CN106676128A - 水稻OsWOX11蛋白及其编码基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻OsWOX11蛋白及其编码基因的应用。具体涉及一种重组表达载体，所述重组表达载体能在植物细胞中过表达WOX蛋白，优选水稻WOX11蛋白；含有所述重组表达载体的转基因细胞系或工程菌，以及所述重组表达载体或工程菌的应用。WOX基因的过量表达影响着植物组织培养中外植体产生愈伤组织的能力。本发明为植物组织培养以及品种繁殖提供了一个新的方向，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

Description

水稻OsWOX11蛋白及其编码基因的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsWOX11蛋白及其编码基因的应用。

背景技术

植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基对离体的植物器官组织细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或是完整植株的技术。其研究的类型主要包括组织培养、器官培养、细胞培养以及原生质体培养。组织培养已广泛的应用于作物育种，次生代谢物的生产，植物的快速繁殖等领域。

利用组织培养为基础的遗传转化、品种培育和快速繁殖等技术依赖于愈伤组织的形成。传统上，认为愈伤组织是一团脱分化的，无序***的细胞团。随着研究的不断深入，人们发现愈伤组织类似于一团有序的根原基，其形成更像是一个转分化的过程〔Sugimoto,K.、Jiao,Y.和Meyerowitz,E.M.，2010，Arabidopsis regeneration from multiple tissues occurs via a root developmentpathway，Dev Cell 18，463-471；Liu,J.、Sheng,L.、Xu,Y.、Li,J.、Yang,Z.、Huang,H.和Xu,L.，2014，WOX11and 12are involved in the first-step cell fatetransition during de novo root organogenesis in Arabidopsis，Plant Cell 26，1081-1093〕。植物被认为具有很强的再生能力，其成体干细胞分布在各个组织中，而愈伤组织的细胞来源就是这些潜在的成体干细胞〔Sugimoto,K.等，同上；Liu,J.等，同上〕。通过利用植物体内成体干细胞的调控机制来提高植物组织培养过程中愈伤组织发生能力是从源头上来增强愈伤组织形成能力的新方法，更加具有普适性的意义。

WOX(WUSCHEL related homeobox)是一类植物特有的转录因子，含有同源异型结构域，在植物生长发育过程中起着十分重要的作用〔van der Graaff,E.、Laux,T.和Rensing,S.A.，2009，The WUS homeobox-containing(WOX)protein family，Genome Biology 10，248〕。目前的研究表明WOX基因通常表达在干细胞龛中，并且具有维持细胞干性的功能，例如WUS，WOX5以及WOX4分别在茎顶端分生组织的OC(organize center)，根顶端分生组织的QC(quiescent center)以及形成层处表达，具有维持其周围干细胞的属性的功能。综上所述，愈伤组织起源于植物体内的干细胞，而WOX基因通常都具有维持细胞干性的功能，并且该功能在各个物种都非常的保守，这为我们的研究奠定了理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供新的植物愈伤组织的培养方式以及WOX蛋白及其编码基因在组织培养中调控愈伤组织形成中的应用。

更具体而言，本发明的目的是提供新的水稻愈伤组织的培养方式以及水稻WOX蛋白或其编码序列在组织培养中调控愈伤组织形成中的应用。

更具体而言，作为一个实施例，本发明所提供的同源异型结构域的WOX蛋白，名称为OsWOX11，来源于水稻(Oryza sativa ssp.japonica)，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

因此，本发明第一方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体能在植物细胞中过表达WOX蛋白。

在一个具体实施例中，所述重组表达载体能在植物细胞中过表达水稻WOX蛋白。

在一个具体实施例中，所述重组表达载体能在植物细胞中过表达水稻、玉米、杨树、番茄或拟南芥的WOX11蛋白。

在一个具体实施例中，所述水稻的WOX11(即OsWOX11)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在一个具体实施例中，所述重组表达载体含有SEQ ID NO:4所示的编码序列。

本发明第二方面提供一种农杆菌，所述农杆菌转入了本发明的重组表达载体。

在一个具体实施例中，所述农杆菌是根癌农杆菌。

本发明第三方面提供植物WOX蛋白或其编码序列、能过表达植物WOX蛋白的重组表达载体以及含所述重组表达载体的农杆菌在组织培养中调控(尤其是提高或增强)愈伤组织形成中的应用。

本发明第四方面提供植物WOX蛋白或其编码序列、能过表达植物WOX蛋白的重组表达载体以及含所述重组表达载体的农杆菌在形成愈伤组织中的应用。

本发明第五方面提供一种形成愈伤组织的方法，所述方法包括：

(1)将过表达植物WOX蛋白的重组表达载体转入植物中；

(2)获取过表达该WOX蛋白的植物的组织或器官；和

(3)在适于形成愈伤组织的条件下培养所述组织或器官；

从而形成愈伤组织。

本发明第六方面提供一种产生愈伤组织能力增强的植株的方法，所述方法包括：

(1)用过表达植物WOX的重组表达载体转化植株；

(2)收获该植株的繁殖材料；和

(3)使该繁殖材料再生成植株；

从而产生愈伤组织能力增强的植株。

本发明第七方面提供一种提高植物再生能力的方法，所述方法包括用过表达植物WOX的重组表达载体转化植株的步骤。

在组织培养中，将上述水稻OsWOX11基因的过表达载体转化被子植物的模式物种拟南芥(Arabidopsis thaliana Col-0)，可以得到产生愈伤组织能力增强的植株，提高了植物的再生能力。因此为植物遗传育种提供了一个优质基因，同时也对深入理解愈伤组织形成过程的分子机理，进一步利用和理解植物再生过程具有非常重要的意义。本发明的愈伤组织诱导方式，蛋白以及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

附图说明

图1显示转基因拟南芥中检测OsWOX11基因的过表达量的结果。OX1，OX2和OX3分别为三个独立转化株系。WT为非转基因野生型对照。

图2显示OsWOX11过量表达拟南芥叶片外植体生长愈伤组织的表型。材料培养于愈伤组织诱导培养基上8天。A，非转基因野生型拟南芥。B，转基因过量表达OsWOX11(pCAMBIA1300-35S:OsWOX11)拟南芥。

图3显示不同物种的WOX11家族蛋白同源结构域的序列对比图。

具体实施方式

本发明提供新的植物愈伤组织的培养方式以及WOX蛋白及其编码基因在组织培养中调控愈伤组织形成中的应用。

WOX(WUSCHEL related homeobox)是一类植物特有的转录因子，含有同源异型结构域，在植物生长发育过程中起着十分重要的作用。WOX包括WUS、WOX5、WOX4、WOX11等。

本发明尤其涉及来自水稻(Oryza sativa ssp.japonica)的WOX11，即OsWOX11。具体而言，本发明OsWOX11的氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明也包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的突变体。这些突变体包括：与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留SEQ ID NO:1的生物学活性的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。这类突变体包括来自不同物种的WOX11蛋白，例如来自玉米、杨树、番茄、拟南芥等的WOX11蛋白。优选的是，来自其它植物的WOX11家族蛋白与OsWOX11(SEQ ID NO:1)第18－85位所示的同源结构域具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上的序列相同性。更优选的是，本发明包括与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％以上的序列相同性，同时同源结构域(即WOX11蛋白的第18－85位氨基酸序列)之间的序列相同性在90％以上、优选95％以上，更优选97％以上的序列相同性的突变体。

突变体还包括：在SEQ ID NO:1所示的序列中具有一个或数个突变(***、缺失或取代)、同时仍保留SEQ ID NO:1的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸(例如前述接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点等)所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的生物学活性。

本发明包括编码WOX蛋白，尤其是OsWOX11蛋白及其突变体的多核苷酸序列。OsWOX11的编码序列例子之一如SEQ ID NO:4所示。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:4所示的编码序列相同或者是简并的变异体。“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但与SEQ ID NO:4所示的编码序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本文中，编码多肽的多核苷酸可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的多核苷酸序列杂交且两条序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳至少90％，最佳至少95％的相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明以OsWOX11为例，但来自其它植物的与OsWOX11的基因高度同源(如具有50％以上，如60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上的序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。作为例子，所示其它植物包括玉米，杨树，番茄和拟南芥。其中，玉米的WOX11(ZmWOX11)的登陆号为EU954172；杨树的WOX11包括PtrWOX11/12a，基因号：Potri.013G066900；和PtrWOX11/12b，基因号：Potri.019G040800；番茄(SlWOX11)的登陆号为XP_004242129.1；拟南芥(AtWOX11)的基因号：AT3G03660；而水稻(OsWOX11)的基因号：Os07g48560。

本发明的WOX蛋白的核苷酸全长序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。本发明的载体优选是过表达载体。

本发明中，可将编码WOX蛋白的多核苷酸序列***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码WOX蛋白的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。构建重组表达载体的方法也是本领域周知的。

本发明提供一种农杆菌，所述农杆菌转入了本发明的重组表达载体。通常，农杆菌是根癌农杆菌。转入的方法也是周知的，例如可采用电击法。

本发明提供植物WOX蛋白或其编码序列、能过表达植物WOX蛋白的重组表达载体以及含所述重组表达载体的农杆菌在组织培养中调控(尤其是提高或增强)愈伤组织形成中的应用，以及植物WOX蛋白或其编码序列、能过表达植物WOX蛋白的重组表达载体以及含所述重组表达载体的农杆菌在形成愈伤组织中的应用。

本发明提供一种形成愈伤组织的方法，所述方法包括：

(1)将过表达植物WOX蛋白的重组表达载体或含该重组表达载体的农杆菌转入植物中；

(2)获取过表达该WOX蛋白的植物的组织或器官；和

(3)在适于形成愈伤组织的条件下培养所述组织或器官；

从而形成愈伤组织。

还提供的是一种产生愈伤组织能力增强的植株的方法，所述方法包括：

(1)用过表达植物WOX的重组表达载体或含该重组表达载体的农杆菌转化植株；

(2)收获该植株的繁殖材料；和

(3)使该繁殖材料再生成植株；

从而产生愈伤组织能力增强的植株。

还提供的是一种提高植物再生能力的方法，所述方法包括用过表达植物WOX的重组表达载体或含该重组表达载体的农杆菌转化植株的步骤。

如本文所用，所述的“植物”包括农作物以及园艺植物，包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的拟南芥(Arabidopsis thaliana)，禾本科的水稻和玉米，蔷薇科的樱桃，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司提供，测序工作由上海铂尚生物科技有限公司完成。

实施例1、获取过表达OsWOX11的转基因拟南芥植株

一、OsWOX11基因过表达载体的构建

从水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu)获得OsWOX11(Os07g48560)基因的CDS序列(SEQ ID NO:4)，根据5’和3’末端序列设计一对引物，引物序列分别为F端：5’-cgcggatccATGGACGGCGGCCACAGCCCGGAC-3’(SEQ ID NO:5)，和R端5’-acgcgtcgacTCGCTCAACTCGATCAAGACG-3’(SEQ ID NO:6)。

提取水稻幼叶于诱导培养基上培养两天的总RNA(使用TRIzol，Invitrogen)抽提)，以水稻的总RNA为模板，用RevertAid Reverse反转录酶(ThermoScientific)合成cDNA(依据User Guide:RevertAid Reverse Transcriptase，ThermoScientific的用户手册进行)。以cDNA为模板，PCR扩增水稻的OsWOX11基因的全长CDS序列。PCR反应体系包含(50μl)：模板0.5μl，高保真酶KODplus(TOYOBO)1μl，10×缓冲液5μl，2.5μM dNTP 5μl，25mM MgSO₄5μl，10μl的5’和3’引物各2.5μl，水28.5μl。反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环。反应结束后，将PCR产物进行0.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约800bp的扩增片段，使用BamHI酶和SalI酶切回收后将其连接到载体pCAMBIA1300-35S载体上(由pCAMBIA1300改造而来)，形成OsWOX11基因过表达载体pCAMBIA1300-35S:OsWOX11。

二、过表达OsWOX11在拟南芥中的表达检测

将构建好的OsWOX11基因过表达载体(即pCAMBIA1300-35S:OsWOX11)，使用电击法转化农杆菌GV3101，再使用常规的浸花法转化拟南芥。待拟南芥种子成熟后，收取种子，干燥，使用75％的乙醇灭菌20分钟，均匀播撒种子于含潮霉素(25mg/L)的1/2MS培养基上，其中1/2MS培养基配制方法为：MS(购自phytoTechology Laboratories)2.2g/L；蔗糖10g/l；MES(购自上海双向西巴斯公司)0.5g/L；Agar 1％(pH 5.8)。大约3周后得到转化苗，将转化苗移栽至土壤中，并剪取叶片，使用前述方法提取RNA并进行反转录，以所得到的cDNA为模版进行实时荧光定量PCR检测，PCR体系(20μl)为：模板0.5μl，无菌水7.9μl，OsWOX11的F端定量引物：5’-ATCTCCTCCGACTGCTTCGTC-3’(SEQ ID NO:7)0.8μl，和R端定量引物5’-CTCGAGATGGCGAACAGGTC-3’(SEQ ID NO:8)0.8μl，SybrgreenPCR Mix 10μl。反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。实时荧光定量结果如如图1所示，结果显示在拟南芥叶片中出现了OsWOX11的高表达。

实施例2、过表达OsWOX11在拟南芥中的表型鉴定

待转基因拟南芥结子后，收取种子，干燥，于1/2MS培养基上培养12天后，以叶片为外植体在愈伤组织诱导培养基及CIM培养基配制方法为：B5(购自phytoTechology Laboratories)3.21g/L；MES 0.5g/L；蔗糖20-40g/L；2,4-D(购自SIGMA)2.2μM；Kinetin(购自SIGMA)0.2μM；Agar 0.8％(pH 5.8)上诱导7天，结果如图2所示。与野生型相比，转基因拟南芥形成愈伤组织的能力明显增强。

Claims (10)

1.一种重组表达载体，所述重组表达载体能在植物细胞中过表达WOX蛋白，优选水稻、玉米、杨树、番茄和拟南芥的WOX11蛋白。

2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，

所述水稻WOX11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；或

所述重组表达载体含有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

3.一种转基因细胞系或工程菌，所述转基因细胞系或农杆菌转入权利要求1－2中任一项所述的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的转基因细胞系或工程菌，其特征在于，所述转基因细胞系为植物细胞或动物细胞，所述工程菌为农杆菌，优选为根癌农杆菌。

5.植物WOX蛋白或其编码序列、能过表达植物WOX蛋白的重组表达载体以及含所述重组表达载体的农杆菌在组织培养中调控愈伤组织形成中的应用，或在形成愈伤组织中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体如权利要求1－2中任一项所述。

7.一种形成愈伤组织的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将过表达植物WOX蛋白的重组表达载体或转入了该重组表达载体的农杆菌转入植物中；

(2)获取过表达该WOX蛋白的植物的组织或器官；和

(3)在适于形成愈伤组织的条件下培养所述组织或器官；

从而形成愈伤组织。

8.一种产生愈伤组织能力增强的植株的方法，所述方法包括：

(1)用过表达植物WOX的重组表达载体或转入了该重组表达载体的农杆菌转化植株；

(2)收获该植株的繁殖材料；和

(3)使该繁殖材料再生成植株；

从而产生愈伤组织能力增强的植株。

9.一种提高植物再生能力的方法，所述方法包括用过表达植物WOX的重组表达载体转化植株的步骤。

10.如权利要求7－9中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物选自：十字花科、禾本科和蔷薇科植物，包括拟南芥、水稻、玉米、樱桃、烟草、瓜果、蔬菜和油菜。