CN106546705B - 一种脂质体药物体外释放的测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂质体药物的测试方法，尤其涉及一种在体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程的测试方法。本发明通过将脂质体药物溶液与空气共同装入容器，并利用容器的震荡或旋转等运动模拟体内血液循环对药物的动力作用，使得体系中的空气在运动中分散形成气泡，与脂质体发生物理碰撞，从而破坏脂膜，达到药物的有效释放。所有操作参数，包括温度、转速、容器内脂质体药物与空气的体积比等均为可控，便于调节释放速率，可在短时间内实现药物的有效释放。还可加入离子交换树脂吸附释放出的游离药物，起到模拟体内漏槽状态的效果。

Description

一种脂质体药物体外释放的测试方法

技术领域

本发明涉及一种脂质体药物的测试方法，尤其涉及一种在体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程的测试方法。

背景技术

自20世纪90年代磷脂双层膜发现以来，脂质体作为药物递送载体的研究获得了长足发展。脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。磷脂分子在水中将分子亲水头部***水中，疏水尾部伸向空气，形成具有脂质双层结构的球形脂质体，粒径通常为25～1000nm。

脂质体的双层膜结构类似于生物膜，具有良好的生物相容性；经脂质体包裹的药物，具有靶向性、长效性、低毒性以及包封保护良好的优点。因此，脂质体被用于多种活性药物的递送，以改善药物进入体内后的血液循环时间，增加在靶部位的蓄积。通过改变粒子的粒径、脂质处方组成以及脂膜表面特征，可以改变脂质体的功能。使用不同脂质材料可以制备长循环脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体等各种功能性脂质体，达到特殊治疗目的。

因此，为了合理设计脂质体药物递送***，就需要对药物在体内和体外的释放行为进行详细研究，通过体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程进行测试。

然而，目前仅有的测试方法都有严重不足之处。以阿霉素脂质体为例，FDA指南中的体外释放考察方法仅仅给出了介质pH和温度这两个实验参数，通过大体积缓冲液或含有人血浆的缓冲液模拟体内生理环境。但由于阿霉素在脂质体内以硫酸阿霉素的沉淀形态存在，溶解度很低，导致释放速率太慢，难以满足质量控制体系中快速评估的要求。

Avi Schroeder和Yechezkel Barenholz采用的低频超声法(LFUS)能在短时间(3分钟)内释放80％的药物，但低频超声会导致脂质膜瞬态孔样缺陷，对脂质体的破坏剧烈，释放中的脂质体已无制剂概念，无法模拟体内生理环境。Atsuko Hioki和Yoshie Maitani采用在高温(50℃)条件下，加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin(BSA))来加速药物释放；Koji Nakamura和Hiroaki Kasukawa利用在经pH梯度法制备的脂质体中加入不同浓度铵离子的方法评估药物释放行为，并区分加载了药物的脂质体的不同脂质组分。上述方法虽然能在较短时间内完成释放，但其释放曲线十分不稳定，重复性差，无法作为质量评价的标准。

Jennifer A.Shabbits和Lawrence D.Mayer研究了的多层囊泡“沉淀”过量100倍环境下的大单层囊泡(large unilamellar vesicles，LUVs～100nm)的药物释放速率，以模拟血细胞和组织中的大膜池。该方法虽然能获得脂质体药物在体内滞留的真实属性，但由于MLVs的多变性，仍难以实现精确地质量评估。

综上可以看出，现有的脂质体药物体外释放测试方法难以在药物释放速率与体内体外相关性及可重复性之间获得平衡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂质体药物体外释放的测试方法，其能高度模拟体内药物释放的生理环境、各操作参数可控、能大大提高释药速率、重复性高。

为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种脂质体药物体外释放的测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，该方法包含如下步骤：

(1)在预定的温度下，将所述脂质体药物与空气按照预设的体积比装入容器内，并将所述容器封闭；

(2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；

(3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物中的未释放药物浓度或已释放的药物浓度，计算药物的释放速率。

进一步地，所述脂质体药物为脂质体蒽环类药物、脂质体长春新碱或脂质体两性霉素B，优选为脂质体阿霉素。

进一步地，所述步骤(2)中的所述运动为绕一非竖直的旋转轴旋转，且所述容器为条状，所述容器以径向垂直所述旋转轴的方式安装。

更进一步地，所述步骤(2)的旋转运动利用分子杂交仪完成，所述旋转轴为水平，所述容器为离心管，所述转速为15～50rpm。

进一步地，所述步骤(1)中，所述体积比为1:(0.1～5)；所述预定的温度为30～60摄氏度。

进一步地，所述步骤(1)中，所述脂质体药物与空气按照预设的体积比可定义为所述容器内还存在不少于其容积25％的空气。

进一步地，在所述步骤(1)中，向所述容器内加入预设量的用于吸附释放出的游离药物的离子交换树脂，所述的预设量不小于将所述脂质体药物内包封的所有药物全部吸附所需的量；所述步骤(3)中测定的是所述脂质体药物中的未释放药物浓度。

更进一步地，当所述脂质体药物内包封的药物选自蒽环类药物、长春新碱或两性霉素B；所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。

与现有方法相比，本发明具有如下优点：

(1)通过容器运动模拟体内血液循环对药物的动力作用，能更好地模拟药物进入体内后的释放行为，其释放过程更接近体内释放的真实情况；

(2)所有操作参数，包括温度、转速、容器内脂质体药物与空气的体积比等均为可控，从而能方便地调节释放速率，可在短时间内实现药物的有效释放；

(3)释放过程可随时暂停，不影响重启后的药物释放，便于取样；

(3)实验重复性远高于现有技术的各种方法；

(4)若在容器内加入离子交换树脂，则可利用树脂对释放出来的游离药物进行即时吸附，起到模拟体内漏槽状态的效果，并能快速测定残留的未释放药物浓度，大大提高实验效率。

综上所述，本发明在药物释放速率与体内体外相关性及可重复性之间获得了平衡，是一种能综合满足体外释放实验各方面需求的方法。

附图说明

图1：实施例1～3中，不同温度下的药物释放曲线；

图2：实施例4、2、5中，不同药物体积下的药物释放曲线。

图3：实施例6～8中，不同药物体积下的药物释放曲线。

图4：实施例2、9、10中，不同转速下的药物释放曲线。

图5：实施例11～14中，不同阳离子吸附树脂加入量下的药物释放曲线。

图6：本发明重复性试验：不同样品在不同时间点的阿霉素释放速率。

具体实施方式

本发明的基本原理是通过容器运动模拟体内血液循环对药物的动力作用，体系中的空气在运动中分散，形成气泡与脂质体发生物理碰撞，从而破坏脂膜，达到药物的有效释放。

在实验温度方面，选择磷脂相变温度52度附近为宜，优选40～50摄氏度。虽然温度越高脂膜的流动性越好，药物释放速率越快，但过高的温度会破坏脂质体本身，也就谈不上释放。因为该方法下药物的释放速度不仅能通过温度调节，还可通过转速或空气占比来调节，所以除非是专门针对温度梯度进行试验，可以选择30度或更低、60度或更高，否则无需选择过于极端的温度。

容器的运动必须具备竖直方向上的位移，否则无法使浮在溶液上方的空气与溶液中脂质体发生相对碰撞。为达到混合效果，最简单的运动方式就是上下震荡或旋转。实际操作中，则利用分子杂交仪进行绕水平轴的旋转最为方便，且离心管需以径向垂直旋转轴的方式竖直设置在旋转轴四周。这样的旋转方式使得空气的分散效果更好，对体内血液循环的模拟更真实。

同时，还可利用离子交换树脂对释放出来的游离药物进行吸附，释放出的游离药物被交换树脂吸附，就能方便地直接测定残留药物浓度。

阳离子树脂可吸附蒽环类药物(柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌)、长春新碱、两性霉素B等，其中强酸型阳离子交换树脂具有强酸性的反应基如磺酸基(-SO₃H)，可以广泛吸附所有的阳离子；弱酸型阳离子交换树脂具有较弱的反应基如羧基(-COOH基)，仅可交换弱碱中的阳离子如Ca₂ ⁺、Mg₂ ⁺。阴离子交换树脂主要是强碱型阴离子交换树脂，可以和所有阴离子进行交换吸附。

若在实验开始前先加入离子交换树脂，则可起到模拟体内漏槽状态的效果；若在实验完成并取样后再加入离子交换树脂，则仅起到吸附游离药物，简化样品检测前处理操作用。

以下通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。实施例考察了以下5个参数：离心管类型、温度、转速、药物溶液与空气体积比以及离子交换树脂加入量，对药物的释放速率的影响。

实施例1：5ml离心管-温度37℃、转速25rpm、药物体积2ml-10％树脂

(1)、配置脂质体阿霉素溶液：

将pH 6.0的磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline，PBS)放于超声清洗机中超声20min除气；用移液枪移取脂质体阿霉素1.25ml至50ml容量瓶中，用上述PBS定容为40倍稀释液，计算出初始药物浓度。

(2)、阳离子交换树脂预处理

将阳离子交换树脂加入到层析柱中，将水自然沥干后，用洗耳球吹打至无连续液体流出。(3)、体外释放实验

a、在5ml的EPPENDORF离心管中加入2ml脂质体阿霉素稀释液和0.2g(w/v＝10％)阳离子交换树脂；

b、设定分子杂交仪温度为37℃，转速为0rpm，进行预热；

c、将离心管以径向垂直于水平旋转轴的方式固定在分子杂交仪的杂交管架上；

d、设定分子杂交仪温度为37℃，转速为25rpm，开始旋转并计时。

e、在2h、4h、6h时间点取样，一支离心管即为一份样品。用HPLC检测样品上清液中的残留药物浓度。

f、药物释放速率＝(1-残留药物浓度/初始药物浓度)×100％，实验结果见下表：

表1、实施例1的不同时间点阿霉素释放速率

实施例2：5ml离心管-温度49℃、转速25rpm、药物体积2ml-10％树脂

具体步骤同实施例1，参数设置如标题，温度改变。实验结果见下表：

表2、实施例2的不同时间点阿霉素释放速率

实施例3：5ml离心管-温度52℃、转速25rpm、药物体积2ml-10％树脂

具体步骤同实施例1，参数设置如标题，温度改变。实验结果见下表：

表3、实施例3的不同时间点阿霉素释放速率

附图1是根据实施例1～3的结果作图，在其他条件相同(5ml离心管，药物体积2ml，转速25rpm，加入w/v 10％的阳离子吸附树脂)时，不同温度下的药物释放曲线。由此可见，温度会影响阿霉素药物的释放速率，温度升高，释放相对变快。

实施例4：5ml离心管-温度49℃、转速25rpm、药物体积1ml-10％树脂

具体步骤同实施例2，参数设置如标题，药物体积改变。实验结果见下表：

表4、实施例4的不同时间点阿霉素释放速率

实施例5：5ml离心管-温度49℃、转速25rpm、药物体积4ml-10％树脂

具体步骤同实施例4，参数设置如标题，药物体积改变。实验结果见下表：

表5、实施例5的不同时间点阿霉素释放速率

附图2是根据实施例4、2、5的结果作图，在其他条件相同(5ml离心管，温度49℃，转速25rpm，加入w/v 10％的阳离子吸附树脂)时，不同药物体积(即药物与空气的体积比)下的药物释放曲线。

从图中可以清晰地看出，药液与空气的体积比会明显改变阿霉素的释放行为。随着药物体积从1ml增加到4ml，阿霉素释放速率显著变慢。这是因为该测试方法中，破坏脂膜依靠的就是分散到溶液中的空气，因此通过控制空气体积比，能精确操纵释放速率，操作直观简单。

实施例6：5ml离心管-温度47℃、转速25rpm、药物体积1.8ml-10％树脂

具体步骤同实施例1，参数设置如标题，取样时间点为1h、3h、5h。实验结果见下表：

表6、实施例6的不同时间点阿霉素释放速率

实施例7：5ml离心管-温度47℃、转速25rpm、药物体积2.4ml-10％树脂

具体步骤同实施例6，参数设置如标题，药物体积略加改变。实验结果见下表：

表7、实施例7的不同时间点阿霉素释放速率

实施例8：5ml离心管-温度47℃、转速25rpm、药物体积3ml-10％树脂

具体步骤同实施例6，参数设置如标题，药物体积略加改变。实验结果见下表：

表8、实施例8的不同时间点阿霉素释放速率

附图3是根据实施例6～8作图，在其他条件相同(5ml离心管，温度47℃，转速25rpm，加入w/v 10％的阳离子吸附树脂)时，不同药物体积(即药物与空气的体积比)下的药物释放曲线。和附图2相比，该组实验中的药物体积变化幅度较小，结果所得的药物释放曲线无明显区别。

实施例9：5ml离心管-温度49℃、转速15rpm、药物体积2ml-10％树脂

具体步骤同实施例2，参数设置如标题，转速改变。实验结果见下表：

表9、实施例9的不同时间点阿霉素释放速率

实施例10：5ml离心管-温度49℃、转速35rpm、药物体积2ml-10％树脂

具体步骤同实施例2，参数设置如标题，转速改变。实验结果见下表：

表10、实施例10的不同时间点阿霉素释放速率

附图4是根据实施例2、9、10作图，在其他条件相同(5ml离心管，温度49℃，药物体积2ml，加入w/v 10％的阳离子吸附树脂)时，不同转速下的药物释放曲线。由此可见，转速对药物释放速度的影响也很大。转速增加直接加速了气泡对脂膜的破坏，药物释放速率显著提升。

实施例11：5ml离心管-温度49℃、转速30rpm、药物体积1.8ml-0％树脂

具体步骤同实施例1，参数设置如标题，取样时间点为1h、3h、5h。但在旋转前不加入阳离子交换树脂，待旋转完成并取样后，才在样品中加入树脂，用以吸附游离药物。实验结果见下表：

表11、实施例11的不同时间点阿霉素释放速率

实施例12：5ml离心管-温度49℃、转速30rpm、药物体积1.8ml-5％树脂

具体步骤同实施例11，参数设置如标题，改变加入的阳离子吸附树脂含量。实验结果见下表：

表12、实施例12的不同时间点阿霉素释放速率

实施例13：5ml离心管-温度49℃、转速30rpm、药物体积1.8ml-10％树脂

具体步骤同实施例11，参数设置如标题，改变加入的阳离子吸附树脂含量。实验结果见下表：

表13、实施例13的不同时间点阿霉素释放速率

实施例14：5ml离心管-温度49℃、转速30rpm、药物体积1.8ml-20％树脂

具体步骤同实施例11，参数设置如标题，改变加入的阳离子吸附树脂含量。实验结果见下表：

表14、实施例14的不同时间点阿霉素释放速率

附图5是根据实施例11～14作图，在其他条件相同(5ml离心，温度49℃，转速30rpm，药物体积1.8ml)时，加入不同质量的阳离子吸附树脂后的药物释放曲线。其中，包括最小量5％(w/v)在内的所有树脂量，都超过能将离心管内所有药物全部吸附的所需量。从图中可以看出，树脂的加入对药物释放的影响非常小。

实施例15：15ml离心管-温度47℃、转速40rpm、药物体积10ml-20％树脂

具体步骤同实施例1，参数设置如标题，更换了离心管型号，取样时间点为1h、3h。实验结果见下表：

表15、实施例15的不同时间点阿霉素释放速率

实施例16：15ml离心管-温度47℃、转速40rpm、药物体积11ml-10％树脂

具体步骤同实施例15，参数设置如标题，药物体积略增，树脂加入量减少。实验结果见下表：

表16、实施例16的不同时间点阿霉素释放速率

实施例17：15ml离心管-温度47℃、转速30rpm、药物体积10ml-20％树脂

具体步骤同实施例15，参数设置如标题，转速改变。实验结果见下表：

表17、实施例17的不同时间点阿霉素释放速率

实施例18：15ml离心管-温度47℃、转速20rpm、药物体积10ml-10％树脂

具体步骤同实施例15，参数设置如标题，转速改变。实验结果见下表：

表18、实施例18的不同时间点阿霉素释放速率

将上述15ml离心管的数据与5ml离心管的数据对比发现，离心管容积增大，有利于药物释放。在近似的温度和相同的转速下，15ml离心管中的药物与空气体积比大于5ml离心管，而达到90％以上的药物释放率所需的时间则短于后者。因此，通过增大离心管型号来提高药物释放速率也是有效的手段之一。

实施例19：5ml离心管-温度49℃、转速25rpm、药物体积2ml-10％树脂

具体步骤同实施例1，参数设置如标题。取样时间点为1h、2h、4h、6h、8h，每个时间点取6支样品，验证重复性。实验结果见下表：

表19、实施例19的不同样品在不同时间点的阿霉素释放速率

附图6是上述各样品的药物释放曲线对比。从图中可以看出，本方法的重复性很好，特别是在较长的时间尺度下，药物释放的稳定性很好。

以下通过多组实施例和对比例，考察不同运动方式对实验效果的影响。

实施例20：15ml离心管-温度47℃、转速60rpm、药物体积10ml-2g树脂-竖直装样

对比例1：15ml离心管-温度47℃、转速60rpm、药物体积10ml-2g树脂-水平装样

具体实验步骤基本同实施例1，参数设置如标题。区别在于，对比例中，安装离心管时采取径向平行于旋转轴的方式。同时，该两组实验均采取了比较大的转速。

取样时间点为1h、2h、3h、4h、5h，每个时间点取2支样品。实验结果见下表：

表20、实施例20和对比例1在不同时间点的阿霉素释放速率

从上表可以看出，转速较大时，采用径向垂直于旋转轴的装样方式，仅1h就达成了较大的释放比例，而采取水平装样的方式则是放很慢。这是由于围绕水平的旋转轴进行旋转时，如果离心管同样为水平，则空气和溶液二者之间在竖直方向上的相对位移幅度不大，且由于离心力，空气容易靠在管壁内侧，难以形成剧烈搅动。因此，采取竖直装样的方式释放速度较快，水平装样则较慢，从实验效率的角度考量，以竖直装样为优。

对比例2：1.5ml EP管-温度47℃、震荡频率1000rpm、药物体积1ml-0.2g树脂-震荡

该对比例2考察震荡运动方式下的药物释放。

基本的实验步骤同实施例1，参数设置如标题。区别在于，装样采用1.5ml EP管，利用恒温震荡混匀仪进行震荡，震荡频率1000rpm。取样时间点为1h、2h、3h，每个时间点取4支样品，样品离心，取上清，用HPLC检测阿霉素含量。实验结果见下表：

表21、对比例2中不同时间点的阿霉素释放速率

从上表可以看出，同一个时间点，不同样品的释放速率差异较大，这表明采取震荡的运动方式难以保证实验的重复性，可控性较低。如果降低振荡频率，则又无法在短时间内达到有效释放。

对比例3：50ml肖特瓶-温度47℃、震荡频率150rpm、药物体积50ml-5g树脂

该对比例3考察采用另一种振荡器的震荡运动方式下的药物释放。

基本的实验步骤同实施例1，参数设置如标题。区别在于，装样采用50ml肖特瓶，其中加入50ml阿霉素脂质体稀释液。利用恒温摇床振荡器进行震荡，震荡频率150rpm，摇床上同时安装2瓶溶液同时进行。取样时间点为1h、2h、3h、4h、5h、6h，每次取样0.5ml上清，用HPLC检测阿霉素含量。实验结果见下表：

表22、对比例3中不同时间点的阿霉素释放速率

从上表可以看出，即使是同一台恒温震荡摇床，同时进行实验的两组样品，药物释放行为差异依然很大。这可能是因为摇床对样品的固定不够好，开始震动后样品会发生位移，从而影响实验的重复性。

从对比例2和3可以看出，震荡虽然作为一种运动方式，在释放效率方面能够满足药物实验需求，但在实际操作中，采用实验室的常用设备难以对其进行精确控制，从而导致该运动方式的实用性很低，不如旋转方式。

对比例4：50ml西林瓶-温度47℃、搅拌速率450rpm、药物体积10ml-2g树脂

对比例4考察的是恒温磁力搅拌运动方式下的药物释放。

对比例4的基本的实验步骤同实施例1，参数设置如标题。区别在于，装样采用50ml西林瓶，其中加入10ml阿霉素脂质体稀释液。利用六孔水浴磁力搅拌器同时对6组样品进行搅拌，搅拌速率为450rpm，取样时间点为1h、2h、3h、4h、5h、6h，每次取样0.5ml上清，用HPLC检测阿霉素含量。实验结果见下表：

表23、对比例4中不同时间点的阿霉素释放速率

从上表可以看出，即使采用同一台搅拌器，在相同条件下同时进行实验的6个样品，其释放速率差异依然很大。由此可见磁力搅拌的运动方式可控性同样非常低，不适合选择该方式。

对比例5：溶出杯-温度45℃、搅拌速率250rpm、药物体积250ml-20g树脂

对比例5则采用了溶出实验的通用仪器溶出仪，利用搅拌桨进行搅拌。

同时将5个溶出杯内分别加入250ml阿霉素脂质体稀释液，设定转速为250rpm(通常溶出实验采取的转速为几十rpm)。取样时间点为1h、2h、3h、4h、5h。该对比例5取样后，测试未释放的阿霉素脂质体残留浓度。实验结果见下表：

表24、对比例5中不同时间点的阿霉素脂质体残留浓度

从上表可以看出，即使将温度设定为较高的45℃，采取相对猛烈的搅拌速率，依然无法使阿霉素发生释放。因此，该方法完全无法用于药物释放实验。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (8)

1.一种脂质体药物体外释放的测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，其特征在于所述测试方法包含如下步骤：

(1)在预定的温度下，将所述脂质体药物与空气按照预设的体积比装入容器内，并将所述容器封闭；

(2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；

(3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物中的未释放药物浓度或已释放的药物浓度，计算药物的释放速率；

所述步骤(2)中的所述运动为绕一非竖直的旋转轴旋转，且所述容器为条状，所述容器以径向垂直所述旋转轴的方式安装；

所述脂质体药物与空气按照预设的体积比定义为所述容器内还存在不少于其容积25％的空气。

2.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述预定的温度为30～60℃。

3.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述旋转轴旋转利用分子杂交仪完成，所述旋转轴为水平，所述容器为离心管，所述分子杂交仪转速为15～50rpm。

4.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于在所述步骤(1)中，向所述容器内加入预设量的用于吸附释放出的游离药物的离子交换树脂，所述的预设量不小于将所述脂质体药物内包封的所有药物全部吸附所需的量。

5.如权利要求4所述的测试方法，其特征在于所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。

6.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述脂质体药物为脂质体蒽环类药物、脂质体长春新碱或脂质体两性霉素B。

7.如权利要求6所述的测试方法，其特征在于所述蒽环类药物为柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星或米托蒽醌。

8.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于所述脂质体药物为脂质体阿霉素。

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