CN106566815B

CN106566815B - 一种生产甘草次酸或其前体物的酿酒酵母工程菌及构建方法

Info

Publication number: CN106566815B
Application number: CN201610965315.9A
Authority: CN
Inventors: 李春; 朱明�; 王彩霞; 孙文涛; 周安琪
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: CN106566815A

Abstract

本发明公开一种生产甘草次酸或其前体物：11‑羟基‑β‑香树脂醇，或11‑氧‑β‑香树脂醇，或30‑羟基‑β‑香树脂醇，或11，30‑羟基‑β‑香树脂醇，或30‑羟基‑11‑氧‑β‑香树脂醇，或30‑醛基‑11‑氧‑β‑香树脂醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法，其生产步骤为分别构建β‑香树脂醇合酶表达盒、β‑香树脂醇的碳11位的氧化酶表达盒、11‑氧‑β‑香树脂醇的碳30位的氧化酶表达盒、细胞色素P450氧化还原酶表达盒，并共同导入酿酒酵母基因组中。本发明将甘草次酸的合成与酵母的生长耦合，实现了甘草次酸或其前体物的酵母合成，该方法不需要效应剂的诱导、工艺简单，可用于发酵生产甘草次酸及其关键前体物。

Description

一种生产甘草次酸或其前体物的酿酒酵母工程菌及构建方法

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及发酵生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇(11-hydroxy-β-amyrin)，或11-氧-β-香树脂醇(11-oxo-β-amyrin)，或30-羟基-β-香树脂醇(30-hydroxy-β-amyrin)，或11,30-羟基-β-香树脂醇(11,30-hydroxy-β-amyrin)，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin)，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇(Glycyrrhetaldehyde)的方法，属于生物工程领域。

背景技术

萜类物质是植物次生代谢产物的一种，具有多种多样的生物活性与药理价值。药理学已经证明三萜类化合物如甘草酸(Glycyrrhizin，GL)在保肝、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等方面具有非常重要的作用，同时也可作为甜味剂或食品添加剂。甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)是甘草酸合成的前体物质，与甘草酸相比，甘草次酸缺少2分子的葡萄糖醛酸基，所以极性较弱，较容易穿透细胞膜，且保留了与甘草酸一致的生理活性与功能，更容易在细胞内发挥其生物活性与功能。在植物甘草中，甘草次酸的含量极低，主要以甘草酸形式存在。植物提取存在周期长、效率低、成本高、环境破坏大等缺点。甘草次酸复杂的分子结构、严苛的合成条件也使其化学合成难以进行。随着合成生物学的发展，利用微生物合成甘草次酸等具有重大医药价值的化合物已成为一种发展趋势。微生物合成具有周期短，产量高，条件温和，过程可控等特点，因此可以有效缓解对植物资源的依赖，从而具有较高的经济效益与社会价值。

在酿酒酵母工程菌中，甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的合成是经甲羟戊酸途径合成鲨烯，然后经2,3-氧化鲨烯单氧酶、β-香树脂醇合酶催化形成β-香树脂醇。本研究是在此基础上，进一步挖掘发现β-香树脂醇到甘草次酸的合成是由两个氧化酶CYP88D6和CYP72A154(或CYP72A63)顺序共同催化完成，微生物内并未发现这两种酶，因此，需要引入植物甘草中的两个酶在酿酒酵母体内进行表达，从而实现甘草次酸的生物合成。

发明内容

本发明的目的是提供一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种细胞色素P450氧化还原酶基因。

本发明的第四个目的是提供一种细胞色素P450氧化还原酶基因编码的蛋白质。

本发明的第五个目的是提供一种生产甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酵母菌的构建方法。

本发明的第六个目的是提供一种利用生产甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酵母菌的构建方法构建的酿酒酵母工程菌。

本发明的技术方案概述如下：

一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因，它是序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列。

一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因编码的蛋白质，它是序列表SEQ ID No.6所述的氨基酸序列。

一种细胞色素P450氧化还原酶基因，它是序列表中SEQ ID No.11所述的核苷酸序列。

一种细胞色素P450氧化还原酶基因编码的蛋白质，它是序列表SEQ ID No.12所述的氨基酸序列。

一种生产甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)β-香树脂醇合酶表达盒的构建：

将左同源臂、酵母启动子、β-香树脂醇合酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到β-香树脂醇合酶的表达盒；

(2)氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)表达盒的构建：

将酵母启动子、氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶的表达盒。

(3)氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)表达盒的构建：

将酵母启动子、氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶的表达盒。

(4)细胞色素P450氧化还原酶表达盒的构建

将酵母启动子、细胞色素P450氧化还原酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到细胞色素P450氧化还原酶的表达盒。

(5)筛选标记表达盒的构建

将酵母终止子T_PGK1、遗传霉素表达盒基因P_TEF1-kanMX-T_TEF1、右同源臂HOR应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到筛选标记表达盒。

(6)将上述β-香树脂醇合酶表达盒，和/或氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)表达盒，和/或氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)表达盒，和/或细胞色素P450氧化还原酶表达盒***到酿酒酵母INVSc1，或W303a，或W303ɑ，或BJ2168，或BY4742，或BY4700，或CEN.PK2-1C，或CEN.PK2-1D基因组整合位点中，得到生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌。

所述酵母启动子为GPDp，和/或PGK1p，和/或TDH1p，和/或TEF1p，和/或ADH1p，和/或PGI1p，和/或TDH2p，和/或HXT2p，和/或HXT7p，和/或TEF2p，和/或PYK1p，和/或ENO2p，和/或PDC1p，和/或FBA1p，和/或GPM1p，和/或TPI1p，和/或GAL7p，和/或GAL1p，和/或GAL10p。

所述酵母终止子为TDH3t，和/或PGK1t，和/或TDH1t，和/或TEF1t，和/或ADH1t，和/或PGI1t，和/或TDH2t，和/或HXT2t，和/或HXT7t，和/或TEF2t，和/或PYK1t，和/或ENO2t，和/或PDC1t，和/或FBA1t，和/或GPM1，和/或CYC1t，和/或TPI1t。

所述基因组整合位点为HO位点，和/或YPRCtau3位点，和/或URA3位点，和/或TRP1位点，和/或LEU2位点，和/或HIS3位点，和/或delta位点，和/或rDNA位点。

所述β-香树脂醇合酶的核苷酸序列Genbank注册序列号为AB037203。

所述氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)基因是序列表中SEQ ID No.16所述的核苷酸序列或CYP450氧化酶CYP88D6，其核苷酸序列Genbank注册序列号为AB433179。

所述氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)基因是CYP450氧化酶CYP72A154，其核苷酸序列Genbank注册序列号为AB558153，和/或CYP450氧化酶CYP72A63，其核苷酸序列Genbank注册序列号为AB558146。

所述细胞色素P450氧化还原酶是序列表中SEQ ID No.10所述的核苷酸序列，或细胞色素P450氧化还原酶LjCPR1，其核苷酸序列Genbank注册序列号为AB433810，和/或核苷酸序列Genbank注册序列号为BT008426.1的细胞色素P450氧化还原酶AtCPR1，和/或蛋白质序列Genbank注册序列号为NP_001328167.1的细胞色素P450氧化还原酶AtCPR2。

上述一种生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酵母菌的构建方法构建的酿酒酵母工程菌。

本发明就是利用代谢工程与合成生物学技术在酿酒酵母体内引入植物源的甘草次酸的合成途径，实现了甘草次酸及其关键前体物的微生物合成。整个生产过程方便、快捷、无污染，具有非常广阔的应用前景。本发明的生产甘草次酸及其关键前体物的酿酒酵母工程菌为甘草次酸及其关键前体物的异源生产提供了一种切实可行的方法。

附图说明

图1酿酒酵母工程菌发酵生产11-羟基-β-香树脂醇(11-hydroxy-β-amyrin)的组分分析总离子色谱图。

图2酿酒酵母工程菌发酵生产11-羟基-β-香树脂醇(11-hydroxy-β-amyrin)的质谱图。

图3酿酒酵母工程菌发酵生产11-氧-β-香树脂醇(11-oxo-β-amyrin)的组分分析总离子色谱图。

图4酿酒酵母工程菌发酵生产11-氧-β-香树脂醇(11-oxo-β-amyrin)的质谱图。

图5酿酒酵母工程菌发酵生产30-羟基-β-香树脂醇(30-hydroxy-β-amyrin)的组分分析总离子色谱图。

图6酿酒酵母工程菌发酵生产30-羟基-β-香树脂醇(30-hydroxy-β-amyrin)的质谱图。

图7酿酒酵母工程菌发酵生产11,30-羟基-β-香树脂醇(11,30-hydroxy-β-amyrin)的组分分析总离子色谱图。

图8酿酒酵母工程菌发酵生产11,30-羟基-β-香树脂醇(11,30-hydroxy-β-amyrin)的质谱图。

图9酿酒酵母工程菌发酵生产30-羟基-11-氧-β-香树脂醇(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin)的组分分析总离子色谱图。

图10酿酒酵母工程菌发酵生产30-羟基-11-氧-β-香树脂醇(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin)的质谱图。

图11酿酒酵母工程菌发酵生产30-醛基-11-氧-β-香树脂醇(Glycyrrhetaldehyde)的组分分析总离子色谱图。

图12酿酒酵母工程菌发酵生产30-醛基-11-氧-β-香树脂醇(Glycyrrhetaldehyde)的质谱图。

图13酿酒酵母工程菌发酵生产甘草次酸的组分分析总离子色谱图。

图14酿酒酵母工程菌发酵生产甘草次酸的质谱图。

图15酿酒酵母中甘草次酸合成路径图。

具体实施方式

下面通过合成甘草次酸及其关键前体物的优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，具体实验例的目的只是为了说明，而不是限制本发明的范围。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以针对本发明的各个方面进行修改，但是这些修改也属于本发明的保护范围。例如，将本实验例中所使用的启动子或终止子替换为本领域常用的其他启动子或终止子，是本领域的其他技术人员能够理解和实现的。

另外，需要注意的是，除非特别指出，以下具体实例中所采用的各种材料和试剂均为本领域常用材料和试剂，可以通过正常的商业途径获得；所采用的方法均为本领域技术人员公知的常规方法。

实验例1：甘草次酸合成途径中相关基因的获得

A、β-香树脂醇合酶基因的获得

根据β-香树脂醇合酶基因(Genbank注册序列号为AB037203)序列，通过密码子优化，使β-香树脂醇合酶基因的密码子具有酵母偏好性，产生的优化基因序列为SEQ IDNo.1。

B、氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因的获得

根据CYP450氧化酶CYP88D6基因(Genbank注册序列号为AB433179)序列，通过密码子优化，使CYP88D6基因的密码子具有酵母偏好性，产生的优化基因序列为SEQ ID No.2。

根据CYP450氧化酶CYP88D6基因(Genbank注册序列号为AB433179)序列设计引物，SEQ ID No.3：5’-ATGGAAGTACATTGGGTTTGC-3’与SEQ ID No.4：5’-CTAAGCACATGAGACCTTCATCACC-3’，以乌拉尔甘草cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得到1482bp片段，以SEQ ID No.5所示，克隆至pMD18-T载体，测序证明与已报道的CYP88D6相比发生了23个碱基的变化，氨基酸发生了11个变异。SEQ ID No.5所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.6所示。

C、氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶基因的获得

根据CYP450氧化酶CYP72A154基因(Genbank注册序列号为AB558153)序列，通过密码子优化，使CYP72A154基因的密码子具有酵母偏好性，产生的优化基因序列为SEQ IDNo.7。

根据CYP450氧化酶CYP72A63基因(Genbank注册序列号为AB558146)序列，通过密码子优化，使CYP72A63基因的密码子具有酵母偏好性，产生的优化基因序列为SEQ IDNo.8。

D、细胞色素P450氧化还原酶基因的获得

根据甘草转录组数据库筛选，得到细胞色素P450氧化还原酶基因，设计引物，SEQID No.9：5’-ATGACTTCGAATTCCGATTTGG-3’与SEQ ID No.10：5’-TCACCAGACATCCCTGAGGTAACG-3’，以乌拉尔甘草cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得到2076bp片段，以SEQ ID No.11所示，克隆至pMD18-T载体，测序确定其完整序列。SEQ IDNo.11所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.12所示。

E、筛选标记基因的获得

根据pRS42K载体中遗传霉素(G418)表达盒序列，设计引物SEQ ID No.13：5’-GACATGGAGGCCCAGAATACCC-3’与SEQ ID No.14：5’-TCGACACTGGATGGCGGCGT-3’，以pRS42K质粒为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得到1394bp片段，以SEQ ID No.15所示，克隆至pMD18-T载体，测序证明其未发生突变。

F、基因组同源臂的获得

根据酿酒酵母基因组中HO位点左同源臂HOL(SEQ ID No.16)与右同源臂序列HOR(SEQ ID No.17)，设计引物SEQ ID No.18：5’-AATTATCCTGGGCACGAGTGAAACAAAGC-3’与SEQID No.19：5’-ACGCCATTTTAAGTCCAAAGGCACAATTTTAC-3’(如SEQ ID No.53所示)，扩增HO左同源臂HOL；引物SEQ ID No.20：5’-CTGGGGGAACAACTTCACAG-3’与SEQ ID No.21：5’-ACTGTAAGATTCCGCCACATTTTATAC-3’扩增右同源臂HOR，以INVSc1基因组为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，克隆至pMD18-T载体，测序证明其未发生突变。

实验例2：表达盒的构建

A、β-香树脂醇合酶表达盒的构建

将左同源臂HOL、酵母启动子P_FBA1、β-香树脂醇合酶基因、酵母终止子T_CYC1应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到β-香树脂醇合酶表达盒P_FBA1-bAS-T_CYC1

B、氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶表达盒的构建

将酵母终止子T_CYC1、酵母启动子P_GPD、CYP450氧化酶基因CYP72A154或CYP72A63、酵母终止子T_ADH1应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶T_CYC1-P_GPD–CYP72A154-T_ADH1或T_CYC1-P_GPD-CYP72A63-T_ADH1

C、氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶表达盒的构建

将酵母终止子T_ADH1、酵母启动子P_ENO2、氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因UNI47或CYP450氧化酶基因CYP88D6、酵母终止子T_TYS1应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到β-香树脂醇合酶表达盒T_ADH1-P_ENO2-UNI47-T_TYS1或T_ADH1-P_ENO2-CYP88D6-T_TYS1

D、细胞色素P450氧化还原酶表达盒的构建

将酵母终止子T_TYS1、酵母启动子P_PGK1、细胞色素P450氧化还原酶基因CPR、酵母终止子T_PGK1应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到细胞色素P450氧化还原酶表达盒T_TYS1-P_PGK1-CPR-T_PGK1

E、筛选标记表达盒的构建

将酵母终止子T_PGK1、遗传霉素表达盒基因P_TEF1-kanMX-T_TEF1、右同源臂HOR应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到筛选标记表达盒T_PGK1–P_TEF1-kanMX-T_TEF1-HOR

实验例3：生产甘草次酸的酿酒酵母工程菌的获得

采用醋酸锂法进行片段的酵母转化

利用酵母自身的同源重组功能，将上述构建好的表达盒全部共同转入酿酒酵母INVSc1基因组的HO位点。转化后采用添加遗传霉素(G418)的YPD固体平板进行筛选，得到的转化子转移到添加遗传霉素(G418)的YPD液体培养基中进行培养1-2天，提取基因组，PCR鉴定阳性克隆，平板划线或甘油菌保存。

利用酵母自身存在MVA途径的基础上，外源引入甘草次酸的合成酶，获取具备生产甘草次酸功能的酿酒酵母工程菌株。

实验例4：生产甘草次酸及其关键前体物的酿酒酵母工程菌的获得

种子液的培养：从筛选平板上挑取阳性克隆接种到2ml YPD培养基中，30℃，200rpm振荡培养18小时。

发酵实验：按照1％的接种量(吸光度大约0.1)接种到100ml YPD培养基中，30℃，200rpm振荡培养120小时，每24小时取样一次，测定细胞中甘草次酸及其关键前体物的含量，结果显示，酿酒酵母工程菌发酵最终甘草次酸含量为1.515mg/L，其前体物(11-羟基-β-香树脂醇含量为6.9mg/L、11-氧-β-香树脂醇含量为23mg/L、30-羟基-β-香树脂醇含量为25mg/L、11,30-羟基-β-香树脂醇含量为15mg/L、30-羟基-11-氧-β-香树脂醇含量为40mg/L、30-醛基-11-氧-β-香树脂醇含量为2.8mg/L)具有不同的产量。

实验例5：酿酒酵母工程菌发酵产物的鉴定

对发酵产物8000rpm离心5分钟，去上清，沉淀用1.5ml饱和氯化钠重悬，珠打破碎20分钟，等体积的乙酸乙酯萃取，旋转蒸发至粉末状，转移至气相小瓶中，添加500μl N,O-双(三甲基硅基)三氟代乙酰胺与500μl吡啶，80℃反应30分钟，冷却至室温。利用岛津GC2010QP气相色谱质谱联用仪对提取物进行分析。升温程序：80℃保持1分钟，以20℃/min升至290℃，保持38分钟；进样口温度250℃，分流比5:1，进样1μl，色谱质谱接口温度为290℃。结果显示，总离子色谱图与质谱图共同确定了甘草次酸的特征峰，说明酿酒酵母工程菌可以成功的合成甘草次酸和其前体物：11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇。

实验表明，利用TDH1p，和/或TEF1p，和/或ADH1p，和/或PGI1p，和/或TDH2p，和/或HXT2p，和/或HXT7p，和/或TEF2p，和/或PYK1p，和/或PDC1p，和/或GPM1p，和/或TPI1p，和/或GAL7p，和/或GAL1p，和/或GAL10p替换实验例2中的FBA1p，或GPD，或ENO2p，或PGK1p，可以获得相应的表达盒。

利用TDH3t，和/或TDH1t，和/或TEF1t，和/或PGI1t，和/或TDH2t，和/或HXT2t，和/或HXT7t，和/或TEF2t，和/或PYK1t，和/或ENO2t，和/或PDC1t，和/或FBA1t，和/或GPM1，和/或TPI1t替换实验例2中的PGK1t，或ADH1t，或CYC1t，或TYS1t，可以获得相应的表达盒。

利用酿酒酵母菌株W303a，或W303ɑ，或BJ2168，或BY4742，或BY4700，或CEN.PK2-1C，或CEN.PK2-1D均可以替代实验例3中的INVSc1菌株。

用基因组的以下位点YPRCtau3，和/或URA3，和/或TRP1，和/或LEU2，和/或HIS3，和/或delta，和/或rDNA位点可以替代实验例3中的HO位点。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京理工大学

<120> 一种生产甘草次酸或其前体物的酿酒酵母工程菌及构建方法

<130> 1

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtggagat tgaagatcgc tgaaggtggt aaggacccat acatctactc tactaacaac 60

ttcgttggta gacaaacttg ggaatacgac ccagacggtg gtactccaga agaaagagct 120

caagttgacg ctgctagatt gcacttctac aacaacagat tccaagttaa gccatgtggt 180

gacttgttgt ggagattcca aatcttgaga gaaaacaact tcaagcaaac tatcgcttct 240

gttaagatcg gtgacggtga agaaatcact tacgaaaagg ctactactgc tgttagaaga 300

gctgctcacc acttgtctgc tttgcaaact tctgacggtc actggccagc tcaaatcgct 360

ggtccattgt tcttcttgcc accattggtt ttctgtatgt acatcactgg tcacttggac 420

tctgttttcc cagaagaata cagaaaggaa atcttgagat acatctacta ccaccaaaac 480

gaagacggtg gttggggttt gcacatcgaa ggtcactcta ctatgttctg tactgctttg 540

aactacatct gtatgagaat cttgggtgaa ggtccagacg gtggtcaaga caacgcttgt 600

gctagagcta gaaagtggat ccacgaccac ggtggtgtta ctcacatccc atcttggggt 660

aagacttggt tgtctatctt gggtgttttc gactggtgtg gttctaaccc aatgccacca 720

gaattctgga tcttgccatc tttcttgcca atgcacccag ctaagatgtg gtgttactgt 780

agattggttt acatgccaat gtcttacttg tacggtaaga gattcgttgg tccaatcact 840

ccattgatct tgcaattgag agaagaattg ttcactgaac catacgaaaa ggttaactgg 900

aagaaggcta gacaccaatg tgctaaggaa gacttgtact acccacaccc attgttgcaa 960

gacttgatct gggactcttt gtacttgttc actgaaccat tgttgactag atggccattc 1020

aacaagttgg ttagagaaaa ggctttgcaa gttactatga agcacatcca ctacgaagac 1080

gaaacttcta gatacatcac tatcggttgt gttgaaaagg ttttgtgtat gttggcttgt 1140

tgggttgaag acccaaacgg tgacgctttc aagaagcact tggctagagt tccagactac 1200

ttgtgggttt ctgaagacgg tatgactatg caatctttcg gttctcaaga atgggacgct 1260

ggtttcgctg ttcaagcttt gttggctact aacttggttg aagaaatcgc tccaactttg 1320

gctaagggtc acgacttcat caagaagtct caagttagag acaacccatc tggtgacttc 1380

aagtctatgt acagacacat ctctaagggt tcttggactt tctctgacca agaccacggt 1440

tggcaagttt ctgactgtac tgctgaaggt ttgaagtgtt gtttgttgtt gtctatgttg 1500

ccaccagaaa tcgttggtga aaagatggaa ccagaaagat tgtacgactc tgttaacgtt 1560

ttgttgtctt tgcaatctaa gaagggtggt ttgtctgctt gggaaccagc tggtgctcaa 1620

gaatggttgg aattgttgaa cccaactgaa ttcttcgctg acatcgttgt tgaacacgaa 1680

tacgttgaat gtactggttc tgctatccaa gctttggttt tgttcaagaa gttgtaccca 1740

ggtcacagaa agaaggaaat cgaaaacttc atcgctaacg ctgttagatt cttggaagac 1800

actcaaactg ctgacggttc ttggtacggt aactggggtg tttgtttcac ttacggttct 1860

tggttcgctt tgggtggttt ggctgctgct ggtaagactt tcgctaactg tgctgctatc 1920

agaaaggctg ttaagttctt gttgactact caaagagaag acggtggttg gggtgaatct 1980

tacttgtctt ctccaaagaa gatctacgtt ccattggaag gttctagatc taacgttgtt 2040

cacactgctt gggctttgat gggtttgatc cacgctggtc aagctgaaag agacccagct 2100

ccattgcaca gagctgctaa gttgatcatc aactctcaat tggaagaagg tgactggcca 2160

caacaagaaa tcactggtgt tttcatgaag aactgtatgt tgcactaccc aatgtacaga 2220

gacatctacc caatgtgggc tttggctgaa tacagaagaa gagttccatt gccatctact 2280

ccagtttgtt tgacttaa 2298

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaagttc actgggtttg tatgtctgct gctactttgt tggtttgtta catcttcggt 60

tctaagttcg ttagaaactt gaacggttgg tactacgacg ttaagttgag aagaaaggaa 120

cacccattgc caccaggtga catgggttgg ccattgatcg gtgacttgtt gtctttcatc 180

aaggacttct cttctggtca cccagactct ttcatcaaca acttggtttt gaagtacggt 240

agatctggta tctacaagac tcacttgttc ggtaacccat ctatcatcgt ttgtgaacca 300

caaatgtgta gaagagtttt gactgacgac gttaacttca agttgggtta cccaaagtct 360

atcaaggaat tggctagatg tagaccaatg atcgacgttt ctaacgctga acacagattg 420

ttcagaagat tgatcacttc tccaatcgtt ggtcacaagg ctttggctat gtacttggaa 480

agattggaag aaatcgttat caactctttg gaagaattgt cttctatgaa gcacccagtt 540

gaattgttga aggaaatgaa gaaggtttct ttcaaggcta tcgttcacgt tttcatgggt 600

tcttctaacc aagacatcat caagaagatc ggttcttctt tcactgactt gtacaacggt 660

atgttctcta tcccaatcaa cgttccaggt ttcactttcc acaaggcttt ggaagctaga 720

aagaagttgg ctaagatcgt tcaaccagtt gttgacgaaa gaagattgat gatcgaaaac 780

ggtccacaag aaggttctca aagaaaggac ttgatcgaca tcttgttgga agttaaggac 840

gaaaacggta gaaagttgga agacgaagac atctctgact tgttgatcgg tttgttgttc 900

gctggtcacg aatctactgc tacttctttg atgtggtcta tcacttactt gactcaacac 960

ccacacatct tgaagaaggc taaggaagaa caagaagaaa tcactagaac tagattctct 1020

tctcaaaagc aattgtcttt gaaggaaatc aagcaaatgg tttacttgtc tcaagttatc 1080

gacgaaactt tgagatgtgc taacatcgct ttcgctactt tcagagaagc tactgctgac 1140

gttaacatca acggttacat catcccaaag ggttggagag ttttgatctg ggctagagct 1200

atccacatgg actctgaata ctacccaaac ccagaagaat tcaacccatc tagatgggac 1260

gactacaacg ctaaggctgg tactttcttg ccattcggtg ctggttctag attgtgtcca 1320

ggtgctgact tggctaagtt ggaaatctct atcttcttgc actacttctt gagaaactac 1380

agattggaaa gaatcaaccc agaatgtcac gttacttctt tgccagtttc taagccaact 1440

gacaactgtt tggctaaggt tatcaaggtt tcttgtgctt aa 1482

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggaagtac attgggtttg c 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctaagcacat gagaccttca tcacc 25

<210> 5

<211> 1482

<212> DNA

<213> 甘草（Glycyrrhiza uralensis）

<400> 5

atggaagtac attgggtttg catgtgcgct gccactttgt tggtatgcta catttttgga 60

agcaagtttg tgaggaattt gaatgggtgg tattatgatg taaaactaag aaggaaagaa 120

cacccactac ccccaggtga catgggatgg cctcttatgg gcaatctatt gtccttcatc 180

aaagatttct catcgggtca ccctgattca ttcatcaaca accttgttct caaatatgga 240

cgaagtggta tctacaagac tcacttgttt gggaatccaa gcatcattgt ttgcgagcct 300

cagatgtgta ggcgagttct cactgatgat gtgaacttta agcttggtta tccaaaatct 360

atcaaagagt tggcacgatg tagacccatg attgatgtct ctaatgcgga acataggctt 420

tttcgacgcc tcattacttc cccaatcgtg ggtcacaagg cgctagcaat gtacctagaa 480

cgtcttgagg aaattgtgat caattcgttg gaagaattgt ccagcatgaa gcaccccgtt 540

gagctcttga aagagatgaa gaaggtttcc tttaaagcca ttgtccacgt tttcatgggc 600

tcttccaatc aggacatcat taaaaaaatt ggaagttcgt ttactgattt gtacaatggc 660

atgttctcta tccccattaa cgtacctggt tttacattcc acaaagcact cgaggcacgt 720

aagaagctag ccaaaatagt tcaacccgtt gtggatgaaa ggcggttgat gatagaaaat 780

ggtcaacaag aaggggacca aagaaaagat cttattgata ttcttttgga agtcaaagat 840

gagaatggac gaaaattgga ggacgaggat attagcgatt tattaatagg gcttttgttt 900

gctggccatg aaagtacagc aaccagttta atgtggtcaa ttacatatct tacacagcat 960

ccccatatct tgaaaaaggc taaggaagag caggaagaaa taatgaggac aagattgtcc 1020

tcgcagaaac aattaagttt taaggaaatt aaacaaatgg tttatctttc tcaggtaatt 1080

gatgaaactt tacgatgtgc caatattgcc tttgcaactt ttcgagaggc aactgctgat 1140

gtgaacatca atggttatat cataccaaag ggatggagag tgctaatttg ggcaagagcc 1200

attcatatgg attctgaata ttacccaaat ccagaagaat ttaatccatc gagatgggat 1260

gattacaatg ccaaagcagg aaccttcctt ccttttggag caggaagtag actttgtcct 1320

ggagccgact tggcgaaact tgaaatttcc atatttcttc attatttcct ccttaattac 1380

aggttggagc gagtaaatcc agaatgtcat gttaccagct taccagtatc taagcccaca 1440

gacaattgcc tcgctaaggt gatgaaggtc tcatgtgctt ag 1482

<210> 6

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Glu Val His Trp Val Cys Met Cys Ala Ala Thr Leu Leu Val Cys

1 5 10 15

Tyr Ile Phe Gly Ser Lys Phe Val Arg Asn Leu Asn Gly Trp Tyr Tyr

20 25 30

Asp Val Lys Leu Arg Arg Lys Glu His Pro Leu Pro Pro Gly Asp Met

35 40 45

Gly Trp Pro Leu Met Gly Asn Leu Leu Ser Phe Ile Lys Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Gly His Pro Asp Ser Phe Ile Asn Asn Leu Val Leu Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Arg Ser Gly Ile Tyr Lys Thr His Leu Phe Gly Asn Pro Ser Ile Ile

85 90 95

Val Cys Glu Pro Gln Met Cys Arg Arg Val Leu Thr Asp Asp Val Asn

100 105 110

Phe Lys Leu Gly Tyr Pro Lys Ser Ile Lys Glu Leu Ala Arg Cys Arg

115 120 125

Pro Met Ile Asp Val Ser Asn Ala Glu His Arg Leu Phe Arg Arg Leu

130 135 140

Ile Thr Ser Pro Ile Val Gly His Lys Ala Leu Ala Met Tyr Leu Glu

145 150 155 160

Arg Leu Glu Glu Ile Val Ile Asn Ser Leu Glu Glu Leu Ser Ser Met

165 170 175

Lys His Pro Val Glu Leu Leu Lys Glu Met Lys Lys Val Ser Phe Lys

180 185 190

Ala Ile Val His Val Phe Met Gly Ser Ser Asn Gln Asp Ile Ile Lys

195 200 205

Lys Ile Gly Ser Ser Phe Thr Asp Leu Tyr Asn Gly Met Phe Ser Ile

210 215 220

Pro Ile Asn Val Pro Gly Phe Thr Phe His Lys Ala Leu Glu Ala Arg

225 230 235 240

Lys Lys Leu Ala Lys Ile Val Gln Pro Val Val Asp Glu Arg Arg Leu

245 250 255

Met Ile Glu Asn Gly Gln Gln Glu Gly Asp Gln Arg Lys Asp Leu Ile

260 265 270

Asp Ile Leu Leu Glu Val Lys Asp Glu Asn Gly Arg Lys Leu Glu Asp

275 280 285

Glu Asp Ile Ser Asp Leu Leu Ile Gly Leu Leu Phe Ala Gly His Glu

290 295 300

Ser Thr Ala Thr Ser Leu Met Trp Ser Ile Thr Tyr Leu Thr Gln His

305 310 315 320

Pro His Ile Leu Lys Lys Ala Lys Glu Glu Gln Glu Glu Ile Met Arg

325 330 335

Thr Arg Leu Ser Ser Gln Lys Gln Leu Ser Phe Lys Glu Ile Lys Gln

340 345 350

Met Val Tyr Leu Ser Gln Val Ile Asp Glu Thr Leu Arg Cys Ala Asn

355 360 365

Ile Ala Phe Ala Thr Phe Arg Glu Ala Thr Ala Asp Val Asn Ile Asn

370 375 380

Gly Tyr Ile Ile Pro Lys Gly Trp Arg Val Leu Ile Trp Ala Arg Ala

385 390 395 400

Ile His Met Asp Ser Glu Tyr Tyr Pro Asn Pro Glu Glu Phe Asn Pro

405 410 415

Ser Arg Trp Asp Asp Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Thr Phe Leu Pro Phe

420 425 430

Gly Ala Gly Ser Arg Leu Cys Pro Gly Ala Asp Leu Ala Lys Leu Glu

435 440 445

Ile Ser Ile Phe Leu His Tyr Phe Leu Leu Asn Tyr Arg Leu Glu Arg

450 455 460

Val Asn Pro Glu Cys His Val Thr Ser Leu Pro Val Ser Lys Pro Thr

465 470 475 480

Asp Asn Cys Leu Ala Lys Val Met Lys Val Ser Cys Ala

485 490

<210> 7

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggacgctt cttctactcc aggtgctatc tgggttgttt tgactgttat cttggctgct 60

atcccaatct gggtttgtca catggttaac actttgtggt tgagaccaaa gagattggaa 120

agacacttga gagctcaagg tttgcacggt gacccataca agttgtcttt ggacaactct 180

aagcaaactt acatgttgaa gttgcaacaa gaagctcaat ctaagtctat cggtttgtct 240

aaggacgacg ctgctccaag aatcttctct ttggctcacc aaactgttca caagtacggt 300

aagaactctt tcgcttggga aggtactgct ccaaaggtta tcatcactga cccagaacaa 360

atcaaggaag ttttcaacaa gatccaagac ttcccaaagc caaagttgaa cccaatcgct 420

aagtacatct ctatcggttt ggttcaatac gaaggtgaca agtgggctaa gcacagaaag 480

atcatcaacc cagctttcca cttggaaaag ttgaagggta tgttgccagc tttctctcac 540

tcttgtcacg aaatgatctc taagtggaag ggtttgttgt cttctgacgg tacttgtgaa 600

gttgacgttt ggccattctt gcaaaacttg acttgtgacg ttatctctag aactgctttc 660

ggttcttctt acgctgaagg tgctaagatc ttcgaattgt tgaagagaca aggttacgct 720

ttgatgactg ctagatacgc tagaatccca ttgtggtggt tgttgccatc tactactaag 780

agaagaatga aggaaatcga aagaggtatc agagactctt tggaaggtat catcagaaag 840

agagaaaagg ctttgaagtc tggtaagtct actgacgacg acttgttggg tatcttgttg 900

caatctaacc acatcgaaaa caagggtgac gaaaactcta agtctgctgg tatgactact 960

caagaagtta tggaagaatg taagttgttc tacttggctg gtcaagaaac tactgctgct 1020

ttgttggctt ggactatggt tttgttgggt aagcacccag aatggcaagc tagagctaga 1080

caagaagttt tgcaagtttt cggtaaccaa aacccaaact tcgaaggttt gggtagattg 1140

aagatcgtta ctatgatctt gtacgaagtt ttgagattgt acccaccagg tatctacttg 1200

actagagctt tgagaaagga cttgaagttg ggtaacttgt tgttgccagc tggtgttcaa 1260

gtttctgttc caatcttgtt gatccaccac gacgaaggta tctggggtaa cgacgctaag 1320

gaattcaacc cagaaagatt cgctgaaggt atcgctaagg ctactaaggg tcaagtttgt 1380

tacttcccat tcggttgggg tccaagaatc tgtgttggtc aaaacttcgc tttgttggaa 1440

gctaagatcg ttttgtcttt gttgttgcaa aacttctctt tcgaattgtc tccaacttac 1500

gctcacgttc caactactgt tttgactttg caaccaaagc acggtgctcc aatcatcttg 1560

cacaagttgt aa 1572

<210> 8

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggaagttt tcatgttccc aactggtact actgttatca tctctgtttt gtctgttttg 60

ttggctgtta tcccatggta cttgttgaac aagttgtggt tgaagccaaa gagattcgaa 120

aagttgttga aggctcaagg tttccaaggt gaaccataca acttgtctgt tttgaaggac 180

aagtctaagc aaaactacat gttgaagttg caacaagaag acaagtctaa gtctatcggt 240

ttgtctaagg aagctgctcc atctatcttc actccagttc accaaactgt tagaaagtac 300

ggtaacaact ctttcttgtg ggaaggtact actccaagag ttatcatcac tgacccagac 360

caaatcaagg acgttttcaa caagatcgac gacttcccaa agccaaagtt gagatctatc 420

gctaagtact tgtctgttgg tatcttggac cacgaaggta agaagtgggc taagcacaga 480

aagatcgcta acccagcttt ccacttggaa aagttgaagg ttatgttgcc agctttctct 540

cactcttgta acgaaatgat ctctaagtgg aaggaattgt tgtcttctga cggtacttgt 600

gaaatcgacg tttggccatc tttgcaaaac ttcacttgtg acgttatctc tagaactgct 660

ttcggttctt cttacgctga aggtactaag ttgttccaat tgttgaagaa gcaaggtttc 720

ttgttgatga ctggtagaca cactaacaac ccattgtggg gtttgttggc tactactact 780

aagactaaga tgaaggaaat cgacagagaa atccacgact ctttggaagg tatcatcgaa 840

aagagagaaa aggctttgaa gaacggtgaa actactaacg acgacttgtt gggtatcttg 900

ttgcaatcta accacgctga aaagcaaggt caaggtaact ctaagaacat cggtatgact 960

actcaagacg ttatcgacga atgtaagttg ttctacttgg ctggtcaaga aactacttct 1020

tctttgttgg tttggactat ggttttgttg ggtagatacc cagaatggca agctagagct 1080

agagaagaag ttttgcaagt tttcggtaac caaaacccaa acaacgaagg tttgtctcaa 1140

ttgaagatcg ttactatgat cttgtacgaa gttttgagat tgttcccacc attgatctac 1200

ttcaacagag ctttgagaaa ggacttgaag ttgggtaact tgttgttgcc agaaggtact 1260

caaatctctt tgccaatctt gttgatccac caagaccacg acttgtgggg tgacgacgct 1320

aaggaattca agccagaaag attcgctgaa ggtatcgcta aggctactaa gggtcaagtt 1380

tcttacttcc cattcggttg gggtccaaga atctgtttgg gtcaaaactt cgctttgttg 1440

gaagctaaga tcgctgtttc tttgttgttg caaaacttct ctttcgaatt gtctccaaac 1500

tacgttcacg ttccaactac tgttttgact ttgcaaccaa agaacggtgc ttctatcatc 1560

ttgcacaagt tgtaa 1575

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgacttcga attccgattt gg 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaccagaca tccctgaggt aacg 24

<210> 11

<211> 2076

<212> DNA

<213> 甘草（Glycyrrhiza uralensis）

<400> 11

atgacttcga attccgattt ggttcgcacc attgagtcgg tgctgggcgt ttcactcggc 60

gattcggtct ccgattcgct cgttctgata gcgactacct ccgtcgccgt cataattggg 120

ctccttgtgt tcctgtggaa gaaatcttcg gatcggagca gggaggtgag gccggtgatt 180

gtgccgaagt cgttggtgaa ggatgaagac gatgatgtcg acgttgcctc cgggaagact 240

aaggttactg ttttcttcgg tactcagact ggtactgctg agggcttcgc taaggcattg 300

gcggacgaga tcaaggcaag atatgaaaaa gcatatgtca aagttgttga tttggatgac 360

tatgcaatgg atgatgatca atatgaggag aagctgaaga aagaaactct tgcatttttc 420

atgctggcaa cttatggaga tggagagcca actgacaatg ctgcaagatt ctacaaatgg 480

tttactgagg gtaaagagga gaggggcacc tggcttcaac agctcacaca tggagttttt 540

ggcctaggta acaagcaata tgaacatttt aataagatag gtaaagttgt tgatgaagac 600

cttagtgaac aaggtgcaaa gcgtcttgtt ccacttggac taggtgatga tgatcaatcc 660

attgaggatg atttttctgc ctggaaagaa tctctgtggc ctgagttgga tcagttgctc 720

cgagatgagg atgatgtgaa tactgtttct actccctata ctgctgctat tcctgaatat 780

cgagtagtga ttcatgactc cactgtcaca ccatcctatg ataatcaatt cagcgcagca 840

aatgggggtg ctgtatttga tattcatcat ccttgcaggg taaatgttgc tgttaaaagg 900

gagcttcaca aacctcagtc tgaccgttcc tgcatacatt tggagtttga tatatcgggg 960

actggcataa catatgaaac tggagaccat gtgggtgttt atgctgagaa ctgtgatgaa 1020

actgttgaag aagctgggaa gttgttgggt caaaatttag atttgctgtt ttctcttcac 1080

actgataacg aggatggcac ttcccttgga ggctctctgc tacctccttt ccctggtcct 1140

tgcacactgc gtacggcgtt agcacgttat gcagatctct tgaaccctcc acgaaaggct 1200

gctttagttg tattagctgc tcatgcttct gaacctagtg aggcagaaag attgaagttc 1260

ctctcctctc ctcaggggaa ggatgagtac tccaaatggg tggttggaag ccagagaagt 1320

ctccttgagg tgatggctga gtttccatca gcaaaacctc cacttggtgt gtttttcgct 1380

gccatagccc ctcgtttaca gcctcgttat tattctattt catcctctcc taggtttgcc 1440

tcacaaaggg tacatgtaac ttgtgccctg gtgtatggtc caactcccac tggcagaatt 1500

cacaaaggag tatgctcaac ctggatgaag aatgctattc ccttagagga aagccgtgac 1560

tgtggctggg ctcccatttt tatcaggcca tcaaatttca agctaccagc cgatcattcg 1620

attcctatta ttatggttgg acctggtact ggtttggcac cttttagggg atttttacag 1680

gaaagatttg ccctcaaaga ggatggtgtt caacttggtc cttcattact cttctttgga 1740

tgcaggaacc gtcaaatgga ttttatttat gaggatgagc taaagaattt tgtggaacaa 1800

ggttctctgt cagagttgat agttgcattc tctagagagg ggcctgaaaa ggagtatgtt 1860

caacacaaga tgatggataa agcagcatac ctgtggagtc tgatttctca gggaggttat 1920

ctttatgtct gtggtgatgc caagggtatg gccagagatg ttcatcgaat tcttcatacc 1980

attgtccagc agcaggaaaa tgtggagtcg tcaaaggcgg aggctatagt gaaaaaactc 2040

cagatggatg gacgttacct cagggatgtc tggtga 2076

<210> 12

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Thr Ser Asn Ser Asp Leu Val Arg Thr Ile Glu Ser Val Leu Gly

1 5 10 15

Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Ser Asp Ser Leu Val Leu Ile Ala Thr

20 25 30

Thr Ser Val Ala Val Ile Ile Gly Leu Leu Val Phe Leu Trp Lys Lys

35 40 45

Ser Ser Asp Arg Ser Arg Glu Val Arg Pro Val Ile Val Pro Lys Ser

50 55 60

Leu Val Lys Asp Glu Asp Asp Asp Val Asp Val Ala Ser Gly Lys Thr

65 70 75 80

Lys Val Thr Val Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe

85 90 95

Ala Lys Ala Leu Ala Asp Glu Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Tyr

100 105 110

Val Lys Val Val Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Met Asp Asp Asp Gln Tyr

115 120 125

Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Thr Leu Ala Phe Phe Met Leu Ala Thr

130 135 140

Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp

145 150 155 160

Phe Thr Glu Gly Lys Glu Glu Arg Gly Thr Trp Leu Gln Gln Leu Thr

165 170 175

His Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Lys Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys

180 185 190

Ile Gly Lys Val Val Asp Glu Asp Leu Ser Glu Gln Gly Ala Lys Arg

195 200 205

Leu Val Pro Leu Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Ser Ile Glu Asp Asp

210 215 220

Phe Ser Ala Trp Lys Glu Ser Leu Trp Pro Glu Leu Asp Gln Leu Leu

225 230 235 240

Arg Asp Glu Asp Asp Val Asn Thr Val Ser Thr Pro Tyr Thr Ala Ala

245 250 255

Ile Pro Glu Tyr Arg Val Val Ile His Asp Ser Thr Val Thr Pro Ser

260 265 270

Tyr Asp Asn Gln Phe Ser Ala Ala Asn Gly Gly Ala Val Phe Asp Ile

275 280 285

His His Pro Cys Arg Val Asn Val Ala Val Lys Arg Glu Leu His Lys

290 295 300

Pro Gln Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu Phe Asp Ile Ser Gly

305 310 315 320

Thr Gly Ile Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Ala Glu

325 330 335

Asn Cys Asp Glu Thr Val Glu Glu Ala Gly Lys Leu Leu Gly Gln Asn

340 345 350

Leu Asp Leu Leu Phe Ser Leu His Thr Asp Asn Glu Asp Gly Thr Ser

355 360 365

Leu Gly Gly Ser Leu Leu Pro Pro Phe Pro Gly Pro Cys Thr Leu Arg

370 375 380

Thr Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Asn Pro Pro Arg Lys Ala

385 390 395 400

Ala Leu Val Val Leu Ala Ala His Ala Ser Glu Pro Ser Glu Ala Glu

405 410 415

Arg Leu Lys Phe Leu Ser Ser Pro Gln Gly Lys Asp Glu Tyr Ser Lys

420 425 430

Trp Val Val Gly Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe

435 440 445

Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Ile Ala Pro

450 455 460

Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Phe Ala

465 470 475 480

Ser Gln Arg Val His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Gly Pro Thr Pro

485 490 495

Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ala

500 505 510

Ile Pro Leu Glu Glu Ser Arg Asp Cys Gly Trp Ala Pro Ile Phe Ile

515 520 525

Arg Pro Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ala Asp His Ser Ile Pro Ile Ile

530 535 540

Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln

545 550 555 560

Glu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Asp Gly Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu

565 570 575

Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Gln Met Asp Phe Ile Tyr Glu Asp

580 585 590

Glu Leu Lys Asn Phe Val Glu Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Ile Val

595 600 605

Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Glu Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met

610 615 620

Met Asp Lys Ala Ala Tyr Leu Trp Ser Leu Ile Ser Gln Gly Gly Tyr

625 630 635 640

Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg

645 650 655

Ile Leu His Thr Ile Val Gln Gln Gln Glu Asn Val Glu Ser Ser Lys

660 665 670

Ala Glu Ala Ile Val Lys Lys Leu Gln Met Asp Gly Arg Tyr Leu Arg

675 680 685

Asp Val Trp

690

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gacatggagg cccagaatac cc 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgacactgg atggcggcgt 20

<210> 15

<211> 1394

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 60

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 120

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 180

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 240

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 300

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 360

ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 420

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 480

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 540

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 600

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa acagcattcc 660

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 720

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 780

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 840

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 900

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 960

aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 1020

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 1080

ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 1140

atgagttttt ctaatcagta ctgacaataa aaagattctt gttttcaaga acttgtcatt 1200

tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg tgatttatat 1260

tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga aagtaatatc 1320

atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactgctg tcgattcgat actaacgccg 1380

ccatccagtg tcga 1394

<210> 16

<211> 906

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 16

aattatcctg ggcacgagtg aaacaaagct aaaaccttta tttagcatgg ccattgaatg 60

taacaattat atatatcgca agcacaaaaa atcaaggaga gagaactacc actttgttca 120

tgtgtacaat gttcattatc tccataagca aaaaaaaaaa atagaaaaca tatgctataa 180

ggttgatatt ctcacgagta agcggcactt gctacttatt gacattgcag atttttggct 240

acagaaatag tatattagag attataattg ctaatcaaat caaaatataa aattagtaaa 300

ccaaaccatt tatacccttc cttagtagtt atggattgtt ttttaatgat atttctgcaa 360

accaaagaaa gattgttatc cagatagaat ttagttttga tattcatttt tttgttgaag 420

attgaacgcc atatctgggc ctcataattc aaaagacggt gccattatcg gtagcgtttc 480

gcattgtact ggatttcaga aatttcacag ttgatgaatc gaaaagaatg gtctcattgc 540

aacacgtaag gttaagatgt ccctttttac cattataggc aataaatgaa tcataaaacg 600

accgtatact ggtgaaatag tagggagaac gagtacctgt agtaaaaagt ataaatcata 660

gttaatcggg caatgtccct cgatcaagga gtattgtgtc atgttcgaga caaacgccaa 720

catttttgtt tcttttggac aaatgttgtt tgcatttatg atccgttata ttttgatcta 780

atgtagagtt gcacgtagtt cttactggca aagaaatcga tgcataccaa aaaagaataa 840

aggtgatatt tgatctttac cgtttagttc caacgtaaaa ttgtgccttt ggacttaaaa 900

tggcgt 906

<210> 17

<211> 501

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 17

ctgggggaac aacttcacag aatgttttgt catattgtcg aagtggtcac aaaacaagag 60

aagttccgcc aattataaaa agggaacccg tatatttcag cttcacggat gatttccagg 120

gtgagagtac tgtatatggg cttacgatag aaggccataa aaatttcttg cttggcaaca 180

aaatagaagt gaaatcatgt cgaggctgct gtgtgggaga acagcttaaa atatcacaaa 240

aaaagaatct aaaacactgt gttgcttgtc ccagaaaggg aatcaagtat ttttataaag 300

attggagtgg taaaaatcga gtatgtgcta gatgctatgg aagatacaaa ttcagcggtc 360

atcactgtat aaattgcaag tatgtaccag aagcacgtga agtgaaaaag gcaaaagaca 420

aaggcgaaaa attgggcatt acgcccgaag gtttgccagt taaaggacca gagtgtataa 480

aatgtggcgg aatcttacag t 501

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aattatcctg ggcacgagtg aaacaaagc 29

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgccatttt aagtccaaag gcacaatttt ac 32

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctgggggaac aacttcacag 20

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

actgtaagat tccgccacat tttatac 27

Claims

1.一种生产甘草次酸或其前体物质的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，利用从光果甘草中克隆得到的β-香树脂醇合酶(bAS)基因，从乌拉尔甘草中通过克隆得到的β-香树脂醇碳11位氧化酶UNI47基因其基因序列如SEQ IDNo.5所示，CYP450氧化还原酶CPR基因其基因序列如SEQ ID No.11所示，从苜蓿中克隆得到的11-氧-β-香树脂醇碳30位氧化酶CYP72A63基因其基因序列如SEQ ID No.8所示，对其进行密码子优化并化学合成，然后利用酿酒酵母组成型启动子和终止子分别构建，P_FBA1-bAS-T_CYC1,T_ADH1-P_ENO2-UNI47-T_TYS1,T_CYC1-P_GPD-CYP72A63-T_ADH1,T_TYS1-P_PGK1-CPR-T_PGK1的表达盒，以基因组整合的方式在酿酒酵母体内重构甘草次酸及其前体物合成途径，实现酿酒酵母合成甘草次酸或其前体物。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母在合成甘草次酸或其前体物中的应用，前体物包括11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇。