CN106727586A - 一种青蒿琥酯的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种青蒿琥酯的新应用，青蒿琥酯用于逆转肺腺癌厄洛替尼耐药，或青蒿琥酯和厄洛替尼联合用药。以解决现有分子靶向药物最终会产生耐药，限制其在临床上应用的问题。本发明属于肺癌治疗领域。

Description

一种青蒿琥酯的新应用
技术领域
本发明涉及一种逆转肺腺癌厄洛替尼耐药，属于肺癌治疗领域。
背景技术
肺癌是导致癌症相关性死亡主要的原因，分子靶向治疗的出现为肺癌的治疗带来了新的希望，其有明确的作用位点，而且不良反应小，疗效确切。分子靶向药物的缺点是其价格昂贵、不能完全清除病灶，并且最终会产生耐药，这一点限制了其在临床上的应用。。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种青蒿琥酯的新应用，以解决现有分子靶向药物最终会产生耐药，限制其在临床上应用的问题。
为解决上述问题，拟采用这样一种青蒿琥酯的新应用，青蒿琥酯用于逆转肺腺癌厄洛替尼耐药，进一步地，青蒿琥酯和厄洛替尼联合用药。
青蒿琥酯用于肺腺癌厄洛替尼耐药的逆转研究方法：
ART对人肺腺癌PC9细胞的体外抗瘤活性研究：培养PC9细胞株，加入不同浓度的ART，用cell Counting Kit-8(cck-8)检测PC9细胞的增殖率，Real-time RT-PCR和western-blot检测EGFR、IGF1R、AXL和Akt mRNA、蛋白及凋亡相关蛋白的表达；
厄洛替尼继发性耐药细胞系的培养及耐药性的检测：用cck-8法检测PC9/ER的增殖率，计算耐药倍数，Real-time RT-PCR和western-blot检测EGFR、IGF1R、AXL、Akt mRNA和蛋白的表达；
体外实验验证ART逆转肺腺癌ER耐药的作用及机制：在PC9/ER细胞株中加入不同浓度的ART、ER或联合用药，并以LY294002为阳性对照，用cck-8法测增殖率，Real-time RT-PCR和western-blot检测EGFR、IGF1R、AXL和Akt m RNA和蛋白的表达；
通过裸鼠移植瘤体内实验验证ART逆转肺腺癌ER耐药的作用及机制，厄洛替尼继发性耐药细胞系简称PC9/ER，厄洛替尼简称ER，青蒿琥酯简称ART。
与现有技术相比，本发明所述青蒿琥酯能够有效逆转肺腺癌厄洛替尼耐药，配合厄洛替尼后能够有效地改善肺癌预后，很好地解决了分子靶向药物会产生耐药的问题，进一步推进分子靶向药物在临床上的应用。
附图说明
图1光学显微镜下不同浓度青蒿琥酯处理PC9细胞后细胞数量及形态学的变化(x200)，其中：
A：0.1％DMSO对照组； B：青蒿琥酯25μmol/L组
C：青蒿琥酯50mol/L组； D：青蒿琥酯100mol/L组；
图2青蒿琥酯对PC9细胞的增殖抑制作用；
图3青蒿琥酯处理48h后细胞中EGFR、IGF1R、AXL和Akt mRNA的相对表达，注：*p<0.05vs control**p<0.01vs control；
图4青蒿琥酯处理48h后PC9细胞中EGFR、IGF1R、AXL和Akt及其磷酸化的表达水平；
图5青蒿琥酯处理48h后PC9细胞中凋亡相关蛋白的表达水平；
图6青蒿琥酯对PC9细胞和PC9/ER细胞的增殖抑制作用；
图7不同实验组作用于PC9/ER细胞后IGF1R和AXL的蛋白表达及磷酸化水平变化情况；
图8不同实验组作用于PC9/ER细胞后Akt的蛋白表达及磷酸化水平变化情况；
图9不同实验组作用于PC9/ER细胞后凋亡相关蛋白的表达及磷酸化水平变化情况；
图10不同实验组裸鼠体重变化情况；
图11不同实验组裸鼠瘤体体积变化情况，注：*p<0.05vs Con组n＝5。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对发明作进一步地详细描述。
实验例1：
青蒿琥酯对人肺腺癌PC9细胞的体外抗瘤活性研究
1材料与方法
1.1主要实验材料
1.1.1细胞株
人肺腺癌PC9细胞由第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所陈正堂教授惠赠。
1.1.2主要试剂
1.1.3主要材料设备
1.2实验方法
1.2.1细胞的复苏、培养、传代与冻存
肿瘤细胞的复苏与培养
将装有人肺腺癌PC9细胞株的冻存管从液氮罐取出，迅速放入37℃-40℃装有温水的烧杯中快速摇晃，使冻存的细胞液在30s内快速溶解，将细胞转移到无菌离心管中，加入RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清(FBS))5ml，将细胞轻柔吹打成细胞悬液，于离心机中离心(1000rpm离心3-5min)，吸去上清液，再加入RPMI-1640培养液(含10％FBS)的5ml，将细胞吹打混匀后种入25ml培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度的细胞孵育箱中培养，过夜培养后于倒置显微镜下观察可见细胞呈贴壁生长，吸去上清液，用PBS溶液洗涤2-3次，加入RPMI-1640培养液(含10％FBS)5ml。于倒置显微镜下观察细胞形态，适时换液。
肿瘤细胞的传代
于倒置显微镜下观察细胞形态，见细胞长满至细胞培养瓶瓶底体积的80-90％左右时即可传代，将需要传代的人肺腺癌PC9细胞置于超净台中，倒掉培养瓶中的旧培养液，用PBS溶液洗涤2-3次，用含0.025％EDTA的0.25％胰蛋白酶1-2ml消化细胞，盖好瓶盖后置于倒置显微镜下观察细胞，当细胞收回突起变圆时迅速加入少量含10％FBS的新鲜培养液，反复轻柔吹打消化好的细胞使其脱离培养瓶壁，将细胞转移至一新离心管中，于离心机中离心(1000rpm，3-5min)，这时可以看离心管底端有一层白色沉淀，即为收集到的细胞，小心吸弃上清液，再加入一定量的含10％FBS的新鲜培养基(7-10ml/大瓶，3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，轻轻吹打混匀，然后再分装到新的培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度的细胞孵育箱中培养。传代后每2-3天更换新鲜培养液，将对数生长期细胞作为实验对象。
肿瘤细胞的冻存
选择处在对数生长期的人肺腺癌PC9细胞，最好于冻存前一晚换液，然后用含0.025％EDTA的0.25％胰蛋白酶1-2ml消化细胞，于倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时迅速加入少量含10％FBS的新鲜培养液，反复轻柔吹打消化好的细胞使其脱离培养瓶壁，并分散成细胞悬液，然后将细胞转移入新的离心管中，于离心机中离心(1000rpm离心3-5min)，这时可以看离心管底端有一层白色沉淀，即为收集到的细胞，小心吸弃上清液，再加入含10％DMSO和30％胎牛血清的DMEM高糖培养基，混匀细胞后转移至2ml冻存管中，按照-4℃冰箱中放置30min，-20℃冰箱中放置2h，-80℃冰箱中过夜的顺序处理后，移入液氮罐中长期保存。
1.2.2细胞计数
将细胞计数板及盖玻片用75％的无水乙醇擦拭，晾干备用。晾干后将盖玻片覆盖在血球计数板的计算室上。取一瓶人肺腺癌PC9细胞，加入含0.025％EDTA的0.25％胰蛋白酶1-2ml，倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时迅速加入少量含10％FBS的新鲜培养液，反复轻柔吹打消化好的细胞使其脱离培养瓶壁，并分散成单细胞悬液。然后用枪头将单细胞悬液吸出少许(约200μl)，滴加在盖玻片边缘，使单细胞悬液充满盖玻片和计数板的空隙之间。于倒置显微镜下仔细观察并计算四个大方格的细胞总数，压线的细胞遵循的原则是计上不计下和计左不计右。然后按公式计算：细胞数/ml：四个大格的细胞数之和/4×104×稀释倍数。分别计数3次，取平均值。
1.2.3 cck-8检测ART对人肺腺癌PC9细胞的增殖抑制作用
将对数生长期的PC9细胞按每个孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中，每孔为100μl，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，加入ART使其终浓度分别为0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L终体积150μl，并设置调零组、阴性对照(0.1％DMSO)、空白对照组，每个浓度重复3孔。分别培养24h、48h、72h后，小心吸弃上清液，每孔加入不含FBS的RPMI-1640新鲜培养基，然后每孔加入10μl cck8溶液(尽量不要产生气泡，以免影响OD值的读数)，将96孔板置于37℃、5％CO2孵育箱中继续孵育1-4h(最好一致)后，用酶标仪检测波长490nm处的吸光度(OD)值。
细胞增殖率(％)＝[A(干预)-A(空白)]/[A(阴性)-A(空白)]×100
A(干预)：细胞+培养液+cck-8溶液+药物溶液的吸光度；
A(空白)：培养液+cck-8溶液的吸光度；
A(阴性)：细胞+培养液+cck-8溶液的吸光度；
细胞抑制率(％)＝1-细胞增殖率(％)
1.2.4 Real-time RT-PCR检测细胞内mRNA的表达
RNA的提取
选择生长状态良好的、对数生长期的PC9细胞，按5×105个细胞/瓶接种于75ml细胞培养瓶中。24h后分别加入药物处理，实验组为ART(25μM、100μM)，另外0.1％DMSO溶液为对照组。药物处理后，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞孵育箱中培养48h。将培养瓶中的旧培养液吸干净，再用预冷的PBS溶液清洗2-3遍，最后吸干净细胞培养瓶内的PBS溶液。
每瓶细胞中加入1ml Trizol，于冰上静置约3-5min，用吸管充分吹打后转移至无酶的EP管(1.5ml)中。
然后加入1/5体积的氯仿，上下颠倒混匀，后于37℃放置10min。于低温高速离心机中离心(4℃，12000g，15min)，从离心机中小心地取出EP管，离心后液体分为三层(上层为RNA，中层为DNA和底层为蛋白质)，小心吸取上层至另一新的EP管。
加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀EP管内液体，37℃放置10min。于低温高速离心机中离心(4℃，12000g，10min)，小心吸弃上清液。
缓慢地沿管壁加入75％乙醇1mL。于离心机上离心(4℃，1000g，5min)，小心吸弃上清液，将EP管内的沉淀物放置空干。
每管加入20μL DEPC溶液(视沉淀量而定)，完全溶解后，-80℃保存。然后用紫外分光光度计测定总RNA在260nm和280nm处的OD值，计算浓度和纯度。
反转录
采用大连TaKaRa反转录试剂盒进行，反应条件如下：
将上述液体混合后置于Bio Rad-PCR反应仪上进行反转录反应(37℃30min)，然后灭活反转录酶(85℃5s)。
实时荧光定量PCR
采用Bio-Rad***进行实时定量PCR检测
反应体系：总体积20μL，设置三个复孔。
扩增曲线条件：95℃30秒(预变性)→95℃5秒(40个循环)→60℃40秒(扩增反应)。
溶解曲线条件：72℃。
mRNA引物
表1 用于Real-time RT-PCR的引物
结果分析处理(相对定量法)：
A.Ct average＝(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管)；
B.dCt＝Ct average-中间值；
C.基因的表达＝2∧(-dCt)；
D.相对定量＝目的基因的表达/内参基因的表达
1.2.5 Western blot检测细胞内蛋白的表达
取实验组(ART终浓度为25μM、100μM)和对照组(0.1％DMSO溶液)处理48h后的人肺腺癌PC9细胞，吸弃旧培养液，用预冷的PBS溶液清洗2-3次，加入RIPA裂解液(混合有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)1ml充***解细胞，于冰上静置30min，将细胞轻轻刮离培养瓶壁，转移至EP管内，于低温高速离心机上离心(4℃，12000g，20min)。
取少量上清液，BCA法测定蛋白浓度。调整蛋白至同一浓度，按1:4比例加入5×上样缓冲液，煮沸5min，待彻底冷却后将样品小心加入聚丙烯酰胺凝胶的样品孔内。
电泳：进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrlamine gel electrophoresis，PAGE)转膜(湿转)：采用Bio-Rad湿转***进行转膜，经150V(按分子量大小确定转膜的时间)的转印后；用TBS洗涤3次，每次10分钟。
封闭：含5％脱脂奶粉的TBS封闭1小时。
一抗孵育：脱脂奶粉封闭后，用TBST清洗3次，10分钟/次，加入一抗，-4℃冰箱充分孵育过夜。
二抗孵育：TBST漂洗3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的特异性二抗(以1:5000比例稀释)中，放置于摇床上，常温孵育1小时。
TBST洗3次，每次10分钟。
检测：用ECL化学发光法进行检测，再进行凝胶成像仪扫描。
1.3统计学方法
每组实验重复三次，用SPSS20.0统计软件对所得实验数据进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析分析组间差异。P<0.05认为有差异，P<0.01认为有显著性差异。
2结果
2.1 ART对人肺腺癌PC9细胞数量和形态学的影响
用终浓度为25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L的ART作用于PC9细胞，48h后在光学显微镜下观察，和对照组(0.1％DMSO)相比，各用药组的细胞数量明显减少，细胞形态由短梭形逐渐变成不规则形或三角形，且随着剂量的增加，数量减少得更明显。(见图1)
2.2采用cck-8法检测ART对PC9细胞增殖能力的影响
用终浓度为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L作用于PC9细胞，24h、48h及72h后测定490nm波长的OD值，结果显示，不同浓度大小的ART对PC9细胞的增殖能力均有影响，并且有剂量依赖性，经计算48h的IC50为32.14±4.69μmol/L。(见表2及图2)
表2 青蒿琥酯对PC9细胞增殖抑制效应
组内差异＊p＜0.05:组间差异#p＜0.05
2.3 ART对肺腺癌PC9细胞中EGFR、IGF1R、AXL和AKT mRNA表达的影响
分别收集实验组(ART25μmol/L及100μmol/L)及对照组(0.1％DMSO溶液)作用48h后的PC9细胞，提取总RNA后行Real-time RT-PCR检测，通过Bio-Rad***获得细胞内EGFR、IGF1R、AXL和Akt基因的相对拷贝数。与对照组比较，实验组处理后PC9细胞内的EGFR mRNA的表达量较对照组增高，而IGF1R、AXL和Akt mRNA的表达量则有所降低，也存在剂量依赖性，剂量越高，差异越显著(P<0.01)。(见图3)
2.4 ART对肺腺癌PC9细胞EGFR、IGF1R、AXL和Akt蛋白及凋亡相关蛋白表达的影响
2.4.1 ART可下调PC9细胞AXL和Akt的磷酸化水平
分别收集实验组(ART 25μmol/L及100μmol/L)及对照组(0.1％DMSO溶液)作用48h后的PC9细胞，提取总蛋白后用Western blot检测相关蛋白EGFR、p-EGFR、IGF1R、p-IGFIR、AXL、p-AXL、Akt、p-Akt表达的变化。可见ART作用48h后PC9细胞内EGFR、p-EGFR表达量较对照组变化不明显，IGF1R、p-IGF1R、AXL、p-AXL、Akt、p-Akt蛋白的表达量较对照组均有不同程度的降低，且以磷酸化水平的表达降低更为明显。(见图4)
2.3.2 ART对PC9细胞凋亡相关蛋白的表达有影响
分别收集ART25μmol/L及100μmol/L作用48小时及0.1％DMSO对照组的细胞进行Western blot定量检测凋亡相关蛋白的表达。发现ART作用48h后Caspase-3、Activecaspase-3、PARP、Cleaved PARP的表达水平均有不同程度的上调。(见图5)
实验例2：
青蒿琥酯逆转PC9/ER细胞厄洛替尼耐药的体外实验
1材料与方法
1.1主要实验材料
1.1.1主要试剂
LY294002首先配制成20nmol/L母液(用DMSO溶解)，于-20℃冰箱长期保存，工作液按实验所需用新鲜的细胞培养液在用前进行配制。
1.2实验方法
1.2.1细胞复苏、培养、传代及冻存的实验方法同前。
1.2.2利用cck8试剂盒检测ART对PC9/ER细胞增殖能力的影响。
将对数生长期的PC9细胞和PC9/ER细胞以每孔5×103个细胞的密度，接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，加入ART使其终浓度分别为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L体积150μl，用cck8法进行检测。
1.2.3 Western blot检测细胞内EGFR、IGF1R、AXL和Akt蛋白及凋亡相关蛋白的表达变化情况
分别收集经ART单药组(10μmol/L)、ER单药组(5μmol/L)、ART联合ER组、LY294002阳性对照组、阴性对照组中处于对数生长期的PC9细胞和PC9/ER细胞，利用Western Blot实验检测ART联合ER用药对PC9细胞和PC9/ER细胞EGFR、IGF1R、AXL和Akt蛋白及凋亡相关蛋白的影响。
1.3统计学分析：
每组实验重复三次，用SPSS20.0统计软件对所得实验数据进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析分析组间差异。P<0.05认为有差异，P<0.01认为有显著性差异。
2结果
2.1采用cck-8法检测ART对PC9细胞和PC9/ER细胞增殖能力的影响
用终浓度为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L的ART分别作用于PC9细胞和PC9/ER细胞，48h后测定490nm波长的OD值，结果显示，不同浓度的ART对PC9细胞和PC9/ER细胞的增殖能力均有影响，且有剂量依赖性，药物浓度越高，抑制率越高，其中PC9细胞对ART的IC50为28.80±2.84μmol/L，PC9/ER细胞对ART的IC50为25.78±5.03μmol/L，差异没有统计学意义。(见图6和表3)
表3 PC9细胞和PC9/ER细胞对青蒿琥酯的IC50及IC10值
2.2 ART与ER联合干预对肺腺癌PC9/ER细胞增殖能力的影响
用ER单药及ART与ER联合干预分别作用于PC9/ER细胞，48h后测定490nm波长的OD值，并计算IC50。结果显示，PC9/ER细胞对ER单药的IC50为4.363μmol/L，PC9/ER细胞对ART与ER联合干预的IC50为2.488μmol/L。(见表4)
表4 PC9/ER细胞对ER单药及ART与ER联合干预的IC50值
逆转耐药倍数IC50(ER)/IC50(ER+ART)＝1.75
2.3 ART与ER联合干预对肺腺癌PC9/ER细胞IGF1R和AXL蛋白表达情况的影响
2.3.1 ART与ER联合用药可下调PC9/ER细胞IGF1R和AXL的蛋白表达及磷酸化水平情况。
分别收集ART单药组、ER单药组、ART联合ER干预组作用48小时及0.1％DMSO对照组的PC9/ER细胞，提取总蛋白后用Western blot检测IGF1R、p-IGF1R、AXL、p-AXL的表达情况。可见ART联合ER干预组IGF1R、p-IGF1R、AXL、p-AXL蛋白的表达较对照组均有不同程度的降低，且磷酸化表达水平降低更明显。(见图7)
2.3.2 ART与ER联合干预可下调PC9/ER细胞Akt的蛋白表达及磷酸化水平情况。
分别收集ER单药组、ART单药组、ART联合ER干预组、ER联合LY294002(10μmol/L)干预组、ER+ART与LY294002干预组作用48小时及0.1％DMSO对照组的PC9/ER细胞，提取总蛋白后用Western blot检测Akt和p-Akt的表达情况。可见ART单药组、ER联合ART用药组p-Akt蛋白的表达较对照组均有不同程度的降低，与PI3K抑制剂LY294002联合用药组比较无明显差异。(见图8)
2.3 ART与ER联合干预对肺腺癌PC9/ER细胞凋亡相关蛋白表达情况的影响
分别收集ER单药组、ART单药组、ART联合ER干预组作用48小时及0.1％DMSO对照组的PC9/ER细胞，提取总蛋白后用Western blot检测Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP的表达情况。可见ART联合ER干预组Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP蛋白的表达较对照组均有不同程度的上调，且磷酸化表达水平上调更明显。(见图9)
实验例3
青蒿琥酯逆转PC9/ER细胞厄洛替尼耐药的体内实验
1实验方法
1.1实验动物肿瘤模型的建立
选择对数生长期的PC9/ER细胞数瓶，然后用含0.025％EDTA的0.25％胰蛋白酶1-2ml消化细胞，于倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时迅速加入少量含10％FBS的新鲜培养液，反复轻柔吹打消化好的细胞使其脱离培养瓶壁，并分散成细胞悬液，然后将细胞转移入新的离心管中，于离心机上离心(1000rpm，5min)，将所得的白色细胞沉淀用PBS溶液清洗2-3次，用细胞计数板计数，然后用新鲜培养液(不含FBS)将细胞浓度调整为1×107/ml，在无菌条件下立即送到SPF级动物饲养室。在每只裸鼠的右侧腋窝皮下注射1×107/ml的PC9/ER细胞，每只注射0.1ml，可观察注射局部出现明显的皮丘，即为注射成功，迅速拔出针头，消毒皮肤。连续观察1周后有48只裸鼠(总共52只裸鼠，死亡4只)于右侧腋窝处出现米粒大小结节，说明裸鼠移植模型成功建立。继续培养及观察。
1.2实验分组
48只裸鼠随机分为6组，每组8只。
实验分组为：阴性对照组
ART单药组
ER单药组
ER+ART联合干预组
ER+LY294002联合干预组
ER+ART+LY294002干预组
1.3给药方法
待肿瘤平均直径达100mm3后开始灌胃治疗，每天一次，生理盐水对照组予0.5ml无菌生理盐水灌胃。
1.4抗肿瘤作用观察
给药后每2天观察裸鼠一次，主要内容为称量裸鼠体重及测量肿瘤体积，观测肿瘤体积时需要测量瘤体的长径(Length)和短径(width)，最后计算肿瘤体积(v)，v＝(length×width)/2。用药后14d，用颈部脱臼法处死其中5只荷瘤裸鼠，称体重，比较各实验组裸鼠体重的变化情况。然后将瘤体完整剥离，观察瘤体颜色、形状、包膜及周围浸润情况。每组剩余的裸鼠继续观察至自然死亡，以观察其总生存期有无差异。
1.5免疫荧光
1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复强度根据组织来确定)
3、BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
4、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
5、加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
6、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
7、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
8、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm)
9、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光
1.6统计学分析
每组实验重复三次，用SPSS20.0统计软件对所得实验数据进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析分析组间差异。P<0.05认为有差异，P<0.01认为有显著性差异。
2结果
2.1裸鼠荷瘤实验中的裸鼠及成瘤位置
于裸鼠皮下接种PC9/ER细胞，接种后约1周，可在右侧腋窝皮下摸到粟粒样大小结节，以后逐渐增大，移植成功率为98％(47/48)。
2.2裸鼠体重变化
各实验组接种PC9/ER细胞7d后，观察荷瘤裸鼠的成瘤性，待测量肿瘤平均直径达100mm3后开始灌胃治疗。每天一次，期间每2天称量一次体重，连续观察14d后统计各组裸鼠的体重，结果显示，各组裸鼠体重变化幅度大不，表明药物合用后毒性并没有明显增加。(见图10)
2.3瘤体体积变化
荷瘤裸鼠模型成功建立后，待测量肿瘤平均直径达100mm3后开始灌胃治疗。每天一次，期间每2天测量一次瘤体体积，用药14d后统一用颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离瘤体，统计14d内测量的瘤体体积，发现不同实验组中瘤体大小存在差异，各实验组瘤体体积均较对照组有所缩小。(见图11)
2.4裸鼠荷瘤实验中的瘤体组织
各实验组均于灌胃治疗14d后统一用颈椎脱臼法处死裸鼠，然后将瘤体完整剥离，可观察到各实验组中瘤体大小各异，肉眼可见荷瘤裸鼠的瘤体呈结节状，包膜大多较完整，没有向周围浸润，瘤体多呈灰白色，无出血坏死灶等表现。
2.5免疫荧光检测裸鼠瘤体组织中Akt及p-Akt的蛋白表达
荷瘤裸鼠模型成功建立后，待测量肿瘤平均直径达100mm3后开始灌胃治疗。每天一次，用药14d后统一用颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离瘤体，立即放入-80℃冰箱冰冻，利用冰冻切片的免疫荧光检测裸鼠组织中Akt及p-Akt的蛋白表达，结果表明ART单药及联合用药组体内Akt及p-Akt的蛋白水平表达相对下调。
讨论
非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型，占所有肺癌的80％左右，尽管综合治疗(手术、化疗和放疗)已经得到了发展，但非小细胞肺癌患者的5年生存率仅仅是在17％左右[22]。目前的临床研究表明，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如吉非替尼和厄洛替尼能够明显提高EGFR基因突变(如19外显子突变)癌症患者的总生存期。然而，经过一段时间(中位时间8-12个月)后大多数肿瘤都会产生EGFR-TKI耐药，EGFR-TKIs获得性耐药通常是不可避免的，这限制了其临床应用。然而，EGFR-TKIs获得性耐药的机制尚未完全清楚。
影响分子靶向治疗临床应用最主要的原因是获得性耐药，导致EGFR-TKI获得性耐药的机制有很多，除了EGFR突变和MET原癌基因扩增外，最近也发现了其他获得性耐药的机制，比如说旁路信号的激活(如c-Met、HGF、AXL)[23]、下游信号的异常(如K-RAS突变、PTEN的缺失)、EGFR-TKI介导的细胞凋亡途径(如BCL2-like11/BIM多态性缺失)和组织学转变等。因此我们应该积极寻找及开发抗瘤作用强、毒副作用小、能够逆转小分子靶向治疗耐药的药物，是国内外学者研究的方向
近年来的研究发现从中草药中提取和寻找有效的抗瘤成分已成为肿瘤治疗的希望和新途径。其中青蒿素类药物是研究的热点，有不少研究对其中的青蒿琥酯抗肿瘤的分子机制进行了探讨，目前的研究已证实青蒿琥酯对PI3K/Akt、NF-κB、MAPK、PKC、STATs等信号通路均有抑制作用，但是具体机制尚不清楚。本课题组前期的研究结果表明青蒿琥酯能以浓度和时间依赖性地抑制人肺腺癌A549细胞的生长和增殖，而且能剂量依赖性地诱导细胞凋亡。
基于以上背景，我们进一步对ART的抗肿瘤机制进行了探讨，首先采用cck-8检测不同浓度的ART处理人肺腺癌PC9细胞24h、48h、72h，结果发现ART同样能够以浓度和时间依赖性地抑制PC9细胞生长和增殖，这表明ART对肺腺癌具有细胞毒作用，其可以减缓肿瘤细胞的增殖。而qRT-PCR及Western Blot的结果发现，经ART处理后，细胞内IGF1R、AXL和AktmRNA和蛋白水平均有不同程度的下调，同时其活化形式p-IGF1R、p-AXL和p-Akt的蛋白表达下调更明显。且细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP均存在不同程度的上调，其中Active caspase-3和Cleaved PARP上调更加明显。这些结果表明ART对PC9细胞增殖能力的影响可能是通过抑制EGFR旁路信号(IGF1R、AXL)及下游信号通路(PI3K/Akt)的活化来实现的，可能与进一步诱导PC9细胞的凋亡有关。
旁路信号的激活是导致继发性耐药的重要机制之一。既往的研究显示跨膜蛋白IGF1R可以旁路激活下游的PI3K/Akt信号通路，绕过EGFR-TKI的作用靶点，使细胞达到持续增殖与抗凋亡的效果，导致EGFR-TKI治疗无效，从而产生获得性耐药[24-25]。也有研究显示AXL在细胞增殖、迁移、扩散、抗凋亡、EMT等细胞活动中都发挥着重要的作用[26]，而AXL的下游分子有很多，包括PLCγ、MMP-9、SOCS、PI3K/Akt、ERK1/2、SRC等[27-28]。Sawu等在胃癌MKN7细胞系中发现，Gas6/AXL信号途径能够启动下游PI3K/Akt信号通路，阻止细胞启动程序性死亡程序，抑制胃癌细胞凋亡[29-30]。旁路信号IGF1R和AXL共同的下游信号通路是PI3K/Akt信号通路，该信号通路是细胞存活的重要通路，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白Bad、Caspase 9、IKK、mTOR和p21Clip等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。Akt作为PI3K/Akt信号通路的枢纽，在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的预后成负相关。p-Akt作为Akt的活化形式，能促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，进而促进肿瘤的转移、血管生成。其独特的生物学功能决定了其在肿瘤中的重要作用[31]。研究还表明PI3K/Akt信号通路的过度活化可以导致EGFR-TKI耐药，抑制PI3K/Akt信号通路可以使细胞系重新获得药物敏感性[32]。
因此，我们推测，青蒿琥酯可以通过抑制EGFR旁路信号IGF1R、AXL及下游信号通路PI3K/Akt的活化使获得性耐药细胞重新对分子靶向药物敏感。为了验证我们的推测，我们通过构建PC9/ER耐药模型，模拟临床EGFR-TKIs发生获得性耐药的情况，进行改善耐药的研究。
首先我们通过大剂量厄洛替尼持续冲击PC9细胞，获得了继发性性耐厄洛替尼细胞系PC9/ER细胞，用cck-8检测耐药性，耐药倍数为11.94倍，提示成功建立耐厄洛替尼的PC9/ER细胞。然后通过Real-time RT-PCR和Western Blot发现PC9/ER细胞中存在IGF1R、AXL和Akt的过表达，结果提示PC9细胞的获得性耐药与EGFR旁路信号(如IGF1R、AXL)的激活有关，和目前的研究结果一致。
然后我们进一步研究ART对PC9/ER细胞的药理作用，cck-8的结果显示ART能同样能抑制PC9/ER细胞的增殖，且IC50与PC9细胞无明显差异，提示ART与ER之间不存在交叉耐药性。接下来我们又用cck-8法检测了ER单药和联合ART及ER对PC9/ER细胞的抑制作用，发现联合干预后PC9/ER细胞IC50更低，说明联合用药有逆转耐药的作用(逆转倍数为1.75倍)，也说明了青蒿琥酯可使PC9/ER细胞重新恢复对ER的敏感性。而Western Blot的结果表明PC9/ER细胞内的IGF1R、AXL和Akt蛋白水平均有不同程度的下调，尤其表现在其磷酸化水平上，其中联合干预组下调更加明显。而凋亡相关蛋白Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP均有不同程度的上调。在体内实验中，我们也发现ART单药及联合用药组体内IGF1R、AXL和Akt的蛋白水平表达下调，但是联合用药并没有增加其毒副作用。这些结果表明ART确实可以抑制PC9/ER细胞的增殖，且ART单药及ART和ER联合用药也许能发挥改善耐药，使PC9/ER细胞系重新获得药物敏感性的药理作用。其机制可能使通过抑制EGFR旁路信号(IGF1R、AXL)及下游信号通路(PI3K/Akt)的活化及诱导PC9/ER细胞的凋亡实现的。
综上所述，本研究发现，IGF1R、AXL及其下游信号通路(PI3K/Akt)参与了NSCLC的发生发展过程，而ART可以通过抑制IGF1R、AXL及其下游信号通路(PI3K/Akt)的活化及上调凋亡相关蛋白来发挥抗肿瘤的作用，并且也能抑制耐药细胞中IGF1R、AXL及其下游信号通路(PI3K/Akt)的活化及诱导凋亡，增强厄洛替尼的抑瘤效应，使耐厄洛替尼细胞重新对厄洛替尼敏感。本研究为青蒿琥酯成为候选抗肿瘤药物提供了新的依据，改善肺癌患者预后提供一个新的思路给肺癌患者带来了新的希望。
全文结论
1.ART能抑制人肺腺癌PC9细胞的增殖，其机制可能与诱导细胞凋亡和抑制EGFR信号通路的活化有关。
2.ART能够逆转PC9/ER的耐药，其机制可能是与抑制EGFR旁路信号通路(IGF1R、AXL)和下游信号通路(PI3K/Akt)的活化有关。

Claims (2)

1.一种青蒿琥酯的新应用，其特征在于：所述青蒿琥酯用于逆转肺腺癌厄洛替尼耐药。
2.根据权利要求1所述青蒿琥酯的新应用，其特征在于：青蒿琥酯和厄洛替尼联合用药。
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