.

<table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>

A viabilidade de teste único de caracterização molecular foi de-monstrada por sensibilidade e detecção reproduzível de transcriptos deRNAm específicos em <5 células SKBR3 quando enriquecidos a partir de7,5 ml de sangue de doadores saudáveis.

Exemplo 4

Análise de Teste Múltiplo de Caracterização Molecular de RNA de MamaDiluído Serialmente Fincado Em Um Fundo de RNA de Leucócito

Os testes do portfolio de teste múltiplo de RPA incluem umasonda de PCR junção-específica que elimina a amplificação de DNA genô-mico. As seqüências de primer e de sondas de hidrólise com dupla etiquetatestadas para esta amostra são mostradas abaixo:

<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table>

Cada reação múltipla foi realizada no Smartcycler Il usando asseguintes condições de ciclagem e formulações de reagente como se segue:

<table>table see original document page 27</column></row><table>Depois de isolamento de RNA de linhagens celulares de câncerde mama SKBR3, o RNA total foi diluído serialmente para representar 1 a125 equivalentes celulares (CE). O RNA diluído serialmente foi em seguidafincado em um RNA total de leucócitos de fundo equivalente a 50.000 CE.

PCR em Tempo Real Quantitativo foi aplicado e os resultados corroborandoesta invenção são mostrados abaixo.

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Exemplo N9 5

Análise de RPA Múltiplo por QRT-PCR de células SKBR3 Enriquecidas

Teste Múltiplo de caracterização molecular combinará a porçãode captura celular de tecnologia CeIISearch com um teste de detecção mo-lecular. A sensibilidade do teste CeIISearch pode ser aprimorada utilizandouma tecnologia de detecção molecular capaz de detectar expressão de mar-cador tanto em células intactas quanto em fragmentos celulares tipicamentenão denominados positivos pelo teste CeIISearch. Isolamento de RNA usan-do células SKBR3 enriquecidas imunomagneticamente transcrevendo so-mente CK19 fincado em sangue de doadores saudáveis colhido em tubos desangue com anticoagulante EDTA foi realizado conforme mostrado abaixo.Em contraste com o teste Único de caracterização molecular onde uma a-mostra do paciente deve ser dividida entre todas as reações, o teste Múltiplode caracterização molecular oferece aumentada sensibilidade permitindo aousuário analisr o perfil molecular de uma amostra inteira em uma única rea-ção.<table>table see original document page 29</column></row><table>

Exemplo Ng 6

Análise de Estabilidade de RNA de células SKBR3 Enriquecidas

A estabilidade de RNA do RNA intracelular foi avaliada atravésde QRT-PCR usando o teste Múltiplo de caracterização molecular duranteum período de tempo de 48 horas. 200 células SKBR3 foram fincadas emmúltiplos tubos de 7,5 ml de sangue de doadores saudáveis. Ao final de ca-da ponto de tempo as amostras foram processadas usando a porção de cap-tura celular de tecnologia CeIISearch e o kit CeIISearch Profile Kit. Depois deisolamento de RNA as amostras foram analisadas e os resultados são mos-trados na tabela abaixo e na Figura 1.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

A presente invenção proporciona métodos, equipamentos e kitspara processamento de amostras de células tumorais circulantes (CTC) den-tro do sangue periférico e avaliar seus perfis de expressão genética enquan-to proporcionando suporte para a plataforma de pesquisa celular para testede recorrência de doença. Exemplos mostram a capacidade de detectar al-gumas células tumorais circulantes únicas em um fundo de sangue periféricousando um novo teste múltiplo que oferece aumentadas vantagens em rela-ção aos testes tradicionais de RT-PCR único.

Exemplo N8 7:

Células Circulantes de Próstata

RNA de próstata foi fincado em RNA de leucócitos e testado emum teste múltiplo sobre o Cepheid Smartcycler II. Dados representativos sãomostrados abaixo e na Figura 2.<table>table see original document page 30</column></row><table>

Exemplo N9 7

Sensibilidade Aumentada para Análise da Expressão Genética usando TesteMúltiplo de Nested QRT-PCR de RPA de Mama.

<table>table see original document page 30</column></row><table>

A detecção por (RT)-PCR de transcrição reversa em tempo realde única rodada geralmente é inconsistente porque a concentração de RNAextraído de células tumorais circulantes é freqüentemente muito baixa. QRT-PCR de duas rodadas usando primers nidificado reforça tanto a especifici-dade quanto a sensibilidade do teste especificamente aqueles trabalhandocom mensagens raras ou alvo de qualidade baixa ou pobre. Este métodoincorpora dois pares de primers que são usados para amplificar primeirouma molécula de ácido nucléico modelo maior e , subseqüentemente, umaseqüência de ácido nucléico alvo que é contida na molécula modelo amplifi-cada. Deste modo empregando QRT-PCR de duas rodadas tanto a sensibi-lidade quanto a especificidade são aumentadas para o teste de parceiro mo-lecular de RPA de mama. Figura 3.

Reação de amplificação múltipla nidificada foi realizada noSmartcycler Il usando as seguintes condições de ciclagem e formulações dereagente como se segue: Conforme descrito acima, RNA de SKBR3 diluídoserialmente fincado em um fundo de RNA total de leucócitos foi usado no

exemplo seguinte.

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Depois da primeira rodada de amplificação, os tubos são centri-fugados e uma alíquota de três microlitros é colhida do primeiro tubo e expe-lida para dentro de um segundo tubo contendo os seguintes primers, sondase reagentes.

<table>table see original document page 32</column></row><table>

PCR em Tempo Real Quantitativo foi aplicado usando os se-guintes parâmetros e os resultados corroborando esta invenção são mostra-dos abaixo.

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>

Exemplo N9 8

Análise Nested QRT-PCR de RPA de Mama de Duas Rodadas de célulasSKBR3 Enriquecidas

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Teste múltiplo de QRT-PCR nidificado de RPA de mama seráusado em combinação com o enriquecimento CeIISearch para melhorar atecnologia de detecção molecular capaz de detectar expressão de marcadortanto em células intactas quanto em fragmentos celulares tipicamente nãodenominados positivos pelo teste de CTCs CeIISearch. O isolamento deRNA usando células SKBR3 imunomagneticamente enriquecidas fincadasem sangue de doadores saudáveis colhido em tubos de sangue com antico-agulante EDTA foi realizado conforme mostrado abaixo. Em contraste comuma rodada do ensaio QRT-PCR de RPA onde a sensibilidade e a especifi-cidade são baixas, a QRT-PCR nidificado de RPA de mama de duas roda-das oferece aumento da sensibilidade e da especificidade possibilitando aousuário ter quase sensibilidade de cópia única.

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Exemplo Ng 9

Aumento da Sensibilidade para Análise da Expressão Genética usando Tes-te Múltiplo de Nested QRT-PCR de MCA de Próstata.

A necessidade de aumentada sensibilidade e especificidade emreações de PCR designadas para amplificar seqüências raras em células detumor de próstata circulantes é dedicada na presente invenção. A tecnologiautilizada no teste múltiplo de QRT-PCR nidificado de RPA de mama foi cru-zada para criar o teste de parceiro molecular (MCA) por QRT-PCR nidificadode próstata.

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Reação de amplificação múltipla nidificada foi realizada noSmartcycler Il usando as seguintes condições de ciclagem e formulações dereagente como se sedgue: Conforme descrito acima, LNCAP RNA diluídoserialmente fincado em um fundo de RNA total de leucócitos foi usado noseguinte exemplo.

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Depois da primeira rodada de amplificação, os tubos são centri-fugados e uma alíquota de três microlitros é colhida do primeiro tubo e expe-lida para dentro de um segundo tubo contedo os seguintes primers, sondase reagentes.<table>table see original document page 36</column></row><table>

PCR em Tempo Real Quantitativo foi aplicado usando os se-guintes parâmetros e resultados corroborando esta invenção são mostradosabaixo.

<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo Ng 10

Análise por QRT-PCR Múltiplo de MCA de Próstata de células LNCAP Enri-quecidas

Teste múltiplo MCA de Próstata QRT-PCR nidificado será usadoem combinação com o enriquecimento CeIISearch para melhorar a tecnolo-gia de detecção molecular capaz de detectar expressão de marcador tantoem células intactas quanto em fragmentos celulares tipicamente não deno-minados positivos pelo teste de CTC CeIISearch. O isolamento de RNA u-sando células LNCAP imunomagneticamente enriquecidas fincadas em san-gue de doadores saudáveis colhido em tubos de sangue com anticoagulanteEDTA foi realizado conforme mostrado abaixo. Em Em contraste com o testede QRT-PCR de próstata de uma rodada onde a sensibilidade e a especifici-dade são baixas, a QRT-PCR nidificado de MCA de próstata de duas roda-das oferece aumentada sensibilidade e especificidade possibilitando ao usu-ário ter quase sensibilidade de cópia única.

Exemplo 11:

"Spike In" de SKBR3 seguido por captura pelo sistema CelISearch®Células SKRB3 foram fincadas em 1000 células em 7,5 mL desangue de doador (topo púrpura Vacutainer® com EDTA como conservante)conforme mostrado na Tabela I.

Tabela I. Fincagem de linhagens celulares SKBR3 em sangue do doador

<table>table see original document page 38</column></row><table>

As CTCs foram capturadas por contas imunomagnéticas conju-gadas a EpCAM usando o kit CelISearch® Profile Kit e o sistema Cell-Tracks® AutoPrep. Os tubos contendo as CTCs capturadas foram removidasdo sistema e colocadas em magneto Magcellect®, incubado por 10 min. Osobrenadante foi removido com o tubo ainda em Magcellect®. O pélete foisuspendido em 200 μΙ_ de salina tamponada com fosfato (PBS). A suspen-são celular foi laminada em uma lâmina de 48 cavidades contendo 1,0 ml_por cavidade de Meio Essencial Mínimo de Eagle completo com 10% de so-ro bovino fetal (FBS). As células foram avaliadas qualitativamente por até 14dias durante o crescimento e os resultados da observação estão resumidosna Tabela II. Ao fim do período de cultura (5 dias e 14 dias), as células foramlavadas duas vezes com PBS e Iisadas diretamente na cavidade usandotampão RLT (Qiagen). RNA total dos Iisados foi isolado usando o kit RNeasyMicro Kit (Qiagen). Estas amostras de RNA serão usadas para análises adi-cionais incluindo expressão genética global.

Resultados

As CTCs capturadas usando o sistema CelITracks® AutoPrepparecem ser viáveis embora tenha sido observada uma redução na taxa deduplicação comparada com as células parentais.

Os leucócitos morrem dentro de 2 dias de cultura deste modonão interferindo com o crescimento de CTCs.

Foi visto que as CTCs estavam dividindo embora mais lento doque as células parentais controle conforme esperado.

O tempo de duplicação de crescimento para as CTCs foi cercade >2x comparadas com células parentais.

Uma diferença nas propriedades de crescimento (qualidade eviabilidade) foi observada entre as 2 replicatas sugerindo um efeito possíveldo sangue de doador.

Tabela II. Resultados Qualitativos

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Tabela Il (continuação). Resultados Qualitativos

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Cavidades que foram laminadas a partir de células que passa-ram através da CeIITracks® AutoPrep nunca foram tão densas quanto a ca-vidade controle.

Exemplo 12

Quantidades variáveis de CpG M DNA fincado em 100 ou 500 na de PBL DNA

(25 ciclos de PCR pré-amplificação e uso de 10% de produto dePCR diluído transferira para segundo PCR). Os valores de Ct para DNA dire-to ou modelo pré-amplificado (CpG M) são mostrados na tabela seguinte ena Figura 4.<table>table see original document page 40</column></row><table>

Exemplo 13

DNA de PC e PN fincado em 500 nq de PBL (equivalente a 70.000 células)

(20 ciclos de PCR pré-amplificação seguido por uso de 6% deproduto resultante no segundo PCR)

Tabela VII. Valores de Ct para DNA direto ou modelo pré-amplifiçado(adenocarcinoma de próstata ou normal)

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Resultados:

50 pg de CpG M DNA (equivalente a 7 células) em um fundo de100 ng ou 500 ng de PBL (equivalente a 10.000 ou 70.000 células, respecti-vãmente) foi detectado usando QMSP com ou sem pré-amplificação. Curvasde boa resposta linear foram geradas tanto para reações de pré-amplificaçãoquanto de amplificação direta. No estudo inicial, <20 pg de DNA de adeno-carcinoma de próstata, equivalente a 3 células tumorais circulantes, gerouum sinal específico para região GSTP1 metilada e foi detectado em um fun-do de 70.000 células PBL. Por outro lado, não foi observado sinal detectávelde DNA de próstata normal (PN) ou de sangue (PBL) sugerindo a ausênciade GSTP1 metilado. A sensibilidade de detecção de QMSP nidificado de 1cópia em um fundo de 2,5x104 cópias (20 pg de DNA metilado em 500 ng deDNA não-metilado) é observada. Não foram detectados produtos não-específicos significativos com método de QMSP nidificado e o tamanho cor-reto de fragmentos de PCR finais foram observados sobre o gel (dados nãomostrados). Experimentos de otimização de teste adicionais estão a cami-nho para aumentar a sensibilidade de detecção e reduzir o valor de Ct para <3 células.

Exemplo 14

Demonstração da utilidade do teste para células tumorais circulantes (CTCs)no sangue pela contaminação de linhagens de células de câncer de próstata(LnCAP e DU-145) em sangue de doador

Linhagens de células de de tumor de próstata (LnCAP eDU-145) cultivadas em cultura foram contaminadas com 30, 100, 300 e 500células em 7,5 ml de sangue de doador seguido por captura de CTCs pelosistema CelITracks® AutoPrep de plataforma CelISearch® usando o kit Pro-file Kit. Ácido desoxirribonucléico destas células foi isolado usando microco-lunas Qiagen e submetido a reação de conversão com bissulfito. O DNAmodificado da última etapa foi usado em uma reação de 2 rodadas q-MSPusando as condições na Tabela Ill (22 ciclos) e na Tabela V. Os resultadosdos experimentos são mostrados nas Tabelas Vlll e IX.Tabela VIII. Valores de Ct de CTCs (células fincadas. LnCAP)

<table>table see original document page 42</column></row><table>

As diferenças das reações duplicadas foram menores de 0,7Ct,exceto célula 30 a qual foi 1,5-1,7 Ct.

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Tabela IX. Valores de Ct de CTCs (células fincadas. Du-145)

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Estes resultados demonstram claramente que q-MSP pode seraplicado com sucesso a CTCs de pacientes com câncer de próstata.Listagem de Seqüência<#1;DNA;human>TCGGGGATTTTAGGGCGT<#2;DNA;human>ACGAAAACTACGACGACGAAA<#3;DNA;human>

GATATAAGGTTAGGGATAGGATAG<#4;DNA;human>AACCAATAAAACCTACTCCTCC<#5;DNA;human>

CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCGTGTAGCGGTCGTCGGGGTTG

<#6;DNA;human>

GCCCCAATACTAAATCACGACG

<#7;DNA;human>

CCGCGCATCACCACCCCACACGCGCGGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTG

<#8;DNA;human>

AACACACAATAACAAACACAAATTCAC<#9;DNA;human>AATG G CC A A AG CACTG CTCTTA<#10;DNA;human>ACTTGCTG Illll GCTCATGT<#11 ;DNA;human>

ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACA<#12;DNA;human>

CACCCTTC AG G GTCTTG AG ATT<#13;DNA;human>TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC<#14;DNA;human>ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT<#15;DNA;human>CCACACACAGCCTACTTTCCAA<#16;DNA;human>

TACCCACGCGAATCACTCTCA

<#17;DNA;human>

AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA<#18;DNA;human>

AGTTG CTGATG GTCCTCATGC<#19;DNA;human>CACTTGTGGATTGATTGTCTTGGA<#20;DNA;human>CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA<#21 ;DNA;human>G AGTACGTG G GCCTGTCTGCA<#22;DNA;human>TTGCACTCCTTGGGGGTGACA<#23;DNA;human>

ACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGA<#24;DNA;human>CTCCTGGTTCTCTGCCTGCA<#25;DNA;human>GACGTACTGACTTGGGAATGTCAA<#26;DNA;human>

AAGCTCAGGACAACACTCGGAAGATCATTT<#27;DNA;human>CTGAGGAGTACGTGGGCCTGTC<#28;DNA;human>

TTGCACTCCTTGGGGGTGACA<#29;DNA;human>

CAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAATT<#30;DNA;human>GCTTGGTGGTTAAAACTTACC<#31 ;DNA;human>TG AAC AGTTCTGTTG GTGTA<#32;DNA;human>

CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGGTT<#33;DNA;human>TGACACTGGCAAAACAATGCA<#34;DNA;human>

GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT<#35;DNA;human>

CTTTG CTTTCCTTG GTC AG GCAGTATA ATCC ATT<#36;DNA;human>AAAAACAAG C ATG GCCTAC<#37;DNA;human>CAGCAAGTTGAGAGCAGTCCT<#38;DNA;human>

CATGAGCAAAAACAGCAAGTCGTGAAATTTT<#39;DNA;human>

CGCCCACCTGGACATCTGGA<#40;DNA;human>CACTGGTCGAGGCACAGTAGTGA<#41;DNA;human>GTCAGCGGCCTGGATGAAAGAGCGGTT<#42;DNA;human>AATGGCCAAAGCACTGCTCTTA<#43;DNA;human>ACTTG CTG Illll G CTC ATGT<#44;DNA;human>

ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACATT<#45;DNA;human>CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT<#46;DNA;human>TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC<#47;DNA;human>

ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTTTT45<#48;DNA;human>CC AC AC AC AG CCTACTTTCC AA<#49;DNA;human>TACCCACGCGAATCACTCTCA<#50;DNA;human>

AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAATT<#51;DNA;human>AGTTGCTGATGGTCCTCATGC<#52;DNA;human>CACTTGTGGATTGATTGTCTTGGA<#53;DNA;human>

CCCTCTCCCAGCACTG CTACG CATT

Claims (26)

1. Método para analisar uma amostra biológica para a presençade células específicas para uma indicação compreendendo as etapas de:a) enriquecer células da amostra;b) isolar ácido nucléico e/ou proteína das células; ec) analisar o ácido nucléico e/ou proteína para determinar a pre-sença, nível de expressão ou status de um Biomarcador específico para aindicação.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostrabiológica é selecionada entre urina, sangue, soro, plasma, linfa, escarro,sêmen, saliva, lágrimas, fluido pleural, fluido pulmonar, lavagem bronquial,fluido sinovial, fluido peritoneal, ascite, fluido amniótico, medula óssea, aspi-rado da medula óssea, fluido cerebrospinal, Iisado ou homogenado tecidualou um pélete celular.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a indicaçãoé câncer, avaliação de risco de predisposição genética hereditária, identifi-cação de tecido de origem de uma célula cancerígena tal como uma CTC,identificação de mutações em doenças hereditárias, status da doença (esta-giamento), prognóstico, diagnóstico, monitoramento, resposta ao tratamento,escolha do tratamento (farmacológico), infecção (viral, bacteriana, por mico-plasma, fúngica), quimiossensibilidade, sensibilidade ao fármaco, potencialmetastático ou identificar mutações em doenças hereditárias.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as célulassão enriquecidas por separação de anticorpos/magnética, separação celularativada por fluorescência, (FACs), filtração ou manualmente.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o enrique-cimento manual é por massagem da próstata.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido nu-cléico é nuclear, mitocondrial (homeoplasmia, heteroplasmia), viral, bacteria-no, fúngico ou de micoplasma.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nu-cléico é DNA ou RNA.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a análise é análise deDNA.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a análise deDNA é relacionada com metilação - desmetilação, cariotipagem, ploidia (a-neuploidia, poliploidia), integridade de DNA (avaliada através de géis ou es-pectrofotometria), translocações, mutações, fusões de genes, ativação - de-sativação, polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs), número de cópias ouamplificação de genoma inteiro para detectar composição genética.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a análise éanálise de RNA.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a análisede RNA é relacionada com q-RT-PCR, miRNA ou modificações de pós-transcrição.

12. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a análise éanálise de proteína.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a análisede proteína é relacionada com detecção de anticorpos, modificações pós-translacionais ou "turnover".

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as prote-ínas são marcadores da superfície celular.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que os mar-cadores da superfície celular são do tipo epitelial, endotelial, viral ou celular.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a presen-ça do biomarcador é relacionada com infecção viral/bacteriano, insulto ouexpressão de antígeno.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o antíge-no é usado para separar células.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a análise éusada para obter um perfil molecular das células enriquecidas.

19. Método para determinar o potencial metastático de uma cé-lula de uma amostra biológica compreendendo as etapas de:a) enriquecer células da amostra;b) isolar ácido nucléico e/ou proteína das células; ec) analisar o ácido nucléico e/ou proteína para determinar a pre-sença, nível de expressão ou status de um Biomarcador específico para po-tencial metastático.

20. Método para identificar mutações em doenças hereditáriasde uma célula de uma amostra biológica compreendendo as etapas de:a) enriquecer células da amostra;b) isolar ácido nucléico e/ou proteína das células; ec) analisar o ácido nucléico e/ou proteína para determinar a pre-sença, o nível de expressão ou status de um Biomarcador específico parauma doença hereditária.

21. Método para preservar material genético de uma célula deuma amostra biológica compreendendo as etapas de:a) enriquecer células da amostra;b) isolar ácido nucléico e/ou proteína das células; ec) preservar o ácido nucléico e/ou proteína.

22. Método para produzir uma vacina de células tumorais com-preendendo as etapas dea) obter uma amostra biológica;b) enriquecer células da amostra;c) isolar ácido nucléico e/ou proteína das células; ed) usar o ácido nucléico e/ou proteína para formular a vacina.

23. Composição compreendendo o ácido nucléico e/ou proteínaobtidos como definido pelo método da reivindicação 1.

24. Composição compreendendo um oligonutleotídeo selecio-nado entre SEQ ID NOs: 1-94.

25. Kit compreendendo agentes de detecção de biomarcadorespara realizar o método como definido na reivindicação 1.

26. Artigo compreendendo agentes de detecção de biomarcado-res para realizar o método como definido na reivindicação 1.