CN107384900B - 一种真菌来源的酸性蛋白酶6749及其基因和应用 - Google Patents

一种真菌来源的酸性蛋白酶6749及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

一种真菌来源的酸性蛋白酶6749及其基因和应用。本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种来源于真菌的酸性蛋白酶6749及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明的酸性蛋白酶具有良好的性质，可作应用于食品、饲料、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的蛋白酶。

Description

一种真菌来源的酸性蛋白酶6749及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种来源于真菌的酸性蛋白酶6749及其基因和应用。
背景技术
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，在食品、洗涤、制革等工业都有广泛应用。相比于动植物来源的蛋白酶，微生物源蛋白酶，具有培养方便、操作简单和产酶量高的特点，便于工业化批量生产，得以大规模生产应用。因此，微生物源蛋白酶成为了目前的蛋白酶的重要来源。
蛋白酶按照其作用的pH将其分成酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。按活性中心可将蛋白酶分为四类：丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶是一类在酸性pH下有活性的蛋白水解酶。酸性蛋白酶通常在pH 2.0～6.0之间是稳定的，最适作用pH值随种属不同稍有不同，但通常都在pH 3.0左右，如黑曲霉所产酸性蛋白酶的最适p H为3.0，灰绿青霉为pH 3.5，酵母菌也在pH 3.0。天冬氨酸蛋白酶的活性中心包含两个天冬氨酸残基，该催化残基位于保守区Asp-Thr/Ser-Gly(DT/SG)基序内并形成酶活性位点。
蛋白酶在食品、酿造、毛皮与皮革、医药和饲料等行业中均有广泛应用。饲料中酸性蛋白酶的添加可提高蛋白质的可消化性，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽及氨基酸，易于畜禽消化吸收，可降低饲料对幼仔消化道的刺激，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进畜禽生长。
目前大多数酸性蛋白酶的性质不尽如人意，酶活不高，给工业化生产和食品加工带来极大的浪费，也在一定程度上限制了其应用范围。由于酶自身最适作用条件与所催化的环境条件之间的差别(如pH、温度等)，导致酶的催化效率降低，使其工业应用受到限制。用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种酸性蛋白酶6749。
本发明的再一目的是提供编码上述蛋白酶6749的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶6749基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述蛋白酶6749基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备蛋白酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述蛋白酶的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品、饲料、医药等行业中应用的新的蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：
其中，该酶全长394个氨基酸，N端20个氨基酸为信号肽序列，即“MVVFSKVTAVLAGLSAVASA”。
因此，成熟的蛋白酶6749的理论分子量为40kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：
该蛋白酶的最适pH为3.0，在pH 2.5～pH 3.5范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力；最适温度55℃，在60℃时依然具有80％以上的酶活力。
本发明还提供了编码上述蛋白酶的基因。本发明通过PCR的方法分离克隆了这个蛋白酶基因6749，蛋白酶6749的cDNA全长为1185bp，其cDNA序列如SEQ IDNO.4所示：
其中，信号肽的碱基序列为：
“ATGGTTGTTT TCAGCAAGGT CACGGCCGTC CTGGCCGGTC TCTCTGCCGT TGCGTCGGC”
因此，成熟基因的编码序列为
SEQ ID NO.5所示：
成熟蛋白理论分子量为39.7kDa，该酶属于天冬氨酸蛋白酶。将蛋白酶基因6749的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，确定6749是一种新的蛋白酶。
本发明还提供了包含上述蛋白酶基因的重组载体，优选为pPIC9-6749。将本发明的蛋白酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将蛋白酶基因***到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-6749。
本发明还提供了包含上述蛋白酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/6749。
本发明还提供了一种制备蛋白酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶的表达；以及
3)回收并纯化所表达的蛋白酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/6749。
本发明还提供了上述蛋白酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产蛋白酶。
本发明从Thermoascus crustaceus JCM 12803菌株中得到了一个新的酸性蛋白酶基因，其编码的蛋白酶具有以下几个优点：在酸性条件下有较高活性、较高的反应温度、较宽的pH范围内稳定。所有这些优点都意味着新发明的蛋白酶在饲料、食品、医药等行业中，根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的蛋白酶。
附图说明
图1显示根据本发明具体实施例的重组蛋白酶的最适pH值。
图2显示根据本发明具体实施例的重组蛋白酶的pH稳定性。
图3显示根据本发明具体实施例的重组蛋白酶的最适反应温度。
图4显示根据本发明具体实施例的重组蛋白酶热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.2g/L CaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min
(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。
(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1蛋白酶编码基因6749的克隆
Thermoascus crustaceus基因组DNA提取，置于-20℃备用。
设计合成扩增引物，以Thermoascus crustaceus总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃2min,35个循环，72℃10min。得到一约1800bp片段，将该片段回收后测序。
表1本实验所需的引物
提取Thermoascus crustaceus总RNA，利用Oligo(dT)20和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物F和R(见表1)，扩增该单链cDNA，获得蛋白酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序。
酸性蛋白酶6749的cDNA序列全长1185bp，编码394个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从Thermoascus crustaceus中分离克隆得到的编码蛋白酶的基因为新基因。
实施例2蛋白酶工程菌株的构建
(1)表达载体的构建及在酵母的表达
以测序正确的蛋白酶6749的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物F和R(见表1)，对6749的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和NotI酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen,SanDiego)，蛋白酶6749成熟蛋白的序列***到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-6749，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
以同样的方式构建含6749信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。
(2)高蛋白酶活性转化子的筛选
用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上，将MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高蛋白酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
实施例3重组蛋白酶的制备
(1)蛋白酶基因6749在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5％甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。
(2)重组蛋白酶的纯化
收集摇瓶表达的重组蛋白酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组6749，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取6749浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0.1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
实施例4重组蛋白酶部分性质分析
采用福林酚试剂显色法对本发明的蛋白酶进行活性分析。具体方法如下：在pH3.0，55℃条件下，1mL的反应体系包括500μL适当的稀释酶液，500μL底物，反应10min，加入1mL三氯乙酸(0.4mol/L)终止反应；将该反应体系12000rpm离心3min，吸500μL上清液加入2.5mL碳酸钠(0.4mol/L)，再加入500μL福林酚试剂，40℃显色20min冷却后680nm测定OD值。蛋白酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物酪蛋白生成lμmol酪氨酸所需的酶量为1个活性单位(U)。(1)蛋白酶6749的最适pH及pH稳定性
经纯化的(实施例3)表达的蛋白酶6749在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0为甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～l0.0的Tris-HCl系列缓冲液。纯化的蛋白酶6749在不同pH的缓冲体系、55℃下测定的pH适性结果(图1)表明：6749的最适pH为3.0，在pH 2.5-pH 3.5范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力。
将酶液在不同pH值的缓冲液中于30℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图2)，分析结果表明pH2.0-pH7.0之间能够维持80％以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。
(2)蛋白酶6749反应最适温度及热稳定性
纯化的蛋白酶在pH 3.0条件下，测定不同温度(30-70℃)下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为55℃，在65℃时依然具有50％的酶活力(图3)。耐温性测定为蛋白酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该蛋白酶热稳定下较差在30℃下处理10min，剩余50％酶活(图4)。
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一种真菌来源的酸性蛋白酶6749及其基因和应用
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<210> 2
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<212> PRT
<213> Thermoascus crustaceus JCM 12803
<400> 2
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<212> DNA
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gtgcctcaaa atgtgaaggc ggctgctgag acaggcagcg ctatcacaac cccagaggcc 240
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Claims (9)

1.一种酸性蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种酸性蛋白酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的酸性蛋白酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
4.包含权利要求2所述酸性蛋白酶基因的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述酸性蛋白酶基因的重组表达载体pPIC9-6749，其中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的酸性蛋白酶基因***到质粒pPIC9上的限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组表达载体pPIC9-6749。
6.包含权利要求2所述酸性蛋白酶基因的重组菌株。
7.包含权利要求2所述酸性蛋白酶基因的重组菌株GS115/6749，其中，将权利要求5所述的重组表达载体pPIC9-6749转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/6749。
8.一种制备权利要求1所述酸性蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞；
(2)培养宿主细胞；
(3)分离纯化获得酸性蛋白酶。
9.权利要求1所述酸性蛋白酶用于水解蛋白的应用。
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