CN106755000A - 一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因和前导序列及其分泌表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到基因序列优化的谷氨酰胺转氨酶及其分泌表达方法和应用。本发明将源于茂源链霉菌的谷氨酰胺转氨酶基因及其前导序列按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子进行改造得到优化谷氨酰胺转氨酶基因及其优化前导序列。构建了优化谷氨酰胺转氨酶基因及其优化前导序列共表达重组毕赤酵母体系，筛选得到高表达重组谷氨酰胺转氨酶的菌株。本发明所优化的谷氨酰胺转氨酶基因及其前导序列能在毕赤酵母中稳定、高效的表达，所表达的重组谷氨酰胺转氨酶酶活达到0.5U/mL，是原始谷氨酰胺转氨酶活的4倍，为谷氨酰胺转氨酶进一步工业化扩大生产奠定了基础。

Description

一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因和前导序列及其分泌表达

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及优化的谷氨酰胺转氨酶基因和优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列，及其分泌、表达、应用。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TG)能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与各种酰基受体发生酰基转移反应，是一种有效的蛋白质交联剂。目前该酶应用最广泛的是在肉制品行业以改善蛋白质的结构和功能性质，提高营养价值。近年来，TG在生物医药、组织工程、定点蛋白交联、纺织和皮革处理等多个领域拥有十分广阔的应用前景。

微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase，MTG)的生产菌株主要是链霉菌，如茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense)、吸水链霉菌(Streptomyceshygwscopicus)。链霉菌MTG是一种胞外酶，以无活性的酶原(pro-MTG)形式分泌，pro-MTG的N-端酶原区需要被菌体内生的金属蛋白酶(TAMEP)及丝氨酸蛋白酶(serine protease)切除后，才能转化成活性MTG。由于原生产菌株分子改造困难、自身分泌大量蛋白酶且产量提高潜力有限，传统发酵生产MTG远不能满足市场需求。效价比较高的谷氨酰胺转氨酶仍然依赖于国外进口，但进口酶的价格昂贵，使企业的生产成本增加。随着MTG的应用范围不断扩展，获得产量高、稳定性好、专一性强、酶活力高的谷氨酰胺转氨酶制剂是市场所要求的。

使用异源表达***已成功实现了链霉菌pro-MTG或MTG的基因的表达，但是克隆表达成熟酶基因mtg直接分泌有活性的酶MTG的策略尚未获得成功。目前，表达活性MTG的策略主要有两种，一种是将pro-MTG与SAM-P45蛋白酶在异源宿主中共同分泌表达，但此种策略由于发酵液中残存的蛋白酶活力可能持续降解活性TG而造成不利影响，以及蛋白酶的后续去除会提高分离纯化的成本，因此，不适合工业化要求。另一种是Yurimoto等、李鹏飞等采取将微生物来源的酶原pro-MTG的前导序列(pro)和成熟谷氨酰胺转氨酶(mtg)编码区作为两个独立的元件进行共表达的策略，成功地实现了直接分泌表达活性MTG，但是酶活水平仍然较低。而李鹏飞采取不同于Yurimoto的共表达策略，通过分别构建pro和mtg的基因表达盒，用SolutionⅠ连接酶连接后放在一个表达载体上，获得pro/MTG共表达载体pAOα-pro-MTG，在酵母中也直接分泌表达活性MTG，但是表达量、酶活水平仍然较低。共表达策略的重要优势就是无需蛋白酶活化就能够得到活性的MTG，然而，目前关于mtg及其pro共表达的报道很少。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明将从分子水平对源于茂源链霉菌的谷氨酰胺转氨酶基因(mtg)及其前导序列(pro)进行改造得到优化基因，使优化后的mtg及pro降低转录能量屏障，提高转录效率，提升其在毕赤酵母中的分泌表达水平。并运用pro和mtg作为两个独立的元件进行共表达的策略构建共表达重组毕赤酵母体系，实现在酵母中直接分泌表达活性MTG，并使优化外源基因在酵母细胞中获得高效稳定表达。

本发明采用源于茂源链霉菌的谷氨酰胺转氨酶基因(mtg)及其前导序列(pro)作为原始基因和原始前导序列。

本发明的目的在于提供一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；而谷氨酰胺转氨酶原始基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明谷氨酰胺转氨酶基因相对于谷氨酰胺转氨酶原始基因，其GC含量由原来的64.56％减少到39.94％；CAI值由原来的0.54提高到0.97。

本发明的目的还在于提供一种优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；而谷氨酰胺转氨酶原始前导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明前导序列相对于谷氨酰胺转氨酶原始前导序列，其GC含量由原来的67.41％减少到43.7％；CAI值由原来的0.46提高到0.97。

同时本发明优化后的基因和前导序列在宿主细胞中的分泌表达量高。

本发明的目的还在于提供一种包含上述优化的谷氨酰胺转氨酶基因的表达载体。

本发明的目的还在于提供一种包含上述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列的表达载体。

本发明的目的还在于提供一种上述优化的谷氨酰胺转氨酶基因和/或上述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列的表达载体的构建方法。为了提高表达量，本发明构建了rDNA介导的多拷贝毕赤酵母表达载体pPICZα-rDNA-mtg-WT、

pPICZα-rDNA-mtg-Opt，该重组载体的启动子是醇氧化酶启动子(pAOX1)。pro表达载体的构建采用本实验室构建的表达载体pGAP9(利用pGAP替代pPIC9载体中的pAOX，构建方法参照文献《利用GAP启动子在毕赤酵母中表达牛肉风味强化肽》)，构建了pGAP9-pro，其启动子为pGAP组成型启动子，重组表达载体的宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞为GS115。

本发明的目的还在于提供一种包含上述优化的谷氨酰胺转氨酶基因和上述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列的细胞系或基因工程菌。

本发明的目的还在于提供一种上述优化的谷氨酰胺转氨酶基因和上述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列共表达体系的构建方法。将pro-MTG酶原的成熟mtg编码区和pro序列作为两个独立的元件进行共表达直接分泌活性谷氨酰胺转氨酶的策略。

本发明的目的还在于上述优化的谷氨酰胺转氨酶基因和上述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列应用于生产谷氨酰胺转氨酶。

本发明能在毕赤酵母中稳定、高效的表达，所表达的重组谷氨酰胺转氨酶的酶活可达到0.5U/mL，是原始谷氨酰胺转氨酶的酶活4倍，为谷氨酰胺转氨酶进一步工业化扩大生产奠定了基础。

附图说明

图1为本发明的mtg-Opt和mtg-WT的mRNA二级结构图。

图2为本发明的pro-Opt和pro-WT的mRNA二级结构图。

图3为本发明的重组菌pro-WT/GS115转化子的PCR鉴定电泳图；其中M为1kbDNAmarker，1-5分别为pro-WT上游和3'AOX下游为引物扩增，以pro-WT自身引物扩增产物作为对照。

图4为本发明的重组菌pro-Opt/GS115的转化子的PCR鉴定电泳图；其中M为1kbDNAmarker，1-6分别是pro-Opt上游和3'AOX下游为引物扩增，以pro-Opt自身引物扩增产物作为对照。

图5为本发明的pro-WT/GS115的2#、14#阳性表达产物的Dot bolt检测结果。

图6为本发明的pro-Opt/GS115的18#、19#阳性表达产物的Dot bolt检测结果。

图7为谷氨酰胺转氨酶基因(mtg)及其前导序列(pro)共表达菌株构建原理示意图。

图8为本发明pro/mtg共表达菌株酵母转化子的PCR检测图。

图9为本发明的pro/mtg-Opt和pro/mtg-WT的Dot bolt对比图。

图10为本发明的pro/mtg-Opt鉴定图。

图11为本发明的pro/mtg-Opt和pro/mtg-WT的酶活对比图。

图12为本发明实施例2的AOX1terminator扩增产物结构图。

图13为本发明实施例2的毕赤酵母GS115的rDNA基因序列的扩增产物结构图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1谷氨酰胺转氨酶基因及其前导序列的优化设计和合成

一、谷氨酰胺转氨酶基因及其前导序列的优化设计

本发明首先对从茂源链霉菌中克隆获得的谷氨酰胺转氨酶成熟酶原始基因mtg及其原始前导序列基因pro的序列进行分析，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除、mRNA二级结构稳定性等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对谷氨酰胺转氨酶基因序列进行改造。

茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶成熟酶原基因mtg-WT，全长999bp，序列为SEQID NO.2所示，共编码331个氨基酸；原始前导序列基因pro-WT，全长135bp，序列为SEQ IDNO.4所示，共编码45个氨基酸。

在不改变氨基酸序列的前提下，本发明分别对mtg、pro进行修饰改造。

其中，对mtg进行修饰改造共改变了276个碱基，所得优化的谷氨酰胺转氨酶基因(mtg-Opt)，序列为SEQ ID NO.1所示，其GC％含量由原来的64.56％降低为39.94％，如下表所示。

对pro进行修饰改造共改变了43个碱基，所得优化的前导序列基因(pro-Opt)，序列为SEQ ID NO.3所示，其GC％含量由原来的67.41％降低为43.70％，如下表所示。

而且，优化后的基因(mtg-Opt)和(pro-Opt)通过软件预测(RNA structure 5.8)，其mRNA二级结构自由能相比原始基因mtg-WT及pro-WT得到了较大幅度的提高，如下表所示，这样有利于降低转录能量屏障，提高转录效率，进而提高蛋白表达量。

注：mRNA二级结构自由能使用RNA structure 5.8软件进行计算。

同时，参照图1和图2，优化前后基因的mRNA的二级结构也发生了很大的改变，优化基因(mtg-Opt)和(pro-Opt)的mRNA二级结构减少了发夹结构，更加简单，有利于基因的转录。

二、谷氨酰胺转氨酶基因及其前导序列的合成

将mtg-WT、mtg-Opt、pro-WT和pro-Opt人工合成后连接在载体pUC57上，由南京金斯瑞生物科技公司合成。

实施例2谷氨酰胺转氨酶基因及其前导序列表达载体的构建

一、谷氨酰胺转氨酶基因(mtg-WT、mtg-Opt)表达载体的构建

本发明提供的rDNA介导的多拷贝毕赤酵母表达载体的构建方法，首先采取重叠PCR技术将载体pPICZα-B上AOX1terminator片段和rDNA片段进行融合，构建融合基因(AOXIterminator-rDNA)。然后将融合基因片段与载体pPICZa-mtg-WT、pPICZa-mtg-Opt(提前构建)连接得到表达载体pPICZα-rDNA-mtg-WT、pPICZα-rDNA-mtg-Opt。具体步骤如下：

(一)AOX1terminator-rDNA融合基因的扩增

1、AOX1terminator扩增：以pPICZα-B为模板，Fw-AOX1和Rv-AOX1为引物扩增AOX1terminator末端片段，大小约410bp，5'端引入NotI酶切位点，3'端引入rDNA overlap片段，用于与rDNA基因的拼接。扩增条件为：95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃3min；30个循环；72℃30min。扩增410bp基因片段(pPICZα-B载体上990-1398片段)。其产物结构如图12所示。

2、毕赤酵母GS115的rDNA基因序列的扩增：以毕赤酵母GS115genomic DNA为模板，Fw-rDNA和Rv-rDNA为引物合成1.2kb rDNA片段，该片段含有质粒用于线性转化的SpeⅠ酶切位点单酶切位点。5'端引入Aox1terminator overlap，3'端引入BamHI酶切位点。

扩增条件为：95℃5min；95℃30s，62℃45s，72℃3min；30个循环；72℃30min。扩增1.2kb rDNA片段PCR产物，电泳检测得到预期1.2kb大小的产物。该片段含有质粒用于线性转化的SpeⅠ酶切位点单酶切位点。其产物结构为如图13所示。

3、一步法重叠PCR扩增AOX1terminator-rDNA

利用上述PCR产物rDNA、AOX1terminator为模板，配成25μL的反应体系：Taq酶缓冲液5μL；dNTP(2.5mmol.L-1)2.5μL；Fw(AOX1terminator)和Rv(AOX1terminator)，Fw(rDNA)和Rv(rDNA)各1μL；rDNA，1μL；AOX1 terminator，1μL；Taq酶(5U/μL)1μL；补加ddH₂O至25μL。反应程序：94℃4min，95℃55s，54℃45s，72℃50s；进行5个循环，72℃5min；然后调节反应参数变为95℃55s，54℃80s，72℃2min，5个循环，72℃5min，另加入25μL的反应溶液(含Taq酶缓冲液，dNTP，Taq酶、Fw(AOX1terminator)和Rv(rDNA)各1μL)；95℃55s，54℃80s；72℃2min，30个循环，72℃10min。扩增产物同样采用核酸凝胶回收试剂盒回收，得到预期1.6kb大小的产物，此基因产物两端分别带上NotI和BamHI酶切位点，命名为Aox1terminator-rDNA。

(二)毕赤酵母表达载体pPICZα-rDNA-mtg-WT、pPICZα-rDNA-mtg-Opt的构建

将上步获得的1.6kbAOX1terminator-rDNA融合基因片段以及载体pPICZa-mtg-WT、pPICZa-mtg-Opt(前期构建)均使用限制性内切酶NotI和BamHI双酶切。酶切产物采用PCR产物回收试剂盒回收(Axygen公司)，操作步骤参见试剂盒说明。回收所得的酶切后融合基因与酶切后载体采用T4DNA连接酶连接。酶连产物转至E.coli TOP10感受态细胞。转化操作步骤为：取5μL酶连产物加入100μL大肠杆菌感受态中，混匀，冰上静置15-30min，42℃热激90s，冰上静置3min，37℃摇床培养45min，均匀涂布到含50μg/mL Zeocin抗性的LLZ平板上。转化后挑选抗性平板上克隆进行PCR鉴定，所得阳性克隆分别命名为pPICZa-rDNA-mtg-WT、pPICZa-rDNA-mtg-Opt，并送上海生工生物测序。

引物序列如下表所示：

注：单下划线表示酶切位点，粗下划线表示AOX1terminator-rDNA融合基因的重叠片段序列。

二、谷氨酰胺转氨酶前导序列(pro-WT、pro-Opt)表达载体的构建

分别以金斯瑞生物科技公司合成的质粒PUC57-pro-WT及PUC57-pro优为模板，使用引物分别扩增pro-WT、pro-Opt基因，使基因两端带上Xho1,Not1双酶切位点。用Xho1，Not1分别双酶切质粒pGAP9-IFN-8S-FC(实验室保存)和pro基因，酶切产物采用PCR产物回收试剂盒回收(Axygen公司)，操作步骤参见试剂盒说明。回收所得的酶切后融合基因与酶切后载体采用T4DNA连接酶连接。酶连产物转至E.coli TOP10感受态细胞。转化操作步骤同上述载体pPICZα-rDNA-mtg的构建。转化产物均匀涂布到含100ng/ml Amp抗性的LA平板上，37℃培养过夜。转化后挑选抗性平板上克隆进行PCR鉴定，所得阳性克隆分别命名为pGAP9-pro-WT，pGAP9-pro-Opt，并送上海生工生物测序。

三、试验结果

测序结果与理论预期结果一致，克隆构建正确。

实施例3谷氨酰胺酶前导序列(pro-WT及pro-Opt)的表达与纯化

一、重组菌pro-WT/GS115、pro-Opt/GS115的构建

在pGAP9-pro-WT和pGAP9-pro-Opt重组表达载体上HIS4位点，能够与酵母GS115染色体上的HIS4位点发生同源重组。SalI位于pGAP9质粒的HIS4区域。将重组表达载体pGAP9-pro-WT和pGAP9-pro-Opt利用SalI单酶切后，cleaning up回收得到线性化质粒，电转化到毕赤酵母GS115感受态细胞，用MD平板筛选阳性克隆，阳性转化子即为重组菌pro-WT/GS115和pro-Opt/GS115。

二、重组菌pro-WT/GS115、pro-Opt/GS115的阳性表达克隆筛选

使用50mL LA扩大培养上述阳性克隆pro-WT/GS115和pro-Opt/GS115，使用试剂盒(Axygen公司)中量提取质粒pGAP9-pro-WT、pGAP9-pro-Opt。将上步制备的表达质粒pGAP9-pro-WT、pGAP9-pro-Opt使用内切酶SalI进行线性化，并通过乙醇沉淀回收。

乙醇沉淀步骤：1)向酶切反应体系中加入两倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L醋酸钠，-20℃沉淀2h以上；2)12000g离心10min，弃除上清；3)300μL 70％乙醇重悬沉淀，12000g离心10min，弃除上清；4)37℃烘干，用去离子水重悬并测定浓度，调节浓度为0.5-1.0μg/μL。

制备酵母感受态：制作步骤：1)选取冻存良好的巴斯德毕赤酵母GS115菌株，划线于YPD平板，酵母培养箱30℃恒温培养；2)待克隆生长至直径1mm左右，挑取克隆至液体4mLYPD培养基，酵母摇床30℃恒温培养；3)培养24-48小时，将该菌液1mL接种到50mL新鲜YPD培养基中；4)待OD₆₀₀值达到1-1.5，将菌液转移至50mL离心管，4℃，1500g离心5min，弃上清；5)40mL冰水重悬，4℃，1500g离心5min，弃上清，重复一次；6)20mL1mol/L冷山梨醇重悬，4℃，1500g离心5min，弃上清；7)500μL1mol/L冷山梨醇重悬。

电转化步骤：取上述感受态细胞100μL于无菌预冷电转杯中，向其中加入10μL线性化质粒(5-10μg)，混合均匀。设定电转仪参数：1500V，200Ω，25μF。电转，电转后立即向电转杯中加入1mL1mol/L冷山梨醇。取100-1000μL上述菌液涂布MD平板，平板置于30℃恒温酵母培养箱培养。

阳性表达克隆的筛选：待上述MD平板长出酵母克隆后，挑取若干克隆至含BMGY培养基的48孔平板中对pro/GS115转化子进行初筛，并通过菌液PCR进行鉴定。方法如下：用无菌牙签将MD平板上长出来的转化子复制到具有编号的MD平板上，将MD复制平板置于28℃培养箱培养，待平板上单菌落长好后，接种到48孔平板中，每个孔中含有2mL BMGY，28℃，215r/min培养24h，使OD达到4.0以上，分别挑选18#、19#克隆接入BMGY摇甁发酵培养基，培养条件为28℃、250r/min，培养72h，1000rpm离心10min，上清过0.22μm膜，滤液用HRP标记的抗His抗体进行Dot blot鉴定。同时取少量培养的菌液进行菌液PCR鉴定确定pro-WT、pro-Opt是否同源重组到酵母菌GS115中。

三、试验结果

经过MD培养板营养缺陷型筛选得到的阳性克隆，接种pro/GS115(#2)到BMGY培养基培养过夜，并对菌液进行PCR鉴定，鉴定用的引物分别采用目的基因pro自身引物作为上下游引物以及pro的上游引物和3'AOX1作为下游引物，电泳结果表明目的基因pro-WT、pro-Opt成功重组到酵母菌GS115中，结果如图3和图4所示。

经过MD培养板营养缺陷型分别筛选阳性克隆pro-WT/GS115(2#、14#)、pro-Opt/GS115(18#、19#)，接种至含BMGY的培养基，发酵液经过1000rpm离心10min，上清过0.22μm膜，滤液用HRP标记的抗His抗体进行Dot blot鉴定，筛选出PRO表达量相对较高的表达克隆，结果如图5和图6所示。保种于-20℃。并将其中的pro-Opt/GS115(18#)菌制备感受态，作为实施例4pro/mtg共表达菌株的宿主菌。

实施例4pro和mtg共表达体系的构建、表达与纯化

一、pro/mtg共表达重组毕赤酵母菌株的构建

以实施例3中筛选到的高表达菌株pro-WT/GS115、pro-Opt/GS115作为感受态菌株，酵母基因组中rDNA有100～200个重复单元，以此为同源重组位点可以提高外源基因拷贝数。将实施例2中构建成功的重组表达载体pPICZα-rDNA-mtg线性化并电转化到GS115/pro，载体pPICZα-rDNA-mtg上的rDNA与pGAP9-pro/GS115菌株的rDNA区域发生同源重组，构建pro/mtg共表达菌株，由于pPICZα-rDNA-mtg载体上含有Zeocine抗性基因(Zeocine)，构建的工程菌pGAP9-pro/GS115为组氨酸营养缺陷型菌株，故pro/mtg共表达的重组毕赤酵母菌株可通过MD+Zeocine平板筛选得到得到pro/mtg，原理如图7所示。并对pro/mtg毕赤酵母共表达菌株摇甁表达得到酶活和分泌表达量显著提高的pro/mtg共表达重组菌株。

1、将实施例2中构建成功的重组表达质粒载体pPICZα-rDNA-mtg-WT、pPICZα-rDNA-mtg-Opt用SpeⅠ线性化后，配成100μL的线性化体系为：质粒pPICZα-rDNA-mtg-WT或pPICZα-rDNA-mtg-Opt80μL，SpeⅠ3μL，10×buffer G10μL，37℃酶切过夜，乙醇沉淀回收线性化质粒5-10μg。

2、将回收的线性化质粒电转化到实施例3构建的pro/GS115感受态菌株中，平均涂布于3块MD+Zeoein(600μg/ml)平板上，加压筛选高拷贝阳性克隆，于28℃培养3-6d，至平板上长出的克隆即为阳性转化子，命名为pro/mtg共表达重组毕赤酵母菌株。

3、pro/mtg共表达重组毕赤酵母菌株的PCR鉴定

从600μg/mL Zeocine抗生素的MD平板随机挑取长出的菌落接入BMGY培养基过夜培养，提取基因组DNA。以提取的酵母基因组DNA为模板，分别采用目的基因pro-WT(或pro-Opt)和mtg的上游以及pPICZa-B的3'AOX1的下游为引物进行PCR，进行共表达重组毕赤酵母菌株鉴定。

二、pro/mtg高表达菌株的筛选和表达

从600μg/mL Zeocine抗生素的MD平板随机挑取8个克隆，接种到5mL BMGY(pH＝6.25)液体培养基中，28.5℃、200r/min过夜培养，24h后测OD₆₀₀为4，离心收集菌体，在5mL的BMMY培养基(3％甲醇，pH＝6.25)重悬菌体后诱导表达，每隔24h补加一次甲醇至终浓度为3％，诱导48h，停止培养。发酵液1000rpm离心10min，上清过0.22μm膜，滤液用10％的SDS-PAGE跑胶并进行Western Blot鉴定，鉴定所用抗体为用HRP标记的抗His抗体。获得高表达菌株，并保种于-20℃。

取筛选的高表达毕赤酵母菌株pro/mtg，接种于YPD固体培养基中，28℃培养2-3天，然后挑取单菌落于至10mL YPD液体培养基中，小摇瓶过夜培养，以5％的接种量转接到含有200mL BMGY(pH＝6.25)培养基的500mL摇瓶中，初始OD₆₀₀为1，28.5℃、200r/min过夜培养，24h后测OD₆₀₀为30，离心收集菌体，在20mL BMMY培养基(3％甲醇，pH＝6.25)重悬菌体后诱导表达，每隔24h补加一次甲醇至终浓度为3％，诱导72h，OD₆₀₀为180，收样时pH＝6。

三、毕赤酵母发酵产物的纯化和检测

将发酵液上清pH调至7.5，然后12000g离心30min，去除菌体沉淀，将发酵上清液采用0.22μm中空纤维膜过滤，以除去上清酶液中残留的细胞碎片和可能存在的杂质，收集流穿液0.22FT。然后将0.22FT经过截留分子量为30kDa的超滤膜进行过滤，弃去滤过液，得到浓缩的酶液30FT。对浓缩的酶液使用Dot blot初步筛选后，选择表达量高的克隆进行SDS-PAGE，每孔上样量15μL，12％的分离胶，后进行Western bolt鉴定目的蛋白的表达，鉴定用的抗体是HRP标记的抗His抗体。

四、试验结果

1.经过MD培养板营养缺陷型筛选，获得了pro/mtg的共表达菌株。提取pro/mtg共表达菌株的基因组，分别采用目的基因pro-WT(或pro-Opt)和mtg-WT(mtg-Opt)的上游以及pPICZa-B的3'AOX1的下游为引物进行PCR，分别扩增出100-200bp和1000bp左右的条带，如图8所示。PCR鉴定结果显示pro和mtg基因分别整合到毕赤酵母染色体的不同位点，构建正确。

2.对pro/mtg表达产物进行Dot blot初步筛选，结果显示原基因表达量过低，优化基因表达量较高，如图9所示。

3.对确定表达量高的克隆进行Western Blot鉴定，从Western Blot结果来看，优化基因表达的MTG在还原与非还原条件下，均出现三条带，分子大小在43kDa和55kDa之间，可能是由于糖基化的缘故，由此可以推测目的基因上可能存在三个糖基化位点，如图10所示。而原基因没有检测到表达产物，可能是表达量过低。

实施例5谷氨酰胺转氨酶酶活的测定

一、实验方法

一个单位的谷氨酰胺转氨酶酶活的定义为：谷氨酰胺转氨酶活力(U/mL)：在37℃、pH＝6.0下，每分钟催化N-α-CBZ-Gln-Gly生成1μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸(氧肟酸)所需要的酶量。

配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液，并绘制标准曲线。以N-α-CBZ-Gln-Gly(30mmol/L)为底物，用比色法测定MTG酶活。取40μL发酵上清液，37℃预热1min，加入预热的底物100μL，反应10min后加入40μL终止剂(1mol/LHCl、4％三氯乙酸、5％FeCl₃·6H₂O)，10000g离心5min，525nm波长处测定上清液的吸光度值。

二、试验结果

优化基因所表达的重组谷氨酰胺转氨酶酶活达到0.5U/mL，是原始谷氨酰胺转氨酶活的4倍，如图11所示。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽医学高等专科学校

<120> 一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因和前导序列及其分泌表达

<130> 2010

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggattctg atgatagagt tactccacct gctgaacctt tggatagaat gccagatcct 60

tacagaccat cttatggtag agctgagact gttgttaaca actacatcag aaagtggcaa 120

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ttgtcttacg gttgtgttgg tgttacttgg gttaactctg gtcaatatcc tactaataga 240

ttggcttttg cttctttcga tgaagataga ttcaagaacg agttgaaaaa tggtagacca 300

agatctggtg aaactagagc tgaattcgag ggtagagttg ctaaggagtc ttttgatgaa 360

gagaaaggtt tccaaagagc tagagaagtt gcttctgtta tgaacagagc tttggaaaat 420

gctcacgatg agtctgctta cttggataac ttgaagaaag aattggctaa cggtaatgat 480

gctttgagaa acgaggatgc tagatctcct ttttattctg ctttgagaaa tactccatct 540

ttcaaggaga gaaacggtgg taatcatgat ccttctagaa tgaaggctgt tatctactct 600

aaacactttt ggtctggtca agatagatct tcttctgctg ataagagaaa atatggagat 660

ccagatgctt tcagaccagc tcctggtact ggtttggttg atatgtctag agatagaaac 720

attccaagat ctcctacttc tccaggtgaa ggttttgtta atttcgatta cggttggttt 780

ggtgctcaaa ctgaggctga tgctgataaa actgtttgga ctcatggtaa ccattaccac 840

gctcctaatg gttctttggg tgctatgcac gtttatgaat ctaagttcag aaactggtct 900

gagggttact ctgatttcga tagaggtgct tacgttatca ctttcattcc taagtcttgg 960

aatactgctc cagataaggt taaacaaggt tggccataa 999

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌

<400> 2

atggactccg acgacagggt cacccctccc gccgagccgc tcgacaggat gcccgacccg 60

taccgtccct cgtacggcag ggccgagacg gtcgtcaaca actacatacg caagtggcag 120

caggtctaca gccaccgcga cggcaggaag cagcagatga ccgaggagca gcgggagtgg 180

ctgtcctacg gctgcgtcgg tgtcacctgg gtcaattcgg gtcagtaccc gacgaacaga 240

ctggccttcg cgtccttcga cgaggacagg ttcaagaacg agctgaagaa cggcaggccc 300

cggtccggcg agacgcgggc ggagttcgag ggccgcgtcg cgaaggagag cttcgacgag 360

gagaagggct tccagcgggc gcgtgaggtg gcgtccgtca tgaacagggc cctggagaac 420

gcccacgacg agagcgctta cctcgacaac ctcaagaagg aactggcgaa cggcaacgac 480

gccctgcgca acgaggacgc ccgttccccg ttctactcgg cgctgcggaa cacgccgtcc 540

ttcaaggagc ggaacggagg caatcacgac ccgtccagga tgaaggccgt catctactcg 600

aagcacttct ggagcggcca ggaccggtcg agttcggccg acaagaggaa gtacggcgac 660

ccggacgcct tccgccccgc cccgggcacc ggcctggtcg acatgtcgag ggacaggaac 720

attccgcgca gccccaccag ccccggtgag ggattcgtca atttcgacta cggctggttc 780

ggcgcccaga cggaagcgga cgccgacaag accgtctgga cccacggaaa tcactatcac 840

gcgcccaatg gcagcctggg tgccatgcat gtctacgaga gcaagttccg caactggtcc 900

gagggttact cggacttcga ccgcggagcc tatgtgatca ccttcatccc caagagctgg 960

aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggccgtga 999

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gataacggtg ctggtgaaga gactaagtct tacgctgaaa cttatagatt gactgctgat 60

gatgttgcta acattaatgc tttgaatgag tctgctccag ctgcttcttc tgctggtcca 120

tcttttagag cccca 135

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 茂源链霉菌

<400> 4

gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc tacgccgaaa cctaccgcct cacggcggat 60

gacgtcgcga acatcaacgc gctcaacgaa agcgctccgg ccgcttcgag cgccggcccg 120

tcgttccggg ccccc 135

Claims (6)

1.一种优化的谷氨酰胺转氨酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述优化的谷氨酰胺转氨酶基因的表达载体。

3.一种优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种包含权利要求3所述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列的表达载体。

5.一种包含权利要求1所述优化的谷氨酰胺转氨酶基因和权利要求3所述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列的细胞系或基因工程菌。

6.权利要求1所述优化的谷氨酰胺转氨酶基因和权利要求3所述优化的谷氨酰胺转氨酶前导序列应用于生产谷氨酰胺转氨酶。