CN106546724A

CN106546724A - 一种分子信标探针快速检测赭曲霉毒素a的新方法

Info

Publication number: CN106546724A
Application number: CN201510612538.2A
Authority: CN
Inventors: 杨美华; 豆小文; 褚先锋; 孔维军
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明涉及一种分子信标探针快速检测赭曲霉毒素A的新方法，针对特异性识别OTA的DNA关键位点，设计了茎部6个互补碱基，环部8个碱基的分子信标。所述的分子信标序列为：5＇-FAM-CCGGGTCCACCCACACCCGG-DABCYL-3＇，本探针性质稳定且易于合成，用于样品分析操作简单，20min内即可完成检测，准确度好，灵敏度高，可用于麦芽和啤酒等样品中的赭曲霉毒素A的快速筛查。

Description

一种分子信标探针快速检测赭曲霉毒素A的新方法

技术领域

本发明涉及一种用分子信标探针检测赭曲霉毒素A(OTA)的新方法，特别是涉及针对特异性识别OTA分子的核苷酸序列Apt，人工设计分子信标探针MB，利用竞争结合Apt，适用于麦芽、啤酒等样品中OTA的定量检测，属于真菌毒素快速检测领域。

背景技术

麦芽，系禾本科植物大麦Hordeum vulgare L.的成熟果实经发芽干燥而成，广泛分布于我国各地。由于其极高的营养价值，不仅是酿造啤酒的绝好原料，而且也作为中药材在临床医疗保健中发挥着极其重要的作用。麦芽的生长需经淋水湿润，低温烘干，贮藏要求干燥低温条件，对环境要求颇为苛刻，一旦处理不当极易滋生霉菌，其类似于谷物类作物，尤其易受到赭曲霉毒素A的污染。赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)是一种主要由赭曲霉、碳黑曲霉和纯绿曲霉等产生的有毒次级代谢产物，具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫毒性等，故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。鉴于OTA的强毒性，以及全球污染的广泛性，欧盟(EU)规定谷物中OTA的含量不得超过5μg·kg^-1，并且欧洲食品***(EFSA)规定人类每周OTA的摄入量不得超过0.12μg·kg^-1。我国GB 13078.2-2006要求谷物及其制品、豆类及其制品的OTA最高限量为5μg·kg^-1。麦芽还是啤酒酿造的原材料，欧盟对啤酒中OTA也作出了严格的限量标准(2μg·L^-1)，然而，近年来屡屡报道OTA污染啤酒的事件发生。因此，建立一种灵敏、快速、准确且适合现场检测的方法，以有效监控麦芽和啤酒中的OTA污染水平，确保麦芽和啤酒的品质以人类健康安全则尤为重要。

目前OTA监测主要依赖于液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)和超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)，其检测精度固然高，但耗资昂贵，且需多步前处理，费时费力。为了满足需求，基于适配体的OTA快速检测成为当前研究热点。

适配体(Aptamer)是一类新型生物识别分子，具有分子量小、可化学合成、稳定性好等优势。分子信标(molecular beacon，MB)则是一种茎环结构的适配体序列，其发卡结构的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，环状结构为识别区，自然条件下，发卡结构的两端相互靠近荧光基团受淬灭基团作用，不产生荧光。当存在一段互补序列，能识别环状结构，则造成发卡结构的两端原理，荧光基团恢复荧光。针对能特异性识别靶物质的适配体序列人工设计MB，通过竞争结合适配体序列产生荧光强度的变化，建立灵敏度高、选择性好、抗基质干扰能力强的荧光生物探针，已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。

发明内容

截至目前，国内外报道的基于适配体检测OTA的方法多采用比色法、荧光标记，电化学法，尚未见单分子信标报道应用于OTA检测，尤其是中药麦芽检测中。本发明的目的在于人工设计一种分子信标探针，建立基于分子信标的超灵敏荧光检测OTA水平的方法及应用。

本发明具体实施方法为：对照组，适配体Apt与分子信标MB反应，产生荧光强度F₀；测试组，适配体Apt与OTA反应后，加入分子信标MB，荧光强度为F。计算荧光强度比F/F₀，由于F/F₀与OTA水平呈正相关，以OTA的浓度水平对F/F₀作图，可求得线性方程。因此，根据荧光强度比值可定量检测实际样品OTA污染水平。其优点在于适配体Apt能特异性识别OTA，选择性好，抗基质干扰能力强，设计的分子信标MB探针，能成功与适配体Apt结合后开环，又能成功闭环，保障准确灵敏的监测OTA的水平，将MB探针和适配体Apt结合，建立一种超灵敏的快速检测OTA的方法，具有广阔的开发前景。

技术解决方案

本发明采用的技术方案是：人工设计合成分子信标MB；基于分子信标MB探针，考察影响本法检测的因素如反应时间；在最佳检测条件下，建立对照组和测试组，分别测定荧光强度；计算荧光强度比，对该检测进行方法学验证；将建立的方法应用于实际样品检测，并与LC-MS/MS检测结果进行对比，以进一步确证该方法的可行性。

技术要点：

(1)设计分子信标MB探针，按照下述步骤进行：

a.识别OTA适配体序列的选择：文献研究表明通过SELEX技术筛选所得的Apt(5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′)与OTA的亲和作用能力强，其核酸序列与OTA的解离常数K_d可低至50nM。此外，该适配体能高度特异性识别OTA，选择性好。基于适配体用于OTA的检测原理见图1。

分子信标探针检测原理见图1

b.MB序列的设计：MB核酸序列需要遵循的原则包括：①环状一般由15～30个核苷酸组成，是与靶适配体特异结合的关键位点；②信标的茎干通常为5～8个核苷酸的互补序列，形成发卡结构；③信标茎干的5′修饰荧光基团(如TMR、FAM、QDs等)，3′修饰猝灭基团(如Dabcyl、AuNPs)。文献报道5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG GAGCATCGGACA-3′划线部位属于OTA的关键识别位点，根据该序列以及上述MB设计原则，我们设计并合成了本实验用分子信标序列5′-FAM-CCGGGTCCACCCACACCCGG-DABCYL-3′，利用该分子信标探针进行OTA的检测的可行性见图2。

分子信标检测可行性考察见图2

c.竞争方式考察：第一种将分子信标MB和适配体Apt反应之后，加入待测物OTA，测定荧光强度，平行制备不加入OTA的对照组，测定荧光强度，计算荧光强度比。第二种将适配体Apt与OTA反应之后，加入MB探针，测定荧光强度，同样平行制备不加入OTA的对照组，计算荧光强度比。考察两种方式的荧光强度比随反应时间的变化，确定最佳的竞争检测方式，见图3。

竞争方式的考察见图3

d.反应时间的考察：将适配体Apt与待测物OTA混合，通过考察不同反应时间(5，10，15，20，30，40，50，60min)条件下，加入分子信标探针后荧光强度的变化，从而确定最佳反应时间见图4；

反应时间优化见图4

e.选择性及抗基质干扰考察：选取OTA结构类似物(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2，ZAN，ZON，CIT，DON，FB1，FB2)考察本法的选择性，以麦芽和啤酒为研究对象，考察空白麦芽提取物和啤酒对适配体和分子信标检测的影响，通过考察荧光强度的变化，验证本法的选择性和抗基质干扰能力，结果见图5。

选择性和抗基质干扰考察见图5

(2)分子信标探针检测方法学考察：

标准曲线和范围：制备不同浓度的待测物OTA溶液，以浓度对荧光强度比作图，建立检测OTA的标准曲线，并确定线性范围，见图6；以荧光强度比0.95，测定MB探针检测OTA的检测限；对麦芽和啤酒的空白样品中分别平行加标计算本法检测的回收率，回收率考察结果采用LC-MS/MS方法进行验证。

OTA标准曲线见图6

(3)该MB探针实际应用性考察-检测市售样品中OTA的污染水平。

该检测技术的优点在于：适体能够与复杂基质中痕量的OTA特异性结合，选择性和抗基质干扰能力强，避免了常规分析中繁冗的前处理过程；采用本法灵敏度高，准确性好，无需大型仪器，适合现场分析；该方法操作简便易行，能够满足过程监控的需求。

附图说明：

图1为分子信标探针检测原理示意图

图2为分子信标检测可行性考察图

图3为反应时间优化见图

图4为竞争方式考察图

图5为选择性和抗基质干扰考察图

图6为OTA标准曲线图

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。

溶液配制：

1、适配体溶解液(TE缓冲液，pH8.0)

①1M Tris-HCl(pH 8.0)50mL的配制：称取Tris碱6.06g，加超纯水40mL溶解，滴加浓HCl约2.1mL调pH至8.0，定容至50mL；

②0.5M EDTA(pH 8.0)50mL的配制：称取EDTA-Na₂·2H₂O 9.306g，加超纯水35mL，剧烈搅拌，用约1g NaOH调节pH至8.0，定容至50mL(EDTA二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时，才会溶解)；

③1×TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0)的配制：移取1M Tris-HCl(pH 8.0)1mL和0.5M EDTA(pH 8.0)0.2mL，加超纯水定容至100mL。

2、退火缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mM NaCl，1mM EDTA。

3、检测缓冲溶液：10mM Tris-HCl(pH 8.5)，120mM NaCl，5mM KCl，20mM CaCl₂。

实施例1：检测条件的选择

(1)准备过程：

a.适配体Apt溶液的制备：取2.7nmol的适配体溶解于270μL适配体溶解液中(10mMTris-HCl，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0)，备用；

b.分子信标MB溶液的制备：取5.4nmol的适配体加入540μL退火溶解液(50mM NaCl，1mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH 8.0)，95℃复性3min，室温放置30min，使其缓慢降温至室温。

(2)最佳检测条件的选择：

a.竞争方式：

①试验组：精密移取检测液350μL，分别加入50μL的10μM Apt溶液和10μM MB溶液，反应2min，加入1μg·mL^-1OTA溶液50μL，记录荧光强度：对照组：精密移取检测液350μL，分别加入50μL的10μM Apt溶液和10μM MB溶液50μL，反应2min，加入检测液50μL，记录0～60min内的荧光强度；

②精密移取检测液350μL，分别加入50μL的10μM Apt溶液和1μg·mL^-1OTA溶液，反应15min，加入10μM MB溶液50μL，记录荧光强度；对照组：精密移取检测液350μL，分别加入50μL的10μM Apt溶液和检测液，放置15min，再加入10μM MB溶液50μL，反应2min，加入检测液50μL，记录0～60min内的荧光强度；

实验考察结果显示，竞争方式②条件下，OTA的加入，引起荧光强度的变化更灵敏，有助于提高本法的检测灵敏度，OTA与Apt优先反应，剩余的Apt与MB反应，更有利于实现痕量OTA测定。

b.反应时间的考察：分别精密移取适配体Apt与OTA 50μL室温下反应5，10，15，20，30，40，50，60min后，再加入MB，反应2min测定荧光强度，平行制备对照组，考察F/F₀随反应时间测变化，确定15min为最佳反应时间；

c.选择性及抗基质干扰考察：①分别将Apt与4种AF总、ZAN、ZON、CIT、DON、FB1、和FB2反应15min，加入MB，记录荧光强度，平行制备对照组。结果显示Apt对OTA的结构类似物没有识别能力，进一步将类似物与OTA混合后，与Apt反应，结果显示，OTA结构类似物不干扰OTA的检测。②制备麦芽和啤酒的空白提取液，将Apt分别与提取物和OTA-提取物混合物反应，结果显示基质不干扰OTA的检测。

实施例2：MB探针检测麦芽和啤酒中的OTA

1.样品提取：

麦芽样品：准确称取麦芽粉末(过二号筛)2.0g(精确至0.1g)，加入5mL乙腈-水(80∶20，v/v)溶液，涡旋辅助提取1min，超声提取5min后，4000rpm下离心10min。精密上清液1mL，加入检测液稀释至10mL，混匀，过022μm滤膜，取续滤液即得。

啤酒样品：将市售的罐装啤酒，开盖，超声除气，精密量取10mL置于100mL容量瓶，加检测液定容至刻线，混匀，过0.22μm滤膜，取续滤液即得。

2.荧光检测条件：F7000荧光分光光度仪(日立公司，日本)。仪器参数设置包括激发波长495nm，发射波长500-630nm；扫描速度240nm/s；增益电压400V；狭缝宽度5nm，数据采集间隔0.2nm。

3.液质确证条件：

色谱条件：Prominence UFLC-20A超高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SHISEIOCAPCELL CORE C18色谱柱(50mm×2.1mm，2.7μm)；流动相为0.1％甲酸乙腈(A相)-0.1％甲酸水溶液(B相)，梯度洗脱，0～4min，70％～40％B；4～5min，40％～5％B；5～7min，5％B；7～8min，5％～70％B；8～10min，70％B；流速0.3mL·min^-1；柱温25℃；进样量2μL。

质谱条件：AB SCIEX QTRAP 5500质谱仪(美国AB应用生物***公司)配备Analyst 1.6.2数据采集及处理软件，离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为多反应离子监测；碰撞气(CAD)为Medium；雾化气(Gas 1)为50Psi；辅助加热气(Gas 2)为50Psi；气帘气(CUR)为35Psi；离子源温度(TEM)为550℃；喷雾电压(IS)为+5500V。两对定性定量监测离子对分别为m/z 404.2→239.1和m/z 404.2→358.0用来确证OTA，碰撞能分别为30和26eV。

4.方法学考察

a.标准曲线：精密移取OTA储备液1mg·mL^-1，加入检测液，配制系列浓度(1，0.1，0.01，0.001，0.0001μg·mL^-1)的OTA标准品溶液，以不加OTA的空白溶液为对照，计算相对荧光强度，以荧光强度比值为纵坐标，OTA标准品浓度为横坐标，进行线性拟合，得到标准曲线F/F₀＝-0.17502LogC+0.27383，相关系数R²＝0.984，表明在0.0001～1μg·mL^-1范围内，线性关系良好。

b.检测灵敏度：以LOD(最低检测限)为荧光抑制率5％(即F/F₀×100＝95％)时OTA的浓度，可得MB探针检测OTA的LOD为0.05ng·mL^-1，表明该法灵敏度高。

c.加标回收试验：准确称取不含OTA的麦芽样品，按照250μg·kg^-1，25μg·kg^-1和5μg·kg^-1的浓度水平添加OTA标品，混匀静置30min，按照样品提取方法处理，采用MB探针检测，每个浓度水平重复三次，测定结果见表1，三个水平的回收率为81.0％-95.2％，其RSD低于5.4％，表明该法用于麦芽测定准确度好。分别精密移取空白啤酒样品9份，按照100μg·L^-1，10μg·L^-1和2μg·L^-1三个水平添加OTA标品，混匀，按照样品制备方法处理，采用MB探针检测，每个浓度水平重复三次，测定回收率在83.7％-97.6％，RSD为4.3％-6.2％，表明该法准确度好，重复性满足要求。

加标回收样品，同时采用LC-MS/MS方法进行验证，结果见表1，测定回收率在(92.5％-117.7％)范围内，RSD低于3.6％，该结果进一步验证了MB探针检测OTA新方法的准确度。

表1分别采用本法和LC-MS/MS方法测定加样回收率结果(n＝3)

d.样品测定：运用上述建立的探针方法对2批OTA污染的麦芽样品进行了测定，每个样品平行测定三次，检测结果表明该2批麦芽中OTA污染水平分别为4.48±0.24μg·kg^-1和6.28±0.31μg·kg^-1。基于MB探针的快速筛查方法，所需样量少，操作简便，快速灵敏，能应用于实际样品检测。

Claims

1.一种分子信标MB探针用于样品中的OTA检测的技术，其特征在于：

针对特异性识别OTA的DNA关键位点，设计了茎部6个互补碱基，环部8个识别碱基的，5’标记FAM，3’标记DABCYL的分子信标，所述的分子信标序列为：

5'-FAM-CCGGGTCCACCCACACCCGG-DABCYL-3’。

2.根据权利要求1所述的OTA的分子信标MB探针，其特征在于：

(1)采用荧光检测手段，激发波长495nm，发射波长500-650nm，检测波长520nm。

(2)所述适配体Apt和分子信标浓度均为10μM。

(3)检测缓冲液：10mM Tris-HCI(pH 8.5)，120mM NaCl，5mM MgCl₂，20mM CaCl₂。

(4)MB探针检测，最佳竞争方式Apt与OTA反应15min，再加入MB，记录荧光强度。

3.以该MB为荧光探针，快速检测OTA的方法，其特征在于：

(1)对照组：吸取检测液350μL，分别加入50μL的Apt和检测液，加入OTA溶液50μL，记录荧光强度F₀。

(2)实验组：精密移取检测液350μL，分别加入50μL的Apt溶液和OTA溶液，反应后，加入MB溶液50μL，记录荧光强度F。

(3)相对荧光强度F/F₀与溶液中OTA的浓度呈负相关，从而定量测定OTA的污染水平。

4.以该MB探针为检测手段，建立了麦芽和啤酒中的OTA检测方法。

(1)麦芽样品：准确称取麦芽粉末(过二号筛)2.0g(精确至0.1g)，加入5mL乙腈-水(80：20，v/v)溶液，涡旋辅助提取1min，超声提取5min后，4000rpm下离心10min；精密上清液1mL，加入检测液稀释至10mL，混匀，过022μm滤膜，取续滤液供测定；啤酒样品：将市售的罐装啤酒，开盖，超声除气，精密量取10mL置于100mL容量瓶，加检测液定容至刻线，混匀，过0.22μm滤膜，取续滤液供测定。

(2)该分子信标MB探针检测麦芽和啤酒中的OTA选择性好，且不受基质干扰。