CN104774747B - 用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置，包括：用于承载液滴的多孔膜；用于保证多孔膜处于铺展状态的多孔膜支撑组件；包围在多孔膜***用于防止液滴蒸发的防液体蒸发组件。本发明同时公开了一种利用上述装置进行细胞迁移的方法。该装置结合微流控芯片和液滴技术的优势，利用液滴在多孔膜上下表面的相对位置变化，构建灵活的微型细胞实验装置，用于多种细胞迁移模式的研究，如竞争性细胞迁移、细胞趋化迁移、多细胞共同作用的细胞迁移等。适用于高通量药物筛选、细胞迁移行为的病理生理学机制的研究，以及周围细胞或物质对细胞迁移行为的影响的研究等。

Description

用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置及方法

技术领域

本发明涉及的领域为微流控分析领域，特别涉及一种用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置及使用该装置进行细胞迁移实验的方法。

背景技术

细胞迁移与多种生理病理现象息息相关，原癌细胞扩散、免疫细胞的免疫应答、胚胎发育过程等都涉及到细胞迁移，可见细胞迁移是研究病理、生理学问题的重要内容。传统研究细胞迁移的方法有划痕法、琼脂糖平板法、Boyden小室等方法，但是传统方法试剂消耗量大，通量低，细胞计数不够精确，往往难以实时观察，并且很难模拟复杂的环境用以研究多模式较复杂微环境下的细胞迁移。

微流控技术以其试剂消耗量低、操作灵活、结构多变，可以模拟复杂微环境等优势，近年来在细胞迁移研究方面得到了较多应用。如Kamm研究组采用的通道加凝胶的微流控芯片结构，可以在中间的细胞培养室和凝胶中形成物质浓度梯度分布，用于细胞迁移的研究。利用这一方法该研究组研究了内皮细胞的迁移(Advanced Materials,2009,21,4863)、神经突触受刺激后的反应(Lab on a Chip,2011,11,497)等，并于2012年(NatureProtocols,2012,7,1247)发表论文***性说明其方法的具体操作方案，类似这一方法的装置也为很多研究细胞迁移行为的学者所使用。还有文献报道利用窄细通道研究单个细胞迁移的性质，并发现迁移速度和比例与细胞密度有关(AngewandteChemie InternationalEdition,2014,53,2344)。通过在芯片通道内加工微柱阵列，Wong等(Nature Materials,2014,13,1063)研究了上皮细胞间质转化在恶性肿瘤迁移中的作用。将微流控的集成化优势用于复杂环境多细胞共培养，可以更好地研究细胞迁移行为，甚至可以模拟脏器环境中的细胞行为(Science,2010,328,1662)。

众多微流控***可以在微通道内形成药物浓度梯度，用于研究细胞迁移机制、趋化因子的作用、药物筛选等。但是其***往往带有复杂的液体控制装置，需繁琐的操作，在一块芯片上难以实现高通量的实验。采用基于封闭型微通道设计的微流控芯片还往往存在通道易堵塞，不易灵活操作等问题。如何设计简单灵活的微流控芯片，并具备以上优势是微流控芯片在细胞生物学领域发展的重要目标(Nature,2014,507,181)。

液滴微流控技术具有微量、高效、高通量的特点，但目前其在细胞生物学中的应用还处于起步阶段。

发明内容

本发明提供了一种用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置，该装置结合微流控芯片和液滴技术的优势，利用液滴在多孔膜上下表面的相对位置变化，构建灵活的微型细胞实验装置，用于多种细胞迁移模式的研究，如竞争性细胞迁移、细胞趋化迁移、多细胞共同作用的细胞迁移等。

本发明还公开了一种利用上述装置进行细胞迁移分析实验的方法，该方法结合微流控芯片和液滴技术的优势，利用液滴在多孔膜上下表面的相对位置变化，构建灵活的微型细胞实验，适用于高通量药物筛选、细胞迁移行为的病理生理学机制的研究，以及周围细胞或物质对细胞迁移行为的影响的研究等。

本发明的具体技术方案如下：

一种用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置，包括：

用于承载液滴的多孔膜；

用于保证多孔膜处于铺展状态的多孔膜支撑组件；

包围在多孔膜***用于防止液滴蒸发的防液体蒸发组件。

本发明的用于细胞迁移实验的微流控液滴芯片装置，主要由多孔膜、多孔膜支撑组件、液滴位置控制组件、防液体蒸发组件组成，使用时一般将整个装置置于透明器皿中。

本发明即可在多孔膜一侧设置液滴位置控制组件，也可在两侧均设置液滴位置控制组件，需根据实际需要确定。作为优选，所述多孔膜一侧贴覆有第一液滴位置控制组件，该第一液滴位置控制组件上设有通孔阵列。作为进一步优选，所述多孔膜另一侧贴覆有第二液滴位置控制组件，该第二液滴位置控制组件上设有通孔阵列。

作为进一步优选，所述第一液滴位置控制组件中的通孔与第二液滴位置控制组件中至少一个通孔在多孔膜上的投影部分或全部重叠，投影部分或全部重叠的通孔构成一个液滴链，多个上述液滴链构成液滴链阵列。

根据本发明，所述的多孔膜固定于多孔膜支撑组件上，多孔膜呈铺展状态。更为有利的是，多孔膜呈平面铺展状态。所述的液滴位置控制组件与多孔膜配合，分别在多孔膜的上表面和下表面形成水相液滴，多孔膜上表面和下表面的液滴之间部分地或全部地通过多孔膜的膜孔相连通。所述的防液体蒸发组件被用来覆盖或包裹多孔膜和多孔膜上表面和下表面的液滴，以防止液滴的蒸发。

本发明所述的多孔膜支撑组件的材质为高分子聚合物材料，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、硅橡胶等，或者是无机和有机复合材料，或者是玻璃、石英、硅、金属等无机材料。

本发明所述的液滴位置控制组件具有通孔阵列，其从芯片上下两面贴合多孔膜，形成类似“三明治”型结构。这种液滴位置控制组件中使用的芯片的材质为高分子聚合物材料，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、硅橡胶等，或者是无机和有机复合材料，或者是玻璃、石英、硅、金属等无机材料。所述的液滴位置控制组件的芯片的厚度范围为1微米至5厘米，芯片上通孔的直径范围为1微米至10厘米，通孔的截面形状为圆形、椭圆、矩形、或其他多边形；为保证液滴之间不会通过多孔膜表面进行物质传输而造成交叉污染或渗漏，芯片与多孔膜贴合的区域应不渗漏液体。

作为优选，所述防液体蒸发组件为浸没多孔膜和其表面的液滴，且与多孔膜上液滴不相溶的液相；或者，所述防液体蒸发组件为包围多孔膜和其表面的液滴的湿盒。当液滴为水相时，所述防液体蒸发组件采用与水相液滴不相溶的油相，浸没多孔膜和其表面的液滴与液滴位置控制组件；该油相具有一定透气性，以满足细胞培养的要求。所述防液体蒸发组件采用湿盒包裹多孔膜和其表面的液滴时，湿盒内保持较高的湿度，减少液滴的蒸发。该湿盒还可包裹部分或全部多孔膜支撑组件和液滴位置控制组件。

本发明所述的多孔膜的材质为高分子聚合物材料，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、硅橡胶等，或者是无机和有机复合材料，或者是玻璃、石英、硅、金属等无机材料，可购买商业化多孔膜产品也可实验室自行加工；多孔膜厚度范围为1微米至5毫米，膜上孔直径范围为1纳米至100微米，孔的截面形状可以为圆形、椭圆、矩形、或其他多边形，多孔膜的面积范围是10平方微米至1000平方厘米。作为优选，多孔膜上的孔为纵向独立通孔；作为优选，多孔膜具有透明或半透明性质，以方便观察；作为优选，多孔膜的上表面和下表面与液滴接触的部分具有亲水性质。

本发明也可通过对多孔膜的材质的选择或者对多孔膜表面进行选择性亲疏水处理，在多孔膜表面形成的亲水和疏水区域。通过亲水性和疏水性处理，间接起到了液滴位置控制组件的作用。作为优选，所述多孔膜承载液滴的部分具有亲水性，其余部分为疏水区域；所述多孔膜一侧承载液滴的区域与多孔膜另一侧的至少一个承载液滴的区域部分或全部重合。

本发明液滴形成方法可采用点液装置(如移液器、毛细管或点样针等)在多孔膜上表面和下表面的亲水区域点出液滴。或采用液体流过多孔膜表面的方法，在多孔膜上表面和下表面的亲水区域形成液滴。

当然本发明也可不使用任何多孔膜表面处理方法，采用点液装置(如移液器、毛细管或点样针等)直接在多孔膜的上表面和下表面的特定位置点出液滴。

根据本发明，上述多种结构液滴位置控制组件或者多孔膜表面处理或者多孔膜表面不经过任何处理等技术，可在同一装置中组合使用。作为优选，采用通孔阵列芯片的方法或多孔膜表面选择性处理的方法，有利于提高对液滴位置控制的准确性。

一种使用上述任一技术方案所述装置进行细胞迁移实验的方法，包括如下具体操作步骤：

(a)根据实验需要，借助液滴位置控制组件的帮助，确定在多孔膜上表面和下表面所需形成液滴的目标位置，即需要形成液滴的位置；

(b)借助液滴位置控制组件的帮助，在多孔膜的上表面的目标位置，形成一定体积的所需液滴。液滴形成方法包括采用点液装置(如移液器、毛细管或点样针等)在多孔膜表面的亲水区域点出液滴，或者采用液体流过多孔膜表面的方法，在多孔膜表面的亲水区域形成液滴。液滴内含溶液的种类包括：细胞悬液、或培养液、或刺激液、或诱导液、或稀释液、或缓冲液、或其他功能性溶液。

(c)将多孔膜的上、下表面反转，使其原来的下表面向上，借助液滴位置控制组件的帮助，在该表面(即此时多孔膜的上表面，也即原来多孔膜的下表面)的目标位置形成一定体积的所需的液滴。液滴形成方法包括采用点液装置(如移液器、毛细管或点样针等)在多孔膜表面的亲水区域点出液滴，或者采用液体流过多孔膜表面的方法，在多孔膜表面的亲水区域形成液滴。液滴内含溶液种类包括：细胞悬液、或培养液、或刺激液、或诱导液、或稀释液、或缓冲液、或其他功能性溶液；

(d)采用(b)、(c)的操作顺序和方法或者(c)、(b)的操作顺序和方法，在多孔膜的上、下表面形成多个液滴，构成通过多孔膜膜孔相连通的，由多个位于多孔膜上、下表面的液滴组成的液滴链；再以液滴链为基本单元，构成液滴链阵列，以进行复杂的细胞实验或进行高通量细胞实验；

(e)利用形成有液滴的微流控液滴芯片装置进行后续的细胞实验，包括：

i.将该装置放入细胞培养箱，或活细胞工作站，或其他细胞培养装置中，进行液滴内细胞的培养和迁移实验；

ii.在实验过程中，根据实验需要，在一定时间向目标液滴加入一定体积的液体，进行细胞的刺激、或染色、或其他操作；根据实验需要，在一定时间从目标液滴内取出一部分液体，进行后续的分析、鉴定或实验，或者进行液滴内液体的更换；所述的加液和取液方法是采用点液或吸液装置(如移液器、毛细管或点样针等)，向在多孔膜表面的液滴内加入一定体积的液体，或者从多孔膜表面的液滴中取出一定体积的液体；

iii.采用显微镜或者其他成像观测设备，对在培养和迁移实验过程中，在多孔膜上、下表面的液滴内的细胞的状态(位置、形态、数量)和移动轨迹等进行光学成像观测，包括对位于液滴内不同层的细胞，多孔膜上表面的细胞、多孔膜下表面的细胞、在多孔膜膜孔中的细胞，进行整体成像或局部成像；或者去除多孔膜一面的液滴，保留多孔膜另一面的液滴，观察迁移到这一面细胞的状态，或者去除多孔膜一面的液滴，对另一面的细胞进行选择性地细胞固定和染色等操作后，进行成像观测或保存；当将液滴直径控制在显微镜视场范围内时，可实现在一个视场下完成液滴内全部细胞的绝对细胞计数，细胞计数准确，还可以得到液滴内全部细胞的形态、迁移数目、迁移距离、迁移速度、迁移方向等多项实验数据。

iv.根据ii和iii的实验，获取液滴内细胞在不同时间和空间的细胞状态信息，完成细胞形态变化分析，增殖、存活率检测，迁移百分比测定，功能蛋白的表达和分布测定，细胞分类，细胞间相互作用的研究，刺激物或诱导物对细胞迁移的影响研究，细胞迁移的分子机制研究，药物筛选等实验。作为优选，在一块芯片上，集成完成上述多种细胞实验。所述的装置可按需要对每个细胞液滴进行单独处理，如实现细胞形态观察、细胞位置确定、细胞死活分析等。同时，在同一块芯片可以集成完成多个细胞实验，如细胞形态变化、增殖情况、存活率检测、迁移百分比测定、药物筛选等。这是一般微流控芯片难以实现的。

本发明所述的用于细胞迁移实验的微流控液滴芯片装置的使用方法，在多孔膜上、下表面的液滴的位置是可以精确设定的，上、下表面液滴与多孔膜的接触面部分或全部重合。多个上、下表面的液滴通过多孔膜膜孔相连通形成不同构型的液滴链。在液滴链中，利用某一液滴内物质向相邻其他液滴的扩散作用，在液滴链内可形成该物质的浓度梯度，利用此浓度梯度可完成一系列细胞实验。在液滴链中的不同液滴内放置不同种类的细胞，利用不同液滴通过多孔膜膜孔相连通的特性，进行不同细胞间的相互作用实验，或者模拟生物活体的实验(如利用来自不同器官或组织的细胞构建液滴链)。通过调整液滴链中多孔膜上、下两表面上的液滴的相对位置，可以用于多种模式的细胞迁移实验，如竞争性细胞迁移、细胞趋化迁移、多细胞共同作用的细胞迁移等实验。

本发明所述的用于细胞迁移实验的微流控液滴芯片装置的使用方法，在实验过程中，多孔膜的上表面和下表面可根据需要，多次翻转变换上下位置，以方便分别操作和处理位于多孔膜的上表面和下表面的液滴。这也是本装置的优点之一，可以灵活操控位于多孔膜上、下表面的液滴。

本发明所述的用于细胞迁移实验的微流控液滴芯片装置的使用方法，在一个液滴内可以放置单一种类细胞，也可放置多种不同种类的细胞。细胞在液滴中的状态为均匀分布在一个液滴中呈现三维培养状态，或者贴于多孔膜表面呈现单层二维培养状态，或者在液滴与其他固相或液相的相界面上呈现单层生长状态，或者集中在液滴的某个区域呈现团状状态。

本发明的优点是，细胞和试剂消耗少，实验通量高；可以实时观察细胞状态；装置结构简单，易于搭建，操作简单、灵活、方便；可单独对每个液滴进行独立操作，亦可对芯片上的液滴链阵列进行整体处理；利用多个液滴链单元可以独立进行重复实验，避免由于通道相连引起的堵塞或相互干扰；芯片可以重复利用；实验过程不需要复杂的液体操控装置；当将液滴直径控制在显微镜视场范围内时，可实现对该液滴的全液滴成像，在一个视场下完成液滴内全部细胞的绝对细胞计数，细胞计数准确，还可以得到液滴内全部细胞的形态、迁移数目、迁移距离等多项实验数据；加药或物质刺激过程温和，避免剪切力的影响；通过对液滴链的设计、控制和灵活组合可以完成多种模式的细胞迁移实验，以及复杂的细胞相互作用实验，如竞争性细胞迁移、细胞趋化迁移、多细胞共同作用的细胞迁移等；细胞在液滴中的培养有多种模式可以选择，包括二维和三维条件，以及混合条件培养。

附图说明

图1是实施例1用于研究竞争性细胞迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的纵剖面示意图。

图2a是实施例1用于研究竞争性细胞迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的俯视示意图。

图2b是图2a中局部放大图。

图3是实施例1微流控液滴芯片装置用于研究竞争性细胞迁移的实验结果图。

图4a是实施例2用于研究细胞趋化迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的纵剖面示意图。

图4b是图4a的局部放大图。

图5a是实施例2用于研究细胞趋化迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的俯视示意图。

图5b是图5a的局部放大图。

图6是实施例2微流控液滴芯片装置用于研究细胞趋化迁移的的实验结果示意图。

图7是实施例2微流控液滴芯片装置用于研究细胞趋化迁移的的实验结果照片。

图8a是实施例3用于研究多细胞共同作用下细胞迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的纵剖面示意图。

图8b是图8a的局部放大图。

图9a是实施例3用于研究多细胞共同作用下细胞迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的俯视示意图。

图9b是图9a的局部放大图。

图10是实施例3微流控液滴芯片装置用于研究多细胞共同作用下细胞迁移的实验结果图。

图11是实施例4用于研究巨噬细胞对内皮细胞侵袭影响的微流控液滴芯片装置，其装置的纵剖面示意图。

图12a是实施例4用于研究巨噬细胞对内皮细胞侵袭影响的微流控液滴芯片装置，其装置的俯视示意图。

图12b是图12a的局部放大图。

图中：1-多孔膜，2-多孔膜支撑组件，3-与多孔膜下表面结合的液滴位置控制组件，4-与多孔膜上表面结合的液滴位置控制组件，5-压块，6-防液体蒸发组件，7、8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23-不同组成的液滴，13-液滴内贴壁与多孔膜上表面的细胞，14-通过多孔膜膜孔由多孔膜上表面液滴迁移到多孔膜下表面液滴的细胞。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

研究竞争性细胞迁移的微流控液滴芯片装置，参见图1和图2a，图1为装置纵剖面图，图2a为装置俯视图，图2b为图2a的局部放大图。整个芯片呈圆形，置于直径6厘米的透明塑料培养皿中，内加氟油(与水溶液不互溶，且具有一定透气性)浸没芯片作为防液体蒸发组件6，以厚度7毫米的亚克力环作为压块5置于芯片上防止芯片在油相中漂浮。多孔膜1为孔径8微米，厚度20微米的半透明聚碳酸酯膜(PC)。含阵列通孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片作为液滴位置控制组件3、液滴位置控制组件4分别与多孔膜1的上、下表面贴合，芯片厚度300微米，其上所含的通孔直径均为1.5毫米，两个芯片贴合的相对位置由事先设计的定位孔决定。多孔膜支撑组件2由厚度为3毫米的PDMS圆环构成，贴合在PDMS通孔阵列芯片(液滴位置控制组件3、液滴位置控制组件4)上，确保芯片水平稳定，且避免膜下表面的液滴与皿底接触。

使多孔膜1的下表面向上，此时含阵列通孔的液滴位置控制组件3位于多孔膜1上方。在相应位置的孔中加入液滴7和液滴8，均含有1：8稀释的基质胶，以细胞最适培养基稀释。液滴7和液滴8的差异在于，液滴7不含胎牛血清，液滴8含10％胎牛血清。利用以上方法，在多孔膜1的下表面形成液滴7和液滴8的重复液滴。将该装置置于细胞培养箱中半小时以上，确保基质胶交联稳定。取出该装置，将亚克力环压块5取下，反转多孔膜1使其上表面向上，此时含阵列通孔液滴位置控制组件3位于多孔膜1下表面，含阵列通孔的液滴位置控制组件4位于多孔膜上表面，再将亚克力环压块5复位。在相应的孔中点液滴9，液滴9为经过饥饿处理12小时，以无血清培养基重悬的细胞悬液。利用上述方法可以在多孔膜1上表面形成多个相同组成的液滴9。上述单个液滴7、液滴8、液滴9构成一个液滴链，多个上述液滴链构成液滴链阵列。上述中液滴7、液滴8、液滴9体积均为1000纳升。液滴7和液滴9，液滴8和液滴9均有约25％的膜上面积重叠。

最终多孔膜1上表面向上，下表面向下，置于培养箱中诱导细胞迁移24小时。液滴7和液滴8竞争性诱导液滴9中癌细胞迁移。24小时诱导结束后，显微镜拍摄液滴9位置膜上下的全部细胞，计数此液滴链中的全部细胞数。去除油相防液体蒸发组件6，PBS缓冲液清洗、多聚甲醛固定、结晶紫染色，撕下具有阵列通孔的液滴位置控制组件4，擦去多余细胞，对每个液滴链进行成像，得到迁移到液滴7和液滴8中的细胞数目。经计算即得细胞从液滴9分别迁移到液滴7、液滴8中的比例。

图3为以小鼠结肠癌细胞CT26为例的竞争性细胞迁移实验结果。细胞计数并计算可以得到CT26向无血清培养基的液滴7迁移的百分比和CT26向含血清培养基的液滴8迁移的百分比，可以检测到同一肿瘤细胞向多孔膜下两个液滴的迁移有极显著差异(***P＜0.001，t检验)。不同细胞对竞争迁移的反应也存在差异。利用该装置可以分析癌细胞向不同环境的迁移倾向。

实施例2

用研究细胞趋化迁移的微流控液滴芯片，参见图4a、图4b和图5a、图5b，图4a为用于细胞三维趋化迁移实验的点好液滴的装置的，图4b为图4a的局部放大图，图5a为用于细胞三维趋化迁移实验的点好液滴的装置的俯视图，图5b为图5a的局部放大图。整个芯片呈圆形，置于直径6厘米的透明塑料培养皿中，内加氟油浸没芯片作为防蒸发组件6，以厚度7毫米的亚克力环作为压块5置于芯片上防止芯片在油相中漂浮。多孔膜1为孔径8微米，厚度20微米的PC膜。含阵列通孔的PDMS芯片作为液滴位置控制组件3、液滴位置控制组件4分别与多孔膜1的上表面和下表面贴合，PDMS芯片厚度为300微米，其上所含的通孔直径均为1.2毫米，两个PDMS芯片贴合的相对位置由事先设计的定位孔决定。多孔膜支撑组件2由厚度3毫米的PDMS圆环构成，贴合在PDMS通孔阵列芯片(液滴位置控制组件3、液滴位置控制组件4)上，确保芯片水平稳定，且避免膜下表面的液滴与皿底接触。

使多孔膜1下表面向上，此时含阵列通孔的液滴位置控制组件3位于多孔膜1上方。在相应位置的孔中加入液滴10，液滴10含有1：8稀释的基质胶，以无血清培养基稀释。利用以上方法可以在多孔膜1下表面形成多个重复液滴10。将该装置置于细胞培养箱中半小时以上，确保基质胶交联稳定。取出装置，将亚克力环压块5取下，反转多孔膜1使其上表面向上，此时含阵列通孔的液滴位置控制组件3位于膜下表面，含阵列通孔的液滴位置控制组件4位于膜上表面，再将亚克力环压块5复位。在预设定的位置点液滴11，液滴11为含有50％胎牛血清的培养基，在膜上表面形成多个重复的液滴11。在相应的孔中点液滴12，液滴12为经过饥饿处理12小时，以无血清培养基重悬的细胞悬液，利用上述方法可以在膜上表面形成多个重复的液滴12。上述单个液滴10、液滴11、液滴12构成一个液滴链，多个上述液滴链构成液滴链阵列。上述中液滴10、液滴11、液滴12体积均为800纳升。液滴10和液滴11，液滴10和液滴12均有约15％的膜上面积重叠。

最终多孔膜1上表面向上，下表面向下，置于培养箱中诱导细胞迁移4天。液滴11中的血清可以诱导液滴12中的部分细胞发生穿膜定向迁移。分别在不同液滴12中加入人乳腺癌细胞MCF7、人结肠癌细胞RKO、人乳腺癌细胞MDA-MB-231，4天诱导结束后，可以观察到MCF7几乎无细胞穿过多孔膜，RKO细胞可以穿过多孔膜但是无向液滴11方向的定向迁移，MDA-MB-231存在细胞穿过多孔膜现象，并且部分细胞向液滴11方向迁移，即迁移到液滴10非与液滴12重合的部分。

MDA-MB-231细胞的三维趋化迁移结果参见图6，其中图6a和图6b为迁移前细胞13和迁移后细胞14的位置示意图。图7为MDA-MB-231细胞趋化迁移4天后的明场照片和荧光图片，可以看到部分细胞越过了液滴10和液滴12的交界面。具有***性质的癌细胞MDA-MB-231迁移能力更强，这个装置、方法可以用来研究上皮***转化实验，也可以用来判断不同癌细胞的迁移能力。

实施例3

多细胞共同作用下细胞迁移的微流控液滴芯片装置，其装置的结构示意图参见图8a、图8b和图9a和图9b，图8a为装置纵剖面图，图8b为图8a的局部放大图，图9a为装置俯视图，图9b为图9a的局部放大图。整个芯片呈圆形，置于直径6厘米的透明塑料培养皿中，内加氟油浸没芯片作为防蒸发组件6，以厚度7毫米的亚克力环作为压块5置于芯片上防止芯片在油相中漂浮。多孔膜1为孔径8微米，厚度20微米的PC膜。含阵列通孔的PDMS芯片作为液滴位置控制组件3、液滴位置控制组件4分别与多孔膜1的下表面和上表面贴合，PDMS芯片厚度为300微米，液滴位置控制组件3上所含的通孔直径均为1.2毫米，液滴位置控制组件4上所含的通孔直径均为2.5毫米，两个PDMS芯片贴合的相对位置由事先设计的定位孔决定。多孔膜支撑组件2由厚度3毫米的PDMS圆环构成，贴合在PDMS通孔阵列芯片(液滴位置控制组件3、液滴位置控制组件4)上，确保芯片水平稳定，且避免膜下表面的液滴与皿底接触。

使多孔膜1下表面向上，此时含阵列通孔的液滴位置控制组件3位于膜上方。在相应位置的孔中加入液滴16、液滴17、液滴18、液滴19、液滴20，除含有1：8稀释的基质胶和完全培养基外，每个液滴中分别含有心、肝、肾、肠、肺等脏器细胞，或不含细胞的空白对照。利用以上方法可以在多孔膜下表面形成花瓣型分布的液滴阵列。将亚克力环压块5取下，反转多孔膜1使其上表面向上，此时含阵列通孔的液滴位置控制组件4位于膜上方，亚克力环压块5复位。将此装置置于细胞培养箱中半小时以上，确保基质胶交联稳定。交联完毕后从培养箱中取出装置，在预设定的位置点液滴15，液滴15为经过饥饿处理12小时，以无血清培养基重悬的癌细胞悬液，利用上述方法可以在多孔膜1上表面形成多个重复的液滴15。上述单个液滴15、液滴16、液滴17、液滴18、液滴19、液滴20构成一个液滴链，多个上述液滴链构成液滴链阵列。上述中液滴16、液滴17、液滴18、液滴19、液滴20体积均为800纳升。液滴15体积为2000纳升。液滴16、液滴17、液滴18、液滴19、液滴20各有约25％的膜上面积与液滴15重叠。

最终芯片上表面向上，下表面向下，置于培养箱中诱导细胞迁移1天。结果参照图10所示，图10左图为诱导过程中40倍显微镜下的一个液滴链的照片，图10右图为诱导结束后，细胞固定染色并移除阵列芯片4及其上的液滴15后的显微镜照片。在该装置中各个脏器的细胞既相对独立又相互作用，可以更好的模拟体内复杂的细胞环境下的癌细胞迁移，用以研究原癌细胞迁移的器官倾向性。

实施例4

细胞侵袭是细胞迁移的一种，细胞需要分泌水解酶，分解细胞外基质胶才能穿过多孔膜。用于研究巨噬细胞对内皮细胞侵袭影响的微流控液滴芯片装置，其装置的结构示意图参见图11和图12a、图12b，图11为装置纵剖面图，图12a为图为装置俯视图，图12b为图12a的局部放大图。以湿盒作为防蒸发组件6，整个芯片呈正方形，多孔膜1为厚度100微米的PDMS膜，其上含有占面积20％的通孔，通孔直径为5微米。多孔膜1通过展平置于多孔膜支撑组件2中，多孔膜支撑组件2为两个镜像放置的方形玻璃皿。两个方形玻璃皿确保多孔膜1水平稳定，且保护膜上下的液滴不受破坏。

使多孔膜下表面向上，小心取下此时位于多孔膜上方的方形玻璃皿，在此时多孔膜的上表面上用移液器点出液滴21，液滴21中含有用完全培养基1:5稀释的细胞外基质胶，用移液器在同一表面上点出重复的液滴21。将方形玻璃皿复位，整个芯片装置翻转，此时多孔膜1上表面向上，下表面向下，取下多孔膜1上方的方形玻璃皿，在体视镜下用移液器在多孔膜1上表面点出液滴22和液滴23，其中液滴22中含有巨噬细胞RAW264.7，液滴23包括1微升的1:5基质胶和1微升的内皮细胞HUVEC悬液，在点液滴23时先点1微升的1:5基质胶，后在同一位置点1微升的内皮细胞悬液。确保液滴22和液滴23的下表面均与液滴21的上表面完全接触，同时液滴22和液滴23不融合。采用同样方法，在已形成液滴21阵列的多孔膜上表面形成液滴22和液滴23的阵列。上述单个液滴21、液滴22、液滴23构成一个液滴链，多个上述液滴链构成液滴链阵列。上述中液滴22、液滴23体积均为2微升。液滴21体积为8微升。

最终芯片多孔膜1上表面向上，下表面向下，以方形玻璃皿固定，置于湿盒中(湿盒开有小孔透气)，后放于培养箱中，诱导细胞迁移1天。最终结果显示存在巨噬细胞作用较无巨噬细胞的对照组，内皮细胞形变更大，迁移更多。

这一试验中采用的基质胶浓度较高，且内皮细胞穿过膜上的孔需要首先分解基质胶，该装置可以研究巨噬细胞在内皮细胞的侵袭中的作用。结果与文献报道一致，即巨噬细胞对内皮细胞的侵袭有促进作用，这可能是由于巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引起了内皮细胞迁移的增加。

Claims (6)

1.一种用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置，其特征在于，包括：

用于承载液滴的多孔膜(1)；

用于保证多孔膜(1)处于铺展状态的多孔膜支撑组件(2)；

包围在多孔膜(1)***用于防止液滴蒸发的防液体蒸发组件(6)；

所述多孔膜(1)一侧贴覆有第一液滴位置控制组件(3)，该第一液滴位置控制组件(3)上设有通孔阵列；

所述多孔膜(1)另一侧贴覆有第二液滴位置控制组件(4)，该第二液滴位置控制组件(4)上设有通孔阵列；

所述第一液滴位置控制组件(3)中的通孔与第二液滴位置控制组件(4)中至少一个通孔在多孔膜(1)上的投影部分或全部重叠，投影部分或全部重叠的通孔构成一个液滴链，多个上述液滴链构成液滴链阵列；

所述多孔膜(1)厚度范围为1微米至5毫米，膜上孔直径范围为1纳米至100微米；

所述多孔膜上的孔为纵向独立通孔。

2.根据权利要求1所述的用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置，其特征在于，所述防液体蒸发组件(6)为浸没多孔膜(1)和其表面的液滴、且与多孔膜(1)上液滴不相溶的液相；或者，所述防液体蒸发组件(6)为包围多孔膜(1)和其表面的液滴的湿盒。

3.根据权利要求1所述的用于细胞迁移分析实验的微流控液滴芯片装置，其特征在于，所述多孔膜(1)两侧承载液滴的部分具有亲水性，其余部分为疏水区域；所述多孔膜(1)一侧承载液滴的区域与多孔膜(1)另一侧的至少一个承载液滴的区域部分或全部重合。

4.一种使用权利要求1-3任一权项所述装置进行细胞迁移实验的方法，其特征在于，包括：

(a)在多孔膜(1)的一侧的目标位置形成所需液滴，液滴内的溶液包括：细胞悬液、培养液、刺激液、诱导液、稀释液、缓冲液和其他功能性溶液中的一种或多种；

(b)在多孔膜(1)的另一侧的目标位置形成所需的液滴；液滴的溶液包括：细胞悬液、培养液、刺激液、诱导液、稀释液、缓冲液和其他功能性溶液中的一种或多种；

(c)通过步骤(a)和步骤(b)在多孔膜(1)的两侧表面形成多个液滴，构成通过多孔膜(1)膜孔相连通的、由多个位于多孔膜(1)上、下表面的液滴组成的液滴链；再以液滴链为基本单元，构成液滴链阵列，通过这些液滴链阵列进行细胞实验。

5.根据权利要求4所述的进行细胞迁移实验的方法，其特征在于，所述细胞实验包括下列实验或操作的一种或多种：

液滴内细胞的培养和迁移；

液滴内细胞的刺激、或染色；

液滴成分分析、鉴定；

液滴内液体的更换；

对多孔膜两侧表面的液滴内的细胞的状态和移动轨迹进行光学成像观测；

去除多孔膜一侧的液滴，保留多孔膜另一侧的液滴，观察多孔膜一侧液滴内细胞迁移到另一侧的状态；

去除多孔膜一侧的液滴，对另一侧的细胞进行选择性地细胞固定和染色，进行成像观测或保存；

获取液滴内细胞在不同时间和空间的细胞状态信息，完成细胞形态变化分析，增殖、存活率检测；

获取液滴内细胞迁移百分比测定；

获取液滴内功能蛋白的表达和分布测定；

细胞分类，细胞间相互作用的研究；

刺激物或诱导物对液滴内细胞迁移的影响研究；

细胞迁移的分子机制研究，药物筛选实验。

6.据权利要求5所述的进行细胞迁移实验的方法，其特征在于，步骤(c)中的细胞实验为：在液滴链中，利用某一液滴内物质向相邻其他液滴的扩散作用，在液滴链内形成该物质的浓度梯度；在液滴链中的不同液滴内放置不同种类的细胞，利用不同液滴通过多孔膜膜孔相连通的特性，进行不同细胞的相互作用实验，或者模拟生物活体的实验；通过调整液滴链中多孔膜两侧表面上的液滴的相对位置，进行多种模式的细胞迁移实验，包括竞争性细胞迁移、细胞趋化迁移、多细胞共同作用的细胞迁移实验中的一种或多种。