CN103926397A - 基于核酸外切酶ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素a荧光偏振快速检测方法 - Google Patents

基于核酸外切酶ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素a荧光偏振快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，该方法利用核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针杂交形成双链复合物，该复合物能够与OTA发生特异性链置换反应并释放出荧光标记探针和OTA-核酸适配体复合物，从而引发ExoI对单链荧光标记寡核苷酸探针以及OTA-核酸适配体复合物的酶切反应释放出OTA；释放出的OTA能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环，实现信号放大。本发明的方法解决现有依赖抗体的OTA快检方法易出现交叉反应、灵敏度不高、操作繁杂、成本过高等缺点，具有操作简单，方便快捷的优点，仅需15min即可实现对OTA的快速检测，灵敏度可达0.5nM。

Description

基于核酸外切酶I循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学以及荧光检测技术领域，具体而言，涉及利用反应体系荧光偏振值的变化对赭曲霉毒素A进行检测的方法，特点在于基于核酸适配体的链置换反应和基于核酸外切酶I的信号放大机制的应用，以及该方法检测速度快、灵敏度高及操作性强。
背景技术
赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）在自然界中广泛存在，主要由曲霉和靑霉等产生，常见的易受OTA污染的农产品主要包括小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等粮食，以及花生、蔬菜（豆类）等农作物。毒理学研究表明，OTA具有肝肾毒性以及很强的致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康具有很大的潜在危害。鉴于此，世界各国纷纷制定出粮食及饲料中OTA的限量标准，如欧盟规定谷物原料OTA最大限量5μg/kg，谷物加工制品最大限量3μg/kg；我国规定谷类、豆类中OTA最大限量5μg/kg，以保护人民健康和调控进出口粮食。
目前检测OTA的主要方法是薄层色谱法（TLC）、放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金免疫层析分析法（GICA）、高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD）、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、毛细管电泳技术（CE）等。基于HPLC的分析方法是目前主要的实验室检测方法，灵敏度高，但所需仪器昂贵、前处理复杂、检测成本高，不适合大量样品的快速筛查。TLC法简单，检测成本低，但是灵敏度较差、重现性不好且无法实现自动化；ELISA法灵敏度高、特异性好，但其操作过程比较复杂繁琐。
近年来，有关荧光偏振免疫分析技术（FPIA）的报道逐年增加，应用范围涵盖临床检验、毒品分析、农药残留分析、环境和食品检测等方面，作为一种均相检测方法与其它非均相方法相比具有显著的优点：测定在溶液中进行，避免了反复多次的洗涤步骤，且易于实现自动化和提高分析方法的精度；仅需数分钟甚至数秒钟孵育后即可测定荧光偏振光强度，检测速度快，有利于大批量样品的分析测试；不受内滤作用的影响，对于有颜色和浑浊的溶液仍能很好地完成检测任务；不需要使用放射性同位素，避免了污物不易处理的难题等。FPIA的主要局限性在于：针对不同的抗原靶标，首先要制备或得到相应的单克隆或多克隆抗体，制备周期相当长，且成本较高；由于抗体本身具有不稳定性，不易保存，易失活，容易导致检测结果稳定性差；抗体作为一种经过体内筛选得来的蛋白类分子识别元件，很难避免交叉反应，易出现假阴性、假阳性结果；常规FPIA的检出限一般在纳摩尔以上，灵敏度有待进一步提高。以上这些不利因素都影响了荧光偏振免疫分析方法的发展。所以，有待进一步完善或寻求相关替代分析技术。
核酸适配体（Aptamer），是通过模拟自然进化过程的体外人工筛选技术——指数富集配体***进化技术，筛选得到的具有识别功能的新型核酸分子，其本质是由一段单链寡核苷酸（20～60碱基），通过折叠能够形成特有的三维结构，从而与靶分子高亲和力、高特异性结合。核酸适配体的识别特性与抗体相似，但与抗体相比具有很多独特的优势：可在体外筛选（不依赖生物体），靶分子范围广（从金属离子、毒素等小分子到酶、蛋白等生物大分子，甚至病毒、细菌和细胞等生物体），分子量小（无免疫原性），容易进行化学合成、改造与标记，生物化学稳定性好，能可逆地进行变性与复性，还能利用酶进行扩增、剪切等后续信号放大处理。各种基于核酸适配体的分析、检测方法与技术已呈现出快速、灵敏、方便、低成本等优点，在生物医学应用中已经显示出广阔的应用前景，但在真菌毒素检测方面的应用却相对较少，主要是由于已经筛选出来的各种真菌毒素核酸适配体较少的缘故。所以，本发明利用核酸适配体代替抗体，将其作为分子识别元件的独特优势与荧光偏振均相分析技术的优势相结合，同时引入核酸外切酶Ｉ循环酶切的信号放大机制，开发了基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，能够很好地解决目前依赖抗体的OTA快速检测所面临的难题。
发明内容
为了解决目前OTA检测方法的灵敏度不高，操作繁杂，成本过高的缺点，本发明提供了一种基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针杂交形成核酸适配体双链复合物，所述的赭曲霉毒素A核酸适配体序列为5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’；单链荧光标记寡核苷酸探针（FAM-probe）序列为5’-FAM-CAGAGCCTAC-3’；
（2）链置换反应和酶切反应的循环：赭曲霉毒素A与核酸适配体双链复合物发生特异性链置换反应，产生单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物，从而引发核酸外切酶Ｉ对单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物的酶切反应释放出赭曲霉毒素A；释放出的赭曲霉毒素A能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环一定次数；
（3）检测反应体系以及空白对照的荧光偏振强度：空白对照的荧光偏振强度值为P0，反应体系的荧光偏振强度值为P，根据荧光偏振强度值的变化值ΔP=P0—P的标准曲线确定待检测体系中赭曲霉毒素A的浓度。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤（1）的步骤为将赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针进行预处理：95℃变性5min，25℃冷却30min。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤（2）的步骤为取50μL10mMTris-HCl反应缓冲溶液（pH8.5)，其中包含50nM的核酸适配体双链复合物，0.8U/μL的核酸外切酶Ｉ以及待检测的赭曲霉毒素A，室温反应15min，以使赭曲霉毒素A与核酸适配体双链复合物发生特异性链置换反应，产生单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物；释放出的赭曲霉毒素A能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环一定次数。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤（3）的步骤为将反应后的溶液用10mMTris-HCl反应缓冲液（pH8.5)调整反应体积为100μL，放入荧光光谱仪，以490nm为激发波长、525nm为发射波长，测定其荧光偏振强度并记录荧光偏振强度值的变化。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的待测样品为小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等粮食以及花生、豆类蔬菜等农作物中的赭曲霉毒素A。
本发明通过按上述步骤对配制的不同浓度赭曲霉毒素A标准液进行检测，记录各标准溶液样品所产生的荧光偏振强度值的变化值（ΔP=P0—P）；用ΔP对标准溶液中赭曲霉毒素A浓度作图获得标准曲线，未知样品中赭曲霉毒素A所产生的荧光偏振强度的变化值与标注曲线对照确定其浓度。
综上所述本发明的有益效果具体体现在以下方面：
1）本发明采用赭曲霉毒素A核酸适配体作为分子识别元件，利用荧光偏振检测技术构建的OTA检测方法，具有特异性高的特点，同事大大降低了检测OTA真菌毒素的成本，提高了检测方法的灵敏度，而且操作简单方便；
2）本发明基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，在赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针双链复合物预先形成后，仅需15min即可实现对OTA的检测。
附图说明
图1：基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法的现象图：其中（a）为Aptamer+FAM-probe，（b）为Aptamer+FAM-probe+OTA，（c）为Aptamer+FAM-probe+ExoI，（d）为Aptamer+FAM-probe+OTA+ExoI，（e）为Aptamer+FAM-probe+AFB1。[OTAaptamer]=50nM,[OTA]=[AFB1]=100nM，AFB1为黄曲霉毒素B1。
图2：对赭曲霉毒素A标准品溶液进行检测的工作曲线图：（A）浓度范围为0-1nM；（B）浓度范围为1-50nM。。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
（1）赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针杂交形成核酸适配体双链复合物
首先将赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针进行预处理：95℃变性5min，25℃冷却30min。赭曲霉毒素A核酸适配体（aptamer）序列为5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’；单链荧光标记寡核苷酸探针（FAM-probe）序列为5’-FAM-CAGAGCCTAC-3’。
（2）链置换反应和酶切反应的循环
取50μL10mMTris-HCl反应缓冲溶液（pH8.5)，其中包含50nM的核酸适配体双链复合物，0.8U/μL的核酸外切酶Ｉ以及适量浓度的赭曲霉毒素A，室温反应15min，以使赭曲霉毒素A与核酸适配体双链复合物发生特异性链置换反应，产生单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物；从而引发核酸外切酶Ｉ对单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物的酶切反应释放出赭曲霉毒素A，同时导致反应体系的荧光偏振强度的变化；释放出的赭曲霉毒素A能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环，反应体系的荧光偏振强度变化不断增大，从而实现信号放大。反应体系荧光偏振强度变化的大小与赭曲霉毒素A的浓度有关，据此可实现对赭曲霉毒素A的检测。
将反应后的溶液用10mMTris-HCl反应缓冲液（pH8.5)调整反应体积为100μL，放入荧光光谱仪，以490nm为激发波长、扫描窗口宽度60s，扫描速度12000nm/min，激发、发射狭缝宽度5.0nm，测定发射波长525nm处荧光偏振强度值的变化：空白对照的荧光偏振强度值（P0）最大，随着赭曲霉毒素A浓度的增加反应体系的荧光偏振强度值（P）逐渐降低。
如图1所示，赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针杂交形成的核酸适配体双链复合物，因总体分子量较大所以具有较大的荧光偏振值。在OTA存在的情况下，赭曲霉毒素A核酸适配体与OTA特异性结合，发生特异性链置换反应，产生游离的单链荧光标记寡核苷酸探针。游离的单链荧光标记寡核苷酸探针与核酸适配体双链复合物相比分子量较小，从而导致反应体系的荧光偏振值降低。与此同时，体系中的核酸外切酶Ｉ对单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物进行酶切反应，一方面导致反应体系的荧光偏振值进一步降低；另一方面释放出赭曲霉毒素A，从而引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环，结果导致反应体系的荧光偏振强度变化不断增大，从而实现信号放大。而在黄曲霉毒素B1（AFB1）存在的情况下，赭曲霉毒素A核酸适配体不识别AFB1，因此不能发生链置换反应，核酸适配体双链复合物不会解离，所以反应体系荧光偏振强度不会改变。
按上述（1）、（2）步骤对配制的不同浓度赭曲霉毒素A标准液进行检测，记录各标准溶液样品所产生的荧光偏振强度值的变化值（ΔP=P0—P）；用ΔP对标准溶液中赭曲霉毒素A浓度作图获得标准曲线（图2），由图可知R2>0.99，说明赭曲霉毒素A的浓度与本发明所述检测方法的荧光偏振值之间具有高度的正相线性关系，未知样品中赭曲霉毒素A所产生的荧光偏振强度的变化值与标注曲线对照就可以确定其浓度。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针杂交形成核酸适配体双链复合物，所述的赭曲霉毒素A核酸适配体序列为5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’；单链荧光标记寡核苷酸探针（FAM-probe）序列为5’-FAM-CAGAGCCTAC-3’；
（2）链置换反应和酶切反应的循环：赭曲霉毒素A与核酸适配体双链复合物发生特异性链置换反应，产生单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物，从而引发核酸外切酶Ｉ对单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物的酶切反应释放出赭曲霉毒素A；释放出的赭曲霉毒素A能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环一定次数；
（3）检测反应体系以及空白对照的荧光偏振强度：空白对照的荧光偏振强度值为P0，反应体系的荧光偏振强度值为P，根据荧光偏振强度值的变化值ΔP=P0—P的标准曲线确定待检测体系中赭曲霉毒素A的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，所述的步骤（1）的步骤为将赭曲霉毒素A核酸适配体与单链荧光标记寡核苷酸探针进行预处理：95℃变性5min，25℃冷却30min。
3.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，所述的步骤（2）的步骤为取50μL10mMTris-HCl反应缓冲溶液（pH8.5)，其中包含50nM的核酸适配体双链复合物，0.8U/μL的核酸外切酶Ｉ以及待检测的赭曲霉毒素A，室温反应15min，以使赭曲霉毒素A与核酸适配体双链复合物发生特异性链置换反应，产生单链荧光标记寡核苷酸探针以及赭曲霉毒素A核酸适配体复合物；释放出的赭曲霉毒素A能够引发下一个链置换反应和酶切反应，依次循环一定次数。
4.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，所述的步骤（3）的步骤为将反应后的溶液用10mMTris-HCl反应缓冲液（pH8.5)调整反应体积为100μL，放入荧光光谱仪，以490nm为激发波长、525nm为发射波长，测定其荧光偏振强度并记录荧光偏振强度值的变化。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的基于核酸外切酶Ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素A荧光偏振快速检测方法，所述的待测样品为小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等粮食以及花生、豆类蔬菜等农作物中的赭曲霉毒素A。
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