CN105462925A - 一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2 T细胞制备方法 - Google Patents

一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2 T细胞制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2？T细胞制备方法，包括以下步骤：步骤1）：采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得人外周血单个核细胞；步骤2）：将分离的PBMCs置于含有刺激剂结核杆菌耐热性抗原，细胞因子rhIL-2和5-10%自体血浆的RPMI1640培养基中；同时加入rhIL-12、PD-1抗体对PBMCs进行培养；步骤3）：每隔2-3天根据细胞生长情况补加新鲜RPMI1640培养基；步骤4）：根据细胞生长情况，第10-16天收集细胞，即得到高毒性Vγ9Vδ2？T细胞。本发明提供了一种细胞增殖快、细胞纯度高、细胞毒性强、肿瘤杀伤能力强，且成本低廉的Vγ9Vδ2？T细胞制备方法，为其在临床上应用于肿瘤治疗药物奠定了基础。

Description

一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2 T细胞制备方法
技术领域
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体的说是一种高毒性人Vγ9Vδ2T细胞的制备方法。
背景技术
γδT细胞兼具先天免疫和获得性免疫的特性，以及其对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤作用，使其在肿瘤免疫治疗方面具有非常广泛的应用前景。近年来，以γδT细胞为基础的过继性细胞免疫治疗在临床上取得了长足的进展。γδT细胞用于肿瘤免疫治疗有两种策略：1、在体内诱导γδT细胞的激活和增殖；2、在体外激活和修饰γδT细胞，并直接回输的过继性免疫治疗。一系列的临床研究表明，过继性免疫治疗以及体内扩增Vγ9Vδ2T细胞都是安全的治疗方法，在肿瘤治疗中能够引起客观的临床反应。
然而,越来越多的研究显示，γδT细胞主要通过多种途径发挥对肿瘤的细胞毒作用,但也能够分泌IL-4、IL-10、TGF-β以及抑制T细胞增殖,从而下调抗肿瘤反应。γδT细胞存在一定程度的可塑性，不同的细胞因子和γδTCR刺激，Vγ9Vδ2T细胞能够分化成不同功能的细胞，从而发挥不同的作用。
PD-1在活化和凋亡T细胞中高表达，并能够抑制T细胞的增殖及活性，损害抗肿瘤免疫反应。目前普遍认为，肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞上的PD-1相互作用，导致肿瘤特异性T细胞凋亡，是PD-L1介导肿瘤免疫逃逸的主要机制。
γδT细胞因其在体内数量很低，其功能的多样性（包括正向和负向的抗肿瘤作用）以及因PD-1介导的肿瘤免疫逃逸而导致γδT细胞的无能限制了其在临床上的应用推广。因此，如何提高γδT细胞增殖能力，进一步提高γδT细胞的细胞毒作用和抗肿瘤作用，是目前急需要解决的问题。
发明内容
为解决现有技术的问题和缺陷，即Vγ9Vδ2T细胞存在的下调抗肿瘤反应和PD-1介导的肿瘤免疫逃逸而导致的Vγ9Vδ2T细胞无能，本发明通过优化培养方案来提高Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒作用以及肿瘤杀伤能力。目的是提供一种有效制备高毒性、高肿瘤杀伤能力的Vγ9Vδ2T细胞。
本发明采用的技术方案是：一种高毒性人Vγ9Vδ2T细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得人外周血单个核细胞（PBMCs）；
步骤2：将分离的PBMCs置于含有刺激剂结核杆菌耐热性抗原（Mtb-Hag），细胞因子rhIL-2和5-10%自体血浆的RPMI1640培养基中；同时加入5-20ng/ml的rhIL-12、0.5-10ug/ml的PD-1抗体对PBMCs进行培养。
步骤3：每隔2-3天根据细胞生长情况补加新鲜RPMI1640培养基；
步骤4：根据细胞生长情况，第10-16天收集细胞，即得到高毒性Vγ9Vδ2T细胞。
优选的，所述步骤1中，具体包括以下步骤：采集患者外周静脉血，510g，离心7分钟，吸取血浆层，56℃灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，680g，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。
优选的，所述步骤2中，初始培养的PBMCs的密度为1-2×106cell/ml。
优选的，所述步骤2中，刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为100-1000IU/ml。
优选的，所述步骤2中，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1抗体的浓度为0.5-10ug/ml。
优选的，所述步骤3中，新鲜RPMI1640培养基中含有10ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体以及500-1500IU/ml的IL-2。
优选的，所述步骤3中，控制补液后细胞的密度在1-2×106cell/ml。
优选的，所述步骤4中，所得到的Vγ9Vδ2T细胞的纯度在70%以上。
本发明的有点在于：
（1）本发明制备方法简单，成本低廉，能够快速得到大量可用于的临床的Vγ9Vδ2T细胞。（2）本发明通过采用IL-12对Vγ9Vδ2T的处理，增强了INF-γ的分泌能力，流式细胞术检测胞内INF-γ表达，结果表明INF-γ分泌能力从12.5%提高到了34.7%。
（3）本发明采用IL-12和PD-1抗体的处理，极大的提高了Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒性，且对癌细胞的杀伤能力从40.1%提高到了58.3%。
附图说明
图1为实例2培养到第11天的Vγ9Vδ2T细胞图片；
图2为实例2对Vγ9Vδ2T细胞流式检测表型分析结果；
图3为实例2对Vγ9Vδ2T细胞分泌的细胞因子的分析结果；
图4为实例2对Vγ9Vδ2T细胞肿瘤杀伤能力分析结果。
具体实施方式
下面以实例来说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
实例1
本实例1是用IL-12和PD-1抗体刺激PBMCs，以获取大量、高纯度、高细胞毒活性的Vγ9Vδ2T细胞，具体包括以下步骤：
1.无菌条件下用50ml注射器采集患者外周静脉血，聚蔗糖-泛影葡糖按密度梯度离心分离获得单个核细胞。具体步骤为：500g/分钟，离心7分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后900g/分钟，10分钟，上清血浆备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按照1:2的比例加入离心管中，680g/分钟，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为500g/分钟，410g/分钟，均离心7分钟，得到外周血单个核细胞（PBMCs）。
2.将分离的PBMCs置于含有1-10ug/ml的Mtb-Hag、100-1500IU/ml的rhIL-2和1%-10%自体血浆的RPMI1640、GT-T551或AIM-V中，并加入5-20ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体，调整细胞密度为1-2×106cell/ml。优选的刺激剂和细胞因子的浓度分别为：5ug/ml的Mtb-Hag、500IU/ml的rhIL-2和5%自体血浆，优选的rhIL-12的浓度为10ng/ml，优选的PD-1抗体的浓度为1ng/ml，细胞的初始密度为1.5×106cell/ml，转入细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养袋，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后补加含有等量浓度IL-2、PD-1抗体和rhIL-12的培养基，以后根据细胞生长状态，每2-3天补加含有等量浓度IL-2、PD-1抗体和rhIL-12的培养基，并维持补液后细胞的密度为1-2×106cell/ml。根据细胞生长状态，细胞培养的时间约为10-16天。在细胞培养的第14天，培养的Vγ9Vδ2T细胞绝对扩增细胞倍数平均高达500倍（n=10）。
实例2
本实例2是将对上述培养的Vγ9Vδ2T细胞进行形态学、纯度、免疫表型、细胞因子分泌和细胞毒活性检测。具体操作包括以下步骤：
1.细胞培养24小时即可见Vγ9Vδ2T细胞沉于培养瓶的底部，并形成小型集落，48小时后，集落变大，培养6-11天，可以看到细胞集落增大，增多，并有不规则的单核细胞。培养11天后，大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形（见附图1），用4%台盼蓝染色，显微镜计数，结果表明本发明制备的细胞其活力为97.3%（n=10）。
2.分别取第0、7、14和21天的细胞，用流式细胞缓冲液洗涤细胞2次，调整细胞密度为1×106cell/ml，每管加入50ul细胞悬液，加入荧光标记抗体（抗CD3-PerCP、抗TCRγδ-PE、抗Vδ2TCR-FITC）染色，4℃避光孵育30分钟，再加入流式细胞缓冲液洗涤2次，并用200-400ul流式细胞缓冲液重悬，流式细胞仪上机检测。本发明制备的细胞制剂，第14天，CD3+T细胞纯度高达95.2%，Vγ9Vδ2T细胞的纯度达到73.6%（n=10）。
3.取第7、14和21天培养的Vγ9Vδ2T细胞，调整细胞密度为1×106cell/ml，将细胞铺于24孔板，按照下表加入相应的试剂，37℃孵育4小时。（其中“-”为不加试剂，“+”为加试剂）
分组 空白对照组 激活对照组 阻断对照组 实验组
Iomonycin（1ug/ml） - + - +
PMA 10ng/ml - + - +
BFA 5ug/ml - - + +
将细胞从24孔板转移到1.5mlEP管中，离心收集细胞，用PBS重悬，向激活对照组、阻断对照组和实验组分别加入抗CD3-PerCP、抗Vδ2TCR-FITC，室温避光孵育30分钟。向阻断对照组和实验组加入cytofix/cytoperm，4℃孵育10分钟，加入wash/perm洗涤细胞2次，将细胞重悬于100ulPBS中，加入胞内因子荧光抗体IFN-γ-PE，室温避光孵育30分钟，流式上机检测。结果显示本发明制备的Vγ9Vδ2T细胞，其IFN-γ的分泌能力为34.7%。
4.取对数期生长的K562细胞株作为靶细胞，用PBS调整细胞密度为1-2×106cell/ml，加入calcein-AM，37度培养箱避光孵育30分钟。离心，收集细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，最后用含5%血清的1640培养基重悬，分别调整细胞密度为1×105cell/ml、5×104cell/ml、2.5×104cell/ml，各取100ul铺于96孔培养板中，培养24小时，取本发明制备的细胞（调整细胞密度为1×106cell/ml），加入96孔板培养板中，每孔加入1ml，效靶比分别为10:1，20:1，40:1，各效靶比设3个复孔，并分别设置空白对照，放置在37度培养箱中，共同培养4小时。收集细胞，用流式细胞缓冲液洗涤细胞2次，并用100ul缓冲液重悬，加入2ul的PI染色15分钟，流式上机检测细胞杀伤效率，杀伤活性计算公式为：杀伤活性（%）=PI阳性率/（calcein阳性率+PI阳性率）。结果显示本发明制备的Vγ9Vδ2T细胞对K562细胞株具有很高的杀伤活性，杀伤率平均为58.3%（n=10）。

Claims (8)

1.一种一种PD-1抗体诱导的高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，包括以下步骤：
步骤1）：采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得人外周血单个核细胞；
步骤2）：将分离的PBMCs置于含有刺激剂结核杆菌耐热性抗原，细胞因子rhIL-2和5-10%自体血浆的RPMI1640培养基中；同时加入rhIL-125-20ng/ml、PD-1抗体0.5-10ug/ml对PBMCs进行培养；
步骤3）：每隔2-3天根据细胞生长情况补加新鲜RPMI1640培养基；
步骤4）：根据细胞生长情况，第10-16天收集细胞，即得到高毒性Vγ9Vδ2T细胞。
2.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，具体包括以下步骤：采集患者外周静脉血，300-500grp，离心5-7分钟，吸取血浆层，56℃灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞分离液的离心管中，600-680grp，离心15-20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2-3次，即得到外周血单个核细胞PBMCs。
3.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2中，初始培养的PBMCs的密度为1-2×106cell/ml。
4.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2中，刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为500-1500IU/ml。
5.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤2中，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1抗体的浓度为0.5-10ug/ml。
6.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3中，新鲜RPMI1640培养基中含有5-20ng/ml的rhIL-12，0.5-10ug/ml的PD-1抗体以及500-1500IU/ml的IL-2。
7.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3中，控制补液后细胞的密度在1-2×106cell/ml。
8.根据权利1所述高毒性人Vγ9Vδ2T细胞制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所得到的Vγ9Vδ2T细胞的纯度在70%以上。
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