CN106635845B - 一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉菌株 - Google Patents

一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉突变菌株。所述突变菌株能显著提高脯氨酸蛋白酶的产量，在摇瓶发酵条件下其脯氨酸蛋白酶活力达到65.2u/ml，比出发菌的发酵酶活提高了84.2%，取得了意料不到的技术效果。从而有利于降低脯氨酸蛋白酶的生产成本，促进该酶的广泛应用。

Description

一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉菌株
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉突变菌株及其应用。
技术背景
脯氨酸蛋白酶（prolyl endoprotease, PEP）是一类高效水解蛋白质或者多肽中脯氨酸羧基端肽键的蛋白酶。它能有效降解生物体内富含脯氨酸的生物活性肽，如催产素、促甲状腺激素释放素等，这些活性肽含量的高低与PEP的活性升降有关。在食品与发酵工业, 脯氨酸内肽酶可能是一种有价值的酶类,如能通过水解啤酒中富含脯氨酸的蛋白多肽, 阻止其与多酚类物质形成大聚合物浑浊沉淀，从而提高啤酒的非生物稳定性。2005年，Enens等证明了该酶在蛋白水解物中的去苦味作用。此外，鉴于PEP的特异性，该酶还有可能作为一种分子生物学的工具酶，用于蛋白质序列测定、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等。
报道表明，已经多种物种和组织来源的脯氨酸蛋白酶，既存在于细菌、真菌中，也存在于植物以及动物组织中。不同来源的脯氨酸蛋白酶在底物特异性、热稳定性、最适pH、有机溶剂抗性和盐离子的抗性方面表现出较大的差别。
脯氨酸蛋白酶最早在人子宫的匀浆液中被发现。以后，又陆续在脑膜炎黄杆菌、荚膜鞘氨醇单胞菌、猪的大脑和人的T淋巴细胞中发现脯氨酸蛋白酶。随后相继有克隆和异源表达脯氨酸蛋白酶的报道。
微生物产脯氨酸内肽酶的研究始于1978年，Yoshimoto和Walter等首先通过对500多个微生物的筛选试验中，发现仅在黄杆菌属中发现了类似PEP活性的蛋白酶，并在1980年提纯到该酶，对其性质进行了描述，发现其为一种胞外的蛋白酶。Kanatani等分离得到一株具有产PEP能力的菌株，分类学分析显示该菌株为气单胞菌属，其氨基酸序列和黄杆菌属以及猪来源的PEP同源性分别为56%和41%。2002年，Capiralla等从极端嗜盐微生物盐生盐杆菌分离纯化得到疏水氨基酸特异性内肽酶，并对其性质进行了研究，同时指出他们在蛋白质水解产物中脱苦味的潜在应用。该研究应用肽类底物特异性显示了次末端含有脯氨酸的肽类以及偏好水解羧基末端疏水性氨基酸的肽类有更高的特异性。Szwajcer-Dey等学者筛出一株生产PEP菌株黄单胞菌（Xanthomonas sp.）。Kanatani等筛选获得一株生产PEP的菌株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilic）。日本学者Oyama等研究了产PEP的菌株，分类学命名为假单胞菌（Pseudomonas sp. KU-22）。
脯氨酸蛋白酶是一类可以特异性水解位于多肽内脯氨酸残基的羧基端肽键的裂解酶，尽管目前已有部分的细菌源、真菌源和植物源的脯氨酸内肽酶被发现，但野生型生产菌株存在一定局限性，利用传统育种等手段很难提高其产量，因此亟需利用分子生物学手段筛选出高产脯氨酸蛋白酶菌株以满足市场需求。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉突变菌株。所述突变菌株是通过紫外诱变的方法筛选到的，能大幅提高脯氨酸蛋白酶的产量，有利于脯氨酸蛋白酶的广泛应用。
本发明一方面提供了一种黑曲霉重组菌株，其携带有编码序列为SEQ ID NO：4的脯氨酸蛋白酶基因。
本发明另一方面涉及一种突变菌株，是将上述黑曲霉重组菌株进行紫外诱变筛选到的，命名为黑曲霉Su-F13（Aspergillus niger Su-F13），已于2016年11月30日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016698。
本发明还涉及所述黑曲霉突变菌株在脯氨酸蛋白酶生产中的应用。
本发明通过诱变获得的黑曲霉突变菌株Su-F13能显著提高脯氨酸蛋白酶的产量，在摇瓶发酵条件下其脯氨酸蛋白酶活力达到65.2u/ml，比出发菌黑曲霉Su-F2的发酵酶活提高了84.2%，取得了意料不到的技术效果。从而有利于降低脯氨酸蛋白酶的生产成本，促进该酶的广泛应用。
附图说明
图1为质粒pSU图谱；
图2为脯氨酸蛋白酶F1及其突变体F2最适反应温度对比；
图3为脯氨酸蛋白酶F1及其突变体F2最适反应pH对比。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1脯氨酸蛋白酶基因的获得
提取本实验室保存的一株黑曲霉（Aspergillus niger）Su2-1的基因组。利用下述引物F和引物R进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。将扩增产物进行琼脂糖电泳，结果显示扩增获得的基因片段大小为2100bp。
引物F：ATGCGTTCCTTCTCCGCTGTCG
引物R：TCAAGCATAATACTCCTCCACC
将获得的基因片段送上海生工生物工程股份有限公司完成测序。测序结果显示该基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。通过NCBIBLAST比对发现，该基因编码的蛋白为脯氨酸蛋白酶，命名为F1。
实施例2脯氨酸蛋白酶突变体的获得
申请人为了提高上述脯氨酸蛋白酶F1的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
以F1基因为模板，以引物F和引物R用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃ 220rpm培养6 h左右，离心弃上清，将菌体用pH5.5的缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有脯氨酸蛋白酶F1的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30µl裂解液至两块新的96孔板，其中一块于50℃处理10min后，稀释到pH5.5的缓冲液中，另一块不处理，稀释到pH5.5的缓冲液中，分别测定其酶活。
结果发现，不同的突变子经过高温处理后保持的酶活性不同，有些突变对脯氨酸蛋白酶的活性没有影响，有些突变甚至使其活性降低了，对依然保持高活性的突变子进行DNA测序。最终，申请人获得了能显著提高脯氨酸蛋白酶F1耐热性的三点突变体：G101E，V146I和R441W。
将上述含G101E，V146I和R441W三点突变的脯氨酸蛋白酶突变体命名为F2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
将上述脯氨酸蛋白酶突变体基因分别用引物F、R进行PCR扩增，引物两端引入EcoRI、Not I位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸120s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述脯氨酸蛋白酶突变体F2的基因大小约为2100bp。
实施例3重组表达载体的构建
将脯氨酸蛋白酶F1及其突变体F2基因分别通过XbaI连接到表达载体pSU（图1）中，构建得到表达载体pSU-F1、pSU-F2。
原生质体制备：接种宿主菌黑曲霉Su2-1于PDA+U平板，30℃培养5-7d。割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U培养基中，30℃培养24h生长菌丝体，用于转化。将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬，加入0.2g溶菌酶。30℃、100rpm培养2-3h。将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体。
转化：原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108。200ul原生质体中加入10ul准备好的质粒，加入50ul 25%的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25%的PEG6000室温放置5min，加入4ml 山梨醇溶液颠倒混匀。倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。
转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液。通过对粗酶液进行蛋白电泳检测，筛选出有明显蛋白条带表达的转化子。
申请人将筛选到的其中一个重组表达脯氨酸蛋白酶F1的阳性转化子命名为黑曲霉Su-F1（Aspergillus niger Su-F1）,一个重组表达脯氨酸蛋白酶突变体F2的阳性转化子命名为黑曲霉Su-F2（Aspergillus niger Su-F2）。
将黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2的发酵上清液进行脯氨酸蛋白酶酶活检测，同时以黑曲霉宿主菌发酵上清液做对照。结果表明：黑曲霉宿主菌的发酵上清液酶活仅为3.2 U/ml，而黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2的发酵上清液酶活分别为30.5u/ml、35.4u/ml。从而进一步说明，本发明构建的重组菌黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2能分别重组表达脯氨酸蛋白酶F1和及其突变体F2。
酶活测定方法
（1）脯氨酸蛋白酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.0的条件下，每分钟分解Z-GLY-Pro-pNA释放1 μmolpNA的酶量，定义为一个酶活力单位U。
（2）酶活测定方法
试剂：磷酸氢二钠（0.2mol/L）-柠檬酸（0.1mol/L）缓冲液 pH5.0
Z-GLY-Pro-pNA溶液（5mmol/L）
取1 ml浓度为5mmol/L的Z-GLY-Pro-pNA溶液于10 ml磷酸-柠檬酸缓冲液中混匀，测样前10 min配制，可使用4h。
在试管中加入1.1 ml上述底物混合液；
将试管在37℃的水浴锅中预热15 min；
将比色皿（0.5 cm）放置在比色皿架上，比色皿架的温控调整到37℃，分光光度计调节至410 nm测定吸光度；
吸取0.1 ml稀释的酶液，加入至含底物混合液的试管中，加入酶液时开始计时，涡旋混匀后倒于比色皿中；
将比色皿置于比色皿架上后，读取30 s的数据；
酶液反应时如出现吸光值下降后并上升的趋势，则记录下降至谷底的吸光值及时间，并延续记录10 min后数据；
如不出现吸光值下降的情况，可直接记录反应前后410 nm处的吸光值，反应时间为10 min。
通过ΔA410计算脯氨酸蛋白酶酶活：
U=(ΔA410×V×1000×1000×N)/(T×γ×ν×β)
ΔA410：吸光值变化；
T：反应时间（10 min）；
V：反应体系体积（1.2 ml）；
1000×1000：将mol换算成μmol；
γ：摩尔消光系数（cm2/mol）8800；
β：比色杯光程（0.5 cm）；
ν：样品量（0.1 ml）；
N：稀释倍数；
实施例4 酶学性质分析
1、最适反应温度测定
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0条件下测定实施例3获得的重组菌株黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2发酵粗酶液的脯氨酸蛋白酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，脯氨酸蛋白酶F1的最适反应温度为45℃，而脯氨酸蛋白酶突变体F2的最适反应温度为55℃，且在45-60℃范围内均能保持80%以上的酶活，耐温性得到显著提高。
2、最适反应pH测定
采用pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的缓冲液，将实施例3获得的重组菌株黑曲霉Su-F1和黑曲霉Su-F2发酵粗酶液进行稀释测定，在37℃下进行脯氨酸蛋白酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，脯氨酸蛋白酶F1的最适反应pH值为4.0，而脯氨酸蛋白酶突变体F2的最适反应pH值也为4.0，没有明显变化。
实施例5 诱变筛选
确定致死率：接种上述黑曲霉工程菌Su-F2于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面变黑，产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×107），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95%，选取该照射时间进行后续诱变实验。
诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×107），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。
共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体，挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变体128个接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测及脯氨酸蛋白酶活力检测，筛选出脯氨酸蛋白酶产量明显提高的突变体。
最终申请人获得一株脯氨酸蛋白酶产量最高的突变菌株，命名为黑曲霉Su-F13（Aspergillus niger Su-F13），在摇瓶发酵条件下其脯氨酸蛋白酶活力达到65.2u/ml，比出发菌黑曲霉Su-F2的发酵酶活提高了84.2%，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2016年11月30日将上述突变菌株黑曲霉Su-F13（Aspergillus nigerSu-F13）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016698。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
潍坊康地恩生物科技有限公司
<120> 一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉菌株
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 526
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Met Arg Ser Phe Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ser Trp
1 5 10 15
Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Val
20 25 30
Pro Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Asn
35 40 45
Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Asp Lys Gly Thr Phe Ser
50 55 60
Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro
65 70 75 80
Val Val Leu Phe Thr Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly
85 90 95
Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln
100 105 110
Gly Ala Val Ile Ile Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro
115 120 125
Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln
130 135 140
Ala Val Leu Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe
145 150 155 160
Asp Asn Ser Thr Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val
165 170 175
Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Val Ala
180 185 190
Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala
195 200 205
Ile Tyr Asp Phe Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala
210 215 220
Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys
225 230 235 240
Val Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu
245 250 255
Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Phe Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu
260 265 270
Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Ala Thr Gly Tyr
275 280 285
Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly
290 295 300
Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu
305 310 315 320
Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asp Tyr Cys
325 330 335
Ala Gly Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp
340 345 350
Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Tyr Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn
355 360 365
Pro Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe
370 375 380
Tyr Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg
385 390 395 400
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450 455 460
Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ser Thr Ala Asn
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Met Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Lys Lys Val Val Asp Asn
500 505 510
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ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg 240
gttgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat 300
gggactctca ctggtgttta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattat cattgagcac 360
cgctactggg gtgattcttc gccttatgag gtactcaatg ccgaaactct tcagtatctt 420
acattggacc aagccgttct ggacctgacc tacttcgccg agacggtgaa actgcaattc 480
gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac 540
agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600
gccactagtg ctcctgtgga ggctatctat gacttttggc aatacttcta ccccatccag 660
caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720
gttggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggcttggga 780
gctgttgagc atttcgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcag 840
gacaacgact ttgccacagg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900
gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960
gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aggctacggc 1020
tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccctatc 1080
tacaccgata catccgtcgg caatcccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctttgcaac 1140
gagcctttct tctactggca agacggtgct cccgagggta cctccaccat tgtgccccgg 1200
ctcgtcagcg cctcctactg gcaacgccaa tgctcgctct acttccccga aacgaacggc 1260
tacacgtacg gtagcgcgaa gggtaagaac tctgccacgg tgaacagctg gaccggtggg 1320
cgggacatga cccgcaacac gacgcggttg atctggacga atgggcaata cgacccctgg 1380
cgcgactccg gtgtgtcgag cactttccgg cctggtggac cgctggcgag cacggcgaat 1440
gaacccgtgc aggttattcc gggcggattc cattgctccg atttgtatat ggcagattat 1500
tatgcgaacg agggggtaaa aaaggtggta gataatgagg tgaagcagat taaggagtgg 1560
gtggaggagt attatgcttg a 1581
<210> 3
<211> 526
<212> PRT
<213> 3
<400> 3
Met Arg Ser Phe Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ser Trp
1 5 10 15
Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Val
20 25 30
Pro Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Asn
35 40 45
Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Asp Lys Gly Thr Phe Ser
50 55 60
Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro
65 70 75 80
Val Val Leu Phe Thr Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly
85 90 95
Tyr Leu Thr Asn Glu Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln
100 105 110
Gly Ala Val Ile Ile Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro
115 120 125
Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln
130 135 140
Ala Ile Leu Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe
145 150 155 160
Asp Asn Ser Thr Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val
165 170 175
Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Val Ala
180 185 190
Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala
195 200 205
Ile Tyr Asp Phe Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala
210 215 220
Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys
225 230 235 240
Val Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu
245 250 255
Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Phe Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu
260 265 270
Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Ala Thr Gly Tyr
275 280 285
Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly
290 295 300
Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu
305 310 315 320
Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asp Tyr Cys
325 330 335
Ala Gly Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp
340 345 350
Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Tyr Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn
355 360 365
Pro Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe
370 375 380
Tyr Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg
385 390 395 400
Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Ser Leu Tyr Phe Pro
405 410 415
Glu Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ser Ala
420 425 430
Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr
435 440 445
Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly
450 455 460
Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ser Thr Ala Asn
465 470 475 480
Glu Pro Val Gln Val Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr
485 490 495
Met Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Lys Lys Val Val Asp Asn
500 505 510
Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala
515 520 525
<210> 4
<211> 1581
<212> DNA
<213> 4
<400> 4
atgcgttcct tctccgctgt cgctgccgca gccctggcgc tctcttgggc gtctctggct 60
caggctgctc gccctcgtct tgtgcccaag cctgtccctc ggccagcttc gagtaaatcg 120
gctgcgacca caggcgaggc taactttgag cagttgctgg accatcataa tccagacaag 180
ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg 240
gttgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat 300
gagactctca ctggtgttta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattat cattgagcac 360
cgctactggg gtgattcttc gccttatgag gtactcaatg ccgaaactct tcagtatctt 420
acattggacc aagccattct ggacctgacc tacttcgccg agacggtgaa actgcaattc 480
gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac 540
agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600
gccactagtg ctcctgtgga ggctatctat gacttttggc aatacttcta ccccatccag 660
caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720
gttggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggcttggga 780
gctgttgagc atttcgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcag 840
gacaacgact ttgccacagg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900
gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960
gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aggctacggc 1020
tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccctatc 1080
tacaccgata catccgtcgg caatcccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctttgcaac 1140
gagcctttct tctactggca agacggtgct cccgagggta cctccaccat tgtgccccgg 1200
ctcgtcagcg cctcctactg gcaacgccaa tgctcgctct acttccccga aacgaacggc 1260
tacacgtacg gtagcgcgaa gggtaagaac tctgccacgg tgaacagctg gaccggtggg 1320
tgggacatga cccgcaacac gacgcggttg atctggacga atgggcaata cgacccctgg 1380
cgcgactccg gtgtgtcgag cactttccgg cctggtggac cgctggcgag cacggcgaat 1440
gaacccgtgc aggttattcc gggcggattc cattgctccg atttgtatat ggcagattat 1500
tatgcgaacg agggggtaaa aaaggtggta gataatgagg tgaagcagat taaggagtgg 1560
gtggaggagt attatgcttg a 1581

Claims (3)

1.一种黑曲霉重组菌株，是将携带有脯氨酸蛋白酶基因的表达载体转化入黑曲霉获得的；所述的脯氨酸蛋白酶基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
2.一种黑曲霉突变菌株，是将权利要求1所述的黑曲霉重组菌株进行紫外诱变获得的；所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2016698。
3.权利要求2所述的黑曲霉突变菌株在脯氨酸蛋白酶生产中的应用。
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seq2;ncbi;《US7309595》;20080207 *
何攀.黑曲霉来源脯氨酰蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2 中表达的研究.《中国优秀硕士学位论文基础科学辑》.2015,第A006-206页. *
黑曲霉来源脯氨酰蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2 中表达的研究;何攀;《中国优秀硕士学位论文基础科学辑》;20150115;第A006-206页 *

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