CN105194673A - 生长抑制特异性蛋白6（gas6）在治疗心肌肥厚中的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生长抑制特异性蛋白6（GAS6）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了GAS6的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明在发生心肌肥厚的模型中，GAS6的表达和正常组相比显著升高；抑制GAS6表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能，促进GAS6过表达则显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此，GAS6可作为药物靶标，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物；GAS6的抑制剂可用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

Description

生长抑制特异性蛋白6（GAS6）在治疗心肌肥厚中的功能及应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种生长抑制特异性蛋白6（Growtharrestspecific6，GAS6）在治疗心肌肥厚中的功能及应用。

背景技术

心肌肥厚是心肌对长期生物力学压力或容积负荷增加的代偿性反应，常见于高血压、主动脉瓣狭窄等心血管疾病，其主要表现为心肌细胞体积增大、蛋白合成增多、细胞外基质增多等特征[1-3]。高血压、老年退行性主动脉瓣疾病在我国呈逐年上升趋势。由高血压等疾病所致的心肌肥厚、高血压心脏病发病率也随之增加。尽管心肌肥厚最初可以使心肌细胞增大，心肌收缩力加强，是一种维持正常心输出量的代偿机制，但长期持续性的压力或容积负荷过重则会引起心肌重构，同时由于心肌需氧量增大，而冠状动脉血供相对不足，引起心肌缺血、心肌细胞凋亡，进而导致失代偿，从而引起心力衰竭、恶性心律失常、甚至猝死等[4,5]。研究表明随着心脏左室肥厚的发生发展，心肌缺血、室性心律失常、心力衰竭、猝死等心血管事件的发生率增加了6～10倍[6]。

目前认为心肌肥厚是一种多种因素参与调节的复杂的动态过程。研究发现长期的生物力学压力和/或容积负荷过度，使心室壁应力增加，导致心肌肥厚。此外，血管紧张素II（AngII）、内皮素（ET）、儿茶酚胺、转化生长因子-β（TGF-β）等各种胞外刺激信号可诱导核内基因表达的改变，从而导致心肌细胞肥大[7-11]。从分子水平上看心肌肥厚的病变过程分三个环节：胞外肥厚刺激信号的出现、胞内信号转导及核内基因转录活化，最终诱发细胞发生肥大表型变化。目前研究已经显示多种信号通路参与心肌肥厚的过程。其中，钙调神经磷酸酶calcineurin/NFAT、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路以及由这三条通路所调节的下游转录因子MCIP1.4、NF-κB、AP-1、MEF2、mTOR等在心肌肥厚的发生发展中起着重要作用[1,2,12-17]。钙调神经磷酸酶（calcineurin）是一种受钙离子及钙调素调节的多功能信号酶，可通过使活化T细胞核因子（nuclearfactorofactivatedTcells，NFAT）转位入核，调节核内肥大基因（ANP、BNP）的表达[18,19]。MAPK包括三个亚家族[20]：ERKs、JNKs和p38-MAPK。磷酸化的MAPKs激活促进与心肌肥厚有关的下游转录因子NF-κB、AP-1、MEF2、NFAT等的转录活性，而调节细胞基因转录和蛋白合成，引起心肌细胞肥大，导致心肌肥厚[20]。

Growtharrestspecific6（GAS6），GAS6是因其在饥饿的NIH3T3成纤维细胞中表达升高而被发现的[21]。GAS6是维生素K依赖性蛋白家族的成员，它在结构上与维生素K依赖性抗凝血酶蛋白S有44%的相似性[22]。GAS6在体内广泛表达，也表达于心脏中并在翻译后经过γ羧基化后迅速进入细胞外基质。GAS6在细胞外作为配体可与受体型络氨酸激酶TAM家族受体结合发挥生物学功能[23]。GAS6在细胞增殖、存活、血管稳态、动脉粥样硬化中的作用已经被广泛研究。GAS6主要通过激活体内ERK1/2，PI3K-AKT等信号通路发挥生理功能[24]。

参考文献：

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发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定GAS6的表达和心肌肥厚的相互关系，提供一种GAS6作为药物靶标在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚及其纤维化的药物中的应用，提供一个用于保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚和纤维化的靶基因GAS6的新用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过试验确定了GAS6表达与心肌肥厚之间的关系：

1、发生心肌肥厚时心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，GAS6的表达明显上调

本发明分别选用正常人和扩张型心肌病患者患者心脏，正常假手术（Sham）小鼠和通过主动脉弓缩窄手术（WT）造成心肌肥厚的小鼠心脏，以及分别通过对照组（PBS）、血管紧张素2（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞，分别检测了ANP、β-MHC、GAS6的蛋白表达情况。结果表明，扩张型心肌病患者和发生心肌肥厚的小鼠心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，GAS6的表达明显上调，同样在经血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞中ANP、β-MHC的表达也明显上调，GAS6的表达明显上调（图1、图2、图3）。

2、GAS6干扰（AdshGAS6）及过表达（AdGAS6）腺病毒对经AngII诱导的心肌细胞肥大模型的影响

本发明发现在经血管紧张素II（AngII）诱导的体外心肌肥厚模型中，GAS6过表达心肌细胞出现明显肥大，GAS6不表达心肌细胞的肥大明显被抑制（图4）。

3、GAS6基因敲除显著抑制了心肌肥厚、纤维化的程度，保护心功能；GAS6基因过表达显著促进了心肌肥厚及其纤维化的程度，恶化心功能

本发明选用野生型小鼠、GAS6基因敲除小鼠及心脏特异性GAS6转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究GAS6基因敲除/过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除GAS6基因所致的GAS6缺陷显著抑制心肌肥厚、纤维化，保护心功能；过表达GAS6基因显著恶化心肌肥厚、纤维化以及心功能（图5-12）。

由以上结果可知发生心肌肥厚时，GAS6表达上调，GAS6基因缺陷抑制了心肌肥厚及其纤维化，保护心功能，GAS6基因过表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此，GAS6基因可作为药物靶点，构建GAS6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物；GAS6基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的目的。例如以GAS6为靶基因，设计可干扰GAS6表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使GAS6基因沉默来治疗心肌肥厚疾病；还可以设计并构建GAS6的突变体，注射后进入细胞，竞争GAS6原形的作用底物，从而抑制GAS6的功能，起到治疗目的；此外，还可以以GAS6为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用GAS6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制GAS6的分子，从而为心肌肥厚的治疗提供新的治疗性分子。

针对GAS6的上述功能，提供GAS6作为药物靶标在筛选保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及其纤维化的药物中的应用。

针对GAS6的上述功能，提供GAS6的抑制剂在制备保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及纤维化的药物中的应用。

一种保护心脏功能的药物，包含GAS6的抑制剂。

一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及纤维化的药物，包含GAS6的抑制剂。

所述的GAS6的抑制剂具有本领域公知的含义，其可以是能够特异抑制GAS6对靶基因的调控作用的任何物质，可以是在细胞中特异抑制GAS6表达的物质，也可以是与GAS6具有特异性相互作用的物质。优选为GAS6基因的siRNA、GAS6基因的RNA干扰载体，GAS6的抗体及其他能够抑制GAS6表达的抑制剂中的一种。

一种筛选用于保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及其纤维化的药物的方法，为筛选GAS6的抑制剂的方法，包括根据GAS6的序列设计其反义RNA，或者将GAS6与候选物质接触，检测GAS6的表达，并选择特异抑制GAS6表达的候选物质。

本发明具有如下有益效果：

本发明发现了GAS6基因的新功能，即GAS6能够恶化心脏功能和促进心肌肥厚及纤维化的作用。因此，GAS6可作为药物靶标，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物；GAS6的抑制剂可用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

附图说明

图1是正常人和扩张性心肌病（扩心病）患者心脏中ANP、β-MHC、GAS6的蛋白表达情况及统计柱状图，扩心病患者心脏GAS6的表达上调（*：p＜0.05vs正常人组）。

图2是野生型小鼠在假手术（Sham）和主动脉弓缩窄手术（AB）后心脏中ANP、β-MHC、GAS6的表达情况及统计柱状图，GAPDH作为内参，其中4W表示4周，8W表示8周；发生心肌肥厚的心脏GAS6的表达上调（*：p＜0.05vs野生型小鼠Sham组）。

图3是体外培养乳鼠原代心肌细胞中对照组（PBS）和血管紧张素II（AngII）、苯肾上腺素（PE）刺激后ANP、β-MHC、GAS6的蛋白表达情况及统计柱状图，GAPDH作为内参，AngII、PE刺激后GAS6表达上调（*：p<0.05vsPBS组）。

图4是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshGAS6、AdGFP和AdGAS6感染，经AngII刺激后的免疫荧光及细胞表面面积统计柱状图，GAS6的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大，GAS6的过表达腺病毒促进心肌细胞肥大（*：p＜0.05vsPBS组，#：p＜0.05vsAngII组）。

图5是野生型小鼠（WT）和GAS6基因敲除小鼠（KO）AB术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；HW为心脏质量，BW为体重，LW为肺脏总量，TL为胫骨长度（*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组）。

图6是野生型小鼠（WT）和GAS6基因敲除小鼠（KO）AB术4周后心室横截面以及心脏组织HE染色、WGA染色和心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05vsWTSham组，#p＜0.05vsWTAB组）。

图7是野生型小鼠（WT）和GAS6基因敲除小鼠（KO）AB术4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图（*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组）。

图8是野生型小鼠（WT）和GAS6基因敲除小鼠（KO）AB术4周后心功能检测结果的统计柱状图；LVEDd为左室舒张末期内径，LVESd为左室收缩末内径，FS为短轴缩短率（*：p＜0.05vsWTSham组，#：p＜0.05vsWTAB组）。

图9是NTG和TG小鼠AB术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图10是NTG和TG小鼠AB术4周后心室横截面以及心脏组织HE染色、WGA染色和心肌细胞横截面积统计柱状图（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图11是NTG和TG小鼠AB术4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图12是NTG和TG小鼠AB术4周后心功能检测结果的统计柱状图；LVEDd为左室舒张末期内径、LVESd为左室收缩末内径、FS为短轴缩短率（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的野生型小鼠（WT）、全身性GAS6基因敲除小鼠（KO）、心脏特异性GAS6转基因小鼠（TG）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

（1）全身性GAS6基因敲除小鼠的构建：

利用CRISPR-Cas9技术构建全身性GAS6基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）预测小鼠GAS6的引导序列，设计2条单链oligo：

oligo1：TAGGAGCACACAAGGTCAATAC，

oligo2：AAACGTATTGACCTTGTGTGCT。

oligo1和oligo2退火形成双链DNA，将双链DNA连入经BsaI酶切的pUC57-sgRNA（Addgene51132）构建sgRNA表达载体。

以上述构建的sgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段：

Forwardprimer：TAGGGTTATCGAGGTTCATGACGCC，

Reverseprimer：AAACGGCGTCATGAACCTCGATAA。

以所扩增的PCR产物为模板使用MEGAshortscriptKit（Ambion，AM1354）进行体外转录；Cas9质粒（Addgene44758）通过T7Ultrakit（Ambion，Am1345）进行转录。将转录得到的Cas9和引导序列RNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit（Qiaen，217084）纯化后，通过FemtoJet5247显微注射***注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内。选取经显微注射后存活的受精卵，将其移植到健康雌鼠输卵管中，经过21天妊娠之后得到F0代小鼠。

F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定，野生型小鼠包含一段长2.2kb的DNA序列，而突变小鼠（GAS6基因敲除小鼠）含有630bp的DNA序列，最终蛋白产物通过westernblot进行检测鉴定。其中，PCR鉴定引物如下：

GAS6-F：5’-GAAGCAGGCACAGCTTATCC-3’，

GAS6-R：5’-TTCCCCTCATGAATCCACTC-3’。

实验所用小鼠为突变体纯合子。

（2）心脏特异性GAS6转基因小鼠的构建：

以野生型C57BL/6小鼠GAS6基因cDNA（OpenBiosystems，MMM4769-202762692）为模板，用如下引物PCR扩增小鼠GAS6全长基因（NCBI，GAS6mus，GeneID：14456）：

上游引物：CTAGCTAGCGCCACCATGCCGCCACCGCCCGGG，

下游引物：AGCTTTGTTTAAACCTAGGGGGTGGCATGCTC。

扩增的GAS6全长基因及pCAG-loxP-CAT-loxP质粒（pCAG-loxP-CAT-loxP质粒由北京协和医学院基础学院杨青林老师提供，制备过程参见文献：KimT,ZhelyabovskaO,LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors(PPARs),57.）经PmeI（NEB，#R0560L）和NheI（NEB，#R0131L）双酶切后连接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-GAS6-hGHpA载体（CAG(chickenbeta-actin)-CAT(chloramphenicolacetyltransferase)-GAS6-hGHpA），将构建的质粒通过显微注射***注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内，该受精卵移植入健康雌鼠中，发育得到F0代小鼠。将得到的F0代小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交，并通过他莫昔芬诱导（他莫昔芬80mg/kg/天，腹腔注射，连续刺激5天）得到心脏特异性GAS6转基因老鼠（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：JiangDS,BianZY,ZhangY,ZhangSM,LiuY,ZhangRetal.Roleofinterferonregulatoryfactor4intheregulationofpathologicalcardiachypertrophy.Hypertension2013;61:1193-1202.）。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在SPF级实验动物中心，SPF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1GAS6在正常人和心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏（非心脏原因的死亡捐献的个体）、扩张型心肌病患者心脏（做心脏移植手术病人置换的受体），对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识GAS6蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP（Millipore，AB2232）、β-MHC（santacruz，sc53090）的抗体进行检测，测定其GAS6（santacruz，SC-1935）的表达，GAPDH（CellSignalingTechnology，2128）作为内参。检测结果如图1所示，扩张型心肌病患者心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，GAS6的表达明显上调（图1）。

实施例2GAS6在野生型小鼠假手术组和心肌肥厚模型组心脏中的表达

1.采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型，模型操作流程：

1.1术前准备

（1）麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准（一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间）。

（2）术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

（3）气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确***气管内，随后右侧卧位置于加热垫上（加热垫需提前预热），然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

1.2主动脉弓缩窄术（AB）

AB术心肌肥厚（AB）模型组：取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G（25.0-27.5g小鼠）或者27G（23.5-25.0g）注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处***胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。

假手术组（Sham）在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同AB术心肌肥厚模型组。

1.3术后护理

手术中主动脉弓降支结扎后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

2.取材

打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80℃冰箱保存后用于分子生物学检测。

3.GAS6在Sham组小鼠和心肌肥厚模型组小鼠心脏中的表达

分别选野生型小鼠Sham组和心肌肥厚模型组AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别GAS6蛋白及心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的抗体进行检测，测定其GAS6的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图2所示，心肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、β-MHC的表达明显上调，GAS6的表达在AB术后明显上调。表明发生心肌肥厚的心脏GAS6的表达上调。

实施例3GAS6在对照组（PBS）或血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞中的表达

分离培养新生1天Sprague-Dawley乳鼠心肌细胞，培养原代心肌细胞48h后换液（原代新生SD大鼠心肌细胞培养的具体过程见下述实施例4），加入无血清的DMEM/F12饥饿心肌细胞12h使细胞同步化后，分别给予PBS、血管紧张素II（AngII，1μM）、苯肾上腺素（PE，1μM）刺激48小时，对心肌细胞提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别GAS6蛋白及心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的抗体进行检测，测定其GAS6的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图3所示，经血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞中ANP、β-MHC的表达明显上调，GAS6的表达明显上调。

实施例4GAS6干扰（AdshGAS6）及过表达（AdGAS6）腺病毒对AngII刺激的原代心肌细胞肥大的影响

1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

（1）新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75%酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mLDMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

（2）用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm³的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

（3）加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

（4）将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

（5）将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu（终浓度0.1mM），混匀之后，加入到用0.1%明胶包被的器皿中。

（6）轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5%CO₂孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2.GAS6干扰（AdshGAS6）及过表达（AdGAS6）腺病毒对经AngII诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA（含shRNA（沉默RNA）的腺病毒，用作对照）、AdshGAS6（含shRNA-GAS6（沉默RNA-GAS6融合蛋白）的腺病毒）、AdGFP（含GFP（绿色荧光蛋白）的腺病毒，用作对照）及AdGAS6（含GFP-GAS6（绿色荧光蛋白-GAS6融合蛋白）的腺病毒）（这些腺病毒的构建过程参见文献：ChenK,GaoL,LiuY,etal.Vinexin-βprotectsagainstcardiachypertrophybyblockingtheAkt-dependentsignallingpathway[J]. BasicResCardiol ,2013,108(2):1-14.）腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II（AngII）（购自Sigma公司，A9525）或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明AdshGAS6腺病毒感染后的心肌细胞表面面积较AdshRNA对照组减少，而经AdGAS6腺病毒感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP明显增加（图4）。即GAS6的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大，GAS6的过表达腺病毒促进心肌细胞肥大。

实施例5心肌肥厚模型小鼠心肌肥厚及纤维化检测和心功能检测

1.采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g的野生型小鼠（WT）、GAS6基因敲除小鼠（KO）、心脏特异性GAS6转基因小鼠（TG）及非转基因小鼠（NTG）各分成假手术组（Sham）和AB术心肌肥厚模型组，即WTSham组、WTAB组，KOSham组、KOAB组，TGSham组、TGAB组，NTGSham组、NTGAB组，每组10只小鼠。造模方法同实施例2。AB术后4周分别进行心肌肥厚及纤维化的检测和心功能的检测。

2.取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满质量分数10%KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10%KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL）。

3.病理学检测

3.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

3.2苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-ProPlus6.0软件圈细胞面积。

3.3麦胚凝聚素（WGA）染色

主要步骤：将经60℃烘烤30min的石蜡标本切片置于二甲苯5min×3次→100%乙醇5min×2次→95%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水漂洗5min×2次→PBS漂洗5min→PBS漂洗10min→弃去PBS，滴加胰酶工作液（DIG-3008，福州迈新）37℃避光孵育20min→PBS漂洗5min×3次→取出切片，用滤纸擦干组织周围的液体（组织切勿干燥），用组化笔划圈平放于湿盒中→滴加WGA-AlexaFlour488工作液（10μg/mL）37℃避光孵育2h→弃去染液，PBS漂洗5min×3次→SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI封片→荧光镜下观察，显微镜拍照。

3.4天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计（Image-ProPlus6.0软件）：胶原比例=胶原面积/（总面积-空白面积）×100%。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

WT及KO小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果见图5-7。Sham（假手术）组中WT及KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL的上升程度均小于WT小鼠AB组（图5）。HE染色及WGA染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，GAS6-KO小鼠的心脏明显小于WT组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，WT小鼠则比KO小鼠细胞肥大明显，差异有统计学意义（图6）。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；KO小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB术后增加较少（图7）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，KO小鼠的心肌肥厚程度及纤维化程度小于WT小鼠。

图9-11是NTG和TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果。AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显大于NTG小鼠（图9）。HE染色及WGA染色切片可观察到：AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远大于NTG小鼠；TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积显著大于Sham组与NTG小鼠AB组（图10）。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量大于NTG小鼠AB组（图11）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度大于NTG小鼠。

4.超声检测心功能

4.1前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

4.2心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂（天津成信公司）。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室***肌短轴切面，测量左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）及短轴缩短率（FS）。

图8是WT和KO小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的心功能检测结果。与WTSham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，KO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度小于WT小鼠。

图12是NTG和TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的心功能检测结果。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则大于NTG组。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，GAS6基因缺陷显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能，GAS6基因过表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此GAS6基因具有恶化心功能和促进心肌肥厚及纤维化的作用，特别是GAS6基因具有能够促进主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.GAS6作为药物靶标在筛选保护心脏功能的药物中的应用。

2.GAS6作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及纤维化的药物中的应用。

3.GAS6的抑制剂在制备保护心脏功能的药物中的应用。

4.一种保护心脏功能的药物，其特征在于：包含GAS6的抑制剂。

5.GAS6的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及纤维化的药物中的应用。

6.一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及纤维化的药物，其特征在于：包含GAS6的抑制剂。

7.根据权利要求3或5所述的应用、权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的GAS6的抑制剂是能够特异抑制GAS6对靶基因的调控作用的任何物质。

8.根据权利要求3或5所述的应用、权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的GAS6的抑制剂是在细胞中特异抑制GAS6表达的物质或与GAS6具有特异性相互作用的物质。

9.一种筛选用于保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及其纤维化的药物的方法，其特征在于：为筛选GAS6的抑制剂的方法。

10.根据权利要求9所述的方法：其特征在于：包括根据GAS6的序列设计其反义RNA，或者将GAS6与候选物质接触，检测GAS6的表达，并选择特异抑制GAS6表达的候选物质。