CN106574925B - 用于生物测定的底物介导的反应器 - Google Patents

用于生物测定的底物介导的反应器 Download PDF

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Abstract

本发明除其他情况之外提供了用于高效、稳健且多重分析生物分子的方法、组合物以及***，其基于与测定试剂的受控释放结合的底物介导的区室化，以用于无干扰检测生物分子。

Description

用于生物测定的底物介导的反应器
相关申请
本申请要求于2014年5月23日提交的美国临时专利申请序列号62/002,664的优先权和权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明背景
生物分子的量化是基础科学、转化研究和临床诊断的基础。能够同时分析多种生物标记的方法简化了工作流程并且最小化样品体积的要求。然而，由于靶特异性检测试剂的非预期性相互作用，往往难以以多重方式量化生物标记。这些“脱靶”相互作用限制了跨蛋白质和核酸靶的生物分子测量的多重水平、灵敏度以及特异性。
鉴于抗体固有的混杂性，蛋白质的多重检测为一项极具挑战性的任务。通常用于免疫测定的一种方法为夹心测定。在此测定中，使用底物结合的“捕获抗体”捕获靶并且通过使用结合靶并携带可检测部分的“检测抗体”使得靶的结合显而易见。
因为抗体总是表现出与脱靶样品分子或脱靶检测抗体的一定水平的交叉反应性，所以当以多重格式进行免疫测定时，测定的性能往往受到损害。因此，夹心测定最常以酶联免疫吸附测定(ELISA)格式使用，其中单一蛋白质靶以每个测定孔检测。使用在单重ELISA中表现良好的抗体对进行的多重蛋白测定的发展仍然需要大量的验证努力来确保相容性。
相似的相容性挑战存在于核酸的多重检测中。此挑战的一个实例为在多重PCR中。虽然PCR提供一种扩增靶分子以用于高灵敏度检测的稳健手段，但是当在一次扩增多种核酸靶时，所述技术容易出现非特异性扩增。通常，每种靶的扩增均使用具有对该靶特异的正向引物和反向引物的引物组来进行。当在单孔中扩增多种靶时，使用多个引物组。与免疫测定中的抗体交叉反应性相似，引物也可与彼此(异源二聚体)、与脱靶链、或与自身(同源二聚体)相互作用，从而导致脱靶物质的非预期扩增。因为这个原因，大多数PCR反应物，尤其是在定量PCR的情况下，在各个反应孔中物理分离。
发明概述
本发明提供一种用于靶特异性检测生物分子的高效、稳健且多重的测定***。具体地，本发明基于与测定试剂的受控释放相结合的底物介导的区室化，以用于使用简单的器械，诸如流式细胞仪或微阵列扫描仪来无干扰检测生物分子。因此，本发明克服了与试剂不相容性和“脱靶”相互作用相关联的各种挑战，并且实现了跨蛋白质和核酸靶的生物分子测量的显著提高的多重水平、灵敏度和特异性。
因此，在一个方面，本发明提供用于分析生物分子的方法，其包括：在允许靶生物分子与捕获部分之间的结合的条件下，将样品与多个多功能底物孵育，其中每个多功能底物包含具有一个或多个捕获部分的靶捕获区域以及通过可释放手段具有一种或多种检测试剂的试剂储存区域，每个所述捕获部分特异性结合靶生物分子；将不混溶流体与在载体流体中的所述多个多功能底物接触，从而形成多个隔室，每个隔室包含单个多功能底物；从所述试剂储存区域释放所述一种或多种检测试剂，以使得所述检测试剂在单个隔室内与结合捕获部分的所述靶生物分子结合；以及分析在所述检测部分与结合所述捕获部分的所述生物分子之间的结合，从而分析在所述样品中的所述靶生物分子的存在或量。
在一些实施方案中，所述多功能底物为多功能微粒。在一些实施方案中，所述底物由水凝胶制成。在一些实施方案中，所述水凝胶选自光致抗蚀剂、二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙二醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、藻酸酯、PLGA或其任何组合。在一些实施方案中，所述微粒为非球形颗粒。在一些实施方案中，每个隔室的形状基本上由所述多功能底物的形状限定。
在一些实施方案中，所述多个多功能底物包括单分散性微粒。在一些实施方案中，所述多个多功能底物包括其最长尺寸在1μm与500μm之间的多分散性微粒。在一些实施方案中，所述多功能底物包含空腔、凹陷或孔。
在一些实施方案中，所述多功能底物包含一个或多个细胞或细菌。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞或细菌释放能够在单个隔室内通过载体流体扩散的分子。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞或细菌释放能够通过不可渗透或半渗透不混溶相扩散的分子。在一些实施方案中，由所述一个或多个细胞或细菌释放的分子具有治疗活性或益生菌活性。
在一些实施方案中，所述一个或多个捕获部分选自抗体、纳米抗体、寡核苷酸探针、肽核酸、小分子、适体、细胞、细菌、病毒、细胞器、肽、或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂选自检测抗体、纳米抗体、酶、PCR引物、蛋白质、寡核苷酸、肽、适体、小分子、其他化学化合物或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂用检测部分标记，所述检测部分选自荧光团、发色团、放射性同位素、生物素、酶产物、抗体、量子点、分子信标和/或适体。
在一些实施方案中，所述多功能底物包含一个或多个疏水性区域。在一些实施方案中，所述一个或多个疏水性区域由疏水性聚合物构成。
在一些实施方案中，所述不混溶流体为可选择性渗透的。在一些实施方案中，所述不混溶流体为油并且所述载体流体为含水流体。在一些实施方案中，所述不混溶流体为含水流体并且所述载体流体为油。在一些实施方案中，所述油选自Fluorinert FC-40油、Tegasoft或矿物油。在一些实施方案中，所述油还包含表面活性剂诸如ABILWE-09、PFPE-PEG或一些其他双功能分子。
在一些实施方案中，所述靶生物分子为蛋白质、核酸、细胞、细菌或化学化合物。
在一些实施方案中，所述可释放手段选自可逆性相互作用、不可逆反应、可逆***联剂或光可裂解接头。在一些实施方案中，所述可逆性相互作用选自静电相互作用、物理相互作用、磁性相互作用、化学相互作用或核酸双链体形成。在一些实施方案中，所述不可逆反应为键裂解。在一些实施方案中，所述可逆***联剂选自分别通过羟胺、硫醇和/或高碘酸盐可裂解的EGS、DSP和/或DST。在一些实施方案中，所述光可裂解接头为基于1-(2-硝基苯基)乙基的接头。
在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂以受控方式从所述试剂储存区域释放到所述隔室中。在一些实施方案中，所述受控方式包括使用加热、紫外光、可见光、微波辐射、酶催化、pH或特异性化学剂作为刺激。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂在不同时间释放。
在一些实施方案中，所述接触步骤包括乳化的步骤。在一些实施方案中，所述乳化的步骤通过机械搅拌或剪切、声音搅动或微流体装置来实现。
在一些实施方案中，所述分析步骤包括量化存在于所述靶捕获区域中的检测部分的量，从而确定样品中的靶生物分子的量。
在一些实施方案中，所述每个多功能底物还包含编码区域。
在一些实施方案中，所述多功能底物使用基于荧光识别器或可见光识别器的流式细胞仪或微阵列扫描仪来分析。
在一些实施方案中，所述隔室在检测之前反转。
在一些实施方案中，所述多个多功能底物包含具有针对多个靶生物分子的多个捕获部分的多个多功能底物子组，并且其中所述方法分析在所述样品中所述多个靶生物分子的存在或量。
在另一个方面，本发明提供用于产生限定底物的隔室的方法，其包括：将不混溶流体与分散在载体流体中的底物集合接触以形成混合物；以及向所述混合物添加能量，从而在不混溶流体内产生离散的、含有底物的载体流体隔室，其中所述隔室的尺寸大于在底物不存在下所形成的隔室的尺寸。
在一些实施方案中，所述底物为颗粒。在一些实施方案中，所述底物由水凝胶制成。在一些实施方案中，所述颗粒是非球形。在一些实施方案中，所述隔室的形状基本上由其中所含有的颗粒的形状限定。
在一些实施方案中，所述底物包括其最长尺寸在1μm与500μm之间的单分散性颗粒或多分散性颗粒。
在一些实施方案中，所述底物包含空腔、凹陷或孔。
在一些实施方案中，所述水凝胶选自光致抗蚀剂、二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙二醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、藻酸酯、PLGA或其组合。
在一些实施方案中，所述底物含有两个或更多个不同的区域。在一些实施方案中，每个不同的区域含有共价结合的生物探针、可逆结合的检测试剂、小分子、反应性分子、细胞、细菌和/或其组合。
在一些实施方案中，所述底物包含一个或多个疏水性区域。在一些实施方案中，所述一个或多个疏水性区域由疏水性聚合物构成。
在一些实施方案中，所述不混溶流体为油并且所述载体流体为含水流体。在一些实施方案中，所述不混溶流体为含水流体并且所述载体流体为油。
在另一个方面，本发明提供多功能底物(例如，颗粒)，其包含：至少一个靶捕获区域、至少一个试剂储存区域和至少一个编码区域，其中所述靶捕获区域具有一个或多个抗体、纳米抗体、寡核苷酸探针、肽核酸、小分子、适体、细胞、细菌、病毒、细胞器、肽、或其组合；其中所述试剂储存区域具有一种或多种可释放检测剂，并且其中所述编码区域包含识别特征。
在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂选自检测抗体、纳米抗体、酶、PCR引物、蛋白质、寡核苷酸、肽、适体、小分子、其他化学化合物或其组合。在一些实施方案中，所述多功能颗粒还包含一个或多个疏水性区域。在一些实施方案中，所述多功能颗粒包含空腔、凹陷或孔。
本发明的其他特征、目的和优点在以下详述、附图和权利要求书中为显而易见。然而，应当理解，详述、附图和权利要求书虽然指示本发明的实施方案，但是仅以说明性而非限制性的方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对本领域的技术人员将变得显而易见。
附图简述
附图仅用于说明性目的，而非限制性目的。
图1示出在多相***中液滴所含有的底物的示例性模式。示出封装在大许多的液滴内的小珠(左)、限定液滴的更大底物(中左)、限定多个含水隔室的多功能底物(中右)以及嵌套的底物***(右)。
图2示出使用温度变化的寡聚物-缀合的检测抗体的示例性可逆释放和捕获。
图3示出示例性液滴辅助性夹心测定。多功能底物具有装饰有捕获抗体的靶捕获区域以及装饰有固定寡聚-缀合检测抗体的寡核苷酸锚分子(anchor)的试剂储存区域。在整体靶捕获后，将油相引入到所述***中并且在每个底物周围形成液滴。在液滴内，所述检测试剂被释放并允许在所述底物的靶捕获区域内形成检测复合物。
图4示出示例性水凝胶限定底物的液滴。示出在含水液滴隔室内由于表面张力而自身折叠的棒状颗粒。
图5示出示例性水凝胶限定底物的液滴。示出在溶液中的颗粒(左)、在乳液中限定含水液滴的颗粒(中)以及在荧光下成像的在液滴中的颗粒(右)。
图6示出Cy5修饰的寡聚物从封闭在液滴内的多功能颗粒的试剂储存区域中的示例性温度控制的释放。示出(a)颗粒封装和试剂释放的工作流程以及(b)在释放Cy5修饰的寡聚物后在液滴中的颗粒的荧光图像。
图7示出证实从抗山羊颗粒上的IL-8颗粒释放的Cy5标记的山羊抗人类IL-8抗体的串扰的示例性数据。当在分离的液滴内进行试剂释放时，与整体观察到的结果相比，交叉反应性显著减小。
图8示出使用乳液分离反应对重组人类IL-8进行的示例性稀释曲线分析。
图9由图A、图B和图C构成，其示出由颗粒封装以及适当阳性对照和阴性对照产生的颗粒荧光强度的示例性柱状图。
定义
为了更容易地理解本发明，首先对某些术语进行定义。针对以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中列出。
分析物：如本文所用，术语“分析物”广义地是指待分析、待检测、待测量或待量化的任何物质。分析物的实例包括但不限于蛋白质、肽、激素、半抗原、抗原、抗体、受体、酶、核酸以及其组合。在一些实施方案中，术语“分析物”与术语“靶生物分子”互换使用。
缔合：如本文所用，术语“缔合”、“缀合”、“连接”、“附接”、“络合”和“系接”以及语法等同词通常是指彼此连接的两个或更多个部分，无论是直接连接还是或间接连接(例如，通过充当连接剂的一个或多个另外的部分)，以形成足够稳定的结构以使得所述部分在其中使用所述结构的条件下，例如生理条件下保持连接。在一些实施方案中，所述部分通过一个或多个共价键彼此附接。在一些实施方案中，所述部分通过涉及特异性(但是非共价的)结合(例如，链霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白相互作用、抗体/抗原相互作用等)的机制彼此附接。可选地或另外地，足够数量的较弱相互作用(非共价的)可为部分提供足够的稳定性以保持连接。示例性非共价相互作用包括但不限于亲和力相互作用、金属配位、物理吸附、主体-客体相互作用、疏水性相互作用、π堆积相互作用、氢键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用等。
生物分子：如本文所用，术语“生物分子”是指在细胞和组织中常见的分子(例如，蛋白质、氨基酸、肽、多核苷酸、核苷酸、碳水化合物、糖、脂质、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、类固醇等)，无论是天然存在的还是人工产生的(例如，通过合成方法或重组方法)。生物分子的具体种类包括但不限于酶类、受体类、神经递质类、激素类、细胞因子类、细胞应答调节剂类诸如生长因子和趋化因子、抗体类、疫苗类、半抗原类、毒素类、干扰素类、核酶类、反义剂类、质粒类、DNA、以及RNA。
互补：如本文所用，术语“互补”，“互补的”和“互补性”是指根据Watson/Crick配对规则的核苷酸序列配对。例如，序列5'-GCGGTCCCA-3'具有互补序列5'-TGGGACCGC-3'。互补序列也可以是与DNA序列互补的RNA序列。在天然核酸中不常见的某些碱基可包含在互补核酸中，这些碱基包括但不限于肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补不必是完全互补；稳定的双链体可含有错配碱基对、变性碱基、或未匹配碱基。核酸技术领域技术人员可考虑多个变量来凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸序列的碱基组成和序列、离子强度以及错配碱基对的发生率。
粗制：如本文所用，术语“粗制”当与生物样品结合使用时，是指处于基本上未精制状态的样品。例如，粗制样品可以是细胞裂解液样品或活组织检查组织样品。粗制样品可存在于溶液中或作为干配制品存在。
编码区域(encoding region)、编码区(coding region)或条形码区域：如本文所用，术语“编码区域”、“编码区”、“条形码区域”或语法等同词是指在对象或底物(例如，颗粒)上可用于识别所述对象或底物(例如，颗粒)的区域。这些术语可互换使用。通常，对象的编码区域具有与所述对象的身份相关联的图形特征和/或光学特征。此类图形特征和/或光学特征也称为所述对象的信号特征。在一些实施方案中，对象的编码区域具有引起可变荧光强度(一个或多个波长)的空间图案化特征(例如，具有各种形状和/或尺寸的条或具有各种尺寸的一系列孔)。在一些实施方案中，对象的编码区域具有在各种空间图案中的各种类型和/或量的荧光团或其他检测部分，它们引起各种图案的可变荧光信号(例如，不同颜色和/或强度)。
官能化：如本文所用，术语“官能化”是指通过引入与最初在材料上发现的物理、化学或生物特性不同的物理、化学或生物特性来修饰材料的任何过程。通常，官能化涉及向所述材料引入官能团。如本文所用，官能团为分子内负责那些分子的特性化学反应的原子的特定基团。如本文所用，官能团包括化学基团(例如，酯、羧酸酯、烷基)和生物基团(例如，寡核苷酸衔接子或接头序列)两者。
杂交：如本文所用，术语“杂交”或“杂交化”是指其中两条互补核酸链在适当的严格条件下彼此退火的过程。适用于杂交的寡核苷酸或探针通常含有10-100个核苷酸长度(例如，18-50个、12-70个、10-30个、10-24个、18-36个核苷酸长度)。核酸杂交技术为本领域已熟知的。参见，例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.。本领域技术人员理解如何估算和调整杂交条件的严格性，以使得具有至少所需互补水平的序列将稳定地杂交，而具有较低互补水平的那些序列将不会稳定地杂交。针对杂交化条件和参数的实例，参见，例如，Sambrook等，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等1994，Current Protocols in Molecular Biology。JohnWiley&Sons,Secaucus,N.J.
标记：术语“标记”和“用可检测试剂或部分标记”在本文中可互换使用，以规定一个实体(例如，核酸探针、抗体等)可例如在结合到另一个实体(例如，核酸、多肽等)后进行可视化。可选择所述可检测试剂或部分，以使得它产生可测量的信号，并且所述信号的强度与结合的实体的量相关(例如，成正比)。用于标记和/或检测蛋白质和肽的各种各样的***为本领域已知的。标记的蛋白质和肽可通过结合或缀合到经由光谱学手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、电学手段、光学手段、化学手段或其他手段可检测的标签来制备。标签或标记部分为可直接检测的(即，它不需要任何进一步的反应或操纵就可检测，例如，荧光团为可直接检测的)或它为可间接检测的(即，通过反应或与可检测的另一个实体结合来使它可检测，例如，半抗原在与含有报告子诸如荧光团的适当抗体反应后通过免疫染色可检测)。合适的可检测试剂包括但不限于放射性核苷酸、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标签、磁性标签、半抗原、分子信标、适体信标等。
单分散性或多分散性：如本文所用，术语“单分散性”或“单一尺寸”是指在颗粒的情况下具有基本上相同的尺寸和形状并且在聚合物的情况下具有基本上相同的质量的对象的集合。相反地，具有不一致的尺寸、形状和质量分布的对象的集合称为多分散性。单分散性颗粒通常通过使用基于模板的合成来合成。
颗粒：如本文所用，术语“颗粒”是指离散的对象。这样的对象可以具有任何形状或尺寸。颗粒的组成可根据应用和合成方法而改变。合适的材料包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸类聚合物、金属、顺磁材料、氧化钍溶胶、石墨碳、二氧化钛、胶乳或交联葡聚糖诸如琼脂糖、纤维素、尼龙、交联胶束和特氟隆。在一些实施方案中，颗粒可以是光学可检测的或磁性可检测的。在一些实施方案中，颗粒含有荧光部分或发光部分或其他可检测部分。在一些实施方案中，直径或另外地最长尺寸小于1000微米(um)的颗粒也称为微粒。在一些实施方案中，直径小于1000纳米(nm)的颗粒也称为纳米颗粒。
多核苷酸、核酸或寡核苷酸：术语“多核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。通常，多核苷酸包含至少三个核苷酸。DNA和RNA为多核苷酸。聚合物可包含天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、以及脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、以及2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、嵌入的碱基、修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、***糖、以及己糖)、或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-二亚磷酰胺键)。
对象或底物：如本文所用，术语“对象”和“底物”互换使用并且是指任何离散的物质。对象或底物可以是颗粒、小珠、平坦表面、噬菌体、大分子、细胞、微生物等。
探针：如本文所用，术语“探针”是指具有可变长度(例如，3-1000个碱基长度)的DNA或RNA片段，其用于检测与探针中的序列互补的靶核苷酸序列的存在。通常，所述探针与单链核酸(DNA或RNA)杂交，由于探针与靶之间的互补性，所述单链核酸碱基序列允许探针-靶碱基配对。
信号：如本文所用，术语“信号”是指可检测实体和/或可测量实体。在某些实施方案中，所述信号可通过人眼(例如，目视)检测。例如，所述信号可以是或可以涉及可见光谱中的颜色的强度和/或波长。此类信号的非限制性实例包括从化学反应诸如酶反应产生的有色沉淀物和有色可溶产物。在某些实施方案中，所述信号使用装置是可检测的。在一些实施方案中，所述信号当被激发时从发射荧光的荧光团中产生，其中所述光用荧光检测器是可检测的。在一些实施方案中，所述信号是或涉及通过分光光度计可检测的光(例如，可见光和/或紫外光)。例如，通过化学发光反应产生的光可作为信号。在一些实施方案中，所述信号是或涉及辐射，例如，通过放射性同位素、红外线辐射等发射的辐射。在某些实施方案中，所述信号为物理实体的性质的直接或间接指标。例如，信号可用作在生物样品中和/或在反应容器中的核酸的量和/或浓度的指标。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出目标特性或性质的总体或接近总体范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解的是，生物现象和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或者达到或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”在本文中用于获得在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
详述
本发明除其他情况之外提供用于高效、稳健且多重分析生物分子的方法、组合物以及***，其基于与测定试剂的受控释放结合的底物介导的区室化以用于无干扰检测生物分子。在一些实施方案中，一种用于本发明的合适的***为颗粒限定的微乳液***。
本发明的各个方面在以下部分中详细描述。各部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可适用于本发明的任何方面。在这个申请中，除非另行指出，否则使用“或”意味着“和/或”。
多相***封装
根据本发明，底物介导的区室化可发生在多相***中。在多相***中，连续流体中的不连续流体的液滴的形成通常由所述***的物理特性决定。具体地说，所述***的表面能(与流体的密度、粘度和表面张力相关)和动能(与流体速度相关)为重要的。给定***中的比表面能和动能，发生相分离，以提供具有可使用韦伯数(We＝ρv2l/σ)预测的特性尺寸的液滴，其中ρ、v、l和σ分别表示流体密度、速度、液滴直径和表面张力。
在封闭液滴的小珠的情况中，所使用的固态小珠通常显著地小于在***中形成的液滴以便允许基于溶液的反应。当显著小于特性液滴尺寸的底物存在于不连续相中时，液滴形成的机制并未受到很大影响。然而，当显著大于特性液滴尺寸的底物存在时，液滴形成的物理特性显著地改变并且液滴形成主要为底物介导的。图1示出在多相***中的此底物封装的几种模式。在这个过程中所使用的底物可涵盖宽尺寸范围，通常为约1μm至1000μm(例如，约1μm至900μm、约1μm至800μm、约1μm至700μm、约1μm至600μm、1μm到500μm、1μm到400μm、1μm到300μm、1μm到200μm或1μm至100μm)。底物可以是亲水性、疏水性或两者的组合(Bong,Pregibon,&Doyle,2009；Dendukuri,Hatton,&Doyle,2007)。
可使用各种封装方法，一种封装方法为油包水乳液，其利用底物(例如，水凝胶底物)限定在连续不混溶相内的含水液滴。可选地，可使用可逆溶胶-凝胶聚合物来选择性地分离在含水较少的凝胶相内的水凝胶模板的含水隔室，从而有效地去除或减少隔室之间的扩散。另一种分离水凝胶反应器的方法可包括在每个微粒周围交联不可渗透聚合物壳、封装水凝胶底物以及分离每个含水隔室。
如本文所用，“载体流体”用于描述底物悬浮在其中并且用所述底物封装的介质。“不混溶流体”在本文中用于描述不能与载体流体混合的任何介质(即，液体)。通常，不混溶流体包围封装的底物。在一些实施方案中，不混溶流体包括油并且载体流体包括含水流体。在一些实施方案中，不混溶流体包括含水流体并且载体流体包括油。在一些实施方案中，合适的油为Fluorinert FC-40油、Tegasoft或矿物油。在一些实施方案中，合适的油还含有表面活性剂诸如ABIL WE-09、PFPE-PEG或一些其他双功能分子。在一些实施方案中，不连续相为封装在隔室内的任何介质并且连续相为包围封装的隔室的任何介质。
在一些实施方案中，所述不混溶流体为可选择性渗透的。如果一些化合物可从连续相行进至不连续相，但是其他化合物不能从不连续相行进出连续相，那么相可以是可选择性渗透的。在一些实施方案中，所述选择渗透性是基于尺寸。在一些实施方案中，所述选择渗透性是基于除尺寸之外的性质。在一些实施方案中，化合物可从连续相行进至不连续相，因为它在连续相和不连续相中均为可溶的。
也可使用各种方法来破坏乳液。这些方法包括：重力沉降、离心、电聚结、以及化学方法(例如，添加电解质中和液滴界面的电荷，从而引起聚结)。
多功能底物
适于本发明的底物或对象(例如，颗粒)可包含一个或多个功能区域。合适的底物或对象可具有平面形态、球形形态或非球形形态。合适的底物或对象可以是固态、半固态、聚合物等。示例性的合适的底物可由选自由以下组成的组的材料制成：水凝胶、玻璃、光致抗蚀剂、二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙二醇、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、藻酸酯、PLGA、光学纤维、纤维素以及其组合。在一些实施方案中，合适的材料为水凝胶。合适的底物也可呈各种形式、尺寸和形状。例如，合适的底物可以是图案化平面底物、微芯片、塑料、小珠、生物膜或颗粒。在一些实施方案中，合适的底物为颗粒。出于说明行目的，在下文中详细描述颗粒。
颗粒
适用于根据本发明使用的颗粒可由任何材料制成。合适的颗粒可以是生物相容的或生物不相容的。合适的颗粒也可以是可生物降解的或不可生物降解的。
在一些实施方案中，颗粒为水凝胶。通常，水凝胶包含基本上稀释的交联网络。水或其他流体可穿透所述网络，从而形成这样的水凝胶。在一些实施方案中，适用于在本发明中使用的水凝胶由亲水性聚合物制成或包含亲水性聚合物。例如，亲水性聚合物可包含阴离子基团(例如，磷酸酯基团、硫酸酯基团、羧酸酯基团)；阳离子基团(例如，季胺基团)；或极性基团(例如，羟基、巯基、胺基)。在一些实施方案中，水凝胶由于其较大水含量而为超吸收剂(例如，它们可含有超过99％的水)，并且具有与天然组织非常相似的灵活度。在重量和体积两者的组成中，水凝胶为流体并且因此表现出与其组分液体(例如，水)密度相似的密度。本发明涵盖水凝胶特别适用于本发明的一些实施方案中的认知。在一些实施方案中，水凝胶用于限定在与含水溶液或亲水溶液不混溶或部分混溶的连续疏水相内的含水隔室。在不希望受到任何特定理论约束的情况下，预期水凝胶使得1)使用检测器械，具体地说可商购获得的没有大量修改的器械(例如，流式细胞仪)便于具体实施，并且2)不需要表面官能化便能结合官能部分(例如，在单一光刻聚合步骤中)。
可使用各种另外的材料和方法来合成颗粒。在一些实施方案中，颗粒可由一种或多种聚合物制成或包含一种或多种聚合物。在颗粒中使用的聚合物可以是天然聚合物或非天然(例如，合成的)聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是直链聚合物或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树枝状聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。根据序列，共聚物可以是嵌段共聚物、接枝共聚物、无规共聚物、共混物、混合物、和/或任何前述聚合物和其他聚合物的加合物。
在一些实施方案中，本发明的颗粒可由天然聚合物制成或包含所述天然聚合物，所述天然聚合物诸如碳水化合物、蛋白质、核酸、类脂等。在一些实施方案中，天然聚合物可通过合成来制造。来源于哺乳动物细胞外基质的各种组分的许多天然聚合物诸如胶原、透明质酸(HA)和纤维蛋白可用于本发明的颗粒中。胶原为哺乳动物细胞外基质的主要蛋白之一，而HA为几乎所有动物组织中可见的多糖。藻酸酯和琼脂糖为来源于海藻来源的多糖。天然聚合物的一些优点包括低毒性和高生物相容性。
在一些实施方案中，包括在一些优选的实施方案中，每个底物由含水性互穿聚合物网络构成，含有多达99.9体积％的水。每个底物可用特异性捕获部分来官能化，所述捕获部分诸如寡核苷酸探针、抗体、适体、小分子、细胞或肽。这些捕获部分可用于特异性地结合来自生物样品的分析物，所述生物样品包括分离的DNA或RNA、细胞裂解液、组织消化液或血浆/血清。另外，这些水凝胶底物可用一种或多种检测试剂，诸如分析物特异性检测抗体或PCR引物，以可逆方式或不可逆方式官能化。
尺寸和形状
通常，适用于本发明的颗粒可具有任何尺寸。在一些实施方案中，合适的颗粒的尺寸在至少一个维度内大于1μm多至约1000μm(例如，在至少一个维度内为1-500μm、1-450μm、1-400μm、1-350μm、1-300μm、1-250μm、1-200μm、1-150μm、1-100μm、1-50μm、2-50μm、2-100μm、50-1000μm、50-500μm、50-450μm、50-400μm、50-350μm、50-300μm、50-250μm、50-200μm、50-150μm、100-1000μm、100-500μm、100-450μm、100-400μm、100-350μm、100-300μm、100-250μm、100-200μm、100-150μm)。在一些实施方案中，由适用于本发明的颗粒限定的体积以皮升的数量级计(例如，所述颗粒和/或颗粒限定的隔室的体积可以是1-1,000皮升、1-900皮升、1-800皮升、1-700皮升、1-600皮升、1-500皮升、1-400皮升、1-300皮升、1-200皮升或1-100皮升)。在一些实施方案中，由适用于本发明的颗粒限定的体积以毫微微升的数量级计(例如，所述颗粒和/或颗粒限定的隔室的体积可以是1-1,000毫微微升、1-900毫微微升、1-800毫微微升、1-700毫微微升、1-600毫微微升、1-500毫微微升、1-400毫微微升、1-300毫微微升、1-200毫微微升或1-100毫微微升)。
颗粒的维度可具有各种纵横比，诸如长度/宽度、长度/厚度等。在一些实施方案中，至少一个尺寸诸如长度长于另一个尺寸诸如宽度。根据本发明，具有大于一的至少一个纵横比的颗粒可特别适用于流过式扫描(例如，在流式细胞仪中)，以有利于自对准。在一些实施方案中，颗粒的至少一个纵横比可为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约10:1、至少约15:1或甚至更高。
合适的颗粒可具有多种不同的形状，其包括但不限于球体、椭球、圆柱体、卵形、椭圆形、壳体、立方体、长方体、圆锥体、锥体、棒体(例如，圆柱体或具有正方形或矩形横截面的细长结构)、四角体(具有四个腿状附肢的颗粒)、三角形、棱柱体等。在一些实施方案中，颗粒为棒状的。在一些实施方案中，颗粒为条状的。在一些实施方案中，颗粒为珠状的。在一些实施方案中，颗粒为柱状的。在一些实施方案中，颗粒为带状或链状的。在一些实施方案中，颗粒可以是任何几何形状或对称的。例如，在本发明中也可使用平面颗粒、圆形颗粒、弧形颗粒、管状颗粒、环状颗粒、四面体颗粒、六角形颗粒、八角形颗粒、其他规则几何形状的颗粒、和/或不规则几何形状的颗粒。在一些实施例中，所述底物包含空腔、凹陷或孔。在一些实施方案中，空腔、凹陷或孔的存在允许在隔室内有更多的空间用于反应发生。
在一些实施方案中，所述底物包含一个或多个疏水性区域。在一些实施方案中，所述一个或多个疏水性区域包含疏水性聚合物。在一些实施方案中，所述疏水性聚合物包含高度交联的聚合物网络。在一些实施方案中，所述疏水性聚合物包含疏水性聚合物前体。在一些实施方案中，所述底物包含围绕每个底物的多个隔室，其中所述隔室由所述底物的疏水性区域分隔开。在一些实施方案中，包含一个或多个疏水性区域的所述底物为多功能的。
合适的颗粒可以是单分散性的，即在群体中的每个颗粒具有相同的尺寸和形状。合适的颗粒可以是多分散性的，即颗粒群包括具有不同尺寸和形状的颗粒。
靶捕获区域
在一些实施方案中，适用于本发明的颗粒包含一个或多个靶捕获区域。各种捕获部分或基团可引入到底物的表面，以产生所选定功能性(例如，以捕获靶生物分子)。这种捕获部分可例如通过共价结合化学地附接到所述表面，或可物理地附接到所述表面或包埋于其中。对靶生物分子特异的所需捕获部分可使用本领域已知的各种方法进行设计。在一些实施方案中，所需捕获部分包括抗体、纳米抗体、寡核苷酸探针、肽核酸、小分子、适体、细胞、细菌、病毒、细胞器、肽、或其组合。
试剂储存区域
在一些实施方案中，适用于本发明的颗粒包含一个或多个试剂储存区域。各种的检测试剂可引入到底物的表面，以产生所选择的功能性。这种检测试剂可通过可释放手段附接到所述底物。在一些实施方案中，所述可释放手段选自可逆性相互作用、不可逆反应、可逆***联剂或光可裂解接头。在一些实施方案中，可逆性相互作用选自静电相互作用、物理相互作用、磁性相互作用或核酸双链体形成。在一些实施方案中，所述不可逆反应为键裂解。在一些实施方案中，所述可逆***联剂选自分别通过羟胺、硫醇和/或高碘酸盐可裂解的EGS、DSP和/或DST。在一些实施方案中，其中所述光可裂解接头为基于1-(2-硝基苯基)乙基的接头。特对靶生物分子特异的所需检测试剂可使用本领域中已知的各种方法进行设计。在一些实施方案中，所需检测试剂包括检测抗体、纳米抗体、酶、PCR引物、蛋白质、寡核苷酸、肽、适体、小分子、其他化学化合物、或其组合。
编码区域
在一些实施方案中，合适的颗粒包含具有可检测部分的一个或多个编码区(也被称为编码区域)，所述可检测部分给出附接到或嵌入在相同颗粒的一个或多个探针区域的探针的身份。可使用各种可检测部分，其包括荧光团、发色团、放射性同位素、量子点、纳米颗粒和/或嵌入的DNA/RNA染料。可检测部分另外的实例在以下可检测实体部分进行描述。
在一些实施方案中，所述一个或多个编码区域具有荧光团使得荧光水平被用于编码。例如，在每个编码区中的荧光可为在多个水平下可区分的，例如多至10-20水平(例如，多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20水平)。作为非限制性的实例，当使用三个编码区并且对每个编码区而言有10水平可区分，这将允许多至1000(10x10x10)个唯一编码。另外或可选地，可使用多个信号(例如，不同的荧光颜色)用于编码。在一些实施方案中，每个编码区具有彼此不同的一个信号。这可通过使用具有唯一发射光谱的各种荧光团的共混物来实现。
在一些实施方案中，靶捕获区域、试剂储存区域和编码区域通过惰性区域彼此分开。在一些实施方案中，一个或多个靶捕获区域和一个或多个编码区域彼此重叠。在一些实施方案中，编码区域和靶捕获区域可以是相同的区域。
生物测定
一旦底物已通过区室化有效地彼此分离，储存在底物中的检测试剂就可释放到限定的含水隔室内以用于结合、扩增或检测。通过将受控释放与底物介导的区室化组合，可以进行整体多重靶捕获，其中检测试剂的释放和结合分开进行。
通常，试剂的受控释放可使用可逆性相互作用(例如，静电、物理、磁性等相互作用)或不可逆相互作用(键裂解等)来实现，所述可逆性相互作用可使用外部刺激来调节。检测试剂可通过可逆***联剂来附接，所述可逆***联剂诸如可分别通过羟胺、硫醇和高碘酸盐裂解的EGS、DSP和/或DST。在一种相似的方法中，当暴露于紫外光时，光可裂解接头诸如基于1-(2-硝基苯基)乙基的接头可用于选择性地释放检测部分。
一种在水凝胶基质内可逆地储存检测试剂的有效方法为通过DNA双链体形成。用已知寡核苷酸序列官能化的检测试剂可与共价附接在水凝胶基质内的互补“锚分子”序列杂交。这允许试剂在适当温度或缓冲液条件下受控释放。例如，可使用温度作为试剂释放和重新捕获的刺激来使用DNA与饰有寡聚物的底物的杂交，如图2所示。
将底物介导的区室化与试剂在隔室内的受控释放组合的这种方法允许不相容的单克隆抗体或多克隆抗体或PCR引物平行使用，各自含有在单独的限定底物的隔室中。当封装检测反应完成时，反应封装可反转，从而允许另外的测定处理或分析。反转油包水乳液可通过添加适当的破坏试剂来实现，所述破坏试剂通常为在连续油相中选择性地改变表明活性剂条件的溶剂。
可利用底物介导的区室化和受控试剂释放的方法进行分析物、试剂、结构或细胞的分离、操纵、扩增、量化或分离。底物可具有一个或多个多功能区域以用于靶捕获、试剂储存和/或底物识别。此外，所述底物可具有多种化学作用以促进液滴形成、界面对齐或亚区室化。
在一些实施方案中，在每个隔室内进行的生物测定为免疫测定。在一些实施方案中，所述免疫测定为酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些实施方案中，所述ELISA为夹心ELISA。在一些实施方案中，在每个隔室内进行的生物测定为聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述PCR为高度多重PCR。在一些实施方案中，在每个隔室内进行的生物测定为单细胞分析。在一些实施方案中，在每个隔室内进行的生物测定为数字PCR。在一些实施方案中，在每个隔室内进行的生物测定为细胞分泌分析。在一些实施方案中，在每个隔室内进行的生物测定为多重ChIP-Seq(染色质免疫沉淀与大规模平行的DNA测序的组合)。
靶分析物
本文中所描述的方法和组合物可用于分析任何靶生物分子。通常，靶生物分子可以是存在于样品中的任何以下形式：多肽、蛋白质、寡肽、氨基酸、多糖、寡糖、单糖、多核苷酸、核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、代谢物、脂质、脂肪酸、糖脂、甾醇、甘油脂、维生素、激素、神经递质或其任何的组合。在各种实施方案中，靶核酸可以是在生物学有机体(包括例如，微生物或传染性病原体)中可见的一种核酸、或者任何天然存在的组分、其生物改造的组分或合成的组分。在本发明的某些实施方案中，靶核酸可以是以下各项的一部分或含有以下各项的一部分：基因、调控序列、基因组DNA、cDNA，包括mRNA、rRNA、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、非编码长RNA(Inc RNA)、核小RNA(snRNA)、双链RNA(ds RNA)的RNA或其任何组合。在本发明的某些实施方案中，靶核酸可以是核酸类似物或人工核酸，诸如DNA/RNA嵌合体。
样品
任何多种样品可适用于与本文所公开的方法使用，所述样品包括但不限于生物样品和化学制剂或重组制剂。通常，可使用含有生物分子的任何生物样品(例如，细胞、组织等)。生物样品的类型包括但不限于细胞、细胞裂解液、FFPE(FASP蛋白消化)消化液、包括组织活检样品的组织、全血、血浆、血清、尿液、粪便、唾液、脐带血、绒毛膜绒毛样品羊水、以及经子宫颈灌洗流体。根据发明性方法，也可使用任何上述生物样品的细胞培养物，例如，绒毛膜绒毛培养物、羊水和/或羊水细胞培养物、血细胞培养物(例如，淋巴细胞培养物)等。在一些使用实施方案中，生物样品包括患病细胞诸如癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中，生物样品为产前样品。
因此，适用于本发明的典型生物样品含有异源生物分子。在一些实施方案中，生物样品含有来自不同细胞类型(例如，正常细胞和患病细胞诸如肿瘤细胞)的生物分子的混合物。在一些实施方案中，生物样品(例如，血液、血清或血浆)含有母体生物分子和胎儿生物分子的混合物。合适的样品可以是未纯化的生物样品或最少纯化的生物样品或者可由分离的生物分子、尿液或血浆/血清制成。
在一些实施方案中，本发明用于分析在生物样品中作为稀少事件存在的靶生物分子(也称为低丰度生物分子)。在一些实施方案中，由本发明的发明性方法检测到的靶生物分子的量表示小于在生物样品中的总生物分子的1％(例如，小于0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％)。在一些实施方案中，由本发明的发明性方法检测到的靶生物分子的量表示小于在生物样品中的总生物分子的百万分之1。在一些实施方案中，由本发明的发明性方法检测到的靶生物分子的量表示小于在生物样品中的总生物分子的千万分之1。在一些实施方案中，本发明用于分析少至一个靶生物分子副本或多至一百万或更多靶生物分子副本。
可检测实体
任何多种可检测试剂可用于实践本发明。合适的可检测实体包括但不限于：各种配体、放射性核素；荧光染料；化学发光剂(例如像，吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)；生物发光剂；光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)；金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)；纳米团簇；顺磁金属离子；酶；比色标签(例如像，染料、胶体金等)；生物素；洋地黄毒苷(dioxigenin)；半抗原；以及对于抗血清和单克隆抗体可用的蛋白质。
在一些实施方案中，可检测部分为生物素。生物素可结合到抗生物素蛋白(诸如链霉抗生物素蛋白)，其通常缀合到(直接地或间接地)自身可检测的其他部分(例如，荧光部分)。
在某些实施方案中，可检测部分为酶。合适的酶的实例包括但不限于在ELISA中使用的那些酶，例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。其他实例包括β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、尿素酶、葡萄糖氧化酶等。酶可使用接头基团诸如碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等缀合到分子。
可检测部分可包括多于一种化学实体，诸如在荧光共振能量转移(FRET)中。共振转移引起放射强度整体增强。例如，参见Ju等(1995)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)92:4347，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。合适的可检测部分可以是当结合到双链DNA/RNA时具有显著荧光增强的嵌入DNA/RNA染料。合适的染料的实例包括但不限于SYBRTM和Pico Green(来自Molecular Probes,Inc.of Eugene,Oreg)、溴化乙锭、碘化丙啶、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、Toto-1、Yoyo-1以及DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐)。关于嵌入染料的使用的另外的讨论提供自Zhu等人，Anal.Chem.66:1941-1948(1994)，所述文献以引用的方式整体并入。
下文描述了其他可检测部分的一些非限制性实例。
荧光染料
在某些实施方案中，可检测部分为荧光染料。具有各种各样的化学结构和物理特性的许多已知的荧光染料适用于在本发明的实践中使用。荧光可检测部分可通过具有被检测器捕获的发射光的激光来刺激。所述检测器可以是记录它的强度的电荷耦合器件(CCD)或共焦显微镜。
合适的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如，荧光素异硫氰酸菁(isothiocyanine)或FITC、萘荧光素(naphthofluorescein)、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、氧杂菁染料、藻红蛋白、藻红、曙红、罗丹明染料(例如，羧四甲基罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、SPECTRUM REDTM、SPECTRUM GREENTM、花青染料(例如，CY-3TM、CY-5TM、CY-3.5TM、CY-5.5TM等)、ALEXA FLUORTM染料(例如，ALEXA FLUORTM 350、ALEXA FLUORTM 488、ALEXAFLUORTM 532、ALEXA FLUORTM 546、ALEXA FLUORTM 568、ALEXA FLUORTM 594、ALEXA FLUORTM633、ALEXA FLUORTM 660、ALEXA FLUORTM 680等)、BODIPYTM染料(例如，BODIPYTM FL、BODIPYTM R6G、BODIPYTM TMR、BODIPYTM TR、BODIPYTM 530/550、BODIPYTM 558/568、BODIPYTM564/570、BODIPYTM 576/589、BODIPYTM 581/591、BODIPYTM 630/650、BODIPYTM 650/665等)、IRDyes(例如，IRD40、IRD700、IRD800等)等。对于更多合适的荧光染料和用于将荧光染料偶联至其他化学实体诸如蛋白质和肽的方法的实例，参见，例如，“The Handbook ofFluorescent Probes and Research Products”，第九版，Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。荧光标记试剂的有利性质包括高摩尔吸收系数、高荧光量子产率和光稳定性。在一些实施方案中，标记荧光团表现出在光谱的可见光范围(即，在400纳米与750纳米之间)而不是紫外光范围(即，低于400纳米)内的吸收波长和发射波长。
放射性同位素
在某些实施方案中，可检测部分为放射性同位素。例如，分子可被同位素标记(即，可含有已被原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子替代的一个或多个原子)或者同位素可附接到所述分子。可并入到分子的同位素的非限制性实例包括氢、碳、氟、磷、铜、镓、钇、锝、铟、碘、铼、铊、铋、砹、钐、以及镥的同位素(即，3H、13C、14C、18F、19F、32P、35S、64Cu、67Cu、67Ga、90Y、99mTc、111In、125I、123I、129I、131I、135I、186Re、187Re、201Tl、212Bi、213Bi、211At、153Sm、177Lu)。
在一些实施方案中，信号扩增使用标记的树枝状聚合物作为可检测部分来达到(参见，例如，Physiol Genomics 3:93-99,2000)，所述文献的全部内容以引用的方式整体并入本文。荧光标记的树枝状聚合物购自Genisphere(Montvale,N.J.)。这些聚合物可通过本领域已知的方法化学地缀合到寡核苷酸引物。
检测和量化
可使用各种方法来检测、量化和/或分析捕获的靶生物分子。通常，由于本文所描述的各种生物测定，靶生物分子可通过检测和/或分析在检测试剂与结合捕获部分的生物分子之间的结合来检测。在一些实施方案中，靶生物分子可通过检测和/或分析由与结合捕获的靶生物分子的检测试剂缔合的可检测实体产生的信号来检测。在一些实施方案中，在检测信号时，信号从与检测试剂物理地缔合的实体(例如，可检测部分)发射。在一些实施方案中，在检测信号时间，信号从未与检测试剂物理地缔合的实体(例如，可检测部分)发射。在一些实施方案中，靶生物分子的量可通过量化所检测信号相对于参考或对照的量来测定。
在一些实施方案中，可检测信号是光信号，例如像荧光信号或发光信号。可使用各种装置来检测与靶生物分子相关联的信号。通常，所述信号是光信号并且使用光学检测器。光学检测器可包括以下一种或多种：光电二极管(例如，雪崩光电二极管)、通向例如光电倍增管、显微镜和/或摄像机(例如，电荷耦合器件(CCD)照相机)的光纤光导、流过装置诸如流式细胞仪或微阵列扫描仪。
用于表征和量化多功能对象的的示例性方法和装置在国际专利申请号PCT/US13/29854和美国专利申请公开号2013/0244909中进行讨论，所述专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，信号使用本领域已知的标准软件转换为数值。在一些实施方案中，信号(或表示信号的数值)基于背景信号来归一化。本领域中已知的任何多种软件程序可用于分析如本文所描述的信号，所述软件包括但不限于GENEPIX PROTM 4.0.1.12软件(Axon Instruments,USA)、Feature Extraction(Agilent)、Matlab(Mathworks)等。用于转换和量化由流式细胞仪检测到的、来自如本文所描述的多功能颗粒的信号的示例性软件程序在国际申请PCT/US13/29854中进行描述，所述申请的内容以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1：多重液滴辅助性免疫测定
蛋白生物标记目前为分子诊断实验室的主力。许多蛋白标记的多重分析减少了与这些测试相关联的劳动和成本并且增大了它们的预测能力。虽然用于多重免疫测定的现有技术受到靶间抗体相容性限制的影响，但是已证实使用受控的试剂释放、利用底物介导的液滴形成克服了这些限制。
验证了使用含有荧光识别区域、试剂储存区域和靶捕获区域的多功能水凝胶微粒的液滴辅助性免疫测定，如图3所示。使用表位特异性的捕获抗体对靶捕获区域进行共价地官能化，同时使用寡核苷酸修饰的检测抗体经由DNA双链体形成对试剂储存区域进行官能化，其中系接在检测抗体上的短寡核苷酸与试剂储存区域内的互补序列杂交。编码区域含有识别特征(例如，荧光信号、图像条形码等)以识别底物。
对于液滴辅助性免疫测定，用对应的捕获抗体、检测抗体和条形码官能化的编码底物与生物样品整体孵育。在孵育步骤期间，靶蛋白被每个颗粒上的靶捕获区域内的捕获抗体特异性地捕获，也被试剂储存区域内的检测抗体特异性地捕获。然后将水凝胶微粒与氟化油混合，并且将所述溶液涡旋以形成稳定的限定底物的乳液，理想的是在每个乳液中具有单一颗粒。在分离后，通过将反应温度增加到超过DNA-DNA双链体的熔融温度，将所述检测抗体从试剂储存区域内释放。在释放后，所述检测抗体自由迁移到捕获探针区域，从而结合到捕获的靶蛋白并且从而能够荧光检测捕获的蛋白靶。然后将反应物冷却以允许过量检测抗体被试剂储存区域重新捕获。靶丰度可通过在细胞仪、荧光显微镜等上的读出由相对的荧光信号来确定。
实验概观
通常，所述测定包括以下步骤：
1.孵育(整体)。通过在编码的水凝胶微粒底物上的检测抗体捕获特异性蛋白。
2.冲洗底物以除去未结合的靶[任选的，但优选的]。
3.底物介导区室化。形成乳液，从而在连续油相中封装每个单个颗粒。
4.通过增加温度来释放检测抗体试剂(在液滴中)。
5.将Cy5标记的检测抗体结合到捕获的蛋白靶(在液滴中)。
6.破坏乳液[任选的，但优选的]。
7.冲洗[任选的，但优选的]。
8.在允许蛋白靶量化的Guava流式细胞仪上扫描水凝胶颗粒。
使用由聚(乙二醇)构成的、通过停流式光刻产生的水凝胶颗粒(Dendukuri,Gu,Pregibon,Hatton,&Doyle,2007；Dendukuri,Pregibon,Collins,Hatton,&Doyle,2006；Pregibon,Toner,&Doyle,2007)。颗粒为棒状的，每个颗粒在沿着颗粒的单独区域中含有唯一的捕获抗体、检测抗体和荧光编码。捕获抗体使用标准EDC化学法与在颗粒的靶捕获区域的羧基基团附接。寡核苷酸标记的检测抗体通过DNA-DNA双链体形成在水凝胶基质内可逆地结合。标记的检测抗体通过Innova Biosciences来制备。
对于孵育，使用添加到过滤板(Millipore,MSBVN1210)的每个实验孔中的35μl微粒悬浮液，并且施加真空压力以除去任何液体，从而在孔中留下颗粒。然后在颗粒顶部添加50μL生物样品，并且在室温搅拌孵育60分钟，以允许靶蛋白结合到存在于颗粒上的捕获抗体。在靶捕获后，使用过滤清洗颗粒两次以除去未结合的蛋白。
在靶捕获后，将所述颗粒重新悬浮在50μL低盐缓冲液中并且转移到0.5mL PCR管中。将管涡旋15秒以将水凝胶颗粒分散到含水介质中。紧接着在涡旋之后，将100μL由2％w/w在FC-40氟化油中的聚(乙二醇)-二-(氟化油脂-FSH酰胺)构成的乳液溶液添加到每个管中。在添加乳液溶液后，将管剧烈涡旋30秒以产生限定底物的液滴的乳液。将所述管在37℃下孵育60分钟，从而释放检测抗体以用于与捕获抗体结合靶结合。
在乳化步骤后，将反应物冷却并添加25μL溶剂(1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇，Sigma)以破坏所述乳液。然后将此混合物10秒以将所述溶剂分散到整个乳液。然后将所述管的水相(顶部)转移到过滤板，以将颗粒与油相分离。冲洗所述颗粒并在流式细胞仪上分析每个测定孔。使用在编码区内的各种水平的荧光团来确定颗粒含有的哪些物质对应于哪种蛋白测定，从而允许高度多重蛋白分析反应。蛋白靶可通过测量在每个水凝胶微粒的靶捕获区域内的荧光的量来量化。
对于基于流动的读出，使用Guava easyCyte(6HT或8HT)流式细胞仪来扫描颗粒。在每个颗粒的捕获区域、试剂储存区域和编码区域内，颗粒含有绿色荧光团以触发事件。使用在RED2通道中对应于Cy5的荧光来实现结合的靶/试剂的量化。使用Firefly AnalysisWorkbench软件进行所有的扫描后分析。
底物介导的区室化
为了确定在限定液滴中的颗粒的功效，将水凝胶微粒并入油-水乳液中。通过流动式光刻制造尺寸约为200μm×45μm×45μm的聚乙二醇(PEG)水凝胶微粒，并且所述微粒含有有助于颗粒识别的染料。将水凝胶微粒悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水相中。然后将乳液溶液(2％w/w在FC-40氟化油中的聚(乙二醇)-二-(氟化油脂-FSH酰胺))添加到所述水相中并且剧烈涡旋。测试各种微粒浓度、表面活性剂浓度和油与水的比率。
将条件最优化以获得包含封装单一微粒的大量液滴的热稳定性乳液。通过将含水液滴的尺寸调整至小于微粒的尺寸，可实现单一微粒液滴。用50μL水凝胶微粒制备的乳液示出在以下图4中。可看出由于由试图最小化其表面积的含水气泡施加界面力，所述水凝胶微粒在折叠。
所使用的颗粒的机械性质极大地影响了所形成的液滴的形状。虽然刚性颗粒较少受到液滴表面张力的影响，但是当封装时，单薄颗粒可显著地变形。在图5中展示了这种影响。刚性的条形码颗粒易于完全限定颗粒的形状。相反地，长柔性颗粒被折叠，呈封闭液滴的形状。颗粒的机械性质可通过改变组成(例如，材料孔尺寸、交联密度)、形状、纵横比等来微调。颗粒也可使用刺激类似磁力、静电等来制成可逆地刚性。例如，可制成柔性的顺磁颗粒，以伸展来与外部磁场对齐(Bong,Chapin,&Doyle,2010)。这种现象可根据需要用于破坏液滴。
试剂释放
为了证实试剂可储存并选择性地释放到颗粒模板的反应器中，将含有可释放荧光团的水凝胶微粒并入到油-水乳液中。将含有生物惰性区域和空间分离的试剂储存区域的双功能PEG水凝胶微粒聚合。所述试剂储存区域含有通过在序列5'端的AcryditeTM锚分子并入到水凝胶基质内的寡核苷酸。然后将用Cy5荧光团修饰的互补序列杂交到在试剂储存区域内含有的寡核苷酸上。所述两个序列被设计为在低盐磷酸盐缓冲液中具有37℃的熔融温度。
然后将含有Cy5修饰的寡核苷酸的水凝胶微粒重新悬浮在PCR管中的低盐磷酸盐缓冲液中。通过涡旋将微粒分散在溶液中，然后添加乳液溶液(2％w/w在氟化FC-40中的聚(乙二醇)-二-(氟化油脂-FSH酰胺))。在添加后，将两相混合物涡旋直至形成均匀的乳液。然后将所述乳液加热到37℃以达到含有Cy5的寡核苷酸的熔点。然后将一部分乳液转移到显微镜载片，以用于在倒置荧光显微镜上成像。使用金属卤化物灯和600nm过滤器对微粒进行成像，从而照射存在于样品中的Cy5染料。在图6中所得的图像显示由释放的寡核苷酸照射的液滴的边界，从而证实试剂可释放单一液滴中并且包含到所述液滴中。随着在显微镜载片上的小体积样品快速冷却，在Cy5寡核苷酸与锚分子重新杂交时，也可使试剂储存区域可视化。
测定分离
为了验证分离乳液内的反应物的能力，使用已知发生整体交叉反应的试剂进行多重测定。使用具有捕获区域、试剂储存区域和编码区域的多功能水凝胶颗粒，如下进行功能化：
颗粒#1(IL-8)
-捕获区域：小鼠抗人类IL-8抗体(R&D Systems,Part 890804)
-试剂储存区域：寡聚物修饰的山羊抗人类IL-8多克隆抗体(R&D Systems,AF-208-NA)
-编码区域：Cy3，强度水平1
颗粒#2(抗山羊)
-捕获区域：兔抗山羊IgG(Sigma,G4018)
-试剂储存区域：没有试剂
-编码区域：Cy3，强度水平2
对于IL-8颗粒，使用磺基-NHS化学将捕获抗体共价附接到靶捕获区域。所述附接使用抗小鼠FITC IgG(Sigma，F0257)和倒置荧光显微镜上的读出进行确认。将IL-8检测抗体缀合到与存在于水凝胶试剂储存区域内的锚分子互补的Cy5标记的寡核苷酸。将寡聚物缀合的检测抗体在磷酸盐缓冲盐水溶液中在室温下与IL-8颗粒的试剂储存区域杂交4个小时。然后在过滤板的孔中使用两次冲洗将过量的缀合物从溶液中除去。通过使用荧光显微镜观察Cy5荧光来证实试剂储存区域中的检测抗体寡核苷酸缀合物的杂交。
对于抗山羊颗粒，使用磺基-NHS化学将抗山羊抗体附接到靶捕获区域并且没有试剂附接到存在于微粒试剂储存区域内的寡核苷酸锚分子。使用抗兔FITC IgG(Sigma,F9887)和荧光显微镜上的成像来确认抗山羊抗体的附接。对于分析期间的识别，在编码区域内用不同水平的Cy3荧光团装载两种颗粒类型(IL-8和抗山羊)。
为了确定在具有和没有乳液的情况下微粒类型之间的串扰的量，将IL-8微粒和抗山羊微粒在两个单独的孔中混合在一起。然后将两个孔缓冲液更换成低盐磷酸盐缓冲液。然后将一个孔转移到PCR管中并且涡旋以均匀地分散颗粒。然后添加乳液溶液(2％w/w的在氟化FC-40中的聚(乙二醇)-二-(氟化油脂-FSH酰胺))，并且将对应的两相混合物涡旋直至乳液形成。将第二个孔转移到PCR管中并且离心以沉淀微粒，然后将过量的体积减低至10微升以尝试模拟液滴中的有效浓度。然后将两个管升高至37℃以解离并释放山羊IL-8检测抗体。
在37℃下孵育一小时后，使用25μL添加来吸收存在于乳液溶液中的洗涤剂的溶剂(1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇，Sigma)来打破所述乳液。将此混合物涡旋10秒以分散溶剂。然后将所述管的水相(顶部)转移回到过滤板以便将颗粒与剩余的油相分离。然后将第二个没有乳液的管也转移回到这同一个过滤板。然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗所述微粒并在流式细胞仪上读出。在抗山羊颗粒的颗粒靶捕获区域测量的信号示出在图7中。
免疫测定稀释曲线
为了验证使用限定底物的液滴和受控试剂释放的夹心测定，创建IL-8靶的标准曲线。使用具有重组人类IL-8(R&D Systems,208-IL)的IL-8颗粒，所述颗粒使用PBS中的10,000pg/mL至0.1pg/mL的10倍稀释液来制备。将颗粒吸移到16个孔中，之后进行样品吸移。在室温下将微粒与靶搅拌孵育60分钟。在靶捕获后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗所述微粒以除去未结合的靶，将微粒重新悬浮在50μl低盐磷酸盐缓冲液中并且转移到PCR管中。然后将颗粒涡旋并且将100μl乳液溶液(2％w/w在氟化FC-40中的聚(乙二醇)-二-(氟化油脂-FSH酰胺))添加到所述管中。然后通过涡旋一分钟对两相混合物进行乳化。在涡旋后，将乳液置于37℃的加热块中一小时，以允许检测抗体去杂交并且与靶捕获区域相互作用。
在第二次孵育后，通过添加溶剂(1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇，Sigma)来破坏乳液。将所述管简短地离心以使水相与油相分离，并且然后将每个管的水相吸移到过滤板的孔中，以用于在流式细胞仪中进行分析。在100pg/mL滴定点测量，变异系数计算为17％。基于减去背景的信号除以3倍阴性对照的标准偏差，计算的检测限度为41pg/mL。示例性稀释曲线示出于图8中。
实施例2：反应液滴的物理分离
通过不混溶的连续油相对生物剂或化学剂进行的液滴合并或扩散将导致单个反应的无效分离。***被设计来评估液滴合并/聚结的程度。为了评估聚结，通过剧烈涡旋30秒将具有共价结合的寡核苷酸探针的水凝胶颗粒封装在不混溶的油相中。用水相制备第二种乳液，所述乳液由用Cy5荧光团标记的、与颗粒结合的探针反向互补的500nM寡核苷酸组成。将两种乳液1:1混合，一种乳液仅含有缓冲液中的自然颗粒，另一种乳液含有荧光寡核苷酸靶。将所得混合乳液在37℃孵育60分钟。然后将所述乳液反转，并且使用Guava 8HT流式细胞仪分析每个颗粒上的荧光信号以评估颗粒信号。在许多颗粒上的高信号将表明液滴聚结的显著程度，从而导致荧光互补寡聚物捕获到装载探针的颗粒上。
图9的A部分、B部分和C部分示出由这种方法所获得的颗粒的柱状图以及适当的对照。所使用的对照由封装在油中的、没有荧光寡核苷酸靶存在的颗粒(阴性)和直接用荧光核苷酸孵育的、没有乳化的颗粒(阳性)组成。预期“未封装”颗粒在所有颗粒上显示高信号并且实际上，发现平均强度为200-300AFU。预期阴性对照颗粒仅显示背景荧光，并且发现平均信号为0-10AFU。发现对于多于90％的颗粒而言，与靶荧光寡核苷酸混合的封装颗粒上的信号为0-50AFU。发现一些部分的颗粒具有更高荧光信号，与在“未封装”颗粒上观察的水平相似。这指示一些百分比的液滴可在此乳液***中合并/聚结。这种方法可用于快速筛选乳液***以达到最小化液滴合并并且针对最稳定条件选择的最佳条件。
实施例3：允许两相反应液滴***的示例性连续相
以下描述了这种***的一个示例性实施方案。在此***中，含有水凝胶颗粒的水相与连续不混溶的油相混合，从而导致在油相中单个反应的可逆性稳定封装。
使用由聚乙二醇组成并且具有长度尺寸为100-200微米且宽度方向和高度方向为20-100微米的尺寸的水凝胶颗粒。将在限定颗粒区域含有至少一种捕获抗体并且在另一个区域含有使用互补寡核苷酸系接的至少一种检测抗体的颗粒添加到目标生物样品中。每种颗粒类型具有与它所检测的靶分子缔合的特异性条形码或其他识别特征。可使用多种颗粒类型以在单一反应中同时选择性分析多至1000个生物靶，其中每种颗粒类型存在50-100个靶，以便提供每个靶的多个测量。
对于所述测定，允许将颗粒与样品混合90分钟。然后将所述颗粒用PBS缓冲液冲洗并且悬浮到50微升的体积。将150微升体积的油相和表面活性剂添加到每个管中并且剧烈涡旋30秒以产生剪切力。连续油相由4重量％在HFE7500油中的聚(乙二醇)-二-(氟化油脂-FSH酰胺)组成。涡旋三十秒获得液滴，所述液滴平均而言远小于水凝胶颗粒或者含有单一颗粒。然后将所述乳液在37℃孵育60分钟，从而使得检测抗体释放到微滴反应隔室中并且结合靶的标记被抗体捕获部分捕获。将五十微升破坏溶剂(1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇)添加到所述乳液中，以便除去表面活性剂并且反转乳化。将所得水相通过膜过滤，并且将水凝胶颗粒洗涤并悬浮在200微升PBS缓冲液中。然后可在荧光显微镜或板扫描仪上分析所述颗粒，并且可基于荧光信号强度阐述由初始生物样品捕获的靶信号。
实施例4：高度多重PCR
由于从引物-引物相互作用所产生的高背景信号，基于PCR的技术受限于其复用许多靶的能力。技术诸如ABI TLDA格式或FluidigmBioMark***利用微流体方法来物理地分离单个反应，以便阻止许多引物组合与彼此非特异性地相互作用。然而，这些方法需要昂贵且复杂的器械以及一次性用品。可制备水凝胶微粒，以使得它们含有对待分析的核酸靶特异的寡核苷酸探针以及在水凝胶基质内可逆地结合的正向PCR引物和反向PCR引物。首先将微粒与目标生物样品混合，从而允许所述靶结合到特异性捕获探针。然后将颗粒悬浮在含有扩增所需要的dNTP、缓冲液、阳离子和聚合酶的PCR主混合物中。添加不混溶的油相后，将能量添加到***中并且使用颗粒来限定含水隔室，以用于随后的分离反应。在热循环期间，将所述PCR引物释放到颗粒限定的含水反应器中，从而允许捕获的核酸靶的靶特异性PCR扩增。这种扩增产物可重新捕获到在水凝胶基质内的原始捕获探针，以用于进一步的操纵或分析。
实施例5：单细胞分析
许多基于细胞的测定利用许多细胞的同时裂解和分析。因为结果反映细胞群的平均值，不是单个细胞的真实特性，所以这些方法的真实分析能力受到限制。一次分析一个单个细胞的能力将减轻这个缺点。含有细胞特异性抗体的水凝胶颗粒可与细胞群混合，以使得平均而言，一个细胞结合到每个水凝胶颗粒。然后可将所述颗粒封装在连续不混溶的油相内，从而形成平均而言每个隔室含有一个细胞的水凝胶微粒限定的隔室。然后所述细胞可裂解并且可通过研究特异性分析物与在水凝胶基质内所含有的捕获部分的结合来分析所述细胞的内容物。以这种方式，可在水凝胶模板的微反应器中同时进行许多多分析物单细胞研究。这将增大单细胞分析技术的能力和可用性。可选地，所述颗粒可具有其中单个细胞可静止的孔或空腔，的，或者颗粒可在细胞周围聚合，从而将细胞封装在水凝胶基质中。
实施例6：颗粒限定的微反应器中的数字PCR
在液滴平台诸如Bio-Rad QuantaLife和RainDance上商业化的液滴数字PCR允许核酸靶的绝对定量。这些***依赖于含有PCR引物的许多高度均匀的液滴的产生。这些液滴与生物样品的有限稀释液合并，使得液滴将含有平均不多于一个核酸靶分子，并且执行qPCR产生针对每个靶分子的可测量荧光。可使用水凝胶微粒，而不是依赖于昂贵的流体***来产生单分散性的液滴。将通常直径在1μm与100μm之间的单分散性颗粒与含有生物样品的有限稀释液、dNTP、PCR引物、适当的缓冲液条件和聚合酶的PCR主混合物混合。然后将水凝胶微粒分散在不混溶的连续油相中，从而产生平均含有一个模板分子的单分散性含水微反应器。与荧光标记的引物热循环后，扩增产物捕获到在水凝胶基质内的寡核苷酸捕获探针上。然后可使用器械诸如流式细胞仪分析这些颗粒，以给出在给定样品中的特异性核酸分子的真实定量测量。
实施例7：细胞分泌物分析
外来体、细胞因子和其他生物实体由细胞释放。已经推测，这些分泌物除其他情况之外可有利于细胞至细胞的通信。这些细胞外分子可能难以在单细胞的水平分析。通过用多功能水凝胶颗粒来封装或捕获一个或若干个细胞，可以获得对细胞分泌物或细胞-细胞信号分子的另外的见解。将含有细胞特异性捕获部分的水凝胶微粒与细胞群混合以使得平均每个水凝胶底物捕获一个细胞。然后将水凝胶微粒分散在不混溶的连续油相中，从而产生平均含有一个细胞的含水隔室。可使用在微粒底物内的含有蛋白质、抗体或寡核苷酸探针的限定区域捕获并分析由完整单细胞释放的生物分子。因为这些标记的局部浓度将非常高，所以通常丰度极低的这些分子可在水凝胶微粒底物限定的皮升标度反应器中进行量化。
实施例8：多重ChIP-Seq
染色质-免疫沉淀已经作为用于探索DNA与DNA结合蛋白诸如转录因子、核小体和其他复合物之间的相互作用的很重要的工具出现。这些程序通常利用单个抗体来拉下DNA-染色质复合物，之后进行测序或PCR以表征DNA片段。可使用各自含有不同捕获抗体的许多水凝胶微粒以同时检查在相同样品中的更多DNA-蛋白质复合物。在DNA-蛋白质复合物特异性地结合到每个颗粒后，将微粒封装在连续油相中。然后通过受控刺激诸如热，将抗体特异性DNA标签释放到含水隔室中。钝端连接酶或粘端连接酶与适当的末端修复条件组合，可用于将DNA标签连接到每个捕获的DNA片段上。可纯化这些改编的DNA片段并使用测序或PCR来分析，以使得每个抗体-蛋白质复合物的性质可基于连接到所述DNA片段的已知寡核苷酸标签来阐述。这允许在同一孔中进行高度多重ChIP反应。
其它实施方案和等效物
虽然已经结合各种实施方案和实施例对本公开进行描述，但是并不意图使本公开受限于此类实施方案或实施例。相反，本公开涵盖各种替代方案、修改和等效物，如本领域技术人员将了解的。因此，除非声明那种影响，否则所述描述、方法和图表不应受限于所描述的要素顺序而阅读。
虽然本公开已经描述并说明了某些实施方案，但是应理解，本公开不受那些特定实施方案的约束。相反，本公开包括起作用的所有实施方案和/或已描述和说明的具体实施方案和特征的等效物。
本说明书以引用的方式将以下申请整体并入本文：2011年5月24日公布且题为“Multifunctional Encoded Particles for High-Throughput Analysis”的美国专利号7,947,487于；2010年3月15日提交且题为“Microstructure Synthesis by FlowLithography and Polymerization”的美国专利申请公开号2010/0172898；以及2013年2月7日提交且题为“Scanning Multifunctional Particles”的美国专利申请公开号2013/0210653。

Claims (40)

1.一种用于分析生物分子的方法，其包括：
a)将样品与多个多功能底物孵育，其中每个多功能底物包含具有一个或多个捕获部分的靶捕获区域，每个所述捕获部分特异性地结合靶生物分子，以及通过可释放手段具有一种或多种检测试剂的试剂储存区域，这是在允许所述靶生物分子与所述捕获部分之间的结合的条件下；
b)将不混溶流体与在载体流体内的所述多个多功能底物接触，从而形成多个隔室，每个所述隔室包含单个多功能底物，其中每个隔室的形状基本上由所述多功能底物的形状限定；
c)将所述一种或多种检测试剂从所述试剂储存区域释放，以使得所述检测试剂在单个隔室内与结合所述捕获部分的所述靶生物分子结合；以及
d)分析在所述检测试剂与结合所述捕获部分的所述生物分子之间的所述结合，从而分析在所述样品中所述靶生物分子的存在或量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多功能底物为多功能微粒。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述多功能底物由水凝胶制成。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述水凝胶选自光致抗蚀剂、二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙二醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、藻酸盐、PLGA或其任何组合。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述微粒为非球形颗粒。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个多功能底物包括单分散性微粒。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多个多功能底物包括其最长尺寸在1μm与500μm之间的多分散性微粒。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多功能底物包含空腔、凹陷或孔。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多功能底物包含一个或多个细胞或细菌。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述一个或多个细胞或细菌释放能够在单个隔室内通过所述载体流体扩散的分子。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述一个或多个细胞或细菌释放能够通过不可渗透或半渗透不可混溶相扩散的分子。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中由所述一个或多个细胞或细菌释放的分子具有治疗活性或益生菌活性。
13.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一个或多个捕获部分选自抗体、纳米抗体、寡核苷酸探针、肽核酸、小分子、适体、细胞、细菌、病毒、细胞器、肽、或其组合。
14.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂选自检测抗体、纳米抗体、酶、PCR引物、蛋白质、寡核苷酸、肽、适体、小分子、其他化学化合物或其组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂用选自以下的检测部分标记：荧光团、生色团、放射性同位素、生物素、酶产物、抗体、量子点、分子信标和/或适体。
16.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多功能底物包含一个或多个疏水性区域。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个疏水性区域由疏水性聚合物构成。
18.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述不混溶流体为可选择性渗透的。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述不混溶流体为油并且所述载体流体为含水流体。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述不混溶流体为含水流体并且所述载体流体为油。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述油选自Fluorinert FC-40油、Tegasoft或矿物油。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述油还包含表面活性剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述表面活性剂是双功能分子。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述表面活性剂是ABIL WE-09或PFPE-PEG。
25.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶生物分子为蛋白质、核酸、细胞、细菌或化学化合物。
26.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述可释放手段选自可逆性相互作用、不可逆反应、可逆***联剂或光可裂解接头。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述可逆性相互作用选自静电相互作用、物理相互作用、磁性相互作用、化学相互作用或核酸双链体形成。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述不可逆反应为键裂解。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述可逆***联剂选自分别通过羟胺、硫醇和/或高碘酸盐可裂解的EGS、DSP和/或DST。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述光可裂解接头为基于1-(2-硝基苯基)乙基的接头。
31.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂以受控方式从所述试剂存储区域释放到所述隔室内。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述受控方式包括使用加热、紫外光、可见光、微波辐射、酶催化、pH或特异性化学剂作为刺激。
33.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂在不同时间释放。
34.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括乳化步骤。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述乳化步骤通过机械搅拌或剪切、声音搅动或微流体器件来实现。
36.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述分析步骤包括量化存在于所述靶捕获区域中的检测部分的量，从而确定所述样品中的靶生物分子的量。
37.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述每个多功能底物还包含编码区域。
38.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多功能底物使用基于荧光识别器或可见光识别器的流式细胞仪或微阵列扫描仪来分析。
39.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述隔室在检测之前反转。
40.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多个多功能底物包含具有针对多个靶生物分子的多个捕获部分的多个多功能底物子组，并且其中所述方法分析所述样品中的所述多个靶生物分子的存在或量。
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