CN110339874B - 一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置及使用方法 - Google Patents

一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种外泌体分离与表面蛋白检测的微流控装置及使用方法，该装置包括依次连接有进样泵、微量注射器、设有磁铁的微流控芯片以及废液收集器。本发明可以实现外泌体在同一芯片***上的分离与检测，提供了一种操作简单、低成本、样品量少的外泌体分离与检测的整合平台与方法，具有良好的应用前景。

Description

一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置及使用方法
技术领域
本发明属于外泌体检测领域，特别涉及一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置及使用方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的一种，是细胞主动分泌到胞外环境的，由磷脂双分子层包被的微小囊泡，其尺寸在30-150nm之间。外泌体内部包含有各类生物分子成分，包括蛋白、DNA、RNA等。外泌体表面具有多种抗原，如CD9、CD63、EpCAM等。外泌体在分泌后，可以通过外周血循环进行转移，从而将亲代细胞信息与调控成分靶向传递到目标区域。因此外泌体与癌症的发生发展以及转移有着极为密切的关系。鉴于外泌体在癌症发育与转移中起到的重要作用，我们可以通过分离与检测外泌体来辨别分析，检测早期癌症的存在并监控癌症发展。
作为液体活检的标志物，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)则仅有数个在1ml的人外周血液中，相比之下，外泌体则可以达到109个，具有显著的优势。外泌体分离检测的难点主要在于其尺寸微小(30-150nm)，纳米级别的粒径尺寸使得传统的尺寸分选难以实现。如果能实现外泌体的分离与富集，就可以对外泌体的数目与分子特征进行分析，为癌症诊断分析与靶向药物治疗提供有力依据。
现今外泌体的经典分离方法为超速离心法与梯度离心法，这些方法需要通过极高的离心速率(100，000*g)进行分离，并且存在着样品消耗大，杂质多、外泌体纯度低等问题。而其他方法，如试剂盒法(如ExoQuickTM试剂盒)，其分离成分被商家保密，具体分离产物实际上是未知的，学术界目前持怀疑态度，膜过滤法则效率低下，并无法将外泌体与其他杂蛋白等类似尺寸的杂质分离开来。
微流控芯片技术是近年来发展的一种新兴技术，向生物，化学医药等众多领域快速发展，显示出广阔的应用前景。该技术具有低消耗，高灵敏，适用性广等诸多优势，已被证明在上述领域具有巨大发展潜力。微流控芯片的微通道普遍为微米级别，可以自由设计组合以实现不同需求，并可以弥补目前的外泌体分离方法的不足。目前微流控技术在生物检测领域中的应用日益广泛，对于外泌体的研究也逐步发展，但是目前微流控芯片对于外泌体的研究还存在着一些缺陷，例如检测灵敏度低，检测仪器与材料复杂，难以实现分离检测一体化等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置及使用方法，克服了传统的外泌体分离、检测方法中，操作复杂、功能单一、特异性低、工艺复杂、成本高等缺陷。
本发明提供了一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置，依次连接有进样泵、微量注射器、设有磁铁的微流控芯片以及废液收集器，其特征在于：所述微流控芯片包括外泌体分离区域与检测区域；其中，分离区域包括进样口、蛇形通道和圆形孵育腔体；检测区域包括微柱阵列和出样口；分离区域和检测区域通过通道连接。
所述微流控芯片由盖玻片基底与PDMS芯片键合而成。
所述进样口通过逐渐减小的过渡区域与蛇形通道相连。
优选的，所述过渡区域主体宽900μm。
所述微柱阵列为由截面为圆柱型的长条微柱所组成的阵列，用以捕获并均匀排布免疫复合体。捕获位点为每两个微柱的间隔，其中，微柱间间隔略小于免疫复合体的尺寸，从而可以拦截免疫复合体而避免流失。
所述微柱阵列最后一排设有拦截柱，以避免免疫复合物在过量情况下的遗漏。
所述磁铁设置在圆形孵育腔体上下方，用以在孵育微腔中产生垂直方向的磁场以捕获并保留免疫磁珠。
本发明微流控芯片中的蛇形通道尺寸、圆形孵育微腔、微柱阵列的尺寸、数目、排列方式可以根据实际需求改变。微柱阵列的尺寸，间距是为了更好的捕获免疫复合物，而避免从间隙遗漏或者无法捕获的情况。
所述微流控芯片中高度统一，优选高度为20μm-30μm，最优选为20μm。
优选的，所述微流控芯片中，微柱阵列中圆柱形微柱截面长度为90μm，宽度为30μm，半径为15μm，每两个微柱的间距为14μm。微柱阵列的进出端是上下分布以产生自上而下，自左向右的梯度液流压力。右下部分为出样口区域，通过直线型微通道与圆形出样口相连，并连接废液收集器。
优选的，所述蛇形通道宽度为100μm。
优选的，所述圆形孵育腔体的半径为800μm。
本发明蛇形通道的作用在于：利用蛇形通道来平稳液流，促进磁性微珠在微流控芯片中平稳运行，避免堵塞与逃逸，实现了后续大尺寸免疫复合物(d＝15μm)在微流控芯片中的捕获保留与释放。
本发明微柱阵列的作用在于：当“磁珠-外泌体-量子点”免疫复合物被释放后，进入到阵列中，在由于流体动力学产生的压力差作用下被均匀有序排布在微柱间隙处以观测每个独立免疫复合物的免疫荧光强度，从而避免复数球之间的信号交叉干扰。
本发明磁铁的作用在于：对在孵育实验中被放置在圆形孵育微腔上下以产生纵向磁场，使用盖玻片作为基底以减小两磁铁之间的距离，进一步增大磁场强度。在检测过程中，磁极会被移除以便于免疫复合物顺利流入并排布在检测区域。
本发明采用微量注射器和进样泵，采用正压进样与负压抽取相结合的方式，可以精确的控制进样流速。在外泌体分离标记的过程中使用正压进样，而免疫复合物在微柱阵列中排布时则采用负压抽取。
本发明所述微流控芯片中免疫复合物的捕获原理是基于横向，纵向的流体压力差的流体扩散原理。
本发明还提供了一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置的使用方法，包括：
(1)将实验样品组依次正向导入微流控芯片中进行受控分离与孵育标记；
(2)待实验样品组顺次导入微流控芯片并孵育标记后，导入洗液对微流控芯片进行冲洗；然后改为负压抽取；
(3)在显微镜下实时观测明场与荧光场下免疫复合物的排布情况与量子点发光强度，分析辨别实验中对于不同样品的蛋白表达，并通过显微拍摄与软件分析来测量荧光强度。
所述步骤(1)中的实验样品组包括捕获磁珠、待测样本以及量子点检测探针。
所述步骤(1)中的导入流速为1μl/min-2μl/min。
所述步骤(2)中的负压抽取流速为10-30ml/h。
使用过程中导入缓冲液对所述微流控芯片进行冲洗，再通过负向液流作用，将免疫复合物依次有序排列在微流控芯片的微柱阵列间隙中以实现单一检测，避免了因为磁珠堆叠造成的荧光干扰。
本发明需要在进样之前，先将样品进行常规预处理，使用常规离心机进行梯度离心，最高离心速度为10000*g，用以去除样品中的细胞碎片沉淀等污染物，避免吸附以产生干扰荧光，并且普通实验室用离心机即可满足要求。并且，芯片结构小，现已实现在一块载玻片上实现4个结构集成的芯片，可以根据实际需求，通过多通道进样泵实现多个样品的同时检测。
本发明分立的分离与检测两个模块，可以避免荧光的交叉干扰，并且便于模块的替换。如需要分离外泌体后导出用于其他检测，则可以只制作使用前半部分，同理可以只使用后半部分。并且操作检测不需要提前的芯片表面修饰过程，外泌体的分离、标记均在片上完成，不需要片外预孵育过程。
有益效果
(1)本发明同时实现了外泌体分离与检测，无需额外的处理方法，如过滤，沉淀等，
(2)本发明极大的提高了对微剂量样品(低至1μl的10000倍稀释样品(2.4*103个/μl))中外泌体的捕获能力，具有高效率，低检测限，高特异性，操作便捷等优点。
(3)本发明芯片成本低廉，一方面，硅片模具刻蚀之后，可以重复浇筑PDMS进行利用；另一方面，芯片耗材仅为盖玻片与PDMS，磁体对可以重复使用；同时由于微芯片***结构为单层，避免双层微结构的制作，且不需要添加额外的电极场或声波场，因此，在模具上刻蚀微芯片***的通道时，可以一次工艺完成，无需对准、套刻等步骤，工艺简单，并且免去了后期芯片键合的对准与电极修饰等复杂工序。
附图说明
图1是本发明微流控芯片结构示意图；
图2是本发明微流控芯片中外泌体分离区域的结构示意图；
图3是本发明微流控芯片中外泌体检测区域的结构示意图；
图4是本发明微流控芯片中外泌体检测区域的免疫复合物实际分布图；
图5是实施例3中进样样品分别为阳性循环肿瘤细胞H446，阴性对照人内皮细胞HUVEC以及培养基空白对照组时，通过本发明微流控芯片检测的实验结果图；
图6是实施例3中进样样品分别为阳性循环肿瘤细胞H446，阴性对照人内皮细胞HUVEC以及培养基空白对照组时，通过本发明微流控芯片检测的强度统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
微流控芯片的制备
(1)如图1所示，用AutoCAD画图软件绘制出所需要的结构图形，结构尺寸如前所述。制作掩模版，以四寸单晶硅片为衬底进行涂胶，光刻，深反应离子刻蚀(deep RIE)以刻蚀出芯片通道的高度，去胶清洗，得到具有微结构的硅片模具。
(2)将硅片模具和装有10μl氟硅烷的敞口离心管置于真空锅中，抽真空至负压，使氟硅烷汽化散布在真空锅中，模具在氟硅烷蒸汽氛围中静置12个小时。在通风厨中，将真空锅打开，通风1个小时后，将硅片取出。这一步的目的是在硅片表面沉积一层氟硅烷薄层，从而避免PDMS芯片与硅片的黏连。
(3)按照10:1(w/w)分别称量PDMS预聚物和固化剂，然后混合并搅拌均匀，置于真空锅中抽真空，保持负压条件下静置30min。待PDMS没有气泡后，将其浇注在硅片模具上，静置30min，然后，将其放入95℃烘箱加热1h。最后将固化好的PDMS层从模具上剥离下来，按照图形上的进出样口进行打孔，并将结构以外的多余部分切割掉。最后将PDMS芯片结构面朝上和盖玻片基底放入等离子清洗机中清洗1min，取出后迅速贴合在一起，即完成了微流控芯片的封装。
实施例2
聚苯乙烯微球的功能化修饰
(1)将10μl羧基微球原液，混合于90μl PBS磷酸盐缓冲液中，吹打重悬。之后在6000r/min的转速下离心5min，去除上清液，保留沉淀，重复该操作两次用以清洗微球，最后重悬于80μl的PBS中。
(2)将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)粉末以10mg/ml的浓度混合于酸性(pH＝5)PBS中。在室温下振荡孵育30min，之后重复步骤
(1)中的离心步骤，并重悬在100μl PBS缓冲液中。
(3)将10μg anti-CD9捕获抗体加入到步骤(2)中的微球悬液中，吹打震荡使其充分混合，然后在37℃的条件下利用mixer comfort孵育器孵育4小时。孵育结束后，重复步骤(1)中的离心操作，最后重悬在100μl PBS缓冲液中。
(4)用1％BSA(牛血清蛋白)的PBS溶液对修饰好的微球进行重悬以封闭非特异性结合，然后放在4℃下备用。
实施例3
采用实施例1制备的微流控芯片进行样品的外泌体分离与检测
(1)将检测待用的样品组(实施例2制备的anti-CD9标记的磁珠，待测样品，连接有抗体的量子点，三者的剂量依次为5μl，1μl，10μl)吸入微量注射器以供备用。将实施例1封装好的芯片，放入真空锅中抽真空30min，用移液枪吸取100μlPBS溶液，然后将枪头***芯片，静置10min，依靠微流控通道中的负压，使得PBS溶液自发进入并填充整个微结构芯片。
(2)通过显微镜对准的方法，将磁铁放置于圆形孵育微腔的上下方，以便将磁珠捕获在孵育腔中，注意位置对齐，避免磁极偏差造成捕获效率的降低。
(3)将填充有预先标记有免疫抗体(CD9)磁珠的微量注射器连接在进样泵上，微量注射器与芯片通过细管相连通入，流入并被保留在圆形孵育微腔腔体中，优选流速为2μl/min。
(4)更换微量注射器，将待测实验样品由进样口通入微芯片***中，之后进样口停止进样，并原位室温孵育，优选参数为流速1μl/min，流通1min孵育时间30min。
(5)更换微量注射器，将标有抗体的量子点溶液由进样口通入微芯片***中，之后进样口停止进样，同样进行原位室温孵育，优选参数为流速1μl/min，流通10min，孵育时间20min。流速量子点检测探针溶液进样过程需要避光处理，避免量子点受光激发而影响效率。
(6)孵育后，移除磁铁，进样口改为使用枪头连接，并加有100μlPBS，目的在于冲洗通道与避免空气从进样口进入。出样口连接上针筒，采用负压模式向外抽取，通过管内空气负压形成微流控***内流体压力梯度，从而引导“磁珠-外泌体-量子点”免疫复合物在圆柱形微柱阵列的间隙均匀有序排布；所述优选负压抽取流速为10ml/h-30ml/h。
(7)在避光条件下，使用配置有汞灯的倒置显微镜观察明场与荧光场下的复合物排布与免疫荧光，拍摄并使用image pro plus进行强度分析统计。
(8)进样样品分别为阳性循环肿瘤细胞H446，阴性对照人内皮细胞HUVEC以及培养基空白对照组时，通过本微流控芯片检测的实验结果如图5所示，阳性与阴性样品呈现出肉眼可见显著差异。
(9)本实施例实验过程在76min内完成，相比于超速离心(样品分离需要2小时以上，不包括检测)具有高效率。
(10)如图6所示，阳性样品与阴性相比呈现出肉眼可见的荧光强度差异，根据荧光强度分析软件显示，阳性样品强度为阴性的10倍以上(对照组4.15，实验组41.06)。

Claims (6)

1.一种外泌体分离与表面蛋白检测微流控装置的使用方法，包括：
(1)将实验样品组依次正向导入微流控芯片中进行受控分离与孵育标记；其中，所述微流控装置依次连接有进样泵、微量注射器、设有磁铁的微流控芯片以及废液收集器，所述微流控芯片包括外泌体分离区域与检测区域；分离区域包括进样口、蛇形通道和圆形孵育腔体；检测区域包括微柱阵列和出样口；分离区域和检测区域通过通道连接；所述磁铁设置在圆形孵育腔体上下方；所述实验样品组包括捕获磁珠、待测样本以及量子点检测探针；
(2)待实验样品组顺次导入微流控芯片并孵育标记后，导入洗液对微流控芯片进行冲洗；然后改为负压抽取；
(3)在显微镜下实时观测明场与荧光场下免疫复合物的排布情况与量子点发光强度，分析辨别实验中对于不同样品的蛋白表达，并通过显微拍摄与软件分析来测量荧光强度。
2.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的微流控芯片由盖玻片基底与PDMS芯片键合而成。
3.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的进样口通过逐渐减小的过渡区域与蛇形通道相连。
4.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的微柱阵列最后一排设有拦截柱。
5.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的导入流速为1μl/min-2μl/min。
6.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)中的负压抽取流速为10-30ml/h。
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