CN111718948B - 一段基因及其在生产计曼尼醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一段基因及其在生产计曼尼醇中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产计曼尼醇的酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p‑GES‑ADH1t，此酿酒酵母工程菌是通过将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码计曼尼醇合酶的基因整合至酿酒酵母BY4742的基因组中得到的；将此酿酒酵母工程菌接种至发酵培养基中发酵48h，即可使发酵液中计曼尼醇的产量高达45.31mg/L。

Description

一段基因及其在生产计曼尼醇中的应用

技术领域

本发明涉及一段基因及其在生产计曼尼醇中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

计曼尼醇是齐墩果烷型五环三萜类化合物，由于其具有抗肿瘤、抗HIV、抗氧化、抗炎抑菌等作用，因此，计曼尼醇在医药、食品、化妆品等领域均具有广泛的应用。

目前，生产计曼尼醇的方法主要有植物提取法和化学合成法。其中，植物提取法主要通过对含有计曼尼醇的植物进行提取以生产计曼尼醇，但是，由于计曼尼醇在植物中的含量很低，使用此方法生产计曼尼醇效率低下，并且，使用此方法生产计曼尼醇会消耗大量的植物原材料，对生态环境造成不良影响。化学合成法主要通过氧化还原反应生产计曼尼醇，但是，使用化学合成法生产计曼尼醇存在操作复杂、污染大、成本高、安全性低等问题。

上述缺陷严重限制了计曼尼醇的大规模工业化生产。因此，急需找到一种操作简单、环境友好、成本低且安全性高的生产计曼尼醇的方法以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、环境友好、成本低且安全性高的生产计曼尼醇的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一段基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒携带上述基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、上述基因以及终止子。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子为GAL1p启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述GAL1p启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述终止子为ADH1t终止子。

在本发明的一种实施方式中，所述ADH1t终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组整合有上述基因或整合有上述基因表达盒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4742。

在本发明的一种实施方式中，上述基因或上述基因表达盒整合于酿酒酵母基因组的308a位点。

本发明还提供了一种生产计曼尼醇的方法，所述方法为先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有计曼尼醇的发酵液，然后将含有计曼尼醇的发酵液进行分离，获得计曼尼醇。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为YPD液体培养基或YPG液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为200rpm。

本发明还提供了上述基因或上述基因表达盒或上述宿主细胞或上述方法在生产计曼尼醇中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可高产计曼尼醇的酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t，此酿酒酵母工程菌是通过将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码计曼尼醇合酶(Germanicol synthase，GES)的基因整合至酿酒酵母BY4742的基因组中得到的；将此酿酒酵母工程菌接种至发酵培养基中发酵48h，即可使发酵液中计曼尼醇的产量高达45.31mg/L。

(2)本发明提供了一种利用微生物法发酵生产计曼尼醇的方法，利用此方法生产计曼尼醇时，仅需将酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t接种至发酵培养基中进行发酵即可完成，并且，利用此方法发酵48h，即可使发酵液中计曼尼醇的产量高达45.31mg/L，因此，利用此方法生产计曼尼醇具有操作简单、环境友好、成本低以及安全性高的优势。

附图说明

图1：酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t的第一次菌落PCR验证结果；其中，M为Marker，1-4为酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t。

图2：酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t的第二次菌落PCR验证结果；其中，M为Marker，1为酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t。

图3：酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t发酵获得的发酵液的气相色谱图。

图4：酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t发酵获得的发酵液的质谱图。

图5：不同酿酒酵母工程菌发酵获得的发酵液中计曼尼醇的含量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742购自苏州金唯智生物科技有限公司；下述实施例中涉及的SC-URA固体培养基购自艾礼生物科技(上海)有限公司。

下述实施例中涉及的酵母基因表达附加型载体pRS426-308a的构建方法如下：合成Cas9基因(SEQ ID NO.19)、ADH1启动子(SEQ ID NO.20)、CYC1终止子(SEQ ID NO.21)、sgRNA(SEQ ID NO.22)、酪氨酸启动子(SEQ ID NO.23)和SNR52终止子(SEQ ID NO.24)；通过重叠延伸PCR将ADH1启动子、Cas9基因和CYC1终止子依次连接，得到基因片段1；通过重叠延伸PCR将酪氨酸启动子、sgRNA和SNR52终止子依次连接，得到基因片段2；将基因片段1和pRS426质粒(购自生物风公司)经SacI酶切后连接，得到重组质粒；将基因片段2和重组质粒经KpnI酶切后连接，得到酵母基因表达附加型载体pRS426-308a。

下述实施例中涉及的培养基如下：

YPD液体培养基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。

YPD固体培养基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。

YPG液体培养基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

计曼尼醇含量的测定：

将发酵液8000rpm离心5min，得到沉淀；将沉淀用等体积的含200g/L氢氧化钾的50％(v/v)无水乙醇重悬，得到重悬液；将重悬液沸水浴10min裂解细胞，得到裂解液；在裂解液中添加等体积的正己烷萃取，得到上清；取200μL上清转移至气相小瓶中后，在气相小瓶中添加200μL吡啶和200μL N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，55℃反应1h，得到反应液；将反应而已冷却至室温(25℃)后，利用气相色谱质谱联用仪对反应液进行分析；

其中，发酵液中计曼尼醇的含量的计算公式为：发酵液中计曼尼醇的含量＝样品峰面积/标样峰面积*标样浓度。

实施例1：酿酒酵母工程菌的构建

具体步骤如下：

以来源于苹果的编码Malus domestica beta-amyrin synthase-like(NCBIReference Sequence:NM_001328982.1)的基因(SEQ ID NO.1)为模板，通过密码子优化，设计并合成核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因，由于后期验证此基因可用于合成计曼尼醇，将此基因编码的蛋白命名为计曼尼醇合酶(Germanicol synthase，GES)，将此基因命名为编码计曼尼醇合酶(Germanicol synthase，GES)的基因。

以酿酒酵母BY4742的基因组为模板，以GAL1p-F、GAL1p-P为引物，通过PCR扩增得到GAL1p启动子(SEQ ID NO.2)；以酿酒酵母BY4742的基因组为模板，以ADH1t-F、ADH1t-P为引物，通过PCR扩增得到ADH1t终止子(SEQ ID NO.3)；以酿酒酵母BY4742的基因组为模板，以F1、P1为引物，通过PCR扩增得到上游同源臂(SEQ ID NO.5)；以酿酒酵母BY4742的基因组为模板，以F2、P2为引物，通过PCR扩增得到下游同源臂(SEQ ID NO.6)；

其中，PCR所用引物如下：

GAL1p-F:TAACTTCGAATTTTTTTCTTTTTATCTAAACATGGCATTACCACCATATACATATCCA(SEQ ID NO.7)；

GAL1p-P:CGTCAGCAACCTTCAACTTCCACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGG(SEQ ID NO.8)；

ADH1t-F:AGGCTTAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAA(SEQ ID NO.9)；

ADH1t-P:TAGAAGTGGTAGCAATATGTAGCAAAGAGGAGTTAGCATATCTACAATTGGGTGAA(SEQID NO.10)；

F1:TATTTCAGAAAAATTATTCAAAACTAAGAAGAATGAGATG(SEQ ID NO.11)；

P1:ATGGTGGTAATGCCATGTTTAGATAAAAAGAAAAAAATTCGAAGTTAATGTTGAAATTTC(SEQID NO.12)；

F2:TTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCTCTTTGCTACATATTGCTACCACTTCTATTAC(SEQID NO.13)；

P2:TGATAGAACGAGTACAACACCCGA(SEQ ID NO.14)。

将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码计曼尼醇合酶的基因、GAL1p启动子、ADH1t终止子、上游同源臂、下游同源臂和酵母基因表达附加型载体pRS426-308a共同转入酿酒酵母BY4742中，酵母基因表达附加型载体pRS426-308a携带有表达Cas9蛋白的基因以及gRNA，其会通过CRISPR/Cas9技术将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码计曼尼醇合酶的基因、GAL1p启动子、ADH1t终止子、上游同源臂和下游同源臂整合至酿酒酵母BY4742基因组的308a位点，得到转化产物(整合过程中，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码计曼尼醇合酶的基因、GAL1p启动子、ADH1t终止子、上游同源臂和下游同源臂会在酵母体内自行同源重组，形成由上游同源臂、GAL1p启动子、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码计曼尼醇合酶的基因、ADH1t终止子和下游同源臂依次连接而成的基因表达盒)；将转化产物涂布于SC-URA固体培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养48h，得到转化子；将转化子划线于YPD固体培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养48h后进行第一次菌落PCR验证(验证结果见图1)；取菌落PCR验证正确的转化子接种于10mL YPD液体培养基中，于30℃培养12h，得到菌液1；将菌液1按照2％(v/v)接种量转接至新鲜的10mL YPD液体培养基中，于30℃培养12h以消除质粒，得到菌液2；将菌液2划线于YPD固体培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养48h，得到单菌落；挑取单菌落同时在YPD固体培养基上(正常生长)和SC-URA固体培养基上(不生长)上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养48h后取YPD固体培养基上正常生长的菌落进行第二次菌落PCR验证(验证结果见图2)，验证正确，获得酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t。

实施例2：计曼尼醇的生产

具体步骤如下：

以酿酒酵母BY4742为对照，将实施例1获得的酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t在YPD固体培养基上划线，30℃培养48h，获得单菌落；将单菌落接种至10mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养12h，得到种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至50mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h，得到培养液；将培养液离心，收集菌体；将菌体全部转接至50mL的YPG液体培养基中，30℃、200rpm发酵48h，得到发酵液。

检测酿酒酵母BY4742和酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t发酵获得的发酵液中计曼尼醇的含量(检测结果见图3-4)。

由检测结果可知，酿酒酵母BY4742发酵获得的发酵液中检测不到计曼尼醇；酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t发酵获得的发酵液中计曼尼醇的含量为45.31mg/L。

对比例1：酿酒酵母工程菌的构建

具体步骤如下：

以来源于白梨的编码Pyrus x bretschneideri beta-amyrin synthase-like(NCBI Reference Sequence:XM_018650195.1)的基因(SEQ ID NO.15)为模板，通过密码子优化，设计并合成核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的编码计曼尼醇合酶的基因；以来源于月季花的编码Rosa chinensis beta-amyrin synthase-like(NCBI Reference Sequence:XM_024327323.1)的基因(SEQ ID NO.17)为模板，通过密码子优化，设计并合成核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的编码计曼尼醇合酶的基因。

在实施例1的基础上，将实施例1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码计曼尼醇合酶的基因分别替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的编码计曼尼醇合酶的基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的编码计曼尼醇合酶的基因，获得酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t1和酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t2。

对比例2：计曼尼醇的生产

具体步骤如下：

在实施例2的基础上，以实施例2的酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t作为对照，将实施例2的酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t分别替换为酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t1和酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t2，获得发酵液1～2。

检测发酵液1～2中计曼尼醇的含量(检测结果见图5)。

由检测结果可知，发酵液1～2中计曼尼醇的含量分别为1.12mg/L和3.45mg/L，远低于酿酒酵母工程菌BY4742/GAL1p-GES-ADH1t发酵获得的发酵液中计曼尼醇的含量(45.31mg/L)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一段基因及其在生产计曼尼醇中的应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtggaagc ttaaggtcgc agatgggggc aatgatccat acatctacag cacaaacaac 60

ttcgtgggaa ggcagatatt tgagtttgat cctgaagcag gaactactga agagagagct 120

gaggtggaag aagctcgtct tcatttctac aataaccgct atcaggttaa gcccagtggt 180

gacttcctat ggcgaatgca gttcctaagg gagaagaact ttaaacaaac aattccccca 240

attaaagttg aggatggaga ggaaatcaca catgaaaagg ccacagcttc attgagaagg 300

tctgtccact tcttttcagc gttgcaggct agcgatggcc attggcctgc cgaaaatgcc 360

ggcccgttgt ttttccttcc tcctttggta atgtgtgttt acattacagg gcatcttaac 420

actgtattcc atgcagaaca ccgtaaagaa attctgcgtt acatatacta tcatcagaac 480

caagatggtg gttggggatt acacattgaa ggacacagca ctatgttctg cacagctctc 540

agctacattt gtatgcgtat tcttggagaa ggacctgatg gtggccaaga caatgcttgt 600

gcaagagcta gaaagtggat tcttgatcat ggcagtgtta cccacatccc ctcatggggt 660

aaaacttggc tttcgatact tggtgtgttt gagtggtccg gaagcaaccc aatgccccca 720

gagttttgga ttctgccttc atttcttccc atgcatccag caaaaatgtg gtgctactgt 780

aggatggttt acatgcctat gtcatattta tatgggaaaa gatttgttgg tccaatcaca 840

cctctcatac tacaattaag ggaagaactc tatgctcagc cttatgacga aattaactgg 900

aagggagtgc gtcatcactg tgctaaagag gacatctact accctcatcc ttggatacag 960

gactttctat gggatagtct gtacatatgt acggagcctc ttcttactcg ctggccattt 1020

aacaagatga tcaggaaaag ggctctcgaa gtaacaatga agcacattca ttatgaagat 1080

gaaaacagca gatacattac cattggatgt gtcgaaaagg tgttatgcat gctggcttgt 1140

tgggctgaag acccaaatgg tgattatttt aaaaagcatc ttgccaggat accagattat 1200

ttatgggttg ctgaggatgg gatgaagatg caaagttttg gcagtcaaca gtgggatact 1260

ggttttgcca ttcaagcttt gcttgcttcc aatctaaccg atgaaatagc acccacactt 1320

gctagaggac atgacttcgt caagaaatcc caggttaagg acaatccatc gggtgacttc 1380

aaaagcatgc accgccacat ttccaaagga tcgtggactt tctctgatca agaccatgga 1440

tggcaagttt ctgattgcac tgcagagggt ttaaagtgtt gcctgctttt atcgatgatg 1500

ccaccggagc tggttggtga aaaaatggaa cctgagcggt tatacgatgc tgtcaatgtc 1560

ctaatttccc tgcagagtaa aaatggtggt ttagcagcct gggaaccagc tggagcagca 1620

gaatggttag aaatgttgaa tcccacggaa ttcttcgcgg acattgttgt tgagcatgaa 1680

tatgttgaat gcacttcatc agcaattcag gctttagttt tgtttaagaa gttgtaccct 1740

ggccacagga agaaagagat agatcaattt attaccaatg ctgcacagta ccttgaaaat 1800

atacaaatgg aagatggttc atggtacggg aattggggag tttgcttcac atatggtacc 1860

tggtttgctc ttggagggtt aacagctgct ggcaagactt tcaacaactg tgcagttata 1920

cgcaaagcta ttaattttct actcacaatc cagaaagaga acggtggttg gggagagagc 1980

tacctttcat gtccaaaaaa ggagtatgtt cctcttgaag gaaaccgatc aaatttagta 2040

cacacagctt gggctatgat gggtttgatt tatgcaggac aggccgaaag agaccccgca 2100

cctcttcatc gtgcagcaaa gttgataatg aactctcaga tggaaaatgg tgatttttct 2160

cagcaggaaa tcactggagt gttcaataag aattgtatgc tacattatgc agcttataga 2220

aacatctacc ccctgtgggc tcttgcagaa taccgcaagt gggttccatt gccttccaaa 2280

gcgtga 2286

<210> 2

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggattagaa gccgccgagc gggcgacagc cctccgacgg aagactctcc tccgtgcgtc 60

ctcgtcttca ccggtcgcgt tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa 120

caataaagat tctacaatac tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc 180

tggccccaca aaccttcaaa ttaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat 240

tagtttttta gccttatttc tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt 300

aacagatata taaatggaaa agctgcataa ccactttaac taatactttc aacattttca 360

gtttgtatta cttcttattc aaatgtcata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc 420

tctatacttt aacgtcaagg ag 442

<210> 3

<211> 188

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60

tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120

ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc 180

tctaccgg 188

<210> 4

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtggaagt tgaaggttgc tgacggtggt aacgacccat acatctactc tactaacaac 60

ttcgttggta gacaaatctt cgaattcgac ccagaagctg gtactactga agaaagagct 120

gaagttgaag aagctagatt gcacttctac aacaacagat accaagttaa gccatctggt 180

gacttcttgt ggagaatgca attcttgaga gaaaagaact tcaagcaaac tatcccacca 240

atcaaggttg aagacggtga agaaatcact cacgaaaagg ctactgcttc tttgagaaga 300

tctgttcact tcttctctgc tttgcaagct tctgacggtc actggccagc tgaaaacgct 360

ggtccattgt tcttcttgcc accattggtt atgtgtgttt acatcactgg tcacttgaac 420

actgttttcc acgctgaaca cagaaaggaa atcttgagat acatctacta ccaccaaaac 480

caagacggtg gttggggttt gcacatcgaa ggtcactcta ctatgttctg tactgctttg 540

tcttacatct gtatgagaat cttgggtgaa ggtccagacg gtggtcaaga caacgcttgt 600

gctagagcta gaaagtggat cttggaccac ggttctgtta ctcacatccc atcttggggt 660

aagacttggt tgtctatctt gggtgttttc gaatggtctg gttctaaccc aatgccacca 720

gaattctgga tcttgccatc tttcttgcca atgcacccag ctaagatgtg gtgttactgt 780

agaatggttt acatgccaat gtcttacttg tacggtaaga gattcgttgg tccaatcact 840

ccattgatct tgcaattgag agaagaattg tacgctcaac catacgacga aatcaactgg 900

aagggtgtta gacaccactg tgctaaggaa gacatctact acccacaccc atggatccaa 960

gacttcttgt gggactcttt gtacatctgt actgaaccat tgttgactag atggccattc 1020

aacaagatga tcagaaagag agctttggaa gttactatga agcacatcca ctacgaagac 1080

gaaaactcta gatacatcac tatcggttgt gttgaaaagg ttttgtgtat gttggcttgt 1140

tgggctgaag acccaaacgg tgactacttc aagaagcact tggctagaat cccagactac 1200

ttgtgggttg ctgaagacgg tatgaagatg caatctttcg gttctcaaca atgggacact 1260

ggtttcgcta tccaagcttt gttggcttct aacttgactg acgaaatcgc tccaactttg 1320

gctagaggtc acgacttcgt taagaagtct caagttaagg acaacccatc tggtgacttc 1380

aagtctatgc acagacacat ctctaagggt tcttggactt tctctgacca agaccacggt 1440

tggcaagttt ctgactgtac tgctgaaggt ttgaagtgtt gtttgttgtt gtctatgatg 1500

ccaccagaat tggttggtga aaagatggaa ccagaaagat tgtacgacgc tgttaacgtt 1560

ttgatctctt tgcaatctaa gaacggtggt ttggctgctt gggaaccagc tggtgctgct 1620

gaatggttgg aaatgttgaa cccaactgaa ttcttcgctg acatcgttgt tgaacacgaa 1680

tacgttgaat gtacttcttc tgctatccaa gctttggttt tgttcaagaa gttgtaccca 1740

ggtcacagaa agaaggaaat cgaccaattc atcactaacg ctgctcaata cttggaaaac 1800

atccaaatgg aagacggttc ttggtacggt aactggggtg tttgtttcac ttacggtact 1860

tggttcgctt tgggtggttt gactgctgct ggtaagactt tcaacaactg tgctgttatc 1920

agaaaggcta tcaacttctt gttgactatc caaaaggaaa acggtggttg gggtgaatct 1980

tacttgtctt gtccaaagaa ggaatacgtt ccattggaag gtaacagatc taacttggtt 2040

cacactgctt gggctatgat gggtttgatc tacgctggtc aagctgaaag agacccagct 2100

ccattgcaca gagctgctaa gttgatcatg aactctcaaa tggaaaacgg tgacttctct 2160

caacaagaaa tcactggtgt tttcaacaag aactgtatgt tgcactacgc tgcttacaga 2220

aacatctacc cattgtgggc tttggctgaa tacagaaagt gggttccatt gccatctaag 2280

gcttaa 2286

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tatttcagaa aaattattca aaactaagaa gaatgagatg ataagaaaaa cagttaccaa 60

tttagtagct gtaagattaa aaaacttatc ccacgaattt gatgtaatag agaattatct 120

gcgctatata gctagcacca gtgaacatct atttactgct attaagcgcc actttaacaa 180

atgtgccaga aaacttttga aagaagcaat cgactccaaa tcaaactcag aaactgctac 240

ggtggttctg caagaaggat tttctggcat ttgcttattg aaagcgtctt caattatatt 300

aaaactaaaa ttgaagtttc caaaaaagaa agatagaact gatattagca aattgtgtga 360

caagaaagaa cggatgacac agtggttaga aatttcaatt ttgatgaact gagaataata 420

atattatgct cccctggatt ttatgcgaag acactgctga aaaaatttct gatatatgca 480

gagaaggagc aaataagcca gttttaagga accgagataa gctgttttcg cccattgttc 540

tagttctaca aaatatctac agggaatcga tgaggttgta agaaatcctg aatactctat 600

gatagtgcat aacactaaaa agttgaaaga atcccgtatc atggacgatt tccttgaaca 660

tttgagcaaa gacgataaca aagcatggta tggcgcggaa gaaaccgaga gagctgcaaa 720

attagatgca atagaaacac tacttattac agatagtgta ctaaaaagga acgacgtgaa 780

aaaacgtgaa aaatacctag acctaataga gaatagtgga aacaacaatg gcaaaatatt 840

cgtactcagt acttcaaaaa tcacagtgag caacttgaca aaccaacaga tataggctgt 900

gtcttaaaat ataccatcca ataccttgat gaacttttca aagatgacta aaataagtga 960

aatttcaaca ttaacttcga atttttttct ttttatctaa 1000

<210> 6

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctttgctac atattgctac cacttctatt acacaatagt ttcaatagct tgcagcgtag 60

ctaaactcta aaatttatct aaatcactca tataaaccga acccttcccc ttccgcttat 120

agtacagtac ctatacattt cataaacatg gcatggcgat cagcgccaaa caatatggaa 180

aatccacaga aagctattca ttgaaaaaat agtacaaata agtcacatga tgatatttga 240

ttttattata tttttaaaaa aagtaaaaaa taaaaagtag tttattttta aaaaataaaa 300

tttaaaatat tagtgtattt gatttccgaa agttaaaaaa gaaatagtaa gaaatatata 360

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caatagaagt aataaagaaa aagttggtaa agcaacttaa cagtaaaaag gtaatgattg 480

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catgcctata cttttctgtt cgtccttaat gtccgcgatt tagagcaatc attgaaagta 600

ctagatacat tttagccaga gaggactcgt tgacgtagaa ttaaaattca aatgaatttc 660

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cacttgtcat gcggtgagaa tcgtatattg cgtataatcc gtgtttcatc acccacatta 840

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taacttcgaa tttttttctt tttatctaaa catggcatta ccaccatata catatcca 58

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtcagcaac cttcaacttc cacattatag ttttttctcc ttgacgttaa agtatagagg 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aggcttaagc gaatttctta tgatttatga tttttattat taaataagtt ataaaaaaaa 60

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tagaagtggt agcaatatgt agcaaagagg agttagcata tctacaattg ggtgaa 56

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tatttcagaa aaattattca aaactaagaa gaatgagatg 40

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atggtggtaa tgccatgttt agataaaaag aaaaaaattc gaagttaatg ttgaaatttc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttcacccaat tgtagatatg ctaactcctc tttgctacat attgctacca cttctattac 60

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgatagaacg agtacaacac ccga 24

<210> 15

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtggaagc ttaaggtcgc agatggtggc aatgatccat acatctacag cacaaacaac 60

ttcgtgggaa ggcagatatt tgagtttgac cctgaagcag gaactaccga agagcgagct 120

gaggtggaag aagctcgtct tcatttctac aacaaccgct accaggttaa gcccagtggt 180

gatctcctat ggcgaatgca gttcctaagg gagaagaact tcaaacagac aaatccccca 240

attaaagttg aggatggaga ggaaatcaca catgaaaagg ccacaacttc attgagaagg 300

tctgtccact tcttttcagc attgcaggct agcgatggcc attggcctgc cgaaaatgcc 360

ggcccattgt ttttccttcc tcctttggtt atgtgtgttc acattacaga gcatcttaac 420

actatatttc atgcagaaca ccgcaaagaa attctgcgtt acatatactg tcatcagaac 480

caagatggtg gttggggatt acacattgaa ggacacagca ccatgttctg cacagctctc 540

agctatattt gtatgcgtat tcttggagaa ggacctgatg gtggccaaga caatgcttgt 600

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gagttttgga ttctgccttc atttcttcct atgcatccag caaaaatgtg gtgttactgt 780

aggatggttt atatgcctat gtcatattta tatgggaaaa gatttgttgg tccaatcaca 840

cctctcatac tacaattaag ggaagaactc tatgctcagc cttatgacga aattaactgg 900

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gactttctgt gggatagtct gtacatatgt acggagcctc ttcttactcg ctggccattt 1020

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tgggctgaag atccaaatgg tgattatttt aaaaagcatc ttgccaggat accagattat 1200

ttatgggttg ctgaggatgg gatgaagatg caaagttttg gcagtcaaca gtgggatact 1260

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<210> 16

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgtggaagt tgaaggttgc tgacggtggt aacgacccat acatctactc tactaacaac 60

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tggcaagttt ctgactgtac tgctgaaggt ttgaagtgtt gtttgttgtt gtctatgatg 1500

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gcttaa 2286

<210> 17

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgtggaagc ttaaggttgc agaaggtggg gattcctcgg cttacattta cagcacaaac 60

aactttgtcg gaaggcagac atgggagttt gattcggatg caggaactcc tgaagagcga 120

gctgaggttg aagaggcccg tcttcatttc tacaacaacc gctatcaggt caagcccagt 180

ggtgacattc tttggcgtat gcagttccta agggagaaga agttcaaaca gacaattact 240

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cccccagagt tttggattct tccttcgttt cttcctatgc atccagcaaa aatgtggtgc 780

tattgtagga tggtttacat gccaatgtca tacctatatg gaaaaaggtt tgttggccca 840

attacacctc tcattcttaa attgagggag gaacttttta ttcaacctta caatcaaatc 900

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gaagatgaga acagtcgata cattaccatt gggtgtgtgg aaaaggtgtt atgtatgctt 1140

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gatactggtt ttgccattca agctttgctt gctactaatc taacggacga aattggaaca 1320

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gcagcagagt ggttagaact attaaatccg acagagttct tcgcagacat agtaattgag 1680

catgaatatg ttgagtgcac ttcatctgca atccaggctt tagtactgtt taagaagcta 1740

cacccaggac accggaagaa agagattgaa catttcatca ccaatgctat acactacctt 1800

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ccaacacctc ttcatcgtgc agcaaagttt ataattaatt ctcaaatgga aaatggtgat 2160

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tatagaaata tatacccact ctgggctctt gcagaatacc gcaagcgggt tccattgcct 2280

tcctag 2286

<210> 18

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgtggaagt tgaaggttgc tgaaggtggt gactcttctg cttacatcta ctctactaac 60

aacttcgttg gtagacaaac ttgggaattc gactctgacg ctggtactcc agaagaaaga 120

gctgaagttg aagaagctag attgcacttc tacaacaaca gataccaagt taagccatct 180

ggtgacatct tgtggagaat gcaattcttg agagaaaaga agttcaagca aactatcact 240

ccagttaaga tcgaagacgg tgaagttatc actcacgaaa agactactga cgctttgaga 300

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gctggtccat tgttcttctt gccaccattg gttatctgta tgtacatcac tggtcacttg 420

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gaatcttact tgtcttgtcc acaagaaact tacatcccat tggaaggtaa cagatctaac 2040

ttggttcaca ctgcttgggc tatgatgggt ttgatccacg ctggtcaagc tgaaagagac 2100

ccaactccat tgcacagagc tgctaagttc atcatcaact ctcaaatgga aaacggtgac 2160

ttcccacaac aagaaatcac tggtgttttc atgaagaact gtatgttgca ctacgctgct 2220

tacagaaaca tctacccatt gtgggctttg gctgaataca gaaagagagt tccattgcca 2280

tcttaa 2286

<210> 19

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ttgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagaacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

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gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380

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gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

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cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

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tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

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gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

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atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc tacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agac 4104

<210> 20

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accaaaccca 60

tacatcggga ttcctataat accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga 120

gatatacaat agaacagata ccagacaaga cataatgggc taaacaagac tacaccaatt 180

acactgcctc attgatggtg gtacataacg aactaatact gtagccctag acttgatagc 240

catcatcata tcgaagtttc actacccttt ttccatttgc catctattga agtaataata 300

ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca 360

tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca 420

gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt 480

tttccttcct tcattcacgc acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc 540

cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac 600

ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc attgttctcg ttccctttct tccttgtttc 660

tttttctgca caatatttca agctatacca agcatacaat caact 705

<210> 21

<211> 248

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacgtt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240

taatttgc 248

<210> 22

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 23

<211> 209

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agtatactct ttcttcaaca attaaatact ctcggtagcc aagttggttt aaggcgcaag 60

actgtaattt atcactacga aatcttgaga tcgggcgttc gactcgcccc cgggagagat 120

ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacaccttc gggtggcgaa 180

tgggactttc acttgtcaaa cagaatata 209

<210> 24

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tttttttatt ttttgtcact attgttatgt aaaatgccac ctctgacagt atggaacgca 60

aacttctgtc tagtggatag tcgac 85

Claims (10)

1.一段基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒携带权利要求1所述的基因。

3.如权利要求2所述的一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、权利要求1所述的基因以及终止子。

4.如权利要求3所述的一种基因表达盒，其特征在于，所述启动子为GAL1p启动子。

5.如权利要求3或4所述的一种基因表达盒，其特征在于，所述终止子为ADH1t终止子。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基因组整合有权利要求1所述的基因或整合有权利要求2-5任一项所述的基因表达盒。

7.如权利要求6所述的一种重组细胞，其特征在于，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为宿主细胞。

8.如权利要求7所述的一种重组细胞，其特征在于，权利要求1所述的基因或权利要求2-5任一项所述的基因表达盒整合于酿酒酵母BY4742基因组的308a位点。

9.一种生产计曼尼醇的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求8所述的重组细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有计曼尼醇的发酵液，然后将含有计曼尼醇的发酵液进行分离，获得计曼尼醇；所述重组细胞为权利要求2-5任一项所述的基因表达盒整合于酿酒酵母BY4742基因组的308a位点的重组细胞。

10.权利要求1所述的基因或权利要求2-5任一项所述的基因表达盒或权利要求6-8任一项所述的重组细胞或权利要求9所述的方法在生产计曼尼醇中的应用。

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