CN115851755A - 一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明以蒙农杂种冰草分蘖节RNA为材料，采用ORF全长克隆的方法，获得蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子LAZY1或WOX基因的全长序列。构建植物过量表达载体pCAMBIA1300‑UBI，利用农杆菌介导法将pCAMBIA1300‑UBI转入受体材料水稻中，过量表达LAZY1的转基因水稻植株表现出分蘖角度变大的现象。因此本发明提供的调控基因，可以参与植物分蘖角度的调控，可以在植物基因工程中，改良植物的株型，加快高产密植品种选育进程。

Description

一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子WOX11基因和LAZY1基因的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

植物的分蘖角度的调控是一个复杂的生物学过程，受到环境因素，如温度、光照、养分和非环境因素，如激素以及遗传基因等多种因素的共同调控，在构建植物理想株型方面具有重要的意义。在禾本科植物中，如水稻等禾谷类作物中，分蘖数的多少和分蘖角度的大小与作物的产量有着直接的关系。

转录因子(Transcription factor，TF)是一类可以调控基因表达的反式作用因子。相对于功能基因而言，单个转录因子往往可以同时调控多个功能基因的表达。因此，分析和鉴定转录因子的基因功能就显得非常有意义。通过转基因技术，将可以同时调控多个功能基因的转录因子转化植物有望实现快速培育综合性状优良的新品种。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的应用。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子，所述的蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子为WOX11基因或LAZY1基因，其核苷酸序列如SEQ_NO.1、SEQ_NO.2所示。

一种含有上述蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体。

进一步的，所述蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体为pCAMBIA1300-UBI。

一种上述蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子在植物选育中的应用。

进一步的，所述的应用，包括以下步骤：

1)构建蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体；

2)将所构建的蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到分蘖角度有差异的转基因植物。

进一步的，所述载体pCAMBIA1300-UBI中用潮霉素作为转基因植物的筛选标记，或用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。

进一步的，所述植物为禾本科植物，更进一步的，所述植物为水稻。

进一步的，所述应用包括改良植物的株型，更进一步的，调控植物分蘖角度。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明公开了一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明以蒙农杂种冰草分蘖节RNA为材料，采用ORF全长克隆的方法，获得蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子WOX11基因、LAZY1基因的全长序列，如SEQ_WOX11与SEQ_LAZY1所示。构建植物过量表达载体pCAMBIA1300-UBI，利用农杆菌介导法将pCAMBIA1300-UBI转入受体材料水稻中，过量表达WOX11或LAZY1的转基因水稻植株表现出分蘖角度变大的现象。因此本发明提供的调控基因，可以参与植物分蘖角度的调控，可以在植物基因工程中，改良植物的株型，加快高产密植品种选育进程。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图１为植物表达载体pCAMBIA1300-UBI结构图；

图２为过量表达LAZY1基因的转基因水稻分蘖角度表型图；

图３为过量表达WOX11基因的转基因水稻分蘖角度表型图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本申请所用材料为蒙农杂种冰草分蘖节，于2019年12月，采自内蒙古农业大学温室内。

实施例1：WOX11基因ORF全长的克隆

基于蒙农杂种冰草分蘖节转录组测序结果，设计特异引物扩增WOX11基因的开放阅读框(ORF)全长序列。

(1)ORF序列扩增：基于蒙农杂种冰草分蘖节转录组测序结果，设计特异引物扩增WOX11基因的开放阅读框(ORF)全长序列，ORF特异性引物包括：WOX11正向引物：5′-TAGCTCGTCTGCTAGCTCG -3′(SEQ_NO.3)和WOX11反向引物：5′- CATTAATTTGACCTCGCG -3′(SEQ_NO.4)。采用Trizol法进行蒙农杂种冰草分蘖节RNA提取，通过Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA第一链的合成。利用KOD FX Neo(1U/ul)酶对WOX11基因的ORF序列进行扩增，PCR反应扩增程序：98℃5min；98℃10s；55℃30s；72℃2min(35个循环)；72℃10min。PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，凝胶成像***进行拍照和切胶，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行扩增片段回收，再将新鲜的回收产物进行T4克隆载体连接和大肠杆菌感受态细胞的转化，最后将菌液PCR检测的阳性菌液送至生工生物工程有限公司测序。

(2)根据测序峰图，进行序列拼接，去除载体序列之后，在NCBI上进行比对，进一步确定最终结果，如SEQ_NO.1所示。

实施例2：WOX11基因植物表达载体的构建与遗传转化

构建WOX11基因的过量表达载体。使用特异性PCR引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将WOX11基因开放阅读框序列构建到载体pCAMBIA1300-UBI。从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证,通过PCR检测及测序验证后，确认过量表达载体构建成功，命名为pCAMBIA1300-UBI (图１)，该基因位于启动子UBI之后，在启动子UBI的驱动下，pCAMBIA1300可在受体植株内高效表达。

构建载体具体方法为：

①扩增目的基因片段

根据目的基因序列设计特异性引物

以E.coli DH5α(pGEM-T-easy-目的基因)为模板，建立如下的PCR反应体系扩增预表达的目的基因片段；

Pre mixtaq 25uL

上游引物 1uL

下游引物 1uL

pGEM-T-easy-目的基因 1uL

水 22uL

总体积 50uL

其PCR反应条件为：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃60 s，共35个循环；72℃延伸10 min。

将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用E.N.Z.A DNA胶回收试剂盒回收目的片段，以KpnI/BamHI进行双酶切，反应体系如下：

10×Buffer 5uL

PCR产物 35uL

水 5uL

KpnI 2.5uL

BamHI 2.5uL

总体积 50uL

37℃孵育3 h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段。

②过表达载体的酶切制备

挑取一DH5a(pCAMBIA1300-UBI)新鲜培养的菌落接种于10 mL LB液体培养基(含50μg/mL卡纳素)，37℃振荡培养12 h；用E.Z.N.A.小量质粒制备试剂盒抽提质粒pCAMBIA1300-UBI；以KpnI/BamHI进行双酶切，反应体系如表4-3：37℃孵育3h后，将样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，100V电泳1 h。用E.Z.N.A.DNA胶回收试剂盒回收酶切后的质粒。

10×Buffer 5uL

pCAMBIA1300-UBI载体 35uL

水 5uL

KpnI 2.5uL

BamHI 2.5uL

总体积 50uL

③酶切后载体与酶切后目的基因基因的连接

建立如下连接反应，16℃过夜连接。

10×DNA 连接buffer 1uL

酶切后pCAMBIA1300-UBI载体 2uL

酶切后目的基因片段 6uL

T4 DNA ligase 1uL

总体积 10uL

④用CaCl2法将连接产物转化入E.coli DH5α

⑤转化克隆的PCR鉴定

挑取一些菌落分别接种于10 mL LB培养基中(含50μg/mL卡纳青霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下PCR反应筛选阳性克隆。

Pre mixtaq 25uL

上游引物 1uL

下游引物 1uL

模板 1uL

水 22uL

总体积 50uL

PCR程序：同①程序进行。

取PCR反应产物10μL，进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察结果。

取经PCR反应鉴定为阳性的克隆的培养物送测序公司进行重组质粒的序列测定，分析重组质粒中外源基因的阅读框架是否改变。测序引物为

UBI(正向通用引物):5’- ACACCCTCTTTCCCCAAC-3’，如SEQ_NO.5所示。

E9 TER R(反向通用引物):5’- GCAATGAAACTGATGCATTG-3’，如SEQ_NO.6所示。

通过液氮冻融法将所构建的pCAMBIA1300-UBI过量表达载体转入农杆菌EHA105菌株，通过农杆菌介导的遗传转化法将基因转入水稻。过量表达WOX11基因的转基因水稻植株表现出分蘖角度变大的现象(图3)。说明WOX11基因是水稻分蘖角度的关键调节因子，在禾本科植物基因工程研究中有重要应用价值。

实施例3：LAZY1基因ORF全长的克隆

基于蒙农杂种冰草分蘖节转录组测序结果，设计特异引物扩增LAZY1基因的开放阅读框(ORF)全长序列。

(1)ORF序列扩增：基于蒙农杂种冰草分蘖节转录组测序结果，设计特异引物扩增LAZY1基因的开放阅读框(ORF)全长序列，ORF特异性引物包括：LAZY1正向引物：5′-GCCTCTTCAAGATGACGC -3′(SEQ_NO.7)和LAZY1反向引物：5′- CTTCCAGTTCATCCGTAC -3′(SEQ_NO.8)。采用Trizol法进行蒙农杂种冰草分蘖节RNA提取，通过Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA第一链的合成。利用KOD FX Neo(1U/ul)酶对LAZY1基因的ORF序列进行扩增，PCR反应扩增程序：98℃5min；98℃10s；55℃30s；72℃2min(35个循环)；72℃10min。PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，凝胶成像***进行拍照和切胶，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行扩增片段回收，再将新鲜的回收产物进行T4克隆载体连接和大肠杆菌感受态细胞的转化，最后将菌液PCR检测的阳性菌液送至生工生物工程有限公司测序。

(2)根据测序峰图，进行序列拼接，去除载体序列之后，在NCBI上进行比对，进一步确定最终结果，如SEQ_NO.2所示。

实施例4：LAZY1基因植物表达载体的构建与遗传转化

构建LAZY1基因的过量表达载体。使用特异PCR引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将LAZY1基因开放阅读框序列构建到载体pCAMBIA1300-UBI。从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证,通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pCAMBIA1300-UBI (图１)，该基因位于启动子UBI之后，在启动子UBI的驱动下，pCAMBIA1300可在受体植株内高效表达。

构建载体具体方法为：

①扩增目的基因片段

根据目的基因序列设计特异性引物

以E.coli DH5α(pGEM-T-easy-目的基因)为模板，建立如下的PCR反应体系扩增预表达的目的基因片段；

Pre mixtaq 25uL

上游引物 1uL

下游引物 1uL

pGEM-T-easy-目的基因 1uL

水 22uL

总体积 50uL

其PCR反应条件为：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃60 s，共35个循环；72℃延伸10 min。

将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用E.N.Z.A DNA胶回收试剂盒回收目的片段，以KpnI/BamHI进行双酶切，反应体系如下：

10×Buffer 5uL

PCR产物 35uL

水 5uL

KpnI 2.5uL

BamHI 2.5uL

总体积 50uL

37℃孵育3 h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段。

②过表达载体的酶切制备

挑取一DH5a(pCAMBIA1300-UBI)新鲜培养的菌落接种于10 mL LB液体培养基(含50μg/mL卡纳素)，37℃振荡培养12 h；用E.Z.N.A.小量质粒制备试剂盒抽提质粒pCAMBIA1300-UBI；以KpnI/BamHI进行双酶切，反应体系如表4-3：37℃孵育3h后，将样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，100V电泳1 h。用E.Z.N.A.DNA胶回收试剂盒回收酶切后的质粒。

10×Buffer 5uL

pCAMBIA1300-UBI载体 35uL

水 5uL

KpnI 2.5uL

BamHI 2.5uL

总体积 50uL

③酶切后载体与酶切后目的基因基因的连接

建立如下连接反应，16℃过夜连接。

10×DNA 连接buffer 1uL

酶切后pCAMBIA1300-UBI载体 2uL

酶切后目的基因片段 6uL

T4 DNA ligase 1uL

总体积 10uL

④用CaCl2法将连接产物转化入E.coli DH5α

⑤转化克隆的PCR鉴定

挑取一些菌落分别接种于10 mL LB培养基中(含50μg/mL卡纳青霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下PCR反应筛选阳性克隆。

Pre mixtaq 25uL

上游引物 1uL

下游引物 1uL

模板 1uL

水 22uL

总体积 50uL

PCR程序：同①程序进行。

取PCR反应产物10μL，进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察结果。

取经PCR反应鉴定为阳性的克隆的培养物送测序公司进行重组质粒的序列测定，分析重组质粒中外源基因的阅读框架是否改变。测序引物为

UBI(正向通用引物):5’- ACACCCTCTTTCCCCAAC-3’

E9 TER R(反向通用引物):5’- GCAATGAAACTGATGCATTG-3’

通过液氮冻融法将所构建的pCAMBIA1300-UBI过量表达载体转入农杆菌EHA105菌株，通过农杆菌介导的遗传转化法将基因转入水稻。过量表达LAZY1基因的转基因水稻植株表现出分蘖角度变大的现象(图2)。说明LAZY1基因是水稻分蘖角度的关键调节因子，在禾本科植物基因工程研究中有重要应用价值。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子，其特征在于，所述的蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子为WOX11基因或LAZY1基因，其核苷酸序列如SEQ_NO.1、SEQ_NO.2所示。

2.一种含有权利要求1所述蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体。

3.根据权利要求2所述的植物过表达载体，其特征在于，所述植物过表达载体为pCAMBIA1300-UBI。

4.根据权利要求2所述的植物过表达载体，其特征在于，所述植物过表达载体用潮霉素作为转基因植物的筛选标记，或用卡纳青霉素进行转基因植株的筛选。

5.一种权利要求1所述蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子在植物选育中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体；

2)将所构建的蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子的植物过表达载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到分蘖角度有差异的转基因植物。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括改良植物的株型。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用具体为调控植物分蘖角度。

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