BR112015022844B1 - Método para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos do doador em uma amostra biológica, sistema e kit para praticar o mesmo - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DO DOADOR EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, SISTEMA E KIT PARA PRATICAR O MESMO. A presente invenção refere-se a métodos para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos ao doador em uma amostra biológica. Os métodos incluem misturar uma amostra celular a partir de um doador com uma amostra biológica a partir de um recipiente sob condições suficientes para anticorpos imunológicos do recipiente, caso presente, para ligar ao antígeno de superfície de célula doadora (Ag) para formar um complexo de anticorpo imunológico Ag, por em contato a mistura com microesferas que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag (por exemplo, o Ag ou o anticorpo imunológico) em uma superfície do mesmo, adicionar sob condições de lise um anticorpo detectavelmente marcado que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag ligado às microesferas, e detectar a presença ou ausência do anticorpo detectavelmente marcado ligado ao complexo de anticorpo imunológico Ag para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos ao doador na amostra biológica a partir do recipiente. Os sistemas e os kits para praticar os métodos também são fornecidos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica a prioridade à data de deposito do Pedido de Patente Serial Provisório U.S. N° 61/782.003, depositado em 14 de março de 2013, a descrição da qual é incorporada por referência a este documento em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] Mais de 100.000 transplantes de órgãos sólidos são realizados anualmente em todo o mundo, incluindo dezenas de milhares realizados anualmente nos Estados Unidos. Embora melhorias signifi- cantes na imunossupressão e cuidados pós-transplante, função de enxerto de longo prazo é menos que o ideal. Nos Estados Unidos, as taxas de sobrevivência de aloenxerto de 10 anos ajustadas para transplantes de rim de doador vivo e falecido são apenas cerca de 40% e 60%, respectivamente. A falha de enxerto de estágio precoce e tardia, secundária à rejeição de anticorpo mediada (AMR) é uma importante causa de sobrevivência de enxerto inferior.

[003] Os anticorpos para Antígenos de Leucócitos Humanos (HLA) estão circulando anticorpos presentes no candidato ao transplante ou sangue do recipiente que são o resultado de um evento de sensibilização anterior (transfusão de sangue, transplante anterior ou gravidez). Os anticorpos específicos de doador (DSA) presentes pré-transplante podem causar rejeição hiperaguda e perda de enxerto imediata e são avaliados através de um crossmatch de pré-transplante. Em anos mais recentes, o conceito de moni-toramento para o desenvolvimento de pós-transplante de anticorpos clini-camente relevantes direcionados contra a classe I e II HLA específica de doador, incompatibilidades têm sido uma área pertinente de interesse den- tro da comunidade de transplante. Seja detectado pré ou pós- transplante, a presença de anticorpos direcionados contra os antíge- nos expressados nos órgãos do doador, quando não tratados clinicamente, resulta em um ataque imunolígico contra o órgão transplantado e aumenta o risco de perda do enxerto e/ou rejeição. DSA ataca, entre outros, o endotélio do aloenxerto e pode resultar em AMR comprovada por biópsia subsequente e lesão aguda, o que exige imunossupressão acentuada. A progressão do desenvolvimento de DSA e os compostos eventos clínicos correspondentes somam a danificação do aloenxerto, resultando em alterações crônicas ao longo do tempo que, finalmente, comprometem a função do enxerto e da sobrevivência.

[004] A rejeição de anticorpo mediada pode se apresentar como um processo de início agudo, resultante de uma resposta anamnéstica ou produção de anticorpos de novo, ou como um processo tardio e crônico devido à produção de anticorpos de novo. Na fase aguda, muitas vezes são pré-formados anticorpos que causam a rejeição precoce, mas DSA de novo também pode se desenvolver no início do período pós-transplante, resultando em rejeição aguda. Pacientes com DSA pré-formadas estão em risco significativamente maior de ter AMR aguda e têm sobrevivência do enxerto significativamente menor.

[005] A rejeição crônica é uma das principais causas de perda de enxerto censurado por óbito. Os ciclos repetidos de lesão mediada por alo-anticorpo e reparo resultam em mudanças distintas na microvascu- latura do aloenxerto. Pacientes com DSA pré-formados e aqueles que desenvolvem DSA de novo estão em risco aumentado de ter rejeição crônica.

SUMÁRIO

[006] Os métodos para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador em uma amostra biológica são fornecidos. Os métodos incluem formar uma mistura por meio da combi- nação de uma amostra celular de um doador com uma amostra biológica de um recipiente sob condições suficientes para os anticorpos imunológicos do recipiente, caso presentes, se ligarem ao antígeno (Ag) de superfície de célula de doador para formar um complexo de anticorpo imunológico Ag, por em contato a mistura com micro grânulos que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao complexo anticorpo imunológico Ag (por exemplo, Ag ou anticorpos imunológicos) sobre uma superfície respectiva, adicionar sob condições de Lise um anticorpo detectável marcado que especificamente se liga ao complexo anticorpo imunológico Ag ligado às microgrânulos, e detectar a presença ou ausência do anticorpo detectável marcado ligado ao complexo anticorpo imunológico Ag para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador da amostra biológica do recipiente. Os sistemas e kits para praticar os presentes métodos também são fornecidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[007] A invenção pode ser melhor entendida a partir da seguinte descrição detalhada quando lida em conjunto com os desenhos que acompanham. As figuras estão incluídas nos desenhos a seguir:

[008] A FIG. 1 ilustra esquematicamente um método para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador em uma amostra biológica de acordo com uma modalidade da descrição presente.

[009] A FIG. 2 ilustra esquematicamente um método para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador em uma amostra biológica de acordo com uma segunda modalidade da descrição presente.

[0010] A FIG. 3 mostra os resultados de um experimento de DSA- FXM envolvendo a captura e marcação simultânea de DSAs. Quatro amostras foram testadas para DSA-FXM usando microgrânulos de HLA de classe I e classe II distintas pela identificação fluorescente interna de cada microgrânulo. Fluorescência crescente (sinal positivo) devido ao anticorpo específico de HLA é mostrada no eixo X. A FIG. 3, painel A: ambos os anticorpos específicos de doador (DSA) de HLA de Classe I (C-I) e Classe II (C-II) foram negativos (CI-/CII-); FIG. 3, painel b: somente DSA C-II foi positivo (CI-/CII+); FIG. 3, painel c: somente DSA C-I foi positivo (CI+/CII-); e a FIG. 3, painel D: ambos DSAs CI e C-II foram positivos (CI+/CII+).

[0011] A FIG. 4 mostra os resultados de um experimento de DSA- FXM envolvendo a captura e marcação sequencial de DSAs. Um soro AB negativo (Amostra A) e três soros positivos (Amostras B, C e D) foram testados para DSA-FXM. Amostra A: ambos DSA C-I e C-II negativo; Amostra B: ambos DSA C-I e C-II DSA positivo; Amostra C: apenas DSA C-I DSA positivo e DSA C-II negativo; Amostra D: apenas DSA C-II positivo e DSA C-I negativo.

[0012] A FIG. 5 fornece resultados de um experimento de DSA- FXM. Um pool de soros positivos HLA-Ab (PPS) em diferentes diluições foi testado contra várias quantidades de células para FXM, DSA- FXM e LMX-IgG. Os resultados mostram que DSA-FXM é o método mais sensível para detectar DSA e usa muito menos células (por exemplo, DSA pode ser detectado com tão pouco quanto 25.000 células) quando comparado com os métodos padrões. LMX-IgG define as especificidades de HLA contidas no soro PPS em uma plataforma Lu- minex usando microgrânulos de antígeno único e os valores mostrados são as intensidades de fluorescência média (MFI). Valores maiores que ou iguais a 1.000 MFI são considerados positivos; valores entre 500-999 MFI são considerados possíveis positivos (equívocos).

[0013] A FIG. 6 mostra os resultados de um experimento de DSA- FXM. Vinte e três amostras de proficiência externa CAP (College of American Pathologists) foram testadas para DSA-FXM simultanea- mente com teste cego e em paralelo com crossmatch de citometria de fluxo regular (FXM) e a triagem de anticorpo Luminex padrão em mi- crogrânulos de antígeno único (LMX-IgG). Os anticorpos específicos de doador (DSAs) de HLA de classe I (C-I) e/ou HLA II (C-II) foram identificados e a maioria dos DSAs foram adicionalmente confirmados para LMX-IgG. Alguns DSA extras com baixo MCS foram apenas detectados com o método mais sensível de DSA-FXM. As amostras de proficiência externa são soros e células com especificidades conhecidas. As especificidades dos soros são ocultadas para os participantes até que todos os resultados sejam recebidos de todos os centros participantes.

[0014] A FIG. 7 fornece resultados de um experimento de DSA- FXM. Sete amostras positivas de DSA de HLA-DQ foram identificadas para LMX-IgG e confirmadas através de DSA-FXM. Historicamente, têm sido impossível de detectar todas as DSA específicas a DQ através de qualquer tipo de ensaio de DSA envolvendo células ou extratos de célula.

[0015] A FIG. 8 mostra os resultados de um experimento de DSA- FXM. Seis amostras positivas de DSA de HLA-DP foram identificadas para LMX-IgG e confirmadas através de DSA-FXM.

[0016] A FIG. 9 fornece resultados de um experimento de DSA- FXM. Três amostras positivas de DSA de HLA-C foram identificadas para LMX-IgG e confirmadas através de DSA-FXM.

[0017] A FIG. 10 mostra resultados experimentais de um procedimento de teste de DSA-FXM. Painel A: ambos os anticorpos específicos de doador (DSA) de HLA de Classe I (C-I) e Classe II (C-II) foram negativos (CI-/CII-); Painel B: apenas DSA C-I foi positivo (CI+/CII-); Painel C: apenas DSA C-II foi positivo (CI-/CII+); e Painel D: ambos DSAs CI e C-II foram positivos (CI+/CII+).

[0018] A FIG. 11 fornece resultados de 117 testes de DSA-FXM separados com reatividade de DSA de classe I e classe II conhecida ou falta da mesma, mostrando padrões mutuamente exclusivos de rea- tividade correlacionados com os perfis DSA conhecidos.

[0019] A FIG. 12 mostra uma comparação da sensibilidade do ensaio de microgrânulo de antígeno único de FXM, DSA-FXM, e LMX- IgG para um DSA específico de classe I (B7), mostrando que DSA- FXM pode detectar um DSA de classe I de HLA específico na célula alvo mesmo quando os outros dois testes foram negativos.

[0020] A FIG. 13 mostra uma comparação da sensibilidade do ensaio de microgrânulo de antígeno único de FXM, DSA-FXM, e LMX- IgG para um DSA específico de classe II (DR4), mostrando que DSA- FXM pode detectar um DSA de classe II de HLA específico na célula alvo mesmo quando os outros dois testes foram negativos.

[0021] A FIG. 14 os painéis A e B mostram a correlação de Pearson entre os resultados de DSA-FXM e LMX-IgG SAB para comparações de 95 DSA de classe I (Painel A) e de 100 DSA de classe II (Painel B) FXM. O painel C mostra as porcentagens de sensibilidade e especificidade para a classe I e II usando DSA IgG como padrão. Painel D mostra uma comparação de LMX-IgG SAB, LMX-C1q SAB, FXM, e DSA-FXM em 7 amostras de soro (6 indivíduos). Discrepâncias relacionadas com reatividade excessiva de LMX-sab. Em conjunto com a Fig. 15, resultados mostram que o LMX-IgG SAB produz reações falso-positivas (isto é, DSA positivo quando ambos FXM e DSA-FXM são negativos). Isso contribui para a baixa especificidade mostrada na Fig. 15.

[0022] A FIG. 15 mostra uma comparação de FXM e DSA-FXM em 15 pacientes, 12 dos quais tinham autoanticorpos para FXM aos antígenos de especificidade desconhecida (painel inferior). Quatro desses pacientes (P12-P-15) tiveram autoanticorpo direcionado a HLA, conforme determinado por DSA-FXM (painel superior).

[0023] A FIG. 16 mostra como comparação da habilidade de FXM e DSA-FXM para distinguirem reações positivas devido à classe de DSA (I e/ou II). Cabeçalhos de DSA-FXM: As microgrânulos de CI detectam todos de classe I, CIIa detecta DQ, CIIb detecta todos DR e DP, mas apenas alguns DQ. Quatro tipos diferentes de resultados são mostrados. Casos 1 e 3 ambos têm FXMs de célula B positivo, mas o caso 1 é devido ao alo-anticorpo de classe I enquanto que o caso 3 é devido a alo-anticorpo classe II. Casos 2 e 4 ambos têm FXMs T e B positivos, mas o caso 2 é devido a autoanticorpos, enquanto que o caso 4 é devido ao Alo-anticorpo classe I.

[0024] A FIG. 17 o painel A mostra os resultados de DSA-FXM para o DSA de classe I no soro diluído 1:2 em tampão e 1:2 em imuno- globulina intravenosa (IVIG). A IVIG é usada para a dessensibilização de HLA, para diminuir os anticorpos. O FXM habitual mostra aumentos na amostra tratada com IVIG em comparação ao tampão (dados não mostrados) devido à presença do reagente de anti-IgG de segunda etapa e ampla reatividade da IVIG com alvos desconhecidos na superfície das células. O DSA-FXM mostra a inibição da IVIG devido ao fato de que a detecção é específica ao HLA. Assim, DSA-FXM revela a eficácia do tratamento. O painel B mostra os resultados de DSA-FXM para o DSA de classe II no soro diluído 1:2 em tampão e 1:2 em imu- noglobulina intravenosa (IVIG). A IVIG é usada para a dessensibilização de HLA, para diminuir os anticorpos. O FXM habitual mostra aumentos na amostra tratada com IVIG em comparação ao tampão (dados não mostrados) devido à presença do reagente de anti-IgG de segunda etapa e ampla reatividade da IVIG com alvos desconhecidos na superfície das células. O DSA-FXM mostra a inibição da IVIG devido ao fato de que a detecção é específica ao HLA. Dessa forma, DSA- FXM revela a eficácia do tratamento.

[0025] A FIG. 18 o painel A mostra os resultados de um soro de DSA positivo incrementado com 5% de IVIG e testado em diferentes diluições através de DSA-FXM. Os resultados mostraram que IVIG tinha uma inibição dependente de dose em ambos DSAs de classe I de HLA. O painel B mostra os resultados de um soro de DSA positivo incrementado com 5% de IVIG e testado em diferentes diluições através de DSA-FXM. Os resultados mostraram que IVIG tinha uma inibição dependente de dose em ambos DSAs de classe II de HLA.

[0026] A FIG. 19 mostra os resultados de FXM e de DSA-FXM em amostras em série de um candidato de rim submetido ao tratamento de dessensibilização de IVIG para diminuir/anular prospectivamente o DSA a um doador vivo identificado em potencial. Os resultados de FXM mostram valores MCS acentuados devido à IVIG e Rituxan (anti- CD20 terapêutico, um marcador de células B) enquanto os resultados de DSA-FXM mostrar a inibição (eficácia) dos valores de IVIG e de MCS em faixa aceitável para o transplante, mesmo na presença de anticorpos terapêuticos.

DEFINIÇÕES

[0027] Por "anticorpos específicos do doador" ou "DSAs" quer se dizer os anticorpos presentes em um recipiente que se ligam especificamente a antígenos do doador (por exemplo, antígenos de superfície de célula de doador). Os DSAs podem ser "pré-formados" (por exemplo, presentes no recipiente antes de receber um transplante ou transfusão de um doador) e/ou DSAs de novo que são produzidos pelo recipiente em resposta a ter engravidado, ou receber um transplante ou transfusão de um ou mais doadores. Os DSAs podem, em alguns casos, ser DSAs autólogos (autoanticorpos) que se ligam aos componentes de superfície de célula das células do próprio recipiente. Em certos aspectos, os DSAs são anticorpos de fixação de complemento (CFAbs). Em certos aspectos, os DSAs são contra antígenos de HLA.

[0028] Um "reagente de afinidade" da presente invenção tem um domínio de ligação de analito, porção química ou componente que tem uma afinidade de ligação alta para um analito alvo. Por afinidade de ligação alta quer-se dizer a afinidade de ligação de pelo menos cerca de 10-4 M, usualmente pelo menos cerca de 10-6 M ou mais alto, por exemplo, 10-9M ou mais alto. O reagente de afinidade pode ser qualquer um dentre uma variedade de diferentes tipos de moléculas, desde que exiba a afinidade de ligação necessária para a proteína alvo quando presente como ligante de afinidade etiquetado.

[0029] Como tal, o reagente de afinidade pode ser uma ligante de molécula pequena ou de molécula grande. Por ligante molécula pequena quer-se dizer um ligante que varia em tamanho de cerca de 50 a cerca de 10.000 daltons, usualmente de cerca de 50 a cerca de 5.000 daltons e, mais geralmente, de cerca de 100 a 1.000 daltons. Por molécula grande quer-se dizer um ligante em tamanho de cerca de 10.000 daltons ou mais em peso molecular.

[0030] De interesse em particular, tal como os ligantes de afinidade a molécula ligantes grande são anticorpos, assim também são os fragmentos e miméticos de ligação respectivos. Em que os anticorpos são o ligante de afinidade, os mesmos podem ser derivados de composições policlonais, tal que uma população heterogênea de anticorpos que diferem através de especificidade são, cada um, marcados com a mesma etiqueta. Como tal, o ligante de afinidade pode ser um anticorpo monoclonal, oligoclonal, e/ou policlonal. O ligante de afinidade pode ser um fragmento de ligação do anticorpo ou mimético, em que esses fragmentos e miméticos têm a afinidade de ligação necessária à proteína do alvo. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos, tais como Fv, F(ab')2 e Fab podem ser preparados pela clivagem da proteína intacta, por exemplo. por protease ou clivagem química. Também de interesse são os fragmentos de anticorpo recombinante- mente produzidos, tais como anticorpos de cadeia única ou scFvs, em que tais fragmentos de anticorpos recombinantemente produzidos retêm as características de ligação dos anticorpos acima. Tais fragmentos de anticorpos recombinantemente produzidos geralmente incluem pelo menos os domínios VH e VL dos presentes anticorpos, a fim de manter as características de ligação dos presentes anticorpos. Esses fragmentos de anticorpos recombinantemente produzidos ou miméti- cos da atual invenção podem ser facilmente preparados usando qualquer metodologia conveniente, tais como a metodologia divulgada na Patente n°s U.S. 5.851.829 e 5.965.371; as descrições da qual são incorporadas neste documento por referência.

[0031] OS anticorpos, fragmentos e miméticos descritos acima respectivos podem ser obtidos a partir de fontes comerciais e/ou preparados usando qualquer tecnologia conveniente, em que os métodos de produção dos anticorpos policlonais, anticorpos oligoclonais, anticorpos monoclonais, fragmentos e miméticos dos mesmos, incluindo derivados recombinantes, são conhecidos por aqueles de versados na técnica.

[0032] Por "epítopo" quer-se dizer um local em um antígeno ao quais as células B e/ou células T específicas respondem. O termo também é usado permutavelmente com "determinante antigênico" ou "local de determinante antigênico". Um epítopo pode incluir 1 ou mais aminoácidos, tal como três ou mais aminoácidos, em uma conformação espacial única ao epítopo. Um epítopo pode incluir de 1-10 amino- ácidos, como, por exemplo, de 1-5 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos. Os métodos para determinar a conformação espacial dos aminoácidos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, cristalografia de raios x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Além disso, a identificação dos epítopos em uma dada proteína é prontamente alcançada usando as técnicas bem conheci-das na técnica. Consulte, por exemplo, Geysen et al, proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:3998-4002 (general method of rapidly synthesizing peptides to determine the location of immunogenic epitopes in a given antigen); U.S. Pat. No. 4,708,871 (procedures for identifying and chemically synthesizing epitopes of antigens); e Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (technique for identifying peptides with high affinity for a given antibody). Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensáio simples que mostra a habilidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo ao antígeno alvo.

[0033] Por "ligar especificamente" ou "especificamente ligar" quer- se dizer ligação de alta avidez e/ou alta afinidade de um anticorpo a um antígeno ou epítopo específico. A ligação dos anticorpos a seu epí- topo em um antígeno específico é com uma maior avidez e/ou afinidade que a ligação do mesmo anticorpo a diferentes epítopos, particularmente, diferentes epítopos que podem estar presentes em moléculas em associação a, ou na mesma amostra, que um antígeno específico de interesse. Os anticorpos de fixação de complemento, no entanto, têm a avidez e/ou afinidade igual ou similar a diferentes epítopos de diferentes antígenos de interesse. Como tal, "ligado especificamente" ou "especificamente ligado" não se destina a excluir um dado anticorpo fixador de complemento de se ligar a mais de um antígeno de interesse. Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de interesse podem ser capazes de ligar outros polipeptídeos em um nível fraco, porém, detectável, (por exemplo, 10% ou menos da ligação mostrada para o polipeptídeo de interesse). Tal ligação fraca, ou ligação de fundo, é facilmente discernível da ligação de anticorpo específica para o polipeptídeo de interesse, por exemplo, através do uso dos controles apropriados.

[0034] Por anticorpo "detectavelmente marcado" quer-se dizer um anticorpo que tem um marcador detectável fixado, em que o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a outra molécula, por exemplo, outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo de IgG). O anticorpo detec- tavelmente marcado retém a especificidade de ligação. O marcador pode ser fixado por conjugação química, ou em que o marcador é um polipeptídeo, alternativamente poderia ser fixado por meio de técnicas de engenharia genética. Os métodos para produção de anticorpos de- tectavelmente marcados são bem conhecidos na técnica. Os marcadores detectáveis podem ser selecionados de uma variedade de tais marcados conhecidos na técnica, incluindo radioisótopos, cromóforos, fluoróforos, fluorocromos, enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre), moléculas ligantes ou outras partes ou compostos que emitem um sinal detectável (por exemplo, radioatividade, fluorescência, cor) ou emitem um sinal detectável após a exposição do marcador ao seu substrato. Vários pares de marcador/substrato detectáveis (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre/diaminobenzidina, bioti- na/estreptavidina, luciferina/luciferase), os métodos para marcação de anticorpos, e os métodos para uso de anticorpos secundários marcados para detectar um antígeno são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Harlow e Lane, eds. (Using Antibodies: A Laboratory Manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0035] Por "isolado" quer-se dizer um composto de interesse que está em um ambiente diferente daquele no qual o composto ocorre naturalmente. "Isolado", deve incluir compostos que são dentro de amostras que são substancialmente enriquecidas para o composto de interesse e/ou em que o composto de interesse é substancialmente ou parcialmente purificado. O termo "isolado" abrange os exemplos nos quais o composto não é acompanhado por pelo menos parte do material com o qual normalmente é associado em seu estado natural. Por exemplo, o termo "isolado" com relação a um polipeptídeo geralmente refere-se a uma molécula de aminoácido desprovida, completamente ou em parte, de sequências normalmente associada ao mesmo na natureza; ou uma sequência, conforme existe na natureza, mas tendo sequências heterólogas em associação a mesma.

[0036] Conforme usado neste documento, "purificado" significa que o dito material compreende pelo menos cerca de 75%, em peso, da proteína total, com pelo menos cerca de 80% sendo preferido, e pelo menos cerca de 90% sendo particularmente preferido. Conforme usado neste documento, o termo "substancialmente puro" refere-se a um composto que é removido do seu ambiente natural e é pelo menos 60% livre, de preferência, 75% livre e, com mais preferência 90% livre de outros componentes com o qual é naturalmente associado.

[0037] Uma "amostra biológica de um recipiente" conforme usado neste documento se refere a uma amostra de tecido ou fluido isolada de um recipiente, que, no contexto da invenção, geralmente se refere a amostras que possam conter anticorpos específicos de doador, cujas amostras, após o processamento opcional, podem ser analisadas em um ensaio in vitro. As amostras de interesse incluem, mas não estão limitadas a, sangue, plasma, soro, células do sangue, urina, saliva, tecido de biópsia e mucosas. As amostras também incluem amostras dos constituintes de cultura de célula in vitro incluindo, mas sem se limitar a, mídia condicionada resultantes do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, por exemplo, células recombinantes e componentes celulares.

[0038] Por "antígeno de leucócito humano" ou "HLA" destina-se a genes dentro do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), que abrange aproximadamente 3,5 milhões pares de bases no braço curto do cromossomo 6. O MHC é divisível em 3 regiões separadas que contêm os genes de classe I, classe II e classe III. Em humanos, o complexo de HLA de classe I é de cerca de 2000 kb em tamanho e contém cerca de 20 loci. Dentro da região de classe I existem genes que codificam as moléculas bem caracterizadas de MHC de classe I designadas HLA-A, HLA-B e HLA-C. Além disso, há genes de classe I não clássicos codificados por HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-X e MIC loci. A região de classe II contém seis famílias de gene codificadas por HLA-DRB1,3,4,5, HLA-DQA, HLA-DQB, e HLA-DPA, HLA-DPB loci. Esses genes codificam a cadeia α e β das moléculas de MHC classe II clássicas designadas HLA-DRB1, 3, 4, 5, DQ e DP. Em humanos, os genes não clássicos codificados por DM, DN e DO Locus também têm sido identificados dentro da classe II. A região de classe III contém um conjunto heterogêneo de mais de 36 loci associados à resposta imonológica.

[0039] Os termos "determinar", "medir", "avaliar", "analisar" e "ensaiar" são usados de forma intercambiável e incluem determinações quantitativas e qualitativas.

[0040] O termo "substrato sólido" se refere a um suporte sólido no qual os antígenos e/ou os anticorpos podem ser imobilizados no mesmo. Os substratos sólidos exemplificativos incluem placas de multiwell, membranas, incluindo membranas de nitrocelulose e membranas de polietileno, celular e membranas celulares, grânulos, micropartículas, microesferas, microgrânulos e similares. Os métodos da invenção podem ser efetuados com micropartículas, microesferas, microgrânulos, ou grânulos de qualquer material, por exemplo, sílica, ouro, látex, polímeros tais como o poliestireno, polisulfona, polietil ou hidrogel. Além disso, as micropartículas, microgrânulos, grânulos ou microgrânulos podem ser magnéticos.

[0041] O termo "anticorpo fixador de complemento" se refere a um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno ou um patógeno e inicia a cascata de complemento do sistema imunológico que fornece liberação do alvo portando o antígeno (por exemplo, célula) ou pa- tógeno do organismo. Em geral, um anticorpo fixador de complemento é um anticorpo IgM ou IgG que é reconhecido e especificamente vinculado pelo fator de complemento C1q, fator de complemento C3 através de rota alternativa, ou similar.

[0042] É observado, ainda, que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e afins em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0043] Os métodos para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador em uma amostra biológica são fornecidos. Os métodos incluem formar uma mistura por meio da combinação de uma amostra celular de um doador com uma amostra biológica de um recipiente sob condições suficientes para os anticorpos imunológicos do recipiente, caso presentes, se ligarem ao antígeno (Ag) de superfície de célula de doador para formar um complexo de anticorpo imunológico Ag, por em contato a mistura com micro esferas que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao comple-xo anticorpo imunológico Ag (por exemplo, Ag ou anticorpos imunoló- gicos) sobre uma superfície respectiva, adicionar sob condições de Lise um anticorpo detectável marcado que especificamente se liga ao complexo anticorpo imunológico Ag ligado às microesferas, e detectar a presença ou ausência do anticorpo detectável marcado ligado ao complexo anticorpo imunológico Ag para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador da amostra biológica do recipiente. Os sistemas e kits para praticar os presentes métodos também são fornecidos.

[0044] Antes de a presente invenção ser descrita mais detalhada- mente, é para ser entendido que esta invenção não é limitada a determinadas modalidades descritas, como tal, é claro, variam. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações emendadas.

[0045] Onde um intervalo de valores for fornecido, entende-se que cada valor intermediário, ao décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente indique o contrário, entre os limites inferiores e superiores do intervalo também é especificamente divulgado. Cada intervalo menor entre qualquer valor declarado ou valor intermediário em um intervalo citado e qualquer outro valor declarado ou intermediário naquele intervalo citado é englobado dentro da invenção. Os limites superior e inferior desses intervalos podem ser independentemente incluídos ou excluídos no intervalo, e cada intervalo onde qualquer um, nenhum ou ambos limites estão incluídos em intervalos menores também estão englobados na invenção, submetidos a qual-quer limite especificamente excluído na faixa indicada. Onde o intervalo citado incluir um ou ambos os limites, os intervalos excluindo qualquer um ou ambos os limites incluídos também são incluídos na invenção.

[0046] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo versado na técnica ao qual essa invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento também possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, alguns métodos exemplares e em potencial e materiais podem ser descritos agora. Todas e quaisquer publicações mencionadas neste documento são incorporadas neste documento por referência a divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão aos quais as publicações são citadas. Entende-se que a presente descrição substitui qualquer descrição de uma publicação incorporada na medida em que há contradição.

[0047] Deve ser observado que quando usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, a referência a "um eletrodo" inclui uma pluralidade de tais eletrodos e a referência a "o sinal" inclui a referência a um ou mais sinais e assim por diante.

[0048] É observado, ainda, que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento que possa ser opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e afins em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa".

[0049] As publicações discutidas neste documento são providas unicamente para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Adicionalmente, as datas de publicação providas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar serem confirmadas de forma independente. Na medida em que tais publicações podem estabelecer definições de um termo que entre em conflito com a definição explícita ou implícita da presente descrição, a definição da presente descrição controla.

[0050] Assim como pode ser aparente aos versados na técnica ao ler esta descrição, cada um das modalidades individuais descritos e ilustrado neste documento tem componentes discretos e recursos que podem ser prontamente separados ou combinados com as caracterís- ticas de quaisquer uma das outras várias modalidades sem partir do escopo ou o sentido da presente invenção. Pode efetuar-se qualquer método citado na ordem dos eventos citados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível.

MÉTODOS

[0051] Conforme resumidos acima, os aspectos da invenção incluem métodos para determinar a presença ou a ausência de anticorpos específicos de doador em uma amostra biológica. Os métodos incluem formar uma mistura por meio da combinação de uma amostra celular de um doador com uma amostra biológica de um recipiente sob condições suficientes para os anticorpos imunológicos do recipiente, caso presentes, se ligarem ao antígeno (Ag) de superfície de célula de doador para formar um complexo de anticorpo imunológico Ag, por em contato a mistura com micro esferas que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao complexo anticorpo imunológico Ag (por exemplo, Ag ou anticorpos imunológicos) sobre uma superfície respectiva, adicionar sob condições de Lise um anticorpo detectável marcado que especificamente se liga ao complexo anticorpo imunoló- gico Ag ligado às microesferas, e detectar a presença ou ausência do anticorpo detectável marcado ligado ao complexo anticorpo imunológi- co Ag para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos de doador da amostra biológica do recipiente. Várias etapas e aspectos dos métodos serão descritos agora em mais detalhes abaixo.

[0052] Por "doador" quer-se dizer uma fonte (por exemplo, uma fonte humana) da amostra celular. O doador pode ser diferente do recipiente (por exemplo, em que os DSAs podem ser aloanticorpos), ou o doador e o recipiente podem ser o mesmo (por exemplo, em que os DSAs podem ser autoanticorpos). Em certos aspectos, o doador pode ser um candidato para doar células (por exemplo, células do sangue), tecidos (por exemplo, córnea, pele, ossos, válvula cardíaca, tendão, veias femorais e/ou safena, linfonodos, baço e similares), órgãos (por exemplo, rim, coração, fígado, pâncreas, pulmão, intestino, olho e similares) e qualquer combinação das mesmas, para um recipiente em necessidade dos mesmos. Os doadores de interesse incluem doadores humanos, doadores primatas não humanos, doadores mamíferos (por exemplo, porcos), doadores não-mamíferos e quaisquer outros tipos de doador de interesse.

[0053] Conforme usado neste documento, uma "amostra celular" de um doador é uma amostra obtida do doador que inclui pelo menos uma célula. A pelo menos uma célula pode ser uma célula nucleada (por exemplo, linfócito ou célula mononuclear de sangue periférico (PBMC)), ou uma célula sem um núcleo (por exemplo, um eritrócito ou plaqueta). Em certos aspectos, a amostra celular é uma amostra obtida do doador que inclui células selecionadas dentre linfócitos (por exemplo, células T ou células B), PBMC, eritrócitos, plaquetas e qualquer combinação desses. De acordo com determinadas modalidades, a amostra celular do doador é de um tecido do doador (por exemplo, linfonodos, baço, córnea, pele, ossos, válvula cardíaca, tendão, veias femorais e/ou safena e similares), de um órgão de doador (por exemplo, rim, coração, pâncreas, pulmão, fígado, intestino, olhos e similares), ou qualquer combinação de tais tecidos e/ou órgãos. A amostra celular pode ser submetida a um procedimento de purificação antes do uso nos métodos de descrição do presente. Por exemplo, a amostra celular pode ser uma amostra substancialmente pura de linfócitos, células mononucleares de sangue periférico (PBMC), hemácias, e/ou plaquetas, que a amostra é livre de componentes que podem interferir com mistura, contato e/ou detecção dos passos dos presentes métodos. Em certos aspectos, os métodos incluem a obtenção da amostra celular do doador.

[0054] De acordo com certas modalidades, a amostra celular do doador inclui 0,001 x 106 a 2,0 x 106 células. Em certos aspectos, a amostra celular do doador inclui 1 x 106 ou menos células, como 0,5 x 106 ou menos células, 0,4 x 106 ou menos células, 0,3 x 106 ou menos células, 0,2 x 106 ou menos células, 0,1 x 106 ou menos células ou 0,5 x 105 ou menos células. Em certos aspectos, a amostra celular do doador inclui de 25.000 a 200.000 células.

[0055] Por "recipiente" quer-se dizer a fonte da amostra biológica. O doador pode ser diferente do doador (por exemplo, em que os DSAs podem ser aloanticorpos), ou o recipiente e o doador podem ser o mesmo (por exemplo, em que os DSAs podem ser autoanticorpos). Em certos aspectos, o recipiente (por exemplo, um recipiente humano) pode ser um candidato para o recebimento de células (por exemplo, células do sangue), tecidos (por exemplo, córnea, pele, ossos, válvula cardíaca, tendão, veias femorais e/ou safena e similares), órgãos (por exemplo, rim, coração, pâncreas, pulmão, fígado, intestino, olhos e similares) e qualquer combinação dos mesmos, a partir do doador (por exemplo, para aliviar uma condição médica) ou pode já ter recebido as células, um tecido ou um órgão do doador. Os recipientes de interesse incluem recipientes humanos, recipientes primatas não humanos, recipientes mamíferos, recipientes não-mamíferos e quaisquer outros tipos de recipientes de interesse.

[0056] A "amostra biológica" do recipiente pode ser qualquer amostra biológica do recipiente que inclua ou possa incluir anticorpos específicos de doador (DSAs). De acordo com certas modalidades, a amostra biológica do recipiente é selecionada dentre soro, plasma, sangue, saliva, tecido e qualquer combinação dos mesmos. Em certos aspectos, a amostra biológica é 100 μL ou menos de soro, plasma, sangue, saliva, ou qualquer combinação dos mesmos, tais como 90 μL ou menos, 80 μL ou menos, 70 μL ou menos, 60 μL ou menos, 50 μL ou menos, 40 μL ou menos, 30 μL ou menos, 20 μL ou menos ou 10 μL ou menos de soro, plasma, sangue, saliva ou qualquer combinação dos mesmos. De acordo com uma modalidade, a amostra biológica do recipiente é 30 μL ou menos de soro, plasma, sangue, saliva, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certos aspectos, os métodos incluem a obtenção da amostra biológica do recipiente.

[0057] Formar uma mistura através da combinação de uma amostra celular de um doador com uma amostra biológica de um recipiente ocorre sob condições suficientes para anticorpos imunológicos de recipiente (por exemplo, DSAs), se presente, se ligarem ao antígeno de superfície de celular de doador (Ag) para formar um complexo de anticorpo imunológico Ag. De acordo com certas modalidades, os anticorpos imunológicos de recipiente são aloanticorpos. Em outros aspectos, os anticorpos imunológicos de recipiente são autoanticorpos. Condições suficientes para anticorpos imunológicos de recipiente (por exemplo, DSAs), se presente, se ligarem ao antígeno (Ag) de superfície de célula de doador podem ser fornecidas pela seleção de um tampão apropriado (por exemplo, PBS, TBS ou similares), detergentes (por exemplo, Tween), proteína (por exemplo, BSA), pH, temperatura, duração e/ou similares. Condições úteis para permitir a ligação específica dos anticorpos aos seus antígenos alvo são descritas, por exemplo, em Coligan, et al., eds., Current Protocols inImmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2013). Em certos aspectos, a amostra celular de doador (por exemplo, 0,2 x 106 células) e a amostra do recipiente (por exemplo, 50 μL de soro do recipiente) são incubadas durante cerca de 20 minutos à temperatura ambiente em um tampão adequado para permitir que os anticorpos imunológicos de recipiente se liguem ao antígeno de superfície de célula de doador. Em certos aspectos, a mistura, o contato e/ou a detecção das etapas são feitos à temperatura ambiente.

[0058] Em certos aspectos, o anticorpo específico de doador é um anticorpo específico atual doador.

[0059] De acordo com certas modalidades, o antígeno de superfície de célula de doador é um antígeno de HLA, como, por exemplo, os anticorpos específicos de doador são anticorpos de anti-HLA. Em certos aspectos, os anticorpos específicos do doador são anticorpos de classe I anti-HLA e/ou classe II de anti-HLA. De acordo com certas modalidades, os anticorpos específicos de doador se ligam a um antí- geno de superfície de célula de doador selecionado dentre HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA- DQA, HLA-DQB, HLA-DPA, e HLA-DPB.

[0060] Os anticorpos específicos de doador, se presentes, podem ser anticorpos de fixação de complemento (CFAbs). Em certos aspectos, os métodos da invenção incluem não apenas determinar a presença ou a ausência de anticorpos específicos de doador na amostra biológica, mas também incluem determinar se os DSAs são CFAbs ou não CFAbs. A identificação dos DSAs como CFAbs pode ser realizada, por exemplo, usando um agente de ligação marcado diretamente ou indiretamente que especificamente se liga ao CFAbs (e/ou não- CFAbs). De acordo com certas modalidades, o agente de ligação é um componente de complemento isolado C1q. O C1q pode ser direta ou indiretamente marcado com um marcador fluorescente que é distinguível de qualquer outro marcado fluorescente no complexo. Em certos aspectos, o isolado C1q está conjugado a biotina ("Bio-C1q") e pode ser detectado pela adição de estreptavidina marcada de maneira fluorescente (por exemplo, estreptavidina conjugada a R-ficoeritrina (SA- PE)). De acordo com as modalidades acima, a proteína C1q se liga ao DSA Ag-Ab caso o DSA seja um anticorpo fixador de complemento, e o C1q marcado direta ou indiretamente pode ser detectado no complexo (juntamente com o anticorpo detectavelmente marcado de maneira diferente ligado ao DSA) durante a etapa de detecção a jusante do método (por exemplo, em um citômetro de fluxo), que indica que o DSA é um CFAb.

[0061] Seguindo a formação da mistura, a mistura é posta em contato com os grânulos que incluem um anticorpo que especificamente se liga ao antígeno de superfície de célula de doador (por exemplo, um antígeno de HLA) do complexo de anticorpo-Ag. Dependendo do antí- geno de superfície de célula de doador de interesse, tais grânulos podem estar comercialmente disponíveis. Caso contrário, o tipo desejado de grânulo (por exemplo, agarose, látex, poliestireno, magnético ou outro tipo de grânulo) pode ser conjugado a um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse usando estratégias de conjugação conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Hermanson, "Bioconjugate Techniques" AcademicPress, 2a Ed., 2008. Além disso, os kits incluem reagentes e instruções para conjugar um anticorpo de interesse para um grânulo são comercialmente disponíveis (por exemplo, Dynabe- ads® Antibody Coupling Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA)).). Os grânulos podem ser microgrânulos que têm um diâmetro médio de grânulo de 0,1 a 20 mícrons, como, por exemplo, de 0,5 a 10 mícrons, por exemplo, 5 mícrons ou menos (por exemplo, 2,5 a 5 mícrons). O contato é normalmente realizado em condições suficientes para o anticorpo incluído no grânulo se ligar especificamente ao antígeno de superfície de célula de doador (por exemplo, um antígeno HLA) ao quais os anticorpos imunológicos de recipiente (por exemplo, um DSA) já estão ligados. Fornecer tais condições pode incluir a seleção de um tampão adequado (por exemplo, PBS, TBS ou similares), detergente (por exemplo, Tween), proteína (por exemplo, BSA), pH, temperatura, duração e/ou similares. Condições úteis para permitir a ligação específica dos anticorpos aos seus antígenos alvo são descritas, por exemplo, em Coligan, et al., eds., Current Protocols inImmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2013). Opcionalmente, a mistura é lavada entre as etapas de mistura e de contato.

[0062] A etapa de contato resulta no complexo de anticorpo imu- nológico Ag incluindo o antígeno de superfície de célula de doador ligado por: um anticorpo imunológico de recipiente (por exemplo, um DSA), se houver; e o anticorpo presente no grânulo. Uma célula de doador da amostra celular também está associada a esse complexo em virtude do antígeno de superfície de célula de doador do complexo restante na superfície de célula de doador. Após a etapa de contato, um anticorpo detectavelmente marcado que especificamente se liga ao complexo (por exemplo, o complexo de anticorpo imunológico de reci-piente (por exemplo, o DSA)) é adicionado sob condições de Lise. Op-cionalmente, uma ou mais etapas de lavagem são realizadas entre a etapa de contato e a adição do anticorpo detectavelmente marcado sob condições de Lise. As condições de lise são suficientes para lisar as células associadas aos complexos, libertando, desse modo, os complexos das células de doador e facilitando a análise a jusante dos complexos (por exemplo, por citometria de fluxo). Em certos aspectos, as condições de Lise incluem administrar um tampão de lise que inclui rastreador, detergente, inibidor de protease e BSA.

[0063] O anticorpo detectavelmente marcado e as condições de lise podem ser fornecidos através da adição de uma "mistura de lise" à mistura após a etapa de contato, em que a mistura de lise inclui o anticorpo detectavelmente marcado em um tampão de lise. Qualquer tampão de lise apropriado pode ser usado e pode incluir uma ou mais dentre Tris-HCl, EDTA, EGTA, SDS, desoxicolato, Triton X, NP-40, e/ou quaisquer outros componentes de tampão de lise desejáveis. O tampão de lise é tal que o complexo de anticorpo imunológico Ag permanece intacto. O tampão de lise é não-desnaturação de acordo com certos aspectos da presente descrição. O complexo de anticorpo imuno- lógico Ag inclui, agora, o anticorpo associado ao grânulo ligado ao an- tígeno de superfície de célula de doador, o anticorpo imunológico de recipiente (por exemplo, DSA), caso presente, se liga ao antígeno de superfície de célula de doador e o anticorpo detectavelmente marcado se liga ao anticorpo imunológico de recipiente (por exemplo, DSA), caso presente. Os sinais detectáveis do anticorpo detectavelmente marcado do complexo podem ser medidos e proporcionalmente correlacionados com a quantidade de anticorpos imunológicos de recipiente (por exemplo, DSA) na amostra biológica de recipiente.

[0064] Conforme definido acima, os métodos da presente descrição incluem a detecção (por exemplo, detectar quantitativamente) a presença ou a ausência do anticorpo detectavelmente marcado ligado ao complexo de anticorpo imunológico Ag para determinar a presença ou a ausência de anticorpos específicos de doador da amostra biológica de recipiente. A estratégia de detecção empregada pode variar de acordo com os tipos de marcador(es) detectavelmente presente(s) no anticorpo detectavelmente marcado. Os marcadores detectáveis que encontrar uso na prática dos métodos atuais incluem, mas não se limitam a, um fluoróforo, um cromóforo, uma enzima, uma molécula de vinculador, uma molécula de biotina, um doador de elétron, um aceptor de elétrons, um corante, um metal ou um radionuclídeo.

[0065] De acordo com certas modalidades, o anticorpo detecta- velmente marcados é marcado de maneira fluorescente e inclui um fluoróforo selecionado dentre indocarbocianina (C3), indodicarbociani- na (C5), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Texas Red, Pacific Blue, Oregon Green 488, Alexa Fluor-355, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor-555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, JOE, Lissamina, Rodamina verde, BODIPY, isotiocianato de fluoresce- ína (FITC), carboxi-fluoresceína (FAM), aloficocianina (APC), ficoeritri- na (PE), rodamina, diclororodamina (dRodamina), carboxi tetrametilro- damina (TAMRA), carboxi-X-rodamina (ROX), liz, VIC, NED, PET, SYBR, PicoGreen, e RiboGreen

[0066] Quando o anticorpo detectavelmente marcado é marcado de maneira fluorescente, a detecção pode incluir detectar uma ou mais emissões de fluorescência. A(s) emissão(s) de fluorescência pode(m) ser detectada(s) em qualquer formato útil. Em certos aspectos, a detecção inclui fluir os complexos de anticorpo imunológico Ag (que incluem um grânulo) através de um citômetro de fluxo.

[0067] Quando a detecção incluir fluir os complexos de anticorpo imunológico Ag de recipiente através de um citômetro de fluxo, o citô- metro de fluxo será configurado para detectar e identificar exclusivamente os complexos expondo-se os complexos à luz de excitação e medindo a fluorescência de cada complexo em um ou mais canais de detecção, conforme desejado. A luz de excitação pode ser de uma ou mais fontes de luz e pode ser de banda estreita ou larga. Exemplos de fontes de luz de excitação incluem lasers, diodos emissores de luz e lâmpadas de arco. A fluorescência emitida nos canais de detecção usados para identificar os complexos pode ser medida após excitação com uma única fonte de luz, ou pode ser medida separadamente após a excitação com fontes luminosas distintas. Em certos aspectos, o ci- tômetro de fluxo através do qual a mistura é fluida inclui as capacidades de excitação e de detecção de fluorescência tal que a etiqueta fluorescente do anticorpo detectavelmente marcado e quaisquer outros marcadores fluorescentes opcionais associados a outros componentes do complexo são, cada um, detectáveis e distinguíveis mediante questionamento dos complexos através do citômetro de fluxo.

[0068] Os citômetros adicionais incluem a aquisição de dados, análise e meios de gravação, tais como um computador, em que múltiplos canais de dados gravam dados de cada detector para a dispersão de luz e a fluorescência emitida por cada complexo conforme se atravessa a região de sensoriamento. O propósito do sistema de análise é classificar e contar complexos, em que cada complexo se apresenta como um conjunto de valores de parâmetro digitalizado. O citô- metro de fluxo pode ser definido para acionar em um parâmetro selecionado para distinguir os complexos de interesse do fundo e do ruído. O "acionamento" se refere a um limite predefinido para a detecção de um parâmetro. Normalmente se usa como um meio para a detecção da passagem de um complexo através de feixe de laser. A detecção de um evento que excede o limite para o parâmetro selecionado desencadeia a aquisição de dados de luz de dispersão e de fluorescência para o complexo. Os dados não são adquiridos para complexos ou outros componentes no meio que está sendo analisado, o que causa uma resposta abaixo do limiar. O parâmetro de acionamento pode ser a detecção de luz dispersa causada pela passagem de um complexo através do feixe de luz. O citômetro de fluxo, em seguida, detecta e coleta os dados de dispersão de luz e de fluorescência para o complexo.

[0069] A análise citométrica de fluxo dos complexos, conforme descrito acima, produz informações qualitativas e quantitativas sobre os complexos. Onde desejado, a análise acima produz contagens dos complexos de interesse na mistura. Como tal, a análise citométrica de fluxo fornece os dados sobre as quantidades de um ou mais tipos diferentes de complexos na mistura.

[0070] As etapas de mistura, contato e detecção podem ser realizadas coletivamente em qualquer quantidade conveniente de tempo. De acordo com certas modalidades, os métodos da presente descrição são realizados em 12 horas ou menos, como 11 horas ou menos, 10 horas ou menos, 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

[0071] De acordo com certas modalidades, os métodos de presente descrição incluem gerar um relatório que indica se os anticorpos específicos de doador estiverem presentes na amostra biológica do recipiente. Se os DSAs estiverem presentes, o relatório pode incluir as informações sobre a quantidade de DSA na amostra biológica do recipiente. O relatório pode ser gerado por um computador, em que o relatório é, opcionalmente, exibido para um dispositivo de saída em um local remoto ao computador.

[0072] Em certas modalidades, os métodos da presente descrição são usados para detectar DSAs que se ligam aos antígenos de HLA de doador (por exemplo, antígenos de HLA de classe I e/ou HLA de classe II) presentes em células na amostra celular do doador. De acordo com uma modalidade, uma mistura é formada combinando-se uma amostra celular que inclui as células de doador contendo antíge- no de HLA com soro ou plasma do recipiente, tal que qualquer dos DSAs capazes de se ligar especificamente ao HLA de doador podem se ligar ao HLA de doador. A mistura resultante contendo os complexos de DSA-HLA pode ser lavada uma ou mais vezes (por exemplo, três vezes) antes da etapa de contato. De acordo com essa modalidade, a etapa de contato inclui adicionar os microgrânulos revestidos de anticorpo de anti-HLA, como, por exemplo, os anticorpos de anti-HLA fixados aos grânulos se ligam as regiões constantes das moléculas de classe I e/ou classe II de HLA de doador na superfície das células de doador. O complexo resultante, que agora inclui capturar grânulos ligados aos antígenos de HLA de doador, pode ser lavado uma ou mais vezes (por exemplo, três vezes) antes de se prosseguir com o método. De acordo com essa modalidade, os anticorpos ant-IgG marcados de maneira fluorescente (por exemplo, anticorpos PE-anti-IgG) são adicionados sob condições de Lise, como, por exemplo, os anticorpos de anti-IgG se ligam ao DSA do complexo. A lise das células de doador facilita a separação dos complexos de outro material presente na mistura. Em seguida, a fluorescência dos anticorpos de anti-IgG marcados de maneira fluorescente pode ser detectada e, opcionalmente, quantificada, para se determinar a presença (e, opcionalmente, a quantida- de/concentração) ou a ausência dos DSAs no soro ou no plasma de recipiente que se ligam aos HLAs de doador. Em certos aspectos, os métodos são usados para questionar o soro ou o plasma de recipiente para a presença ou a ausência dos DSAs que ligam ao HLA de classe I e/ou de classe II, por exemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- HLA- DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA, e HLA-DPB.

[0073] Um método de acordo com uma modalidade da presente descrição é ilustrado esquematicamente na FIG. 1. De acordo com essa modalidade, os complexos de anticorpo imunológico Ag são detectados por um citômetro de fluxo ou máquina Luminex. Na reação, as células do doador são combinadas com soro do recipiente Os anticorpos específicos de doador (DSA), se presentes, especificamente se liga ao antígeno (Ag) em células de doador para formar um complexo de DSA-Ag. Sob condições de lise, o complexo de DSA-Ag é especificamente capturado por grânulos conjugados com anticorpos contra o mesmo Ag que no complexo de DSA-Ag. O DSA-Ag capturado é de-tectado através de um anticorpo secundário marcado de maneira fluorescente através de um citômetro de fluxo ou máquina Luminex.

[0074] Um método de acordo com uma segunda modalidade da presente descrição é ilustrado esquematicamente na FIG. 2. De acordo com essa modalidade, os complexos de anticorpo imunológico Ag são detectados através de um ensaio imunoenzimático (ELISA). Na reação, as células do doador são combinadas com soro do recipiente Os anticorpos específicos de doador (DSA), se presentes, especificamente se liga ao antígeno (Ag) em células de doador para formar um complexo de DSA-Ag. Mediante a lise da célula, o complexo de DSA- Ag é especificamente capturado em um substrato por meio de um anticorpo contra o mesmo Ag que no complexo de DSA-Ag. Um anticorpo de anti-IgG secundário ligado à enzima se liga ao DSA, e o DSA é detectável mediante a reação da enzima e do substrato. As variações dessa abordagem (por exemplo, ensaios de luminescência) também são fornecidas pela presente descrição.

SISTEMAS

[0075] Também são fornecidos sistemas para realizar os métodos da presente descrição. Os sistemas da presente descrição incluem um subsistema de fluido de amostra que inclui um processador e um meio legível por computador operacional acoplado ao processador com a programação armazenada no mesmo. Quando executado pelo processador, a programação armazenada programa o processador para formar uma mistura combinando-se uma amostra celular de um doador com uma amostra biológica de um recipiente sob condições suficientes para anticorpos imunológicos de recipiente, caso presente, se ligarem ao antígeno (Ag) de superfície de célula de doador para formar um complexo de anticorpo imunológico Ag. Quando executado pelo pro-cessador, a programação armazenada também programa o processador para por entrar em contato a mistura com os grânulos que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag em uma superfície respectiva, e adicionar sob condições de lise um anticorpo detectavelmente marcado que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag. Os sistemas atuais também incluem um citômetro de fluxo configurado para analisar a amostra para a presença ou a ausência do detectavelmente anticorpo ligado ao complexo de anticorpo imunológico Ag para determinar a presença ou a ausência de anticorpos específicos de doador. Em certos aspectos, o citômetro de fluxo é fluidamente acoplado ao subsistema fluídico de amostra.

[0076] O processador pode ser qualquer processador adequado para a execução da programação armazenada. De acordo com certas modalidades, o processador é programado para fazer com que o subsistema fluídico de amostra lave a mistura antes de o subsistema entrar em contato com a mistura com os grânulos que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imu- nológico Ag em uma superfície respectiva. Como alternativa, ou, além disso, o processador pode ser programado para fazer com que o subsistema fluídico de amostra lave a mistura após o subsistema por em contato a mistura com os grânulos que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag, mas antes do citômetro de fluxo analisar a amostra para a presença ou a ausência de marcadores detectáveis ligados aos complexos.

[0077] O meio legível por computador pode ser um meio de sinal legível por computador ou um meio de armazenamento legível por computador. Um meio de armazenamento legível por computador pode ser, por exemplo, mas sem se limitar a, um sistema, aparelho ou dispositivo eletrônico, magnético, óptico, eletromagnético, infravermelho, ou de semicondutores, ou qualquer combinação adequada dos supracitados. Exemplos mais específicos (uma lista não exaustiva) de meio de armazenamento legível por computador incluem o seguinte: uma conexão elétrica que tem um ou mais fios, um disquete de computador portátil, um disco rígido, uma memória de acesso aleatório (RAM), uma memória somente leitura (ROM), uma memória progra-mável apagável somente de leitura (EPROM ou memória Flash), uma fibra óptica, uma disco compacto portátil somente de leitura (CD- ROM), um dispositivo de armazenamento óptico, um dispositivo de armazenamento magnético, ou qualquer combinação adequada dos anteriores. Um meio de armazenamento legível por computador pode ser qualquer meio tangível que possa conter ou armazenar um programa para uso por ou em conexão com o subsistema fluídico de amostra dos sistemas da presente descrição.

[0078] A amostra do celular do doador, os antígenos de superfície de célula de doador, a amostra biológica de recipiente, os anticorpos imunológicos de recipiente (por exemplo, DSAs de anti-HLA), os grânulos que compreendem um anticorpo que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag em uma superfície respectiva, os anticorpos detectavelmente marcados, os tampões, as condições de ligação e Lise e o citômetro de fluxo podem ser conforme descritos acima em relação aos métodos da presente descrição.

[0079] Os sistemas da presente descrição podem ser configurados para detectar a presença ou a ausência de DSAs em uma quantidade conveniente do tempo. De acordo com certas modalidades, os sistemas atuais são configurados para detectar a presença ou a ausência dos DSAs em uma amostra biológica do recipiente em 12 horas ou menos, tais como 11 horas ou menos, 10 horas ou menos, 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

KITS

[0080] Os Kits que incluem um ou mais reagentes úteis para executar os métodos da presente descrição também são fornecidos. De acordo com uma modalidade, é fornecido um kit que inclui uma pluralidade de grânulos que compreendem anticorpos que se ligam especificamente a um complexo de anticorpo imunológico Ag em uma superfície respectiva, um anticorpo detectavelmente marcado que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag e instruções para uso da pluralidade de grânulos e o anticorpo detectavelmente marcado para analisar uma amostra celular de um doador e uma amostra biológica de um recipiente para determinar a presença ou a ausência dos anticorpos específicos de doador na amostra biológica. Os atuais kits podem incluir outros componentes úteis tais como tampão de lise, soro ou plasma de controle, uma amostra de celular de controle e similares. Os grânulos que compreende um anticorpo que se liga especificamente um complexo de anticorpo imunológico Ag em uma superfície respectivas, e o anticorpo detectavelmente marcado que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag, podem ser conforme descritos acima no que diz respeito aos métodos da presente descrição.

[0081] Os reagentes incluídos nos kits atuais podem ser fornecidos em tubos separados, ou dois ou mais reagentes podem ser fornecidos em um único tubo. De acordo com uma modalidade, os grânulos e um anticorpo detectavelmente marcado são fornecidos em tubos separados. Em certos aspectos, o anticorpo detectavelmente marcado é fornecido em um tampão de lise.

[0082] De acordo com uma modalidade, as instruções incluídas nos atuais kits são fornecidas em meio legível por computador que, quando executado por um processador, programa o processador para analisar uma amostra celular de um doador e uma amostra biológica de um recipiente para determinar a presença ou a ausência dos DSAs na amostra biológica.

UTILIDADE

[0083] Os métodos, sistemas e kits atuais encontram uso em qualquer aplicação na qual seja desejável detectar os anticorpos específicos de doador em uma amostra biológica de um recipiente. Os recipientes de interesse incluem, mas não se limitam a, recipientes humanos em necessidade de, ou já tendo recebido, um órgão (por exemplo, rim, fígado, coração, etc.) ou transplante de tecido de um doador de órgão ou tecido. As aplicações de interesse incluem a avali- ação de risco de pré-transplante e/ou acompanhamento de pós- transplante baseado na detecção e/ou quantificação dos níveis dos DSAs na amostra biológica do recipiente.

[0084] Os métodos da presente descrição permitem a distinção entre os anticorpos reativos para as células de doador e os anticorpos reativos para as moléculas de HLA com as células de doador. As tecnologias de correspondência de fluxo anteriores são deficientes em que as mesmas não são capazes de fazer essa distinção importante, em que um resultado de crossmatch de fluxo positivo pode ser completamente irrelevante para interações de anticorpo com HLA.

[0085] Os métodos atuais fornecem uma plataforma que pode ser amplamente usada para desenvolver muitos diferentes ensaios de DSA. Qualquer tipo de amostra biológica do recipiente e qualquer célula-alvo de interesse podem ser usadas para determinar se o DSA está presente ou ausente. Em comparação com as abordagens existentes, os métodos atuais permitem que os anticorpos de recipiente se liguem aos antígenos de doador em sua configuração nativa sem modificações e com alta especificidade de detecção e alta vazão. Além disso, os métodos podem ser concluídos em menos tempo, e exigem menos células de doador, do que as abordagens de detecção de DSA existentes. O sinal de fundo causado pelos anticorpos não relacionados ao antígeno alvo de interesse é eliminado em virtude da captura de fase sólida mediada por anticorpos específica dos complexos que incluem DSAs ligados ao antígeno de interesse.

EXEMPLOS

[0086] Conforme pode ser observado da descrição fornecida acima, a presente descrição tem uma ampla variedade de aplicações. Consequentemente, os exemplos seguintes são apresentados de modo a prover aqueles versados na técnica com uma descrição e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção e não se des- tinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção nem pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Aqueles versados na técnica reconhecerão facilmente uma variedade de parâmetros não-críticos que poderiam ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes. Esforços foram feitos para garantir a precisão no que diz respeito a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados.

EXEMPLO 1: PROCEDIMENTO DE TESTE DE DSA-FM

[0087] O procedimento a seguir pode ser usado para prática das modalidades dos métodos atuais, denominados crossmatch citométri- ca de fluxo de anticorpo específico de doador ("DSA-FXM"). Esse procedimento de exemplo envolve a captura e marcação simultânea e pode ser concluído em 2 horas ou menos.

[0088] Primeiro, preparar um formato de layout de 96 poços para organizar as amostras de FXM a serem testadas. Em segundo lugar, distribuir 0,2 x 106 (menos que 250 μl em volume) das células de doador em todos os poços pré-selecionadas em uma placa de 96 poços, de acordo com o layout da placa. Centrifugar em 2.000xg por 3 minutos. Tremular a placa e realizar blot duas vezes em uma torre de pilha de papéis antes de virar a placa. Ressuspender as células submetendo-se a vórtex suave. Adicionar 50 pl/poço de cada soro nos poços pré-selecionados de acordo com o layout da placa. Suavemente submeter a vórtex a placa e incubar em uma incubadora à RT (22 °C) por 20 minutos. Preparar a mistura de lise (para cada poço, PE-anti-hIgG e tampão de lise em um volume total de 23 μl) durante a incubação. Após a incubação, adicionar 250 μl de 3% de HBSA a cada poço e girar a placa como antes. Tremular a placa e realizar blot duas vezes em uma torre de pilha de papéis antes de virar a placa. Repetir as etapas de lavagem por mais 2 vezes adicionando-se 250 μl de 3% de HBSA a cada lavagem.

[0089] Adicionar 5 μl de Capture Beads Mix a cada poço na último lavagem (3a lavagem) e lave novamente como antes usando 250 μl de 3% de HBSA. Adicionar a mistura de lise do 23 μl (tampão de lise de célula e anticorpo de fluorescência) para cada poço e suavemente submeter a vórtex a placa. Cobrir a placa com um pedaço de papel alumínio e incubar a placa no escuro com agitação suave por 30 minutos. Preparar o tampão de lavagem de DSA-FXM durante a incubação da seguinte forma: produzir 10 ml de tampão de lavagem de DSA- FXM, adicionar 0,5 ml detergente a 9,5 ml de tampão de lavagem de 1X TBS e misturar por inversão o tubo cinco vezes.

[0090] Lavar duas vezes adicionando-se 250 μl de tampão de lavagem de DSA-FXM em cada poço e lavar como antes. Adicionar 250 μl de tampão de lavagem DSA-FXM e lavar como antes. Ressuspen- der os grânulos em cada poço com 200 μl de Flow Fixative e submeter suavemente a vórtex a placa. Colocar a placa em um citômetro de fluxo e adquirir os grânulos. Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 3, FIGs. 5-9, FIGs. 11-14, e FIG. 16.

[0091] Para o experimento mostrado na FIG. 3, quatro amostras foram testadas por DSA-FXM (a modalidade de captura e de marcação simultânea) e grânulos de HLA de classe I e de classe II foram distinguidos através da identificação de fluorescência em cada grânulo. O aumento da fluorescência (sinal positivo) devido ao anticorpo específico de HLA é mostrado no eixo X (canal FL1). A FIG. 3, painel A: ambos anticorpos específicos de doador (DSA) de HLA de Classe I (C-I) e Classe II (C-II) foram negativos (CI-/CII-); FIG. 3, painel b: somente DSA C-II foi positivo (CI-/CII+); FIG. 3, painel c: somente DSA C-I foi positivo (CI+/CII-); e a FIG. 3, painel D: ambos DSAs CI e C-II foram positivos (CI+/CII+).

[0092] Conforme mostrado na FIG. 5, um pool de soros positivos HLA-Ab (PPS) em diferentes diluições foi testado contra várias quantidades de células para FXM, DSA-FXM e LMX-IgG. Os resultados mostram que DSA-FXM é o método mais sensível para detectar DSA e usa muito menos células (por exemplo, DSA pode ser detectado com tão pouco quanto 25.000 células) quando comparado com os métodos padrões. LMX-IgG define as especificidades de HLA contidas no soro PPS em uma plataforma Luminex usando microesferas de antígeno único e os valores mostrados são as intensidades de fluorescência média (MFI).

[0093] Conforme mostrado na FIG. 6, 23 amostras de proficiência externa CAP (College of American Pathologists) foram testadas para DSA-FXM simultaneamente com teste cego e em paralelo com crossmatch de citometria de fluxo regular (FXM) e a triagem de anticorpo Luminex padrão em microgrânulos de antígeno único (LMX-IgG). Os anticorpos específicos de doador (DSAs) de HLA de classe I (C-I) e/ou HLA II (C-II) foram identificados e a maioria dos DSAs foram adicionalmente confirmados para LMX-IgG. Alguns DSA extras com baixo MCS for apenas detectados com o método mais sensível de DSA- FXM. As amostras de proficiência externa são soros e células com especificidades conhecidas. As especificidades dos soros são ocultadas para os participantes até que todos os resultados sejam recebidos de todos os centros participantes. Os dados apresentados na FIG. 7 indicam que sete amostras positivas de DSA de HLA-DQ foram identificadas para LMX-IgG e confirmadas através de DSA-FXM. Conforme mostrado na FIG. 8, seis amostras positivas de DSA de HLA-DP foram identificadas para LMX-IgG e confirmadas através de DSA-FXM. Conforme mostrado na FIG. 9, três amostras positivas de DSA de HLA-C foram identificadas para LMX-IgG e confirmadas através de DSA-FXM.

[0094] Conforme mostrado na FIG. 11, uma coleção de 117 soros que incluem reagentes de tipagem de HLA, controles negativos, e amostras clínicas foram testadas, cujas especificidades de DSA foram conhecidas a partir de testes de SAB de LMX-IgG. Foram obtidos reações positivas ou negativas exclusivas. Quando os resultados de DSA- FXM foram comparados aos resultados de FXM e de SAB de LMX- IgG, o DSA-FXM tinha sensibilidade superior para a classe I (FIG. 12) e classe II (FIG. 13) que qualquer um dos outros testes. A FIG. 14, os Painéis A e B dão a correlação global para 95 DSAs de classe I e 100 DSAs de classe II, respectivamente. A FIG. 14, o Painel C resume a sensibilidade e a especificidade de DSA-FXM em comparação ao ensaio de SAB de LMX-IgG. Conforme mostrado na FIG. 14, Painel D, a especificidade reduzida obtida na FIG. 14, Painel C, a comparação é devido às reações falso-positivas no ensaio de SAB de LMX-IgG e não às reações falso-negativas no ensaio de DSA-FXM.

[0095] Conforme mostrado na FIG. 15, os ensaios de FXM de célula de T e B renderam resultados positivos não específicos (isto é, não devido ao HLA, alvo desconhecido) na presença de autoanticor- pos, enquanto que o DSA-FXM claramente distingue os autoanticorpos em relação ao HLA e discrimina se os autoanticorpos são de classe I ou de classe II.

[0096] Conforme mostrado na FIG. 16, o DSA-FXM é capaz de distinguir os resultados de citometria de fluxo devido ao aloanticorpo de classe I e/ou classe II, assim como para o autoanticorpo que o atual método de FXM em uso geral não pode fazer. Resultados semelhantes observados com FXM (por exemplo, Casos 1 e 3 ou 2 e 4) têm explicações completamente diferentes e interpretações quando testados por DSA-FXM. O DSA-FXM pode ser correlacionado com os perfis específicos de DSA de classe I e/ou II obtidos através de SAB de LMX- IgG para dar um prognóstico para o risco de rejeição pré ou pós- transplante, enquanto que os resultados de FXM não podem.

[0097] Como mostrado na FIG. 17 para a classe I (Painel A) e a classe II (Painel B), o DSA-FXM é capaz de mostrar a inibição de DSA específico de classe através do tratamento de IVIG em comparação ao tampão. Isso iguala o que é visto in vivo antes e após a infusão de IVIG.

[0098] Conforme mostrado na FIG. 18, para a classe I (Painel A) e para a classe II (Painel B), os soros específicos de DSA mostram uma inibição dependente de dose por IVIG que também prevê eficácia in vivo.

[0099] Conforme mostrado na FIG. 1, FXM e DSA-FXM foram executados com uso de amostras em série de um candidato de rim submetido ao tratamento de dessensibilização de IVIG para diminu- ir/anular prospectivamente o DSA a um doador vivo identificado em potencial. Os resultados de FXM mostram aumento dos valores de MCS (isto é, tornaram-se mais positivos) devido a um artefato da infusão de IVIG. O artefato é devido é devido ao anticorpo de segunda etapa (IgG anti-humano) que é usado como o sinal no ensaio. Devido ao fato de que todo o produto de IVIG é IgG purificado, os resultados de FXM mostram aumentos falso-positivos devido ao IVIG, não ao DSA. Rituxan (anti-CD20 terapêutico, um marcador de células B) também aumenta os valores MCS no FXM de célula B devido ao CD20 na superfície da célula B. Embora isso não seja um artefato, o FXM é projetado para detectar o anticorpo de HLA, não alvos específicos de célula nativo. Os resultados de DSA-FXM, em contraste, mostram inibição (eficácia) dos valores de IVIG e de MCS no intervalo aceitável para o transplante, mesmo na presença de anticorpos terapêuticos (anti-CD20).

CÁLCULOS DO RESULTADO

[00100] Usar uma planilha de análise de DSA-FXM para gravar e executar os cálculos. Determinar o Deslocamento de Canal de Mediana (MCS) para controles de Positivo & Soros de Paciente. Para cálculo de MCS: MCS = Valor de Canal de Mediana (MCV) dos soros de paciente (ou controles de Pós) menos Valor de Canal de Mediana (MCV) dos controles Neg. Gravar o resultado como MCS na planilha e computador. Produzir um relatório de acordo com o FXM destacado para definir um DSA-FXM Negativo ou Positivo.

RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO

[00101] Os destaques para FXM foram determinados através dos resultados (MCS) a partir de soros masculinos AB pré-testados (geralmente cerca de 20) contra 5 fontes diferentes de células alvo (PBMC frescos/congelados, congelados de linfonodos e células de baço congeladas). MCS para cada soro AB testado foi calculado subtraindo-se o MCV de controle negativo do MCV de soro AB; e médias de MCS de DSA-FXM foram calculados a partir de todos os MCSs obtidos (N = 138). Os critérios de cortes DSA-FXM foram definidos da seguinte forma: valores de MCS < MCS neg AB + 3 SD foram interpretados como "Negativo"; valores de MCS >= MCS neg AB + 3SD foram interpretados como "Positivo". Positivo de DSA-FXM de HLA-I: MCS >= 61. Positivo de DSA-FXM de HLA-II: MCS >= 60.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00102] Para o procedimento FXM, distribuir 0,1 x 106 de células de PBMC em cada poço em uma placa de 96 poços e centrifugar em 1.300xg por 3 minutos. Tremular a placa para remover o sobrenadan- te; ressuspender as células em 50 μl de soro de ensaio e incubá-las em uma incubadora à RT (22 °c) por 20 minutos. Após a incubação, lavar as células quatro vezes com 250 μl de 3% de HBSA cada vez. Adicionar 100 μl de mistura de reagente de detecção contendo 0,5 μg de FITC-anti human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; West Grove, PA,USA), 0,2 μg de PerCP-CD3 e PE-CD19 (BD Biosciences, San Jose, CA,USA). Após uma incubação adicional de 30 minutos à temperatura ambiente, lavar as células duas vezes com 250 μl de 3% de HBSA de cada vez e ressuspender em 200 μl de 0,2% de paraformaldeído em PBS. Adquirir as células em BD FACSCanto II Flow Cytometer (BD Biosciences,San Jose, CA, USA). Os dados adquiridos são analisados pelo software BD FACSDiva™.

[00103] Para o procedimento de LMX-IgG, os experimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (One Lambda, Canoga Park, CA,USA). O resultado mostra que ambos os DSA de HLA de classe I e II são detectados por DSA-FXM em várias condições (FIG. 5).

EXEMPLO 2: TESTES DE DSA-FXM

[00104] O procedimento a seguir pode ser usado, alternativamente, para prática das modalidades dos métodos atuais, denominados crossmatch citométrica de fluxo de anticorpo específico de doador ("DSA- FXM"). Esse procedimento do exemplo envolve a captura e a marcação sequencial.

[00105] Primeiro, preparar um formato de layout de 96 poços para arranjar a configuração de FXM. Em segundo lugar, distribuir 0,2 x 106 (menos que 250 μl em volume) das células de doador em todos os poços pré-selecionadas em uma placa de 96 poços, de acordo com o layout da placa. Centrifugar em 2.000xg por 3 minutos. Tremular a placa para remover o sobrenadante. Suavemente submeter a vórtex a placa e adicionar 50 μl/poço de cada soro nos poços pré-selecionados de acordo com o layout da placa. Suavemente submeter a vórtex a placa e incubar em uma incubadora à RT (22 °C) por 20 minutos. Após a incubação, adicionar 250 μl de 3% de HBSA a cada poço e girar a placa como antes. Tremular a placa e realizar blot duas vezes em uma torre de pilha de papéis antes de virar a placa. Repetir as etapas de lavagem por mais 2 vezes adicionando-se 250 μl de 3% de HBSA a cada lavagem.

[00106] Adicionar 5 μl de Capture Beads Mix contendo grânulos de captura de HLA de classe I e II a cada poço na última lavagem (3a lavagem) e lave novamente como antes usando 250 μl de 3% de HBSA. Adicionar 23 μl de célula de tampão de lise para cada poço e delicadamente submeter a vórtex a placa. Cobrir a placa com um pedaço de papel alumínio e incubar a placa no escuro com agitação suave por 30 minutos. Lavar os grânulos duas vezes com 250 μl de tampão de lava-gem de DSA-FXM, cada, como antes. Ressuspender os grânulos com 100 μl de anti-IgG fluorescente em tampão de lavagem e incubar a placa à RT por 30 minutos adicionais. Lavar os grânulos duas vezes com 250 μl de tampão de lavagem de DSA-FXM, cada, como antes e ressuspender os grânulos em cada poço com 200 μl de FlowFixative e suavemente submeter a vórtex a placa. Colocar a placa em um citô- metro de fluxo e adquirir os grânulos. Os procedimentos de FXM e de LMX-IgG foram realizados conforme descrito acima. Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 4. Conforme mostrado na FIG. 4, Um soro AB negativo (Amostra A) e três soros positivos (Amostras B, C e D) foram testados através de DSA-FXM (captura e marcação sequência). Amostra A: ambos DSA C-I e C-II negativo; Amostra B: ambos DSA C-I e C-II DSA positivo; Amostra C: apenas DSA C-I DSA positivo e DSA C-II negativo; Amostra D: apenas DSA C-II positivo e DSA C-I negativo.

EXEMPLO 3: TESTES DE DSA-FXM

[00107] O procedimento a seguir pode ser usado, alternativamente, para prática das modalidades dos métodos atuais, denominados crossmatch citométrica de fluxo de anticorpo específico de doador ("DSA- FXM"). Esse procedimento do exemplo envolve a captura e a marcação sequencial.

[00108] Primeiro, preparar um formato de layout de 96 poços para arranjar a configuração de FXM. Em segundo lugar, distribuir 0,2 x 106 (menos que 250 μl em volume) das células de doador em todos os po- ços pré-selecionadas em uma placa de 96 poços, de acordo com o layout da placa. Centrifugar em 2.000xg por 3 minutos. Tremular a placa para remover o sobrenadante. Suavemente submeter a vórtex a placa e adicionar 50 pl/poço de cada soro nos poços pré-selecionados de acordo com o layout da placa. Suavemente submeter a vórtex a placa e incubar em uma incubadora à RT (22 °C) por 20 minutos. Após a incubação, adicionar 250 μl de 3% de HBSA a cada poço e girar a placa como antes. Tremular a placa e realizar blot duas vezes em uma torre de pilha de papéis antes de virar a placa. Repetir as etapas de lavagem por mais 2 vezes adicionando-se 250 μl de 3% de HBSA a cada lavagem.

[00109] Adicionar 100 μl de anti-IgG fluorescente para ressuspen- der as células e cobrir a placa com um pedaço de papel alumínio; e incubar a placa no escuro com agitação suave por 30 minutos. Lavar as células duas vezes com 250 μl de tampão de lavagem de DSA- FXM, cada, como antes. Ressuspender as células em 25 μl de tampão de lise e adicionar 5 μl de Capture Beads Mix contendo grânulos de captura de HLA de classe I e II em cada poço. Incubar a placa à RT 30 minutos adicionais. Lavar os grânulos duas vezes com 250 μl de tampão de lavagem de DSA-FXM, cada, como antes e ressuspender os grânulos em cada poço com 200 μl de FlowFixative e suavemente submeter a vórtex a placa. Colocar a placa em um citômetro de fluxo e adquirir os grânulos. Os procedimentos de FXM e de LMX-IgG foram realizados conforme descrito acima. Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 10 e FIG. 11: A FIG. 10, Painel A: ambos anticorpos específicos de doador (DSA) de HLA de Classe I (C-I) e Classe II (C-II) foram negativos (CI-/CII-); FIG. 10, Painel b: somente DSA C-II foi positivo (CI+/CII-); FIG. 10, Painel c: somente DSA C-I foi positivo (CI-/CII+); e a FIG. 10, Painel D: ambos DSAs CI e C-II foram positivos (CI+/CII+).

EXEMPLO 4: TESTES DE AUTO-DSA-FXM

[00110] Os soros autólogos dos 15 beneficiários foram testados contra as próprias células de PBMC do recipiente através de FXM em paralelo com o procedimento de DSA-FXM descrito no exemplo 1. Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 15: dente 15 auto crossmatchs, 3 foram negativos e 4 foram consideradas positivos através de DSA-FXM e FXM; apenas 8 foram considerados positivos através de FXM e provou-se que os DSAs detectados por FXM não eram DSAs contra antígenos de HLA.

EXEMPLO 5: TESTES DE DSA-FXM DE DESSENSIBILIZAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA INTRAVENOSA (IVIG)

[00111] O efeito de inibição da IVIG em HLA-DSA foi avaliado pelo procedimento de teste de DSA-FXM descrito no exemplo 1. Os resultados experimentais são mostrados nas FIGs. 17-19.

[00112] Para o experimento mostrado na FIG. 17, dois soros positivos de DSA de HLA foram incrementados com 5% de IVIG e testados in vitro através de DSA-FXM. O efeito de inibição de IVIG em ambos os DSA de HLA de classe I e II foi mensurável.

[00113] Conforme mostrado na FIG. 18, um soro de DSA positivo em diferentes diluições foi incrementado com 5% de IVIG e testado através de DSA-FXM. Os resultados mostraram que IVIG tinha uma inibição dependente de dose em ambos DSAs de classe I e II de HLA.

[00114] Uma série de amostras de um candidato de rim sob tratamento de dessensibilização de IVIG foram testadas contra células de um doador vivo em potencial (porém, incompatível) através de DSA- FXM e FXM. Conforme mostrado na FIG. 19, o efeito da inibição de IVIG em HLA-DSA foi observado através de DSA-FXM, mas não pode ser visto através de FXM. Rituxan (anti-CD20 terapêutico) não teve nenhuma interferência sobre os resultados de teste através dos testes de DSA-FXM.

[00115] Embora a invenção acima tenha sido descrita em detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, é facilmente perceptível aos versados na técnica à luz dos ensinamentos da invenção que certas alterações e modificações podem ser introduzidas sem partir do sentido e o escopo das reivindicações acrescentadas. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações emendadas.

[00116] Nesse sentido, o anterior meramente ilustra os princípios da invenção. Será apreciado que os versados na técnica serão capazes de conceber várias disposições que, embora não explicitamente descritos ou mostrados neste documento, incorporam os princípios da invenção e estão incluídos dentro de seu sentido e escopo. Além disso, todos os exemplos e linguagem condicional recitado neste documento destinam-se, principalmente, para auxiliar o leitor na compreensão dos princípios da invenção e os conceitos que contribuiu pelos inventores para promover a técnica e deve ser interpretado como sendo sem limitação a tais exemplos especificamente recitados e condições. Além disso, todas as instruções neste documento recitando princípios, aspectos, e modalidades de invenção, bem como exemplos específicos, destinam-se para englobar tanto equivalentes estruturais e funcionais respectivos. Além disso, pretende-se que tais equivalentes incluem ambos equivalentes conhecidos atualmente e equivalentes desenvolvidos no futuro, por exemplo, todos os elementos desenvolvidos que executam a mesma função, independentemente da estrutura. O escopo da presente invenção, portanto, não pretende ser limitada às modalidades exemplares mostradas e descritas neste documento. Pelo contrário, o escopo e o sentido da presente invenção são incorporados pelas reivindicações acrescentadas.

Claims (14)

1. Método para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos do doador em uma amostra biológica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: formar uma mistura combinando-se uma amostra celular a partir de um doador com uma amostra biológica a partir de um recipiente sob condições suficientes para anticorpos imunológicos de recipiente, caso presentes, se ligarem ao antígeno de superfície de célula doadora (Ag) para formarem um complexo de anticorpo imunológico Ag; pôr em contato a mistura com microesferas que compreendem um anticorpo que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag em uma superfície do mesmo; adicionar sob condições de lise um anticorpo detectavelmente marcado que se liga especificamente ao complexo de anticorpo imunológico Ag ligado às microesferas; e detectar a presença ou ausência do anticorpo detectavelmente marcado ligado ao complexo de anticorpo imunológico Ag para determinar a presença ou ausência de anticorpos específicos ao doador na amostra biológica a partir do recipiente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção é semiquantitativa.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo imunológico é um aloanticorpo, um autoanticorpo, ou um anticorpo fixador de complemento (CFAb).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende fluir o complexo através de um citômetro de fluxo, ou detectar o complexo por meio de um ensaio imunoenzimático (ELISA).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável compreende um fluorocromo, um cromóforo, uma enzima, uma molécula ligante, uma molécula de biotina, um doador de elétrons, um aceitador de elétrons, um corante, um metal, ou um radionuclídeo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico de doador é o atual anticorpo específico de doador.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o Ag é selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB2, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQ, e HLA-DP.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende soro, sangue, saliva, ou plasma.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a amostra celular do doador compreende de 0,001x106 a 2,0x106 células.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a amostra celular do doador compreende menos que 0,2x106 células.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as microesferas são microesferas de agarose, microesferas de latex, microesferas magnéticas, ou microesferas de poliestireno.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método é desempenhado em 12 horas ou menos.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as condições de lise compreendem administrar um tampão de lise que compreende rastreador, detergente, e DNase.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende gerar um relatório indicando se os anticorpos específicos ao doador estão presentes na amostra biológica do recipiente.

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