CN106577766B - 一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物、其制备方法及用途，其中：含吡唑醚菌酯为15~300µg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶~1×10¹⁰CFU/ml；将95%吡唑醚菌酯原药用甲醇配成1×10⁴µg/ml的母液，4℃低温保存；淀粉芽孢杆菌X60菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰‑1×10¹²CFU/ml；将吡唑醚菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含吡唑醚菌酯为15‑300µg/ml、解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶‑1×10¹⁰CFU/ml的组合物。本发明对烟草烟草白粉病具有较好的防治效果，环境友好。

Description

一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物，同时还涉及该生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，及该生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途。

背景技术

烟草白粉病(white powder)是烟草生长上发生的由烟草白粉病菌Erysiphecichoracearum DC引起的真菌性病害。它们均具有间歇性和爆发性的特点，严重时烟叶发病率可高达90％，使烤烟质量下降1～2个等级，重病区减产、减收达50％以上。近年来，烟草白粉病一直是严重威胁烟草生产的主要病害之一。因此，对烟草白粉病的防治迫在眉睫。

长期以来，生产上主要靠化学防治药剂多菌灵、***酮等来防治烟草白粉病。由于病菌具有繁殖速率高、遗传变异大和适合度高的特性，多年连续大量使用化学药剂使得病原菌对主要防治杀菌剂产生严重的抗药性。因此，亟待寻找新的病害防治解决方案。甲氧基丙烯酸酯内化学杀菌剂吡唑醚菌酯是一种现代广谱、高效、内吸性杀菌剂，纯品为白色至浅米色无味结晶固体，别名为N-f2-[1-(4-氯苯)-1H-吡唑-3-基氧甲基]苯卜N-甲氧氨基甲酸甲酯，熔点63.7-65.2℃，蒸气压20-25℃为2.6×10^-8Pa。还未用于烟草病害的防治；同时，微生物菌剂可与病原菌竞争营养、空间位点，诱导植物产生抗病性，其次生代谢产物对病原菌具有抑制作用、对植物具有促生作用，且绿色、环保、安全，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种对烟草烟草白粉病具有较好的防治效果，环境友好的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物。

本发明的另一目的在于提供该生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供该生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途。

本发明的一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物，含吡唑醚菌酯为15～300μg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶～1×10¹⁰CFU/ml。

其中：解淀粉芽孢杆菌X60，其形态特征：在NA培养基上培养24小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间***，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。

该菌种已于2013年8月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏号：CCTCC M 2013375，名称为：解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillusamyloliquefaciens X60)，

(一)解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillus amyloliquefaciens)的分离步骤：

采用“稀释分离法”称取10g烟草根围土壤于洁净烧杯中，加于90ml无菌水，磁力搅拌使其充分混匀，静置20分钟后吸取0.5ml上清液于15×150mm洁净试管中，添加4.5ml无菌水充分混匀得10^-1浓度母液，再从稀释后的试管中吸取0.5ml上清液，再加入4.5ml无菌水充分混匀制得10^-2浓度溶液，依次稀释至10^-9不同浓度的土壤溶液待用。分别吸取上述不同浓度土壤溶液100μl，均匀涂布于培养细菌的NA平板上，28℃黑暗培养，待细菌长出后挑取单菌落纯化。

(二)培养基：

牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂粉16g，水1000ml，pH6.8～7.2。

牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6.8～7.2。

(三)菌种的保种和传代：

用18×180mm的试管，盛NA培养基9ml，做成斜面，接种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。

将纯化后的细菌在NA培养基上划线培养，待细菌长出后挑出单菌落，用灭菌的牙签将细菌单菌落挑至装有5ml NB培养基的试管(15×150mm)里摇培24h，吸取700μl菌液至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700μl 30％灭菌甘油，置于-20℃冰柜中长期保存。

(四)菌种的形态特征：

该菌形成的菌落在NA平板上，30℃，培养2d，菌落直径5～15mm，菌落近圆形、白色、半透明、光滑湿润、稍***，菌体为短直杆状，为好氧细菌，革兰氏反应阳性。经细菌鉴定手册描述，结合Biolog鉴定结果及16S rDNA序列分析结果，将这一菌株记为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens X60)。

(五)菌种的培养特性

培养温度20～50℃，最适温度范围30～37℃；培养初始pH4.0～9.0，最适6.0～7.0；培养盐浓度0.5～5％，最佳0.5％；可培养碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、纤维二塘、淀粉，其中葡萄糖最佳；可培养氮源有牛肉膏、蛋白胨、KNO₃、NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄和NaNO₂，其中牛肉膏和蛋白胨最佳。

本发明的一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将95％吡唑醚菌酯原药用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，4℃低温保存，待用；

(2)在NB培养液中摇培解淀粉芽孢杆菌X60，10000rpm下离心10分钟收集解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体；将解淀粉芽孢杆菌X60在NB培养液中30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(3)将吡唑醚菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含吡唑醚菌酯为15-300μg/ml、解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶-1×10¹⁰CFU/ml的组合物。

上述的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，其中牛肉膏蛋白胨液体培养液(NB)的配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌20分钟后。

上述的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，其中菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。

本发明的一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明将吡唑醚菌酯与高效生防菌进行组合，解淀粉芽孢杆菌用湿菌与菌种保藏液配制而成，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、及0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂；吡唑醚菌酯先用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，使用时用含0.01％吐温40的无菌水稀释。该组合物可以直接喷雾烟草叶片。本发明是专门针对烟草白粉病开发的防病组合物。经活体试验表明，解淀粉芽孢杆菌菌株X60与吡唑醚菌酯组合物对烟烟草白粉病具有较好的抑制作用，且具有较长时间的预防作用。病害防治效果比吡唑醚菌酯单独作用、及解淀粉芽孢杆菌单独作用时的防治效果好。由于组合物对病原菌的作用位点多，对环境友好，可有效解决烟草白粉病菌对传统防治药剂产生的抗药性问题，有利于烟叶的安全可持续发展。

因此，将其用于烟草白粉病的防治具有广阔的发展空间，同时也是农业安全可持续发展的需要。

具体实施方式

实施例1

一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)从烤烟(Nicotiana tabacum L.)根际土壤中分离得到。解淀粉芽孢杆菌X60在NA培养基上培养24小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间***，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。

将解淀粉芽孢杆菌X60在NB培养液(NB培养液配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌)30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液(菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂)，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(2)将95％吡唑醚菌酯原药用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，4℃低温保存，待用。

(3)配制最终测试浓度中含吡唑醚菌酯为300μg/ml、含解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶CFU/ml的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物。

实施例2

一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌X60在NB培养液(NB培养液配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌)30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液(菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂)，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(2)将95％吡唑醚菌酯原药用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，4℃低温保存，待用；

(3)配制最终测试浓度中含吡唑醚菌酯为20μg/ml、含解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁹CFU/ml的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物。

实施例3

一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌X60在NB培养液(NB培养液配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌)30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液(菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂)，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(2)将95％吡唑醚菌酯原药用甲醇配成1×10⁴μg/m的母液，4℃低温保存，待用；

(3)配制最终测试浓度中含吡唑醚菌酯为15μg/ml、含解淀粉芽孢杆菌X60为1×10¹⁰CFU/ml的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物。

试验例：实施例1-3制得的解淀粉芽孢杆菌X60与吡唑醚菌酯组合物对烟草白粉病的抑制试验

白粉病的防治试验在大田中进行，待旺长期烟叶上开始零星出现烟草白粉病病斑时开始实验。

生防菌处理组Ⅰ，将制得的1×10¹⁰CFU/ml解淀粉芽孢杆菌菌剂均匀喷雾至烟苗叶片表面，直至流失；

吡唑醚菌酯处理组Ⅱ，200μg/ml的吡唑醚菌酯喷雾，直至流失；

实施例1组合物处理组(I)，300μg/ml的吡唑醚菌酯与1×10⁶CFU/ml解淀粉芽孢杆菌组合物喷雾，直至流失；实施例2组合物处理组(II)，20μg/ml的吡唑醚菌酯与1×10⁹CFU/ml解淀粉芽孢杆菌组合物喷雾，直至流失；实施例3组合物处理组(Ⅲ)，15μg/ml的吡唑醚菌酯与1×10¹⁰CFU/ml解淀粉芽孢杆菌组合物喷雾，直至流失；多菌灵对照处理组Ⅳ，80％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释喷雾，直至流失；空白对照组Ⅴ，喷雾无菌水。每处理处理烟苗60株。烟叶于自然条件下发病。20天后观察记录叶片发病情况，并调查病情指数，计算防效。

按照以下的病情统计分级，根据叶片发病面积进行病情统计：

0级：全叶无病斑；

1级：病斑面积占叶片面积的1％以下；

3级：病斑面积占叶片面积的2％～5％；

5级：病斑面积占叶片面积的6％～10％；

7级：病斑面积占叶片面积的11％～20％；

9级：病斑面积占叶片面积的21％以上。

田间试验表明，解淀粉芽孢杆菌X60与吡唑醚菌酯菌剂组合物组能够很好的预防烟草白粉病的发生，其防治效果达到93.13％

表2各组施用20天后对烟草白粉病的防效

Claims (5)

1.一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途，其中：该组合物含吡唑醚菌酯为15~300 µg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶~ 1×10¹⁰CFU/ml。

2.如权利要求1所述的一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途，其中：解淀粉芽孢杆菌X60，保藏号：CCTCC M 2013375。

3.如权利要求1或2所述的一种生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途，其中：该组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将95%吡唑醚菌酯原药用甲醇配成1×10⁴µg/ml的母液，4℃低温保存，待用；

（2）在NB培养液中摇培解淀粉芽孢杆菌X60，10000 rpm下离心10分钟收集解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体；将解淀粉芽孢杆菌X60在NB培养液中30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

（3）将吡唑醚菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含吡唑醚菌酯为15-300 µg/ml、解淀粉芽孢杆菌X60为1×10⁶-1×10¹⁰CFU/ml的组合物。

4.如权利要求3所述的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途，其中牛肉膏蛋白胨液体培养液（NB）的配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8～7.2，经120℃灭菌20分钟后。

5.如权利要求3所述的生防细菌和吡唑醚菌酯的组合物在防治烟草白粉病方面的用途，其中菌体保藏液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液、0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。