CN106591119A - 细胞培养装置 - Google Patents

Abstract

细胞培养装置包含孔。在孔内有多个微孔，并且在孔内在微孔上方为第一公共流体体积。在每个微孔内有一组亚微孔，并且在每个微孔内所述组亚微孔上方为第二公共流体体积。

Description

细胞培养装置

技术领域

本公开涉及细胞培养装置。具体地，本公开涉及可用于集落形成测定的细胞培养装置，诸如多孔板。

背景技术

下面的内容不是承认下面公开的任何内容是现有技术或本领域技术人员的公知常识的一部分。

非粘附细胞的集落形成细胞(CFC)测定典型地在防止对流的流体流使细胞移动的半固体或凝胶状介质中进行，并且因此限制了子细胞从亲代细胞的位置移动的距离。这导致当子细胞继续***时来源于单个细胞的多细胞集落的形成。集落形成测定可以提供关于样品中各个有活力的祖细胞的数目的定量信息，并且允许对各个集落的分离和采样用于亚克隆或进一步分析。在干细胞或祖细胞的情况下，CFC测定也可以允许基于形态学将集落归类为不同的谱系。因此，CFC测定可以允许对样品中的祖细胞进行定量和谱系鉴定。

微孔装置也已经用于CFC测定。这样的装置意在将各个细胞俘获在确定的位置处以允许对它们的操作和研究。

发明内容

提供下面的发明内容以向读者介绍接下来的更详细的讨论。本发明内容不意在限制或限定权利要求。

根据一个方面，细胞培养装置包含孔。在孔内有多个微孔，并且在孔内在微孔上方为第一公共流体体积。在每个微孔内可以有一组亚微孔，其中在每个微孔内所述组亚微孔上方为第二公共流体体积。

所述孔可以至少部分地由至少一个孔侧壁、和孔底壁限定。每个微孔可以至少部分地由从所述孔底壁向上延伸的至少一个微孔侧壁限定。每个亚微孔可以至少部分地由从所述孔底壁向上延伸的至少一个亚微孔侧壁限定。每个亚微孔可以进一步由所述微孔侧壁中的一个微孔侧壁的一部分限定。

所述孔底壁可以是透明的或半透明的。

每组亚微孔可以包含以2x2阵列排列的4个亚微孔。在可替代的实例中，亚微孔以另一种构造诸如2x1、3x1、3x2、3x3或更大的阵列排列。

每个亚微孔可以包含亚微孔顶部和亚微孔底部，并且每个亚微孔可以在横截面积上从亚微孔顶部向亚微孔底部逐渐减小。例如，每个亚微孔可以是截头锥形的或截头锥体的。

每个微孔可以包含微孔顶部和微孔底部，并且每个微孔可以在横截面积上从微孔顶部向微孔底部逐渐变小。例如，每个微孔可以是截头锥形的或截头锥体的。

亚微孔、微孔和孔可以一体地形成。

细胞培养装置可以包含定位在亚微孔下方的磁性或可磁化元件。可磁化元件可以是线栅。孔可以至少部分地由孔底壁限定，并且线栅可以埋置在孔底壁内。

每个微孔可以具有微孔顶部和相对的微孔底部，并且每个微孔的顶部可以具有至少100微米的微孔宽度。每个微孔在顶部和底部之间的微孔深度可以为至少75微米。

每个微孔可以具有微孔顶部和微孔底部。每个微孔可以包含在微孔顶部处的最大尺寸以及微孔顶部和微孔底部之间的微孔深度。所述最大尺寸与所述微孔深度的比率可以为1.1∶1至1.9∶1。

根据另一个方面，细胞培养装置包含孔。在孔内有多个微孔。每个包含微孔顶部和微孔底部。每个微孔包含在微孔顶部处的最大尺寸，以及微孔顶部和微孔底部之间的微孔深度。所述最大尺寸与所述微孔深度的比率为约1.1∶1至1.9∶1。

最大尺寸可以为至少140微米。微孔深度可以为至少75微米。

每个微孔可以在横截面积上从微孔顶部向微孔底部逐渐变小。例如，每个微孔可以是截头锥形的或截头锥体的。

所述孔可以至少部分地由至少一个孔侧壁、和孔底壁限定。所述孔底壁可以是透明的或半透明的。每个微孔可以至少部分地由从孔底壁向上延伸的至少一个微孔侧壁限定。

细胞培养装置可以进一步包含定位在微孔下方的磁性或可磁化格栅。孔可以至少部分地由孔底壁限定，并且格栅可以埋置在孔底壁内。

微孔和孔可以一体地形成。

细胞培养装置可以进一步包含在孔内微孔上方的第一公共流体体积。

细胞培养装置可以进一步包含每个微孔内的一组亚微孔。每组亚微孔可以包含以2x2阵列排列的4个亚微孔。

所述孔可以至少部分地由至少一个孔侧壁、和孔底壁限定。每个微孔可以至少部分地由从孔底壁向上延伸的至少一个微孔侧壁限定。每个亚微孔可以至少部分地由从孔底壁向上延伸的至少一个亚微孔侧壁限定。每个亚微孔可以进一步由微孔侧壁中的一个微孔侧壁的一部分限定。

每个亚微孔可以包含亚微孔顶部和亚微孔底部，并且每个亚微孔可以在横截面积上从亚微孔顶部向亚微孔底部逐渐减小。例如，每个亚微孔可以是截头锥形的或截头锥体的。

亚微孔可以与微孔和孔一体地形成。

细胞培养装置可以进一步包含在每个微孔内在所述组亚微孔上方的第二公共流体体积。

在一个实施方案中，提供了细胞培养装置，其包含：

由至少一个孔侧壁、和孔底壁限定的孔；

所述孔内的多个微孔，每个微孔由从所述孔底壁向上延伸并且将微孔流体体积与相邻微孔的微孔流体体积隔开的至少一个微孔侧壁、和所述孔内所述微孔上方的第一公共流体体积限定，每个微孔包含微孔顶部和微孔底部，并且其中相邻的微孔之间的微孔侧壁汇合形成顶点；和

每个微孔内的一组亚微孔和每个微孔内在所述组亚微孔上方的第二公共流体体积，所述一组亚微孔用于在每个亚微孔内容纳一个或多个细胞，每个亚微孔包含亚微孔顶部、亚微孔底部和从所述孔底壁向上延伸的将亚微孔流体体积与相邻亚微孔的亚微孔流体体积隔开的至少一个亚微孔侧壁。

在一个实施方案中，每个亚微孔进一步由所述微孔侧壁中的一个微孔侧壁的一部分限定。在一个实施方案中，所述孔底壁是透明的或半透明的。

在一个实施方案中，每组亚微孔包含以2x2阵列排列的4个亚微孔。在一个实施方案中，每组亚微孔包含以2x1、3x1、3x2、3x3或更大的阵列排列的亚微孔。

在一个实施方案中，每个亚微孔在横截面积上从所述亚微孔顶部向所述亚微孔底部逐渐减小，任选地，其中每个亚微孔是截头锥形的或截头锥体的。在一个实施方案中，每个微孔在横截面积上从所述微孔顶部向所述微孔底部逐渐变小，任选地其中每个微孔是截头锥形的或截头锥体的。

在一个实施方案中，亚微孔、微孔和孔中的一个或多个一体地形成。

在一个实施方案中，细胞培养装置包含定位在亚微孔下方的磁性或可磁化元件。任选地，可磁化元件是埋置在孔底壁内的线栅。

在一个实施方案中，微孔顶部具有至少100微米的宽度。在一个实施方案中，微孔顶部的宽度为至少250微米、至少400微米、至少500微米、或约50微米至1000微米。在一个实施方案中，每个微孔在顶部和底部之间的深度为至少25微米。在一个实施方案中，每个微孔在顶部和底部之间的深度为至少75微米、至少100微米、至少200微米、至少300微米、或约25微米至900微米。

任选地，和/或另外地，在一个实施方案中，每个微孔包含在微孔顶部处的最大尺寸以及微孔顶部和微孔底部之间的微孔深度，并且所述最大尺寸与所述微孔深度的比率为1.1∶1至1.9∶1之间。在一个实施方案中，最大尺寸为至少140微米。在一个实施方案中，微孔深度为至少75微米。

在一个实施方案中，微孔侧壁相对于垂直方向的角度为小于30度。在一个实施方案中，微孔侧壁相对于垂直方向的角度为小于20度。

本文所述的任何特征或特征组合被包括在内，只要如根据上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识将是显而易见的，任何这样的组合中包括的特征不互相不一致。

附图说明

在具体实施方式中对附图进行参照，在附图中：

图1A是在造血集落测定中典型地观察到的集落的图像，显示了许多具有大重叠度的集落个体；

图1B是在造血集落测定中典型地观察到的集落的图像，显示了来源于单个祖先的具有多个中心的一个集落；

图2是本公开的示例性细胞培养装置的透视图；

图3是图2的细胞培养装置的俯视图；

图4是图3中盒子4中所示的区域的放大视图；

图5是沿图4中线5-5所取的横截面；

图6是图3中盒子4中所示的区域的透视剖视图；

图7是图5中圆圈7中所示的区域的放大视图，显示了埋置在孔底部中的可磁化格栅；

图8显示了通过亮视野显微镜所获取的多个微孔构造的图像；

图9A至9C是显示微孔中荧光珠的固定化的图像；

图10A至10E是显示不同微孔构造中集落形成的实例的图像；

图11A是通过亮视野显微镜对细胞培养装置所获取的图像，所述细胞培养装置包含微孔和微孔内的亚微孔；

图11B是使用彩色CCD扫描仪对细胞培养装置获取的图像，所述细胞培养装置包含微孔和微孔内的亚微孔；

图12A至12C是使用CCD线传感器(带有12-线彩色传感器的Epson V500扫描仪)获得的包含微孔的细胞培养装置中的染色的集落的图像；

图13是显示对包含微孔的细胞培养装置中的干细胞祖细胞的计数与标准CFC测定之间的相关性的图；

图14是显示当使用泊松分布来校正每个微孔接种的多个集落形成细胞时基于微孔的CFC测定的增加的线性范围的图；

图15A是通过亮视野显微镜对含有磁性微载体珠的微孔所获取的图像；

图15B是在孵育7天后通过亮视野显微镜对图14A的微孔所获取的图像；

图16是显示磁力辅助的沉降不影响基于微孔的CFC测定中的集落形成的图。

具体实施方式

下面将描述多个装置或方法来提供每个要求保护的发明的实施方案的实例。下面描述的实施方案不限制任何要求保护的发明，并且任何要求保护的发明可以涵盖下面没有描述的方法或装置。要求保护的发明不限于具有下面所述的任一个装置或方法的所有特征或下面所述的多个装置或所有装置所共有的特征的装置或方法。有可能的是，下面所述的装置或方法不是通过本专利申请的授权所授予的任何专有权的实施方案。在下面所述的装置或方法中所公开的任何发明和不通过本专利申请的授权所授予专有权的任何发明可以是另一保护性文件例如继续专利申请的主题，并且申请人、发明人或所有人不意在放弃任何所述发明、排除任何所述发明或通过其本文件中的公开内容向公众贡献任何所述发明。

半固体介质可能对用于各个细胞的定量或亚克隆的CFC测定存在一些限制。由于细胞没有在介质中稳固地固定，操作处理器皿可能会干扰集落。例如，诸如频繁地移动培养皿或向培养物添加液体试剂的扰动有可能干扰集落。这可能限制可以对这些培养物进行的操作的类型和次数。

另外，由于在培养物内没有物理边界，一些集落可能重叠，使得难以确定邻近的细胞群是否是来源于单个祖细胞的集落，或是否代表具有多个中心的单个集落，所述多个中心是由已经从原始祖细胞迁移一段短距离的子细胞产生的。这可以导致对总集落数目的错误计数。

此外，不同的成熟细胞谱系的集落的形态学特征经常不够独特，使得对这些集落的归类会成为往往具有高度可变性的主观过程。在例如对造血祖细胞的CFC测定的情况下，可能难以区分来源于粒细胞祖先、单核细胞祖先和巨核细胞祖先的集落，仅可允许可靠地区别主要的谱系类型(红系和髓系)。为了可靠地根据其来源的祖细胞的类型对集落进行归类，可能需要特定的标记和染色方法。这样的方法经常依赖于引入识别特异性细胞表面标志物或细胞内成分的探针分子。染色方法典型地涉及对细胞的固定和一系列随后的洗涤、染色和脱色程序。这些方法与在半固体介质中对非粘附细胞的集落测定不相容，因为固定、染色和洗涤溶液的添加会干扰集落。

在半固体介质中的标准CFC测定的另一限制是，多个集落出现在另一集落附近或出现具有重叠边界的多个集落，如图1A中所示。这样的集落可能难以与来源于单个细胞的多中心集落相区分，如图1B中所示。这不仅导致对集落计数的高度主观分析，而且由于来自邻近集落的外来细胞的存在使得从培养物中提取各个集落用于进一步扩充或亚克隆变得复杂。

尽管使用已知的微孔装置克服了上面提到的一些缺点，但在已知的微孔装置中，集落经常散布到微孔的体积之外。这导致散布到相邻的微孔中，和/或在常规的处理过程中洗掉集落中的细胞。此外，在已知的微孔装置中，超过一个祖细胞被接种到每个微孔中是很常见的，由此导致在每个微孔中超过一个集落的生长。这可能导致在计数集落时发生错误。

本公开涉及包含微孔的细胞培养装置。该细胞培养装置可以用于集落形成测定，并且可以克服上面提到的一些或全部缺点。特别地，如下面进一步详述地，如本文所述的细胞培养装置可以更好地将各个集落区室化，可以在集落生长时更好地包含容纳所述集落使得它们不会超出微孔的体积，并且可以导致在多天的培养中稳妥地俘获多细胞集落，以在操作诸如添加或去除溶液期间防止或减少它们在微孔之间散布或扩散的机会。这可以允许细胞培养装置用于持续约4-20天的简单的定量集落形成测定。此外，这可以将集落与它们最近的邻居隔开并且减少细胞重叠的出现，使得能够对集落进行客观计数并且提取各个集落而没有无关细胞的污染。

另外，如本文所述的细胞培养装置可以有效地固定化细胞，由此消除了在染色之前固定样品的需要。这可以使得灵敏的活细胞染色方法(例如，对集落进行染色用于对集落类型进行可靠的归类)成为可能，所述活细胞染色方法不改变细胞的代谢和物理特征。与特定的细胞染色方法相结合，微孔中的集落可以归类成亚型(例如，对于造血集落：红系、髓系、粒细胞、巨核细胞、单核细胞等)。此外，本文所述的细胞培养装置允许对细胞进行成像。

参考图2和3，显示了示例性细胞培养装置100。细胞培养装置100包含至少一个孔102。如本文所用，术语“孔”通常是指液体培养基中的细胞可以被放置于其中用于细胞的培养的任何流体储器。在所示的实例中，细胞培养装置100为多孔板的形式，并且包含6个孔102。在可替代的实例中，多孔板形式的细胞培养装置可以包含可替代数目的孔，诸如24个孔或96个孔。多孔板的孔在横截面上典型地是圆形的而不是如图2中所示的矩形。然而，具有大体平坦的底部的任何容器是可接受的。在进一步的可替代的实例中，细胞培养装置可以处于另一种合适的形式，诸如细胞培养皿(如在下文的实施例章节中所用)。在这样的实例中，细胞培养装置可以包含仅一个孔(即，细胞培养皿的单个流体储器)。

参照图2和5，每个孔102包含孔顶部104和孔底部106。此外，每个孔102由至少一个孔侧壁108、和孔底壁110限定。

孔可以具有任何合适的形状。在所示的实例中，孔102大体是正方形的，并且由4个孔侧壁108、和孔底壁110限定。此外，孔可以具有任何合适的尺寸。例如，孔可以具有约30μL-约10L的体积。例如，384孔板的一个孔的范围的下限是约30μL，典型的6孔板的范围的上限是约100mL。对于Qtray，体积为约1.1L，对于装填标准孵箱架子的占用空间(footprint)的平板，体积可以高至10L。因此，在一个实施方案中，孔具有约30μL-约10L的体积。在另一个实施方案中，孔具有约30μL-100mL的体积。在又另一个实施方案中，孔具有约30μL-约6mL的体积。

现在参照图4-6，在每个孔102内有多个微孔112、和微孔112上方的第一公共流体体积114(显示在图5中)。具体地，微孔112在每个孔的孔底部106处，并且与孔顶部104隔开。在每个孔102的孔顶部104处的空间形成第一公共流体体积114，其与每个微孔112相连通。

微孔112提供各个祖细胞可以接种于其内并在其内生长成集落的体积。即，可以将含有祖细胞的液体培养基放在每个孔102中。然后可以对细胞培养装置100离心，从而迫使祖细胞到达每个孔102的孔底部106并进入微孔112中，使得各个细胞被分离到微孔112中并且可以生长形成集落。可选地，可以在重力的作用下使细胞沉降至微孔112中。第一公共流体体积114允许给定孔102内的每个微孔112共用公共介质，使得微孔112内的细胞在大体相同的条件下培养。

参照图5和6，每个微孔112包含微孔顶部116和微孔底部118。每个微孔112由在微孔顶部116和微孔底部118之间延伸的至少一个微孔侧壁120、和在微孔底部处的微孔底面122限定。

参照图5，在所示的实例中，在给定孔102内的每个微孔112的微孔底面122由给定孔102的孔底壁110形成。此外，微孔侧壁120从孔底壁110一体地向上延伸，并且邻近孔侧壁108的微孔112的微孔侧壁120与孔侧壁108一体地形成。

在可替代的实例中，孔底壁和孔侧壁可以与微孔底面和微孔侧壁分开地形成。例如，微孔可以作为***物形成，所述***物被安置在孔的底壁上并任选地固定于孔的底壁(如下文实施例章节中所述)。

微孔可以具有任何合适的形状。参照图4，在所示的实例中，在微孔顶部116处每个微孔112是大体正方形的，并且由4个微孔侧壁120限定。此外，参照图5和6，每个微孔112在横截面积上从微孔顶部116向微孔底部118逐渐减小。更具体地，在所示的实例中，每个微孔112是大体截头锥体的。此形状通常促使祖细胞被接种在微孔112内，而不是在相邻的微孔112之间。更具体地，在所示的实例中，由于微孔112是大体截头锥体的，相邻微孔112的微孔侧壁120在顶点124处会合，使得细胞通常不能接种在微孔112之间。

在其中微孔112在横截面上从微孔顶部116向微孔底部118逐渐减小的实例中，微孔侧壁120相对于垂直方向的角度(在本文中也称为“壁角”)可以是任何合适的角度。在一些实例中，所述角度可以小于约30度，例如10度至20度。在其他实例中，所述角度可以小至2度。如在下文实施例章节中所示，当壁角减小时，微孔的体积增加，导致容纳细胞集落增加。

在所示的实例中，微孔侧壁120以相同的角度从微孔顶部116延伸到微孔底部118。在可替代的实例(未显示)中，微孔侧壁可以包含第一部分和第二部分，所述第一部分以第一角度从微孔顶部向下延伸，所述第二部分以第二角度从所述第一部分向下延伸。第二角度可以小于第一角度(例如，第二角度可以是0度)。这可以允许相邻的微孔的微孔侧壁在顶点处会合，同时仍然允许微孔底面相对大，并且微孔的体积相对大。

在可替代的实例(未显示)中，每个微孔在微孔顶部处可以是大体圆形的，并且可以是大体截头锥形的。在又另一个可替代的实例中，每个微孔在微孔顶部处可以是另一合适的形状，诸如三角形、矩形、梯形或六角形。

在所示的实例中，给定孔102内的微孔112通常具有相同的形状和尺寸。在可替代的实例(未显示)，给定孔内的微孔可以具有不同的形状和尺寸。

在所示的实例中，每个微孔112具有大体在中央的对称轴。在所示的实例(未显示)中，一个或多个微孔可以不具有中央对称轴。

通常，微孔中形成的集落可以具有约10个-100,000个细胞的平均尺寸；然而，一些集落可以生长至具有超过100万个细胞。预期100万个细胞的细胞集落将具有约1.0μL的体积。由于已知微孔装置中的微孔通常不旨在用于细胞培养，因此对于绝大部分来说，它们的尺寸没有被制成为容纳偶尔出现的大集落。然而，在一个已知的微孔装置中，微孔的体积为约0.1μL或更大(Ungrin WO2008/106,771)，其可以容纳这些大集落。如上文所述，在这些微孔装置中，细胞往往仍会散布至微孔的体积之外。令人惊奇地，目前已经确定通过定制微孔的尺寸使得其在顶部处的最大尺寸与其深度的比率(在下文中也称为“最大尺寸深度比”)为小于1.9∶1，并且更特别地，为1.9∶1至1.1∶1，可以减少细胞散布至微孔外，并且可以实现对较大的集落的固定化。

例如，参照图6，每个微孔112在微孔顶部116处是大体正方形的，并且具有在顶部116处的微孔宽度101和微孔长度103和在微孔顶部116和微孔底部118之间的微孔深度105。由于微孔112在顶部116为大体正方形，因此横跨顶部的最大尺寸是对角线107。因此，如果微孔深度105为大约1mm，为了具有小于1.9∶1的最大尺寸深度比，线107的长度将小于1.9mm。例如，微孔宽度101可以为1mm，并且微孔长度103可以为1mm，使得线113的长度为大约1.4mm。

在可替代的实例中，微孔宽度、微孔长度和微孔深度可以为另一尺寸。例如，微孔宽度和微孔长度可以通常为100微米或更大，以及更具体地500微米或更大，并且微孔深度通常可以为75微米或更大。在其中微孔在顶部处为正方形并且在顶部处的微孔宽度和微孔长度为500微米的实例中，在顶部处的最大尺寸将为大约707微米。在这样的实例中，为了具有小于1.9∶1的最大尺寸深度比，则微孔深度将大于大约372微米。

在可替代的实例(未显示)中，其中微孔具有不同的形状，横跨顶部的最大尺寸可以是另一尺寸。例如，如果微孔在顶部处为圆形，则最大尺寸将为顶部处的直径。

每个孔内微孔的密度和总数目可以根据微孔的大小和形状以及孔的大小和形状而变化。在一些实例中，每个孔内微孔的密度可以为每平方毫米0.5-4.0个微孔。在一个具体的实例中，每个孔可以包含约960个微孔。

仍然参照图4-6，在所示的实例中，在每个微孔112内有一组亚微孔126和每个微孔112内该组亚微孔126上方的第二公共流体体积128。

如上文所述，在已知的微孔装置中，超过一个祖细胞被接种到每个微孔中是很常见的，由此导致在每个微孔中超过一个集落的生长。通过在每个微孔112中提供一组亚微孔126，即使超过一个祖细胞被接种至每个微孔112中，祖细胞通常会被分至相邻的亚微孔126中并且生长成单独的集落。

此外，如下文将更详细地描述的那样，亚微孔126的尺寸可以制成为容纳平均的集落(例如，至多达100,000个细胞的集落)，而不是大的集落。因此，亚微孔126将具有足够的尺寸以容纳生长的大部分细胞集落；然而，如果在亚微孔126中确实生长了大集落，则所述大集落可以生长至第二公共流体体积128中并且将被包含在容纳亚微孔126的微孔112内。

另外，通过在每个孔112内提供亚微孔126，来自小集落的细胞可以集中在微孔底面122处。这可以增强通过亮视野显微镜检测小集落的能力。例如，这可以通过在较早的时间点检测集落实现更快速的集落测定或能够检测具有较低增殖潜力的祖细胞。

参照图5和6，每个亚微孔126包含亚微孔顶部130和亚微孔底部132。此外，每个亚微孔126由在亚微孔顶部130和亚微孔底部132之间延伸的至少一个亚微孔侧壁134、和在亚微孔底部132处的亚微孔底面136限定。

亚微孔126可以具有任何合适的形状。在所示的实例中，每个亚微孔126在亚微孔顶部130处是大体正方形的，并且由4个亚微孔侧壁134限定。

参照图5，在所示的实例中，给定孔102内每个亚微孔126的亚微孔底面136由给定孔102的孔底壁110形成。此外，在每个亚微孔126的4个亚微孔侧壁134中，两个由微孔侧壁120的一部分形成，另外两个从孔底壁110一体地向上延伸。

在可替代的实例(未显示)中，微孔底壁、微孔侧壁、亚微孔底面和亚微孔侧壁中的任一个可以由单独的材料形成。例如，给定组的亚微孔可以作为***物形成，所述***物被安置在一个微孔的微孔底面上。

还参照图5和6，每个亚微孔126在横截面上从亚微孔顶部130向亚微孔底部132逐渐变小。更具体地，在所示的实例中，每个亚微孔126是大体截头锥体的。类似于微孔112，此构造促进祖细胞被接种在亚微孔126内，而不是在相邻亚微孔126之间。更具体地，在所示的实例中，在亚微孔126是大体截头锥体的时，相邻的亚微孔126的亚微孔侧壁134在顶点138会合，使得细胞通常不被接种在亚微孔126之间。

在可替代的实例(未显示)中，每个亚微孔在亚微孔顶部处可以是大体圆形的，并且可以是大体截头锥形的。在又另一个可替代的实例中，每个亚微孔在亚微孔顶部处可以是另一合适的形状，诸如三角形、矩形、梯形或六角形。

在其中亚微孔在横截面上从亚微孔顶部至亚微孔底部逐渐变小的实例中，亚微孔侧壁相对于垂直方向的角度可以为任何合适的角度。在一些实例中，所述角度可以小于约30度，例如10度-20度。在其他实施例中，所述角度可以低至2度。

如上文所述，亚微孔126的尺寸可以定制为容纳平均的集落。例如，亚微孔可以具有约3x 10^-6μL至约1.0μL的体积。例如，参照图5，亚微孔126在顶部处的宽度109可以为约30μm至1mm，在顶部和底部之间的深度113可以为约30μm至1mm。此外，亚微孔侧壁134可以从垂直方向以约1至37度的角度延伸。

每个微孔112可以包含任何合适数目和排列方式的亚微孔126。在所示的实例中，每个微孔112包含4个亚微孔126，所述4个亚微孔126以2x2阵列排列。在可替代的实例中，亚微孔可以以其他的构造诸如2x1、3x1、3x2、3x3或更大的阵列排列。

还参照图5和6，孔底壁110还形成微孔底面122和亚微孔底面136，其可以是半透明的或透明的。这可以允许观察细胞培养装置100内的细胞集落，例如通过显微镜或其他视觉成像方法。在所示的实例中，亚微孔底面136是大体扁平的，每个亚微孔底面136是大体共面的。这可以辅助在显微镜下观察细胞集落。然而，在可替代的实例(未显示)中，亚微孔底面可以具有另一形状，例如圆形的。在另一可替代的实例(未显示)中，亚微孔可以不包含亚微孔底面。例如，亚微孔侧壁可以在顶点处会合。

在一些实例(未显示)中，微孔底面和/或亚微孔底面可以包含分界线作为确定细胞培养装置内微孔或亚微孔的位置的标志。

在其他实例(未显示)中，细胞培养装置的内表面可以涂覆以疏水涂层。当将液体置于细胞培养装置中时疏水涂层可以最小化或减小弯月面的形成，这可以促进置于细胞培养装置中的样品的均匀分布。

在其他实例(未显示)中，可以处理细胞培养装置的内表面以促进湿润使得微孔和亚微孔更容易填充以液体。

如上文所述，在一些实例中，细胞可以通过离心或通过重力接种至微孔112和亚微孔126中。在可替代的实例中，可以使用磁力来将细胞接种至微孔112和亚微孔126中。例如，在使用中，细胞可以用磁性粒子诸如粒子或其他磁性粒子标记。感兴趣的特定细胞类型可以使用对靶细胞上的细胞表面标志物特异的抗体混合物以及载体粒子上的活性物质部分(诸如葡聚糖)与磁性粒子偶联。利用这种混合物，形成抗体复合物，所述抗体复合物将靶细胞与磁性粒子交联形成悬浮的磁性粒子、磁性粒子和靶细胞复合物、以及未结合的非靶细胞三者的混合物。然后细胞悬液可以沉积在孔102中，并且可以使其经受在孔底壁110的方向上的磁场梯度。粒子将在该梯度的方向上移动并且聚集在亚微孔底部132。仍然留在悬液中的不需要的细胞可以从孔102中被洗掉，使得仅留下靶细胞以在随后的孵育期间形成集落。

现在参照图7，在一些实例中，细胞培养装置可以包含位于亚微孔下方的磁性或可磁化元件，以增加磁场梯度，并且提高粒子聚集在亚微孔底部的速度。在所示的实例中，可磁化元件包括可磁化线栅140，其被埋置在孔底壁110中。磁场梯度可以磁化线栅140，并且增加磁场梯度。

在可替代的实例(未显示)中，线栅可以被配置成将磁性标记的元件吸引到每个孔内的特定位置。

实施例

实施例1-细胞培养装置的生产

通过将微孔制造为***物并将它们***到培养皿中制备如上所述的细胞培养装置。一些微孔包含亚微孔，一些则不包含。将微孔制成为具有多种最大尺寸深度比，如上所述。

通过对实心铝盘的CNC机械加工生产几种微孔构造的阴模。这些圆形模具的直径为35mm，厚度为20mm，并且展示出具有微孔的相反拓扑结构的表面。将基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的弹性体浇铸在模具中，随后固化弹性体以形成含有微孔的柔性盘，从而来生产微孔***物。具体地，由SylGard 184(DowCorning)弹性体和固化剂的10∶1(w/w)均质混合物来制备所述弹性体。在浇铸进铝模具之前，将此硅酮组分的混合物暴露于真空(＜10mTorr，1小时)以去除任何挥发性组分。将1.5g-1.7g弹性体缓慢地倾倒在模具表面上并使其散布以在模具上形成具有均匀厚度的层。然后将模具的基座置于加热至180℃的热板上。由于模具的最小厚度和铝材料的高传导性，向模具表面的快速传热导致硅酮弹性体的快速固化。在加热5min的时期后，将模具从热板取下并通过短暂地放置在冷却至0℃的铝板上而冷却至环境温度。通过轻轻地拉起铸成品的一个边缘以取下含有微孔的盘来使硬化的PDMS凝胶脱模。

在***至35mm培养皿(Becton-Dickinson，35-1008)之前通过干热(135℃持续1小时)将微孔***物灭菌。将一滴125μL的上述SylGard弹性体和固化剂的混合物置入至该培养皿的中央，然后在无菌条件下将微孔***物***至该培养皿中，并使阵列表面面朝上，从而将微孔***物粘合至该培养皿中。通过将该培养皿与阵列***物在烤箱中在80-85℃温育(2-4小时)以热固化SylGard的粘合层，从而将***物密封至孔中。

以此方式生产的一些微孔阵列的实例显示在图8中，其是通过亮视野显微镜所获取的***物的微孔的俯视图图像。在下面的表中显示了微孔的尺寸，最大尺寸深度比显示为最大水平尺寸与深度的比：

构造	壁角(度)	微孔宽度(mm)	微孔深度(mm)	最大尺寸深度比
					A	37	0.8	0.38	3.0∶1
B	20	0.8	0.5	2.3∶1
					C	15	0.8	0.5	2.3∶1
D	15	1.0	1.0	1.4∶1

实施例2-孔构造对粒子的固定化的作用

评价具有不同尺寸的微孔的细胞培养装置区室化粒子的能力。在此实施例中测试的细胞培养装置不含有亚微孔。使用荧光聚苯乙烯微粒(Bangs FS06F，7.3μm直径)完成评价。将微粒的悬液置于几个细胞培养装置的数个个体微孔中。所有微孔在微孔顶部都是正方形的。所述微孔具有下列的尺寸：

构造	壁角(度)	微孔宽度(mm)	微孔深度(mm)	最大尺寸深度比
					A	15	1.0	1.0	1.4∶1
B	15	0.8	0.5	2.3∶1
					C	37	0.8	0.38	3.0∶1

使粒子通过重力沉降至孔中；剩余的孔空置，仅含有磷酸盐缓冲液(PBS)。然后使细胞培养装置接受代表典型用于细胞培养应用的操作的物理干扰法。具体地，通过移除上面的PBS并更换以2.0mL体积的新鲜PBS来进行清洗步骤。然后使细胞培养装置接受快速的侧向(从一边到另一边)移动。观察在含粒子孔周围的微孔中是否出现粒子的孔与孔之间散布，并且通过荧光显微镜(Leica DMIL倒置显微镜，4x物镜)对其成像。含粒子孔周围的孔的图像显示在图9中。

在图9中，每列中的第一个图像是将荧光珠放置在细胞培养装置的中心附近的微孔后微孔的明视野视图。每列中的下一个图像显示在对细胞培养装置的任何操作之前在微孔中观察到的荧光。每列中的最后一个图像显示在清洗和物理移动细胞培养装置后在微孔中观察到的荧光。

在操作后在使用荧光显微镜获得的图像中没有看见出现粒子转移。这显示具有1.4∶1至3.0∶1的最大尺寸深度比的微孔在常规细胞培养操作期间有效地限制了小粒子的移动。

实施例3-孔构造对容纳细胞集落的影响

将在液体培养基中的人造血祖细胞接种至含有具有多种构造的微孔的细胞培养皿中。在本实施例中测试的细胞培养装置不含有亚微孔。所有微孔在微孔顶部均是正方形的。微孔的尺寸概述在下表中：

构造	壁角(度)	微孔宽度(mm)	微孔深度(mm)	最大尺寸深度比
					A	37	0.8	0.38	3.0∶1
B	30	1	0.75	1.9∶1
					C	20	1	0.75	1.9∶1
D	15	1	0.75	1.9∶1
					E	15	1	1	1.4∶1

以约7个集落/cm²的集落密度接种细胞培养装置并且通过慢速离心将细胞沉降至微孔中。接种的细胞培养装置随后在37℃的许可培养环境和含有5％CO₂的湿化气氛中孵育。以两天的时间间隔监测集落形成并且记录细胞的微孔至微孔散布的任何证据。

图10显示了在5种微孔构造中的集落形成的特征。

关于构造A，在培养早期，可以看到集落仍限于微孔底部。在培养物继续生长总计14天后，集落已经生长超出了微孔并且细胞出现在含有集落的孔周围的大多数孔中。显然具有此构造的微孔在培养14天后不足以容纳集落。因此，利用此构造不可能对接种时的祖细胞数目进行计数。

仍参照图10，关于构造B-E，在所有情况下，在培养早期的时间点时观察到细胞被限制于各个孔中，此时集落仍然很小。在培养较晚的时间点时，看到随着微孔深度增加或壁角减小，细胞的微孔至微孔散布减少。具有最大孔体积的构造(构造E)显示出集落完全被限制于各个孔中，在培养14天后没有出现微孔至微孔散布。

利用微孔构造B-E进行额外的实验，其中将液体培养基中的来自人脐带血的造血祖细胞以21-26个集落/cm²的密度接种至预先湿润的微孔中并使其通过重力沉降至微孔中。评价接种后7或14天微孔的集落形成数和集落容纳情况。对于7天和14天培养两者，如下表中所示，当壁角增加时观察到的集落数目增加。

在7天CFC测定中此趋势的例外是构造B。在此测定中，在所有微孔中存在高的细胞背景，这使得难以准确地对小集落计数。此细胞背景最可能是由于因为壁角浅而以高速率溢出并散布到相邻微孔所引起的。这些数据显示对于最大尺寸深度比在1.9∶1-1.1∶1的范围的微孔，壁角小于30度，更具体地，壁角小于20度，也可以是合乎需要的。

实施例4-对包含亚微孔的细胞培养装置的评价

将液体培养基中的人造血祖细胞接种至在每个微孔内含有一组亚微孔的细胞培养皿中。细胞培养装置内的微孔在微孔顶部处是正方形的，并且具有1.0mm的微孔宽度、1.0mm的微孔深度105和15度的壁角。亚微孔在亚微孔顶部处是正方形的，具有0.37mm的微孔宽度、0.5mm的微孔深度和15度的壁角。

以约7个集落/cm²的集落密度接种细胞培养装置并且通过慢速离心将细胞沉降至亚微孔中。接种的细胞培养装置随后在37℃的许可培养环境和含有5％CO₂的湿化气氛中孵育。在孵育7天后通过亮视野显微镜观察培养物的集落形成并使用CCD数字照相机成像(图11A)。由箭头指示的孔在37℃孵育7天后含有来源于造血干细胞祖先的集落。随后使用活细胞标志物MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑)染色细胞以使用CCD彩色扫描仪通过宏观分析将集落可视化(图11B)。简言之，该染色法包括在含有MTT的培养基中孵育培养物直至观察到足够的颜色形成。然后通过去除培养基(通过移液)以及向亚微孔添加和去除合适的洗涤缓冲液来洗涤染色的细胞。重复此洗涤步骤直至明显没有背景着色。

发现集落被牢固地固定化在亚微孔内，并且在染色和洗涤步骤之前或之后没有自由漂浮的细胞。观察到可以容易通过显微镜计数的密实的和离散的集落，并且使用显微镜和宏观方法获得相当的集落计数。

图11A显示在亚微孔中生长的集落，图11B显示染色结果。在此图像中出现至少6个阳性亚微孔以及一簇4个亚微孔，所述4个亚微孔在图像的右上角聚集在一起。基于此图像中的总集落频次，4个孔的这一组最有可能是由单个祖先产生的，所述单个祖先具有高度的增殖潜力并且生长超出了亚微孔。此实施例清晰地显示了使用亚微孔的优点。

实施例5-集落的染色

在含有具有多种构造的微孔的细胞培养皿中评价了普遍用于生物学样品和细胞培养样品的染色的三种染色方法。在此实施例中测试的细胞培养装置不包含亚微孔。所述方法包括：(a)用与酶碱性磷酸酶(AP)偶联的针对细胞表面标志物的抗体标记细胞，然后添加萘酚磷酸盐底物和Fast-Red色原体从而导致红色沉淀物产生，(b)使用MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑)作为代谢底物的活细胞染色，MTT被活细胞转化成可见的染料，和(c)使用组织学衬染剂伊文思兰(Evans Blue)的非特异性染色。对于每种染色方法，含有集落的细胞培养装置的清洗先通过移除培养基(通过移液)和向微孔添加合适的清洗缓冲液，然后在短的孵育期后移除清洗缓冲液。根据每种染色规程的需要重复此洗涤步骤。染色的结果显示在图12中。

图12A是利用碱性磷酸酶偶联的抗体染色的集落的实例。这些集落包含在具有微孔的细胞培养装置内，所述微孔在微孔顶部处是正方形的，微孔宽度为0.8mm，壁角为15度，微孔深度为0.5mm。集落被明显地染成红色，背景染色最小。另外，当接受染色步骤时没有观察到出现对集落的干扰。图12B和12C显示包含在具有微孔的细胞培养装置内的集落，所述微孔在微孔顶部处是正方形的，微孔宽度为1.0mm开口，壁角为15度，微孔深度为1.0mm。集落分别用伊文思兰和MTT染色。与抗体标记法一样，没有观察到出现干扰集落，并且集落以与背景的高对比水平被染色。

实施例6-对形成集落的祖细胞的定量

在液体培养中在细胞培养装置中进行对造血祖细胞的集落形成培养，同时在半固体培养基中对相同的细胞样品进行标准集落形成细胞测定。在此实施例中测试的细胞培养装置不包含亚微孔。将处于液体培养基中的细胞悬液接种至具有微孔的细胞培养装置中，所述微孔在微孔顶部处是正方形的，具有1.0mm的微孔宽度，1.0mm的微孔深度和15度的壁角。通过慢速离心将细胞沉降至微孔中。将处于半固体培养基(Methocult^TM，Stemcell Technologies)中的相同细胞样品的悬液接种至标准的细胞培养皿中。在任一种情况下，培养皿均接种以大约5-15个集落/cm²的集落密度，随后在37℃的许可培养环境和含有5％CO₂的湿化气氛中孵育。培养14天后评价集落形成并且比较总集落数。

图13图示了在包含微孔的细胞培养装置和标准细胞培养皿中观察到的集落数之间的相关性(被标准化为接种到培养皿中的每1000个细胞的集落数)。斜率为大约1的显著相关性证明了在包含微孔的细胞培养装置中的集落测定与目前的标准CFC测定的良好一致性。在本申请中描述的细胞培养装置由此提供了一种对形成集落的祖细胞的定量的合适方法。

实施例7-CFC测定的线性范围

通过慢速离心用液体培养基将包含微孔的细胞培养装置预先湿润。在本实施例中测试的细胞培养装置不包含亚微孔。在本实施例中测试的微孔在微孔顶部处是正方形的，具有1mm的微孔宽度，1mm的微孔深度和15度的壁角。将来自冷冻的菲可分离的人脐带血的造血祖细胞的液体悬液接种至细胞培养装置中并使其通过重力以约7-57个集落/cm²的预期密度沉降至微孔中，细胞浓度从1x10⁴个细胞/微孔逐步增加至1x10⁵个细胞/微孔。细胞培养装置在37℃的许可培养环境和含有5％CO₂的湿化气氛中孵育。接种后7天时评价细胞培养装置的总集落数。

在图14中，阳性孔(数据点显示为菱形)数目不随细胞接种浓度线性增加。阳性孔可以源自单个祖先，或源自多于一个祖先。加入至给定微孔培养容器的祖先越多(随祖先频次、细胞浓度和添加的体积而改变)，每个微孔接种超过一个祖先的可能性越高。在本实施例中，培养容器具有大约1000个微孔并且因此当每个皿铺板具有最高细胞数时约50％是阳性的。基于观察到的阳性孔的频率，可以使用泊松分布通过确定产生所述阳性孔数目所需的预期祖先数目来对测定的输出进行线性化。图14显示了一旦应用了此校正，铺板的细胞和祖先数目之间的关系是线性的(数据点显示为正方形)。校正的数目代表了在初始样品中祖先的总数目的估计值。

实施例8-对形成集落的祖细胞的磁性分离

用水性缓冲液(含2％FBS的PBS)将实施例7的具有相同构造的微孔的细胞培养装置湿润以除去微孔中残存的任何空气。通过菲可(Stemcell Technologies，07907)密度梯度离心富集人脐带血样品中的单核细胞并将细胞重悬在上述的缓冲液中。将此细胞悬液与葡聚糖涂覆的磁性微粒(Stemcell Technologies，D-微粒)和抗葡聚糖/抗-CD34抗体混合物(Stemcell Technologies，CD34+选择混合物)混合。在孵育以允许悬液中的造血祖细胞与磁性微载体特异性结合后，将混合物添加至细胞培养装置。然后将细胞培养装置置于扁平磁铁(LifeSep 384F)上。看到微载体沿磁场梯度向下迁移被沉降至微孔中。在小于2分钟的时期内观察到悬液变清亮，同时看到暗色沉淀物在微孔底面上形成。通过移液去掉过量的上清液并更换以含有细胞因子的液体培养基以使造血祖细胞增殖。在相同构造的细胞培养装置中和在半固体培养基中的另外培养物作为对照接种，如上面实施例6中所述。细胞培养装置和对照在许可环境(37℃，5％CO₂，湿化孵箱)中孵育7天的时期并且观察孔内细胞集落的形成。

亮视野显微镜观察结果揭示了微载体珠在细胞培养装置的微孔中的均匀分布。然而，在各个微孔内，发现珠子朝向微孔对应于磁场梯度的方向(图15A)的边缘聚集。尽管在接种后磁珠使得各个细胞模糊不清，但在培养7天后，可以观察到在整个细胞培养装置中的各个孔中均形成了集落(图15B)。在其中使用磁性微载体选择性沉降造血祖细胞的细胞培养装置中的总集落计数与在对照细胞培养装置和在皮氏培养皿(Petri dishes)中在半固体培养基中进行的培养中观察到的集落计数相当(图16)。这说明了在包含微孔的细胞培养装置中，通过使用磁性微载体和对细胞表面上的独特标志物特异的抗体混合物，通过将所需的细胞选择性沉降至微孔中，可以进行对特定细胞类型的定量集落测定。

Claims (15)

1.一种细胞培养装置，包含：

由至少一个孔侧壁、和孔底壁限定的孔；

所述孔内的多个微孔，每个微孔由从所述孔底壁向上延伸并且将微孔流体体积与相邻微孔的微孔流体体积隔开的至少一个微孔侧壁、和所述孔内所述微孔上方的第一公共流体体积限定，每个微孔包含微孔顶部和微孔底部，并且其中相邻的微孔之间的微孔侧壁汇合形成顶点；和

每个微孔内的一组亚微孔和每个微孔内在所述组亚微孔上方的第二公共流体体积，所述一组亚微孔用于在每个亚微孔内容纳一个或多个细胞，每个亚微孔包含亚微孔顶部、亚微孔底部和从所述孔底壁向上延伸的将亚微孔流体体积与相邻亚微孔的亚微孔流体体积隔开的至少一个亚微孔侧壁。

2.权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个亚微孔进一步由所述微孔侧壁中的一个侧壁的一部分限定。

3.权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述孔底壁是透明的或半透明的。

4.权利要求1所述的细胞培养装置，其中每组亚微孔包含以2x2阵列排列的4个亚微孔。

5.权利要求1所述的细胞培养装置，其中每组亚微孔包含以2x1、3x1、3x2、3x3或更大的阵列排列的多个亚微孔。

6.权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个亚微孔在横截面积上从所述亚微孔顶部向所述亚微孔底部逐渐减小，任选地，其中每个亚微孔是截头锥形的或截头锥体的。

7.权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个微孔在横截面积上从所述微孔顶部向所述微孔底部逐渐变小，任选地其中每个微孔是截头锥形的或截头锥体的。

8.权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述亚微孔、微孔和孔一体地形成。

9.权利要求1所述的细胞培养装置，进一步包含定位在所述亚微孔下方的磁性或可磁化元件。

10.权利要求9所述的细胞培养装置，其中所述可磁化元件是埋置在所述孔底壁内的线栅。

11.权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述微孔顶部具有至少100微米的宽度和/或每个微孔在所述顶部和所述底部之间的深度为至少75微米。

12.权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个微孔包含在所述微孔顶部处的最大尺寸和所述微孔顶部和所述微孔底部之间的微孔深度，并且所述最大尺寸与所述微孔深度的比率为1.1:1至1.9:1。

13.权利要求12所述的细胞培养装置，其中所述最大尺寸为至少140微米。

14.权利要求12所述的细胞培养装置，其中所述微孔深度为至少75微米。

15.权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述微孔侧壁相对于垂直方向的角度为小于30度，任选地小于20度。