CN104962501B - 一种抗蔬菜水果灰霉病的菌株、拮抗剂的制备及应用 - Google Patents

一种抗蔬菜水果灰霉病的菌株、拮抗剂的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗蔬菜水果灰霉病的菌株、拮抗剂的制备及应用，所述微生物菌株为链霉菌（Streptomyces.sp）菌株ALS‑045，保藏编号为CGMCC No：10986。拮抗剂制备包括菌株筛选，温室盆栽活性验证，菌株生物学鉴定，生物活性制剂制备，田间活性验证等步骤。本发明菌株ALS‑045是防治蔬菜水果灰霉病害生物制剂的优良材料，产孢丰富、菌株液体培养条件简单、制剂剂型稳定，易于工业化放大，具有开发为绿色生物农药的优良潜力。

Description

一种抗蔬菜水果灰霉病的菌株、拮抗剂的制备及应用
技术领域
本发明属于放线菌菌株及其拮抗蔬菜水果病原菌的制剂，具体涉及链霉菌（Streptomyces. sp）菌株及其拮抗制剂。
背景技术
灰霉病是一个寄主范围很广的真菌病害，在水果、蔬菜温棚栽培中普遍发生和流行，灰霉病均由半知菌亚门丝孢纲丝孢目淡色孢科葡萄孢属的真菌引起，即感染Botrytis cinerea半知菌灰葡萄孢所引起。该病菌孢子梗数根丛生，褐色，有隔膜，顶端呈1~2次分枝，顶端密生小柄，大小为1452.5～3168.2微米×8.5～11.5微米。分生孢子椭圆形至圆形，单细胞，近无色，大小4.2～10.5微米×3.5～7.5微米。
灰霉病菌主要以病残菌丝、菌核和分生孢子越夏，借助于气流、雨水或露水传播，易被农事操作携带传播，霉病发生早、蔓延快、危害重、损失大。在大棚种植的蔬菜和水果中，如番茄、黄瓜、草莓、葡萄等都极易受到灰霉病原菌侵染。其中，蔬菜品种中，番茄以青果发病较重，病菌侵染残留的柱头或花瓣，扩展到果实，果皮灰白，有灰色霉层，水腐脱落。而黄瓜灰霉病侵入开败的雌花，在花蒂产生水渍状病斑和灰褐色霉层，花器***、萎缩和腐烂，幼瓜腐烂脱落。水果品种中，草莓果实从残留的花瓣或靠近地面的部位染病，导致果实腐烂，表面产生浓密的灰色霉层，造成病果率30%左右，严重可达60%以上。而葡萄灰霉病不但侵染葡萄花序和幼果，导致其失水、萎缩、干枯脱落，而且贮藏中也易严重损失。这些蔬菜水果生产减产和损失，轻者30～40%，重者50%以上。施用化学农药防控灰霉病是目前的主要方法。但化学农药严重污染环境，残留在农产品上的农药危及人类健康及生命。作为生物制剂的微生物活性代谢产物，具有防治有害生物、低毒、高效、选择性强、残留时间短、环境污染小的优点，与人类的生产和生活方式良好相融，而日趋完善的发酵工程提供了生物制剂工业化生产的基础。
发明内容
本发明旨在通过筛选、培养及试验，提供一种对蔬菜和水果灰霉病控制具有良好效果的拮抗灰霉病微生物Streptomyces. sp ALS-457菌种及其活性剂制备方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
（一）抗蔬菜水果灰霉病的菌株
所述菌株为链霉菌菌株（Streptomyces. sp）ALS-045，保藏编号为CGMCC No：10986。
（二）制备菌株Streptomyces. sp ALS-045拮抗剂的方法
包括以下步骤：
（1）制备孢子悬液
将来源于ALS-045菌株的产孢放线菌接种于经灭菌的ISP2琼脂斜面上接种，28℃培养4～7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜面中加入去离子水，用灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液；
上述斜面培养基ISP2培养基是：酵母浸膏4.0 g，麦芽浸膏10.0 g，葡萄糖4.0 g，琼脂20.0 g，自来水1 L；
（2）将50支ALS-045菌株制备孢子悬液，接种于100 L装有60 L已灭菌液体ISP2培养基的发酵罐中，28℃，120 L/min通气量，150 rpm培养3 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养；
（3）以步骤（2）培养液为种子液，移种到500 L装有350 L已灭菌液体改良高氏一号培养基的发酵罐中，28℃，120 L/min通气量，150 rpm，培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止通气；
上述液体改良高氏一号培养基的配制方法是：玉米淀粉10.0 g，蔗糖10.0 g，酵母浸膏6.0 g，NaCl 0.5g，NaNO3 2.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，自来水1 L，pH 7.4～7.6；
（4）按5%比例向步骤（3）发酵罐的培养体系中加入已灭菌的Amberlite XAD-16大孔吸附树脂，28℃，200 rpm吸附处理24 h，过滤发酵液，弃滤液，菌丝体和树脂相用90%工业乙醇提取3～5次，提取液减压浓缩即得生物制剂浓缩物；
（5）循环步骤（2）～（4），500 L放大发酵两次，共计获得外观为棕黄色油状浓缩物9274 g，即链霉菌菌株Streptomyces. sp ALS-045。
（三）拮抗剂在拮抗蔬菜水果灰霉病中的应用
应用包括：按溶剂体系体积比的1.5%取链霉菌菌株Streptomyces. sp ALS-045浓缩物加入溶剂体系，该溶剂体系的体积比为：乙醇：Tween80：水 =5：1：94，所述ALS-045浓缩物在该溶剂***下分散均匀稳定。
本发明具有实质性进步和技术效果：
本发明以菌丝体抑制和温室盆栽不同层次的筛选模型，获得其中能够抑制灰霉菌生长最强的微生物菌株ALS-045，经过分子生物学鉴定，ALS-045被鉴定为Streptomyces.sp菌株。该菌株已于2015年6月17日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行了有效保藏（地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101）。保藏号为：CGMCC No.10986。
本发明进一步以Streptomyces. sp ALS-045为出发菌株，经培养，
提取培养物，菌株液体培养条件直接利用发酵工程设备，产孢丰富，制剂剂型稳定。经配制所进行的田间小区实验证明：对防治蔬菜水果灰霉病具有良好效果。
本发明菌株ALS-045是防治蔬菜水果灰霉病害生物制剂的优良材料，易于工业化放大，具有开发为绿色生物农药的优良潜力。
附图说明
图1是菌株ALS-04516S rRNA基因序列***发育树状图。
图2是菌株ALS-045扫描电子显微镜形态图。
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
具体实施方式
一、菌株及筛选
1、制备发酵粗提取物
将分离自云南哀牢山国家级自然保护区土壤的87株产孢放线菌接种于ISP2琼脂斜面上，该斜面试管规格为ø15×150 mm，斜面培养基体积5 mL。每株菌接种2支斜面，其中1支为备用斜面，28℃培养4～7d，待菌丝体形成大量孢子后，除备用斜面外，向斜面中加入5mL无菌去离子水，用灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液备用。
上述斜面培养基的配制方法是：ISP2培养基（g/L）：酵母浸4.0 g，麦芽浸膏10.0g，葡萄糖4.0 g，琼脂20.0 g，自来水1 L；pH自然；配好后121℃灭菌20 min。
每株菌的孢子悬液分别接种到装有50 mL液体改良高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，每株菌接种3支三角瓶，同时设置未接菌的3支三角瓶为阴性对照。28℃、180 rpm条件下培养7d；待试管液体培养基内大量菌丝球生长，培养液颜色有明显变化时，按2%比例向各培养瓶中投加已灭菌的粒径范围为0.69 mm的Amberlite XAD-16大孔吸附树脂（北京赛福莱博科技有限公司），28℃、180 rpm原位吸附24 h后停止培养。
上述液体改良高氏一号培养基的配制方法是：玉米淀粉10.0 g，蔗糖10.0 g，酵母浸膏6.0 g，NaCl 0.5g，NaNO3 2.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，自来水1 L，pH 7.4-7.6。
统一收集各摇瓶培养液，用滤布进行过滤，菌渣和树脂采用乙醇提取；滤液采用乙酸乙酯萃取。乙醇和乙酸乙酯提取物分别减压浓缩，即得发酵粗提取物。发酵粗提取物在45℃真空干燥24 h后，各自准确称取10 mg用50 mL 95%乙醇溶解即得筛选样。其中，来源于菌渣和树脂采用乙醇提取样标记为M样；来源于培养过滤液乙酸乙酯提取样标记为Y样。之后，进入筛选。
2、筛选
将从蔬菜和水果灰霉病株中分离获得的致病菌接种到PDA琼脂斜面上，该斜面试管规格为ø15×150 mm，斜面培养基体积5 mL，统一在28℃、400 nm光照下培养6～8 d，待菌丝诱导产孢子后，向斜面中加入5 mL无菌水，用灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液作为筛选样备用。
将孢子悬液与灭菌后冷却至45℃的200 mL PDA琼脂培养基混合均匀，按20 mL/平皿的量倒入内径为9 cm的灭菌平板中，自然冷却后制备成带菌平皿。菌丝生长抑制法采用常规的杯碟法，在每个带菌平皿上放置灭菌牛津杯，在杯内用移液枪加入200微升上述筛选样。以95%乙醇为阴性对照，每处理重复3次，28℃、400 nm光照下培养72 h，用十字交叉法测定抑菌圈直径。
以上PDA培养基的配制方法是（g/L）：马铃薯200.0 g，蔗糖20.0 g，琼脂20.0 g，自来水1 L，pH 自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加糖，溶化后补足水至1 L，121℃灭菌30 min。
实验数据表明：在所有筛选样中，来源于ALS-045菌株菌渣和树脂乙醇提取样（M样）表现出优良的拮抗灰霉菌生长能力。抑菌圈直径分别达到35 mm、32 mm和29 mm，平均32mm；而来源于ALS-045菌株培养过滤液乙酸乙酯提取样（Y样）则无抑菌活性。
实验数据表明：Amberlite XAD-16大孔吸附树脂适用于处理ALS-045菌株的培养液的后续处理。
二、温室盆栽验证实验
考察供试样品菌株ALS-045培养物在温室盆栽条件下对主要蔬菜和水果灰霉病害的防治效果。对照药剂为：50%异菌脲可湿性粉剂，由吉林力生农化农药有限公司生产。
选择播种后10 d左右长势一致的黄瓜、番茄、草莓和葡萄子叶进行保护作用和治疗作用测定。
保护作用：将ALS-045菌株菌渣和树脂乙醇供试样品（M样）用棉签均匀涂抹于黄瓜、番茄、草莓和葡萄子叶正反两面，24 h后，剪下叶片，用经水充分润湿的棉花包于叶柄上。将培养了7 d左右的灰霉病病菌，用打孔器打成直径5 mm的菌饼，菌面向下，放置于叶片正面近叶尖及近叶柄处各放置1块。每处理设4个重复，每重复4片叶，并设清水为空白对照。在20℃的光照培养箱中保湿培养72 h（每天12 h光照，12 h黑暗）。
治疗作用：将培养了7 d左右的灰霉病病菌，用打孔器打成直径5 mm的菌饼，菌面向下，放置于叶片正面近叶尖及近叶柄处各放置1块。每处理设4个重复，每重复4片叶，并设清水为空白对照。在20℃的光照培养箱中保湿培养24 h（每天12 h光照，12 h黑暗）后，将ALS-045菌株菌渣和树脂乙醇供试样品（M样）用棉签均匀涂抹测试植物子叶正反两面，待药液干后剪下叶片，用经水充分润湿的棉球包于叶柄上，在20℃的光照培养箱中保湿培养。
观察发病情况：待空白对照充分发病时，采用十字测量法测量每个病斑直径，按病斑大小进行病情分级，按防治效果公式计算。分级标准为：0级：无病斑；1级：病斑直径0.1-5.0 mm；3级：病斑直径5.1-10.0 mm；5级：病斑直径10.1-15.0 mm；7级：病斑直径15.1-20.0mm；9级：病斑直径20.1 mm以上。该防治效果计算公式为：
病情指数=×100
防治效果（%）=×100
实验结果表明：ALS-045菌株菌渣和树脂乙醇供试样品（M样）对供试植物病害的温室盆栽防治效果良好。与对照药剂治疗性平均防效为87.68%比较，除葡萄平均防效为55.25%外，M样对黄瓜、番茄、草莓灰霉病害的治疗效果，平均防效均超过70%。其中，针对黄瓜治疗性平均防效为72.23%，针对番茄治疗性平均防效为76.45%，针对草莓治疗性平均防效为70.44%。对照药剂与M样的平均防效相当。
除外，该M样具有良好的保护作用。在保护模式模型下，针对上述四种植物，M样平均防效达到80%以上。其中，针对黄瓜保护性平均防效为82.14%，针对番茄保护性平均防效为88.67%，针对草莓保护性平均防效为84.90%，针对葡萄保护性平均防效为80.43%，而对照药剂保护性平均防效为84.24 %。
以上结果显示：ALS-045菌株良好的应用前景。
三、目的菌株ALS-045的分子生物学鉴定
1、基因组DNA提取、扩增和测序
将目的菌株ALS-045接种在已灭菌的50 mL ISP2液体培养基中，180 rpm，28°C下培养3 d，进行基因组DNA的提取、扩增和测序。其中，ISP2液体培养基的成分为（g/L）：酵母浸膏4.0 g、麦芽浸膏10.0 g、葡萄糖4.0 g、自来水1 L、pH自然，配好后121°C灭菌20 min。
（1）提取基因组DNA
取适量3-5 mL培养物，13000 rpm，离心1 min，弃培养基。加入DNA提取裂解液300微升，涡旋沉淀。65℃水浴30 min。加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），涡旋混匀，13000 rpm离心5 min。取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，13000 rpm，离心5 min。弃上清，加入70%乙醇混匀，13000 rpm离心1 min。弃乙醇，倒置离心管，晾干。加入30微升ddH2O，溶解DNA，-20℃保存。
（2）16S rRNA基因的扩增与测序
用以下两个引物扩增16S rRNA基因：
27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG GCG CTC AG-3′；
1541R：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CAG-3′）。
扩增体系含有：
DNA模板1微升（大约20～100 ng DNA）；
10×PCR缓冲溶液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3）；
500 mmol/L KCl；
15 mmol/L MgCl25微升；
dNTPs混合物4微升（每个dNTPs浓度为2.5 mmol/L，TaKaRa）；
1.25 U Taq酶（TaKaRa）；
两个引物（终浓度为0.4 μmol/L）各1微升；
无菌去离子水50微升。
PCR扩增仪器为GeneAmp PCR system（美国PE公司），扩增程序为：95°C 4 min；94°C 1 min，60°C 1 min，72°C 1 min，35个循环；72°C 10 min。
PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后用手术刀切出1500 bp大小的片段，用胶回收试剂盒（WATSON Gel Extraction Mini Kit）回收并纯化目的片段。
（3）用AB I PR ISM 377–96 sequencer测定序列，终止剂为BigDye（Perkin-Elmer），测序引物为27F和1541R。
测序反应体系：
纯化后的扩增产物约1 微升（约30 ng），
BigDye 2.5微升，
引物1微升（约3.2 pmol/L），
无菌去离子水10微升。
扩增程序为：95°C 1 min，56°C 1 min，72°C 1 min，35个循环；72°C，5 min；4°C保存。
通过对ALS-045菌株16S rRNA序列经过PCR扩增和测序，获得长度为886个有效16SrRNA基因碱基序列。
2、16S rRNA基因碱基的分析
测得的DNA序列经NCBI（National Center for Biotechnology Information）BLAST引擎搜索后获取相关种属的16S rRNA基因序列，用ClustalX 1.8软件进行排列。排除碱基缺失位点，用邻接法构建***发育树。距离矩阵按照Kimura’s双参数模型进行计算，Bootstrap检验进行1000次取样。
结果显示：目的菌株ALS-045在***进化发育树上的位置可靠（Bootstrap值>70）。线段标尺（0.005）表示0.5%序列差异的分支长度。在***进化发育树上，菌株ALS-045与标准菌株Streptomyces roseocinereus16S rRNA基因序列最大相似性达到99. 94%（见图1）。
3. 目的菌株ALS-045扫描电子显微镜观察
将ALS-045菌株制备孢子悬液（方法同实例1），取200微升均匀涂布到已制备ISP2琼脂平板上（ISP2培养基成分见实例1）。之后在平板上以30～45°角斜***已灭菌的盖玻片。平板在28℃恒温箱内培养15 d，待培养基表面大量着生有孢子的菌丝蔓延生长至盖玻片上即可停止培养。用镊子小心将附着有菌丝生长的盖玻片取出，放置于灭菌的105 mm空置培养皿内，在室温下充分干燥5 d后，进行菌丝体表面喷金，即可进行扫描电子显微镜观察。电子显微镜的型号为：Quanta 200（FEI公司，美国）。
从扫描电子显微镜观察结果看：菌株ALS-045呈现链霉菌属微生物典型特征：孢子链较长为螺旋状，孢子为椭球状，表面有突起（见图 2）。在自然光下观察，该菌生长初期菌落表面呈浅黄白色，随着生长时间延长，逐渐由粉白红色形成灰黄色；气生菌丝丰富、纤细；基内菌丝不断裂，为紫黄色；产可溶性紫黄色素，具有典型链霉菌的特征。但该菌的菌落、菌丝颜色及色素生成情况与标准菌株Streptomyces roseocinereus存在差异，尚需定种。
综合以上16S rRNA基因和微生物典型特征，推断菌株ALS-045属于链霉菌属（Streptomyces.sp）菌株。
四、菌株ALS-045生物制剂的制备
将50支ALS-045菌株制备孢子悬液（实例1），接种于100 L装有60 L已灭菌液体ISP2培养基（ISP2培养基配制方法同实例3）的发酵罐中（发酵罐型号为GUJS-100。镇江东方生物工程设备技术有限责任公司），28℃，120 L/min通气量，150 rpm培养3 d，待培养液内有大量菌丝球生长停止培养。以该培养液为种子液，将其移种到500 L装有350 L已灭菌液体改良高氏一号培养基（改良高氏一号培养基配制方法同实例1）的发酵罐中（发酵罐型号为GUJS-500。镇江东方生物工程设备技术有限责任公司），28℃，120 L/min通气量，150 rpm培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长停止通气。
按5%比例向培养体系中加入已灭菌的Amberlite XAD-16大孔吸附树脂，28℃，200rpm吸附处理24 h。发酵液过滤，滤液丢弃，菌丝体和树脂相用90%工业乙醇提取3-5次，提取液减压浓缩即得本生物制剂浓缩物。500 L放大发酵共进行两次，共计获得粗提取物9274g，其外观为棕黄色油状物。
按1.5%比例取样配制用于田间小区实验生物制剂，溶剂体系体积比为：
乙醇：Tween80：水 = 5：1：94
浓缩物在该溶剂***下分散均匀稳定。
五、ALS-045菌株生物制剂田间小区药效试验
按农业部药检所“农药田间药效试验准则”选择试验对象、作物和品种、作物栽培及环境条件。
试验药剂为：1.5% ALS-045生物制剂（由云南大学微生物研究所研制）。对照药剂为：400 g/L嘧霉胺悬浮剂（拜耳作物科学公司生产）及500 g/L异菌脲悬浮剂（拜耳作物科学公司生产）。
使用方法为喷雾法。施药器械为16L-8AH型背负式电动喷雾器。
根据各作物灰霉病发生发展规律制定相应的施药时间：在病害初，即发病率不超过5%发生时开始第一次施药，此后每间隔5～7 d一次，共3次。各供试药剂和清水对照均按750 L/公顷用量进行。按农业部药检所“农药田间药效试验准则”药效计算方法调查作物的防治效果。
2014年1月7日至2014年2月6日，在云南省昆明市西山区团结镇开展了1.5% ALS-045生物制剂防治草莓灰霉病田间药效试验。试验结果表明：1.5% ALS-045生物制剂（1800g/公顷剂量组）对草莓灰霉病的防治效果达到62.88%；对照药剂400 g/L嘧霉胺悬浮剂（750g/公顷）和500 g/L异菌脲悬浮剂（750 g/公顷）对草莓灰霉病的防治μμμ效果分别为81.79%、78.97%。
2014年8月2日至2014年9月1日，在云南省红河州建水县曲江镇开展了1.5% ALS-045生物制剂防治葡萄灰霉病田间药效试验。试验结果表明：1.5% ALS-045生物制剂（2700g/公顷剂量组）对葡萄灰霉病的防治效果达到69.82%；对照药剂400 g/L嘧霉胺悬浮剂（750g/公顷）和500 g/L异菌脲悬浮剂（750 g/公顷）对葡萄灰霉病的防治效果分别为82.48%、79.86%。
2014年8月20日至2014年9月18日，在云南省昆明市晋宁县昆阳镇开展了1.5%ALS-045生物制剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验，试验结果表明：1.5% ALS-045生物制剂（1800 g/公顷剂量组）对黄瓜灰霉病的防治效果分别为71.17%；对照药剂400 g/L嘧霉胺悬浮剂（750g/公顷）和500 g/L异菌脲悬浮剂（750 g/公顷）对黄瓜灰霉病的防治效果分别为81.44%、80.15%。
2014年10月10日至2014年11月9日，在云南省昆明市晋宁县昆阳镇开展了1.5%ALS-045生物制剂防治番茄灰霉病田间药效试验，试验结果表明：1.5% ALS-045生物制剂（1800 g/公顷剂量组）对番茄灰霉病的防治效果达到63.69%；对照药剂400 g/L嘧霉胺悬浮剂（750 g/公顷）和500 g/L异菌脲悬浮剂（750 g/公顷）对番茄灰霉病的防治效果分别为76.08%、73.88%。
以上结果表明：菌株ALS-045可作为生物制剂研发的优良材料，其制备的生物制剂具有防治蔬菜水果灰霉病害的优良效果，可以进一步开发成为绿色生物农药。

Claims (3)

1.一种抗蔬菜水果灰霉病的菌株，其特征是：所述菌株为链霉菌菌株（Streptomyces.sp）ALS-045，保藏编号为CGMCC No：10986。
2.利用权利要求1所述的菌株制备拮抗剂的方法，包括以下步骤：
（1）制备孢子悬液
将来源于ALS-045菌株的产孢放线菌接种于经灭菌的ISP2琼脂斜面上接种，28℃培养4～7 d，待菌丝体形成大量孢子后，向斜面中加入去离子水，用灭菌竹签轻刮洗菌苔制备孢子悬液；
上述斜面培养基ISP2培养基是：酵母浸膏4.0 g，麦芽浸膏10.0 g，葡萄糖4.0 g，琼脂20.0 g，自来水1 L；
（2）将50支ALS-045菌株制备孢子悬液，接种于100 L装有60 L已灭菌液体ISP2培养基的发酵罐中，28℃，120 L/min通气量，150 rpm培养3 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止培养；
（3）以步骤（2）培养液为种子液，移种到500 L装有350 L已灭菌液体改良高氏一号培养基的发酵罐中，28℃，120 L/min通气量，150 rpm，培养5 d，待培养液内有大量菌丝球生长即停止通气；
上述液体改良高氏一号培养基的配制方法是：玉米淀粉10.0 g，蔗糖10.0 g，酵母浸膏6.0 g，NaCl 0.5g，NaNO3 2.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O0.02 g，自来水1 L，pH 7.4～7.6；
（4）按5%比例向步骤（3）发酵罐的培养体系中加入已灭菌的Amberlite XAD-16大孔吸附树脂，28℃，200 rpm吸附处理24 h，过滤发酵液，弃滤液，菌丝体和树脂相用90%工业乙醇提取3～5次，提取液减压浓缩即得生物制剂浓缩物；
（5）循环步骤（2）～（4），500 L放大发酵两次，共计获得外观为棕黄色油状浓缩物9274g，该浓缩物是含有链霉菌菌株（Streptomyces. sp）ALS-045的拮抗剂。
3.如权利要求2所述方法制备的拮抗剂在拮抗蔬菜水果灰霉菌中的应用。
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