CN108840930A - 抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗CD19单克隆抗体，其VH链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：3所示的重链CDR1，SEQ ID NO：4所示的重链CDR2，SEQ ID NO：5所示的重链CDR3；其VL链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1，SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2，SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3。本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法及其应用。该单克隆抗体可特异性识别细胞表面的人CD19蛋白；以1×10‑7M或更低的KD与人CD19结合；具有免疫原性低，不引起HAMA反应等优点。

Description

抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
CD19是B细胞表面的跨膜蛋白。它与B细胞活化、信号传导及生长调节密切相关,是B淋巴细胞表面的一种功能受体分子,在B细胞抗原受体(BCR)识别抗原时构成B细胞双重抗原结合模型,参与B细胞内Ca2+的转运,调节B细胞的活化与增殖。CD19作为重要标记物被广泛应用于白血病、淋巴瘤及免疫***疾病的诊断和预后判断.同时利用CD19作为免疫治疗的一个重要靶点,CD19是重要的B细胞恶性肿瘤的靶点。CD19几乎表达在B细胞发育的所有时期，以及各种B细胞肿瘤中，但是，重要的是CD19并不表达在多能性造血干细胞上。这些特点使得CD19成为了很好的B细胞肿瘤的靶点。新型抗体药物在治疗白血病和淋巴瘤方面,研发出包括非结合抗体、药物共轭抗体、双特异性抗体及嵌合抗原受体。
已经显示CD19结合既增强也抑制B细胞激活和增殖，这取决于发生的交联的量(Tedder，同上)。CD19在90％以上的B细胞淋巴瘤上表达，并且预测其在体外和体内影响淋巴瘤的生长(Ghetie，同上)。已经产生的抗CD19抗体为鼠抗体。使用鼠抗体治疗人类受试者的一个缺点是给病人施用后发生人抗小鼠(HAMA)应答。人体对鼠源抗体具有免疫反应，这也是鼠源抗体应用于临床治疗的主要障碍。通过基因工程抗体技术可以在基因水平改造抗体，降低鼠源抗体的免疫原性，提高抗体特异性、稳定性和亲和力。对鼠源抗体进行人源化改造，可保留抗体可变区与人源抗体恒定区融合，提高抗体亲和力；或改造抗体结构，构建只保留抗体可变区的scFv或含抗体可变区和部分恒定区的Fab，可提高抗体在体内的吸收百分比和半衰期。单链抗体(single—chain antibody fragment，scFv)是单克隆抗体的一种形式，通过将抗体的可变区通过铰链区相连接，形成了单链可变区，也称为单链抗体。scFv保留了抗体的抗原结合能力的最小单位。由于其结构更小，更利于基因工程操作，所以被广泛用于人源抗体的构建、筛选和应用。例如CAR-T技术就采用scFv结构的抗体做为嵌合受体识别抗原的区域。因此，需要更有效地治疗和/或预防CD19介导的疾病的改善的治疗性抗CD19抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用，可以特异性识别细胞表面的人CD19蛋白，对CD19阳性的Hela细胞、K562细胞具有显著的杀伤效应；该抗体以1×10-7M或更低的KD与人CD19结合；与Raji和DaudiB细胞肿瘤细胞结合；具有免疫原性低，不引起HAMA反应等优点，具有更好的稳定性和安全性。
本发明是这样实现的：
在本发明的第一方面，提供了一种抗CD19单克隆抗体VH链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：3所示的重链CDR1，SEQ ID NO：4所示的重链CDR2，SEQ ID NO：5所示的重链CDR3。
更优选地，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；
优选地，所述的抗CD19单克隆抗体VH链，它具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗CD19单克隆抗体VL链，它的的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1，SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2，SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3。
优选地，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；
更优选地，所述的抗CD19单克隆抗体VL链，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种抗CD19单克隆抗体，其VH链和VL链分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在另外一些实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的VH和VL区高度(即80％或更高)同源的VH和VL区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO：1、2、3、4的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能。
该抗CD19单克隆抗体以1×10-7M或更低的KD与人CD19结合；与Raji和DaudiB细胞肿瘤细胞结合。
在本发明的第四方面，提供了一种核酸分子，它编码权任一所述抗CD19单克隆抗体。
该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他污染物。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA核酸分子。
本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的一种或多种核酸。可用标准PCR扩增技术获得：使用引物对扩增出CD19单链抗体的片段；双酶切，以T4DNA连接酶于同样双酶切载体质粒(该载体在多克隆位点下游融合表达人IgG1抗体的Fc片段连接并转化于宿主菌中，挑取克隆通过PCR鉴定阳性克隆并通过测序确认，获得真核表达质粒。
本发明中，采用将可变区基因转化为scFv基因，一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。
在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VH区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一个片段有效连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其VL和VH区通过该柔性连接体连接。
在本发明的第五方面，提供了表达载体，它包含编码任一所述抗CD19单克隆抗体的氨基酸序列，其能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。该载体可以是常规的载体。优选地为，本发明采用第三代自灭活慢病毒载体***，该***共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒pMD2.G及基于空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(购自Addgene公司)的编码人CD19胞外区域和跨膜区域的重组质粒pCDH-CMV-huCD19-EF1-GFP-T2A-Puro。根据Genbank登录号NM_001178098提供的人CD19序列，使用基于PCR搭桥的基因合成方法，合成包含信号肽、人CD19胞外区域、跨膜区域、胞内区域，所述胞外结构域包含的CAR基因的胞外识别区序列为所述的抗CD19单克隆抗体的氨基酸序列。
在本发明的第六方面，提供了宿主细胞，其为包含所述载体的原核或真核宿主细胞。人CD19稳定表达细胞系的构建时，将上述构建成功的慢病毒载体pCDH-CMV-huCD19-EF1-GFP-T2A-Puro转染293T细胞包装慢病毒；包装好的重组慢病毒可用于感染白血病细胞Hela或K562等。流式细胞实验表明该抗体可以特异性识别细胞表面的人CD19蛋白。该宿主细胞可以是感染有所述包装好的慢病毒的白血病细胞Hela或K562等，也可以是本发明的第八方面提到的感染有所述包装好的慢病毒的T淋巴细胞。
在本发明的第七方面，提供了抗CD19单克隆抗体的制备方法，包括在所述的宿主细胞中表达该抗CD19单克隆抗体，并且从所述宿主细胞中分离该CD19抗体。本发明抗CD19单克隆抗体对CD19阳性的Hela细胞、K562细胞具有较好杀伤效应。
在本发明的第八方面，提供一种CAR-T细胞，其包含至少一个胞外配体结合结构域、跨膜结构域及至少一个胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含的CAR基因的胞外识别区序列为所述的抗CD19单克隆抗体的氨基酸序列。CAR-T技术就采用scFv结构的抗体做为嵌合受体识别抗原的区域，构建含上述CDR片段的嵌合抗原载体的T细胞。将上述包装好的含scFv基因的慢病毒感染T淋巴细胞，即得本发明的CAR-T细胞。与传统免疫疗法相比，CAR-T细胞在试验中均表现出了更好的靶向性和杀伤性。
在本发明的第九方面，提供了所述的抗CD19单克隆抗体和CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明采用人***细胞系Hela和转染了CD19的Hela细胞(CD19-Hela)作为靶细胞，效应细胞为前述制备的CAR-T细胞，CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞时，T细胞首先会和携带肿瘤抗原的肿瘤细胞进行识别查证，然后形成免疫突触，进而释放杀伤因子完成T细胞的免疫监视及杀伤功能。本发明的CAR-T细胞对CD19阳性的Hela细胞、K562细胞具有更加显著的杀伤效应。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明提供的抗CD19单克隆抗体(scFv-3B5-Fc)其对CD19的表观亲和力为475pM，可以特异性识别细胞表面的人CD19蛋白，对CD19阳性的Hela细胞、K562细胞具有显著的杀伤效应；
2、本发明提供的CAR-T细胞，与传统免疫疗法相比，CAR-T细胞在试验中均表现出了更好的靶向性和杀伤性，对CD19阳性的Hela细胞、K562细胞具有更加显著的杀伤效应；
3、本发明的CAR-T细胞具有免疫原性低，不引起HAMA反应等优点，具有更好的稳定性和安全性。
附图说明
图1为同型对照IgG、本发明的抗CD19单克隆抗体(scFv-3B5-Fc)的荧光峰在CD19表达阳性的Raji细胞上相比有显著的差异；
图2为证明筛选得到的表达scfv的噬菌体可以结合CD19的天然抗原，初步纯化的噬菌体对Raji细胞进行染色和流式分析图；
图3抗体-Fc融合蛋白scFv-3B5-Fc，聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定结果；
图4为本发明的Scfv-3B5融合表达的CAR-T细胞特异性的杀伤CD19-Hela细胞；
图5为本发明的Scfv-3B5融合表达的CAR-T细胞的体外抗肿瘤细胞毒性；
图6为本发明的抗CD19单克隆抗体(scFv-3B5-Fc)在浓度梯度ELISA实验中获得的结合曲线示例性；
图7为本发明提供的CAR-T细胞的质粒结构组成图。
具体实施方式
实施例1 结合人CD19的特异性单链抗体(scFv)的制备
一、基于噬菌体展示的抗人CD19特异性抗体的筛选
1、为达到此目的，在400ml 2×YT/氨苄青霉素培养基中接种噬菌体展示全人源单链抗体天然库的甘油菌(自建文库)，使细胞密度达到OD600＝0.1，在37℃和200rpm条件下振荡培养直至细胞密度达到OD600＝0.5。用1012Pfu的M13KO7辅助噬菌体(购买自ThermoFisher公司)感染，在30℃和50rpm条件下培养30分钟。加入50mg/L卡那霉素后在37℃和200rpm条件下振荡培养30分钟后，通过离心(15分钟，1600×g，4℃)分离沉淀，重悬于400ml 2×YT/氨苄青霉素/卡那霉素培养基，在37℃和200rpm条件下振荡培养16小时。最后通过离心(20分钟，5000×g，4℃)分离沉淀并丢弃，上清用0.45μm规格滤膜过滤后，加入1/4体积20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液并在冰浴中孵育1小时沉淀噬菌体颗粒。随后离心(20分钟，8000×g，4℃)，弃上清，将噬菌体沉淀重悬于25ml预冷PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)中，离心(5分钟，20000×g，4℃)。向上清液加入1/4体积20％(w/v)PEG8000、2.5M NaCl溶液，并冰浴30分钟再次沉淀噬菌体颗粒。离心沉淀(30分钟，20000×g，4℃)，再次将噬菌体沉淀重悬于2ml预冷PBS中，在冰上保持30分钟并离心(30分钟，17000×g，4℃)。上清液与含4％(w/v)BSA的PBS溶液以1:1混合，置于旋转混合器上，室温下保温30分钟，然后直接用于筛选。
2、利用上述噬菌体抗体库，针对生物素标记的人Fc-CD19重组蛋白(购自Acrobiosystems公司)实施了3轮定向筛选，筛选方案如下：
3、将噬菌体抗体库与生物素标记的重组人CD19抗原，在室温下孵育2小时，然后与经2％BSA溶液封闭过的链霉亲和素标记的磁珠(购自ThermoFisher公司)在室温下孵育30分钟。随后用PBST(含0.1％吐温-20)缓冲液洗涤磁珠，除去非特异性结合或结合能力较弱的噬菌体。结合能力强的噬菌体，则用甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2)从磁珠上洗脱下来，用Tris中和液(pH 9.1)中和后，用于感染处于对数生长期的大肠杆菌ER2738，并被用于下一轮筛选。在3轮筛选中，磁珠的用量分别为50μl、20μl和10μl，生物素标记的人Fc-CD19抗原浓度分别为100nM、10nM和1nM，PBST的洗涤次数分别为10次、15次和20次。
二、人CD19特异性结合抗体的鉴定
1、从第三轮筛选所得的克隆中随机挑选单克隆，并用单噬菌体ELISA(酶联免疫吸附实验)分析其与人Fc-CD19的结合能力。为此目的，每个单菌落接种300μl 2×YT/氨苄青霉素培养基(含2％葡萄糖)于96孔深孔培养板，并在37℃和250rpm下振荡培养16小时。用20μl培养物接种到500μl 2×YT/氨苄青霉素培养基(含0.1％葡萄糖)，在37℃和250rpm下振荡培养1.5小时。准备辅助噬菌体溶液，取75μl的M13KO7(滴度为3×1012pfu/ml)混入到15ml2×YT培养基中，50μl/孔加到培养板中。在37℃和150rpm条件培养30分钟，然后加入准备好的卡那霉素溶液50μl/孔(取180μl的50mg/ml卡那霉素，加入到15ml 2×YT培养基)，在37℃和250rpm下振荡培养16小时。最后离心沉淀细胞(30分钟，5000×g，4℃)，将上清转移到新的96孔深孔培养板。
2、如图2所示，为了初步确定筛选得到的表达scfv的噬菌体是否可以结合CD19的天然抗原，我们用初步纯化的噬菌体对Raji细胞进行染色和流式分析。图2的分析结果表明筛选得到的表达scfv的噬菌体可以结合CD19的天然抗原。图2中(A)图为筛选得到的表达scfv的噬菌体，图(B)为阴性对照组。
3、为进行单噬菌体ELISA，在96孔MediSorp ELISA板(购自ThermoFisher)上分别使用100ng/孔人Fc-CD19重组抗原以及阴性对照蛋白Fc(100μl/孔)，在4℃包被过夜。每个孔用含2％BSA的PBST溶液封闭。随后用PBST清洗孔三次并拍净。然后加入100μl/孔上面制备的每种噬菌体溶液到板上各孔中。37℃保温2小时后，用PBST洗涤三次。为了检测结合的噬菌体，将抗M13抗体过氧化物歧化酶偶联物(购自武汉三鹰)以1:5000稀释于PBST中，取100μl加到每个孔中。37℃保温1小时后用PBST漂洗三次，然后用PBS漂洗三次。最后吸取50μl TMB底物加入到孔中，并在室温下显色10分钟，随后加入每孔50μl的2MH2SO4终止显色反应。用酶联免疫检测仪(Bio-Rad)在450nm测量消光值。根据消光值判定为阳性的孔，提取噬菌体质粒进行scfv序列的测序验证。
4、结合测序分析，观察到单链抗体3B5(SEQ ID NO:9)，在ELISA实验中对人CD19结合信号极强，对Fc重组蛋白无结合。
5、单克隆抗体3B5(即本发明的单克隆抗体)，其包括：(a)包含如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列的重链CDR1；(b)包含如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的重链CDR2；(c)包含如SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的重链CDR3；(d)包含如SEQIDNO：8所示的氨基酸序列的轻链CDR1；(e)包含如SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的轻链CDR2；和(f)包含如SEQIDNO：10所示的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗体特异性地与人CD19结合。
实施例2 抗CD19的单链抗体的表达和纯化
1、人CD19单链抗体的表达
对选定的单链抗体进行真核表达载体的重组构建，转染HEK293F诱导重组表达并纯化。使用引物对3B5-F(SEQ ID NO:10)和3B5-R(SEQ ID NO:11)从实施例1中所得克隆pCantab-3B5中扩增出ScFv-3B5片段；通过NheI/BamHI(购自Takara公司)双酶切，以T4DNA连接酶于同样以Nhe I/BamH I双酶切载体质粒pCMV-V5-Fc(该载体在多克隆位点下游融合表达人IgG1抗体的Fc片段，以下简称V5-Fc)连接并转化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通过PCR鉴定阳性克隆并通过测序确认，获得scFv-3B5-Fc真核表达质粒。
2、人CD19单链抗体的纯化
将上述表达质粒分别转染生长良好的HEK-293F细胞，37℃，5％CO2，125rpm摇床连续培养7天，4000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，将处理好的样品以ProteinA(购自GE公司)亲和柱进行亲和纯化，最终获得纯化的抗体-Fc融合蛋白scFv-3B5-Fc，聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定结果如图3所示。图3表明纯化的抗体-Fc融合蛋白scFv-3B5-Fc构建成功。
实施例3、抗人CD19的单链抗体的抗原结合活性分析
1、ELISA分析重组抗体对人CD19抗原的结合活性
通过浓度梯度ELISA实验，测定筛选到的抗体对抗原人CD19的结合活性。为此目的，用0.1M NaHCO3(pH 9.6)包被液稀释抗原人Fc-CD19，每孔包被100ng，50μl/孔，4℃包被过夜，并用含2％BSA和0.01％(v/v)Tween-20的PBST封闭液于室温下封闭2小时。然后用PBST漂洗平板三次并去除干净。随后，向每个孔板加入100μl含一系列浓度(起始浓度10nM，进行3倍梯度稀释，直至稀释到1:729)的各抗体蛋白的PBST溶液，每个样品的测定使用平行三孔分析。37℃保温2小时后，用PBST漂洗三次，随后加入1:20000稀释的带辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体(购自武汉三鹰)100μl/孔，37℃反应1小时。为了检测，用PBST漂洗孔三次，然后用PBS漂洗三次，最后加入TMB显示15分钟，用每孔50μl的2M H2SO4终止显色反应，用酶联免疫检测仪(Bio-Rad)在450nm测量消光值。用GraphPad软件评估所得到的吸光强度值，计算抗体的结合强度。为此目的，每种情况下测量的消光值对相应的抗体浓度作图，并用下面的非线性回归对所得曲线进行拟合。
其中鉴定固定的抗原和抗体蛋白之间的结合/解离平衡是：
x＝抗体蛋白的浓度；
y＝抗原/抗体复合体的浓度(通过显色反应后的吸光值间接测量)；
a＝固定化抗原的总浓度；
b＝解离常数(KD)。
抗体ScFv-3B5-Fc在浓度梯度ELISA实验中获得的结合曲线示例性表示如图6所示，其中ScFv-3B5-Fc的表观亲和力为475pM。
2、FACS分析重组抗体对Raji细胞表面CD19的结合活性
通过FACS分析实验，检测筛选得到的抗体对肿瘤细胞系Raji细胞表面CD19抗原的结合活性。
实施例4 流式细胞学分析各个人CD19稳定表达细胞系与抗CD19单链抗体的结合情况
一、人CD19稳定表达细胞系的构建
1、质粒载体的构建
(1)本实施例使用的载体***属于第三代自灭活慢病毒载体***，该***共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒pMD2.G及基于空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(购自Addgene公司)的编码人CD19胞外区域和跨膜区域的重组质粒pCDH-CMV-huCD19-EF1-GFP-T2A-Puro。
(2)根据Genbank登录号NM_001178098提供的人CD19序列，使用基于PCR搭桥的基因合成方法，合成包含信号肽、人CD19胞外区域、跨膜区域、胞内区域，通过引物对huCD19F(SEQ ID NO：12)/R(SEQ ID NO：13)进行PCR扩增，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，80s；30个循环。获得的片段理论大小为1716bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。其中在开放阅读框的上下游引入Xba I和BamH I酶切位点。上述获得的目的基因由Xba I和BamH I双酶切，连入同样双酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体中，构建成功的慢病毒载体pCDH-CMV-huCD19-EF1-GFP-T2A-Puro，经Xba I和BamH I酶切鉴定及序列测定正确后进行慢病毒包装。
2、质粒转染293T细胞包装慢病毒
(1)以6×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染。培养基为含10％无噬菌体胎牛血清(杭州四季青)的DMEM(ThermoFisher公司)，次日，在转染前约2小时更换培养液为无血清DMEM。
转染的步骤如下：
将5μg目的基因质粒pCDH-CMV-huCD19-EF1-GFP-T2A-Puro，分别与7.5μg包装质粒pSPAX2和2.5μg包膜质粒pMD2.G，溶入500μL Mill Q水中，混匀；
逐滴加入62μL 2.5M CaCl2(Sigma公司)，以1200rpm/min vortex混匀，
最后逐滴加入500μL 2×HBS(280mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na2HPO4，12mM葡萄糖，50mM Hepes(Sigma公司)，pH7.05，0.22μM过滤除菌)，1200rpm/min振荡混匀10s，
立即逐滴加入培养皿中，轻轻摇匀，37℃，5％CO2，培养4～6h后，更换为含10％胎牛血清的DMEM。
(2)在转染48h或72h后，离心除去细胞碎片，然后用0.45μm滤器(Millipore公司)过滤收集病毒。
3、重组慢病毒感染白血病细胞Hela或K562
将上述收集的病毒液经浓缩滴定后，分别感染铺于6孔板中的Hela细胞或K562细胞。感染三天后收集细胞，取部分混合克隆，使用流式细胞术及靶向CD19的荧光标记抗体检测细胞表面CD19的表达情况，流式细胞术的方法与步骤同实施例5。其余的细胞扩大培养后冻存一部分，另一部分传代于6孔板中，加入2ug/ml的Puromycin(购买自Sigma)抗生素，筛选1-2周的时间，显微镜下观察，至视野中全部细胞均表达GFP为止，此时冻存部分细胞用于后续的流式细胞术检测及杀伤实验。
二、流式细胞学分析
1、通过流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman)分析实施例2得到的抗人CD19的单链抗体scFv-3B5-Fc与细胞表面的人CD19的结合能力。
具体方法如下：
(1)取对数生长期的细胞Raji细胞、K562-CD19和K562分别接种到T25细胞培养瓶中，接种细胞密度约为5x105个/ml，37℃孵箱过夜培养。
(2)轻微晃动培养皿内的培养液，200g×5min离心收集细胞。以2～3×106/mL的浓度重悬于1％含小牛血清的磷酸盐缓冲液(NBS PBS)中，按100ul/管的量加入流式专用管中。
(3)200g×5min离心，弃上清。
(4)两个实验组分别加入待测抗体scFv-3B5-Fc、FMC63阳性抗体，另设一个对照组为不加抗体的PBS空白对照。各抗体的终浓度均为20μg/ml，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
(5)每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。
(6)弃上清，加入1:100稀释的羊抗人抗体-FITC(武汉三鹰生物)，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
(7)每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。
(8)弃上清，重悬于300ul 1％NBS PBS中，流式细胞仪检测。
(9)应用流式细胞仪数据分析软件CytoExpert2.0分析数据。
2、如图1所示，流式细胞分析结果表明，同型对照IgG、scFv-3B5-Fc的荧光峰在CD19表达阳性的Raji细胞上相比有显著的差异，在人CD19表达阴性的K562细胞上无明显差别，表明scFv-3B5-Fc可以特异识别人CD19表达阳性的Raji细胞，但是与人CD19表达阴性的K562细胞不结合。因此，抗体scFv-3B5-Fc可以特异性识别细胞表面的人CD19蛋白。因为K562的流式图前后图一样，没有差别所以图中未示。
实施例5 制备CAR-T细胞
一、嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建
1、本实施例中使用的慢病毒质粒载体***属于第三代慢病毒四质粒***，该***共有四个质粒即编码VSV-G蛋白的包膜质粒pCMV-VSV-G(购自addgene)、编码Rev蛋白的包装质粒pRSV-Rev(购自addgene)、编码Gal和Pol的pMDLg/pRRE(购自addgene)及基于空载体pLVX-EF1(本公司构建)的编码目的CAR基因的重组表达载体，该***可以有效降低形成复制性慢病毒颗粒的风险。
2、所有构建的CAR表达慢病毒载体的基因启动子均采用已经公开的专利201310164725.X中的载体上延长因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)。构建具体方法如下：
(1)设计CAR基因的全长氨基酸序列
通常一个典型的CAR结构应包含细胞膜蛋白转运信号肽、肿瘤抗原结合区、铰链区、跨膜区及T细胞共刺激信号。具体到本实施例，如图7所示，我们采用人的CD8的细胞膜转运信号肽，连接scfv-3B5作为肿瘤抗原CD19的结合区，此后再连接人的CD8的胞外近膜Hinge区及CD8的跨膜区，胞质结构域部分连接4-1BB的胞内结构域和CD3ζ的胞内结构域作为T细胞的共刺激结构域。为了方便CAR的检测，我们在CAR结构的后面通过自剪接肽连接了GFP共表达。整个融合基因及其对应的氨基酸序列如下：
(2)核酸序列优化
为了增强CAR基因在T细胞中的表达及增加蛋白质的翻译，我们用网站http://www.jcat.de/的人源密码子优化算法对CAR基因的密码子进行优化，优化后的序列如下：
(3)全序列合成及测序验证
对于优化的密码子序列，交由DNA合成供应商(武汉金开瑞)进行片段合成和全序列拼接，拼接完成之后测序验证，验证无误后通过EcoR I/BamH I限制性内切酶双酶切，连入同样双酶切的pLVX-EF1载体中，从而构建表达各嵌合抗原受体的慢病毒载体pLVX-EF1-3B5-CAR、pLVX-EF1-FMC63-CAR。构建成功的载体经EcoR I/BamH I酶切鉴定及序列测定正确后，可以用于慢病毒包装。如前所述，相关CAR基因经转录翻译为一条肽链，在GM-CSF信号肽的引导下，抗CD19嵌合抗原受体将定位在T细胞的细胞膜上。本实施例采用类似的策略，构建了由scfv-3B5片段以及scfv-FMC63片段组件构成的CAR融合基因。
二、质粒转染293T包装慢病毒
1、以6×106的密度接种培养至第6～10代的HEK-293T细胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染。培养基为含10％胎牛血清和DMEM(均购自Hyclone公司)。
2、转染的步骤如下：
A液配制：将5.2μg的各目的基因质粒pLVX-EF1-3B5-CAR，分别与6.2μg包装质粒pMDLg RRE和pRSV-REV、以及2.4μg包膜质粒pCMV-VSV-G，溶入800μL的无血清DMEM培养液中，混匀。
B液配制：将60μg PEI(聚乙烯亚胺1μg/μl，购自Polysciences公司)溶解于800μL的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀，室温孵育5min。
转染复合物的形成：将A液加入B液中轻轻混合，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min。
将转染复合物1.6ml滴加入HEK-293T细胞中，4-5h小时后，用2％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液。
3、在转染孵育72h后，使用0.45μm滤器(购自Millipore公司)过滤收集病毒，然后采用Beckman Optima L-100XP超速离心机28000rpm，4℃离心2小时，弃离心上清，离心所得沉淀用1/10～1/50原液体积的AIM-V培养液(购自Life公司)进行重悬，以100μL/管分装冻存于-80℃，以待病毒滴定或感染T淋巴细胞。
三、重组慢病毒感染T细胞制备CAR-T细胞
1、由健康人外周血通过密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞(武汉市血液中心提供)，FACS分析确认CD3阳性率，然后按照CD3阳性T细胞与磁珠比例为1:2加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(ThermoFisher公司)和终浓度300U/mL的重组人IL-2(购自上海华新生物高技术有限公司)刺激培养24h。然后以MOI为5用上述重组慢病毒感染T细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度300U/mL的重组人IL-2。
2、感染的T细胞在培养第5天时通过流式细胞检测嵌合抗原受体表达。首先，感染后的CAR-T细胞与生物素标记的人Fc-CD19蛋白37℃孵育30min，D-PBS洗2次，然后加入PE-标记的Streptavidin在37℃孵育30min。D-PBS洗3次后流式细胞仪检测阳性细胞比率。以未感染的T淋巴细胞和只加了PE-标记的Streptavidin染色的T细胞作为阴性对照，鉴定表达嵌合抗原受体的病毒感染T细胞及其阳性率水平。同时也可以通过FACS分析确认表达GFP的T细胞的阳性率，对照Fc-CD19重组抗原检测的T细胞表达CAR基因的阳性水平，可以确认携带CAR基因的慢病毒感染的T细胞可以成功的将CAR结构展示到T细胞的细胞膜上该阳性率结果表明，通过慢病毒感染的方法能够获得表达嵌合抗原受体受体的T细胞。
3、T细胞在分别感染包装有嵌合抗原受体的病毒后，以细胞密度为5×105/ml隔天传代、计数、并对传代的细胞培养液补加IL-2(终浓度为300U/ml)，培养第11天约有50～200倍的扩增，表明表达嵌合抗原受体的CAR-T细胞在体外能够进行一定数量的扩增，为后续体外杀伤试验及体内试验提供了保证。
实施例6 体外毒性效果实验
一、在体外适宜的细胞培养体系中，混合带有特异性肿瘤抗原的靶细胞或实施例5制备的CAR-T细胞，一段时间后即可观察到T细胞或CAR-T细胞对靶细胞实施了识别(聚集)和杀伤(肿瘤细胞数量减少)行为。例如本实验混合过表达CD19的Hela细胞(实施例4中人CD19稳定表达细胞系的构建中得到)和普通扩增培养的T细胞或FMC63CAR-T(阳性对照)、3B5CAR-T。细胞本实验所用的细胞为人***细胞系Hela和转染了CD19的Hela细胞(CD19-Hela)作为靶细胞，效应细胞为前述制备的CAR-T细胞，效靶比视情况分别为2.5，12.5:1和25:1，靶细胞数量为10000个/孔，根据不同效靶比添加适当数量的效应细胞。所有细胞均培养于5％CO2，37℃的细胞培养箱内。
二、显微镜成像分析其体外毒性效果
1、方法：实验开始时，先接种10000个/孔的CD19-Hela细胞至6孔板中，培养12h后根据效靶比添加适当数量的T细胞或CAR-T细胞，继续在5％CO2，37℃培养箱中培养4h后，取出培养板在倒置显微镜下观察成像。
2、结果如图4所示，3B5-CAR-T对CD19阳性的Hela细胞具有显著的杀伤效应。
三、实时无标记细胞分析技术分析其体外毒性效果实验
1、原理：CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞时，T细胞首先会和携带肿瘤抗原的肿瘤细胞进行识别查证，然后形成免疫突触，进而释放杀伤因子完成T细胞的免疫监视及杀伤功能，因此这个过程是一个持续的过程。传统的检测T细胞杀伤肿瘤细胞的方法往往是取一个时间点进行终点检测，其获得的结果往往误差较大，也不能真实的反映出T细胞杀伤肿瘤细胞的完整过程。为了突破这一类检测手段的技术瓶颈的限制，实时无标记细胞分析技术(RealTime Cellular Analysis,RTCA)基于细胞在带有微电极的培养板中贴壁后产生的电阻抗值的检测，可以实现实时、无标记、持续动态的监测小分子化合物、抗体药物、T细胞等引起的细胞毒性效应。基于这种电阻抗的实时细胞杀伤分析技术，研究者能获得很高灵敏度的量化数据，有助于研究和揭示抗肿瘤化合物或细胞的具体作用机制，同时也能显著的降低实验的成本和提高结果的准确度。RTCA技术持续动态的监测靶细胞的贴壁、伸展以及繁殖过程，使用细胞指数Cell Index表示靶细胞的生长状态，或可等同于靶细胞的数量。
2、方法：整个实验过程除了添加效应细胞时，应保证培养板及检测仪器处于稳定的培养环境中，避免Cell Index数据出现较大的波动。为了获得时间依赖的细胞效应特征曲线，在16孔的E-plate的培养孔中加入90ul的培养基，测得背景基线后在加入100ul的细胞悬液,混匀后放置于CO2培养箱中的检测台上，并持续获得反应细胞生长状态的电阻抗值Cell Index。18h后待靶细胞完全贴壁生长一段时间后加入等体积的效应细胞悬液，然后再放入培养箱中的检测台上，继续收集反应细胞生长状态的电阻抗值Cell Index数据。
3、结果：48h后结束整个实验，导出采集的数据如图5所示。图中，SKOV-3-CD19为实施例中稳定表达CD19的稳定细胞系。图5中Cell Index指数通过测量培养板的电阻抗值直观的显示了在培养板上生长的肿瘤细胞的数量。添加的效应细胞为悬浮细胞，故对培养板的电阻抗值没有显著影响。实验初期未加入效应细胞是Cell Index逐渐升高，提示细胞在适宜的培养条件下增殖生长，加入效应细胞后Cell Index的下降表明贴壁生长的靶细胞CD19-SKOV3的数量减少，即受到效应细胞的杀伤而发生凋亡等。表明本发明提供的3B5-CAR-T对CD19阳性的Hela细胞具有显著的杀伤效应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。核酸序列如下：
序列表
<110> 生研医药科技（武汉）有限公司
<120> 抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 0
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 1
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 4
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 5
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 6
Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser His Leu Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 7
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 8
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 732
<212> DNA
<213> 人类( Homo sapiens)
<400> 9
caggtgcagc tggggcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac accgccttgt attactgtgc aaaacattat 300
tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggt tctggcggtg gcggatcgga catccagatg 420
acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccgt cacttgccgg 480
acaagtcaga gtattagtag tcatttaaat tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc 540
aggctcctca tctatggtgc atccaccagg gccactggta tcccagccag gttcagcggc 600
agtggatatg ggacagagtt cactctcacc atcagcagcc tgcagcctga agattttgca 660
acttattact gtcaacaggg taatacgctt ccgtacacga cttttggcca ggggaccaag 720
gtggaaatca aa 732
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatggctagc acaggtcacc ttgaaggagt ctg 33
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gactggatcc acctaggatg gtgaccttgg 30
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttacgcgt cctagcgcta ccggtcgcca ccatgccacc tcctcgcctc 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgaggtcgac ctacttgtca tcgtctttgt aatccctggt gctccaggtg 50

Claims (10)

1.一种抗CD19单克隆抗体，其特征在于，其VH链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：3所示的重链CDR1，SEQ ID NO：4所示的重链CDR2，SEQ ID NO：5所示的重链CDR3；
其VL链的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1，SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2，SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3。
2.一种抗CD19单克隆抗体，其特征在于，其VH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或与其具有至少80％的同源性的氨基酸序列；其VL链的氨基酸序列SEQ ID NO：2或与其具有至少80％的同源性的氨基酸序列所示。
3.如权利要求1-2任一所述的抗CD19单克隆抗体，其特征在于，其为人抗体、人源化或嵌合抗体。
4.一种核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1-3任一所述抗CD19单克隆抗体。
5.一种包含权利要求4所述核酸的表达载体，其特征在于，其能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其为包含权利要求5所述的表达载体的原核或真核宿主细胞。
7.一种抗CD19单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括在权利要求6所述的宿主细胞中表达该抗CD19单克隆抗体，并且从所述宿主细胞中分离该CD19单克隆抗体。
8.一种CAR-T细胞，其特征在于，其包含至少一个胞外配体结合结构域、跨膜结构域及至少一个胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含的CAR基因的胞外识别区序列为权利要求1-3任一所述的抗CD19单克隆抗体的氨基酸序列。
9.一种如权利要求8所述的CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、T淋巴细胞的分离、激活和扩增：将分离的CD3+T淋巴细胞激活后培养扩增；
S2、携带CAR的重组慢病毒感染所述步骤S1处理后的T淋巴细胞，制得所述CAR-T细胞，其中，所述携带CAR的重组慢病毒中携带的CAR基因的胞外识别区序列为权利要求1-3任一所述的抗CD19单克隆抗体的氨基酸序列。
10.权利要求1-3任一所述的抗CD19单克隆抗体及权利要求8所述的CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
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