CN109810690A - 基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途 - Google Patents
基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109810690A CN109810690A CN201811328454.6A CN201811328454A CN109810690A CN 109810690 A CN109810690 A CN 109810690A CN 201811328454 A CN201811328454 A CN 201811328454A CN 109810690 A CN109810690 A CN 109810690A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrogen peroxide
- compound
- fluorescent probe
- probe molecule
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途。该荧光探针分子结构如下所示：本发明还公开了所述基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的制备方法，以及检测水体样品、细胞内、线虫体内、斑马鱼体内等的过氧化氢用途。
Description
技术领域
本发明属于有机功能材料，涉及检测微量物质的荧光探针分子、制备方法及 用途。
背景技术
过氧化氢是活性氧族的一员，与生物体的生命过程密切相关。报道显示，细 胞内内源性的过氧化氢主要产生于细胞内的有氧呼吸中通过线粒体电子传递链 过程，它不仅在细胞内的氧化应激反应中扮演着细胞毒物的角色，而且还是重要 的信使分子。同时，研究发现，过氧化氢参与包括伤口愈合、免疫和干细胞增殖 等病理和生理过程，而细胞内异常的过氧化氢代谢水平与许多疾病密切相关，如 炎症，衰老，癌症，糖尿病和神经退行性疾病。
常见的过氧化氢荧光探针测试法中使用的荧光团，大多基于硼酸酯为识别基 团，其发射波长大多位于蓝光和绿光区域，该波长无法穿透生物组织进行成像， 反而易干扰荧光背景，而且，过氧亚硝基，羟基自由基等活性氧自由基干扰该类 探针特定性识别，极大限制了探针应用。因此，制备近红外、灵敏性高、响应速 度快、选择性高的过氧化氢探针具有重要的理论及应用价值。
发明内容
本发明目的是提供一种近红外、灵敏性高、选择性优良的基于苯并吡喃腈 检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途。
本发明通过以下技术方案实现上述目的，包括：
(一)基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子
具有如下结构：
(二)制备基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的方法
包括以下步骤：
(1)将1-(2-羟基苯基)乙酮和钠在乙酸乙酯中室温剧烈搅拌4小时，得 到的灰绿色固体经过滤，溶解在去离子水中，调节溶液的pH至中性，用乙酸乙 酯萃取三次该水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体物， 为化合物5；
(2)用乙酸溶解步骤(1)所述化合物5，缓慢加入硫酸，加热回流30分 钟，倒入冰水中，用碳酸钠调节溶液的pH至中性，用二氯甲烷萃取三次水溶液， 有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体物，为化合物4；
(3)用乙酸酐溶解步骤(2)所述化合物4和丙二腈，加热回流14小时， 减压蒸馏，加入去离子水，继续加热回流0.5小时，用二氯甲烷萃取三次水溶液， 有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用洗 脱剂分离提纯，得到化合物3；
(4)将步骤(3)所述化合物3和对乙酰氨基苯甲醛溶解到甲苯中，加入 冰乙酸和哌啶，在氮气保护下加热回流36小时，反应液冷却至室温，得到的橙 色固体经过滤后，于浓盐酸和乙醇的混合溶液加热回流24小时，在冰浴条件下 用饱和NaOH调节pH至中性，用乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠干燥有机相， 过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的 固体物，为化合物2；
(5)用无水二氯甲烷溶解对硝基苯乙酮酸、N,N-二异丙基乙胺和2-(7-氧 化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐，在氮气保护下冰浴反应1.5小 时，加入步骤(4)所述化合物2，继续冰浴反应5小时，撤去冰浴，室温下反 应12h，点板确认反应结束后，用去离子水洗三次反应溶液，无水硫酸钠干燥， 过滤，减压蒸馏，得到固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂分离提纯，得到的固 体物即为基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子。
优选地，所述步骤(1)中1-((2-羟基苯基)乙酮和钠的比例为10g:8g。
优选地，所述步骤(2)中化合物5、冰醋酸及硫酸的质量比为6.95g:73.5g: 8.46g。
优选地，所述步骤(3)中化合物4与丙二腈的摩尔比为1:1.2，所述洗脱 剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为3:7。
优选地，所述步骤(4)中化合物3与对乙酰氨基苯甲醛的摩尔比为1:1，浓 盐酸与乙醇的混合溶液体积比为3:2，所述洗脱剂为二氯甲烷。
优选地，所述步骤(5)中对硝基苯乙酮酸、N,N-二异丙基乙胺和2-(7- 氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐及化合物2的摩尔比为10:2: 2:1；所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为1.5:1。
(三)基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的用途
优选地，所述用途是检测水体样品、细胞内、线虫体内、斑马鱼体内的过氧 化氢。
本发明中，我们提供了基于苯并吡喃腈荧光探针分子的制备方法及应用，该 荧光探针分子由一种结构清晰、光性质稳定的荧光团以及能够提供与特定的活性 氧自由基——过氧化氢发生亲核反应的偶羰基组成。当偶羰基的酰胺键断开，改 变了荧光探针分子的颜色及荧光，从而选择性地识别和检测液相体系中的过氧化 氢。其显著进步在于：
1、本发明荧光探针分子合成方法为五个步骤，易合成，收率高。
2、本发明荧光探针分子含有可与过氧化氢发生亲核作用的偶羰基团，对过 氧化氢有很好的选择性，对其它活性氧、活性氮、活性硫等物质具有抗干扰性(见 图7)。
3、本发明荧光探针分子激发和发射光谱在近红外可见区，其荧光探针分子 穿透细胞的渗透能力好，且物理化学性质稳定性良好。
4、本发明荧光探针分子与过氧化氢反应前后，其荧光发射在水溶液、细胞、 线虫体、斑马鱼内增长约22倍，检测整个识别过程颜色及荧光变化灵敏度高， 能够检测水溶液中的过氧化氢以及荧光成像细胞、线虫和斑马鱼体内的过氧化氢。
5、本发明对细胞本身毒副作用小，可以实现线虫及斑马鱼体内过氧化氢的 荧光检测。
基于以上优势，该荧光探针分子可应用于荧光识别和检测环境水体样品、活 体动物中的过氧化氢，具有潜在的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的合 成路线。
图2为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的 1H-NMR谱图。
图3为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的 13C-NMR谱图。
图4为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的 HRMS(ESI)谱图。
图5为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水 溶液体系中对过氧化氢响应的紫外变化光谱图。
图6为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水 溶液体系中对过氧化氢响应荧光光谱变化图。
图7为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水 溶液体系中对不同金属离子在653nm处荧光强度柱状图；
图8为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水 溶液体系中对不同浓度过氧化氢紫外光谱变化图。
图9为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水 溶液体系中对不同浓度过氧化氢荧光光谱变化图。
图10为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在 653nm处荧光强度与相对应H2O2离子浓度拟合曲线图。
图11为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的细 胞毒性试验图。
图12为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细 胞内对外源性过氧化氢荧光识别图。其中，a,e,i为明场；b,f,j为DAPI通道； c为只加入20μmol/L的探针化合物的荧光图片；g为先加入220μmol/L H2O2哺 育3h再加入20μmol/L的探针化合物再哺育2h的荧光图片；k为先加入440 μmol/L H2O2哺育3h再加入20μmol/L的探针化合物再哺育2h的荧光图片；d, h,l为叠加通道。
图13为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细 胞内对内源性过氧化氢荧光识别图。其中，a-d为DAPI通道；e为只加入20μmol/L 的探针化合物的荧光图片；f为先加入40μmol/L丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)哺 育0.5h再加入20μmol/L的探针化合物再哺育1h的荧光图片；g为先加入4 μmol/L鱼藤酮(Rotenone)哺育0.5h再加入20μmol/L的探针化合物再哺育1h 的荧光图片；h为先加入400μmol/L百草枯(PQ)哺育0.5h再加入20μmol/L 的探针化合物再哺育2h的荧光图片。
图14为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在线 虫体内对过氧化氢荧光识别图。其中，a-c为明场；d为只加入20μmol/L的探针 化合物的荧光图片；e为先加入220μmol/L H2O2哺育2h再加入20μmol/L的探 针化合物再哺育1h的荧光图片；f为先加入440μmol/L H2O2哺育2h再加入 20μmol/L的探针化合物再哺育1h的荧光图片。
图15为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在斑 马鱼体内对过氧化氢荧光识别图。其中，a,c为只加入20μmol/L的探针化合物 的荧光图片；b,d为先加入20μmol/L CuSO4哺育1h再加入20μmol/L的探针 化合物再哺育1h的荧光图片。
具体实施方式
实施例1：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的合成
具体合成路线见图1。
(1)化合物5的制备：取1-(2-羟基苯基)乙酮(10.0g，73.5mmol)，钠(8.00 g，0.34mmol)溶解到200mL乙酸乙酯中，室温剧烈搅拌4小时。反应结束后， 将得到的灰绿色固体过滤后，溶解在去离子水中，用饱和NaOH调节溶液的pH 至中性。得到的水溶液用乙酸乙酯萃取三次，有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤， 然后减压蒸馏得到固体物质为化合物5为棕色固体，所得粗产物无需进一步纯化 直接用于下一步，产率为53％。
(2)化合物4的制备：将4.6mL硫酸缓慢加入到含有化合物5(6.95g，38.9 mmol)的70mL醋酸中，反应混合物加热回流约30分钟，然后倒入800mL冰 水中，用碳酸钠将溶液的pH调节至中性。所得水溶液用二氯甲烷萃取三次，有 机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到最终的粗产物，化合物4 为针状灰色固体，将粗产物直接用于下一反应无需进一步纯化，产率76.9％。
(3)化合物3的制备：将化合物4(4.78g，29.9mmol)和丙二腈(2.40g， 36.2mmol)溶解到25mL乙酸酐中，加热回流14小时，然后减压蒸馏，加入 80mL去离子水，继续加热回流0.5小时，得到的水溶液用二氯甲烷萃取三次， 有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析 柱，用石油醚:：二氯甲烷＝3:7洗脱，浓缩洗脱液得2.02g橙色化合物，其产率 为32.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ8.92(d,1H),7.72(t,1H),7.46(d,1H), 7.45(t,2H),6.72(s,1H),2.44(s,3H)。
(4)化合物2的制备：将化合物3(2.08g，1mmol)和对乙酰氨基苯甲醛(1.63 g，1mmol)溶解到60mL甲苯中，加入两滴冰乙酸和哌啶，在氮气的保护下加 热回流36小时，将反应液冷却至室温，得到的橙色固体经过滤后，在浓盐酸： 乙醇＝3:2(V:V)的混合溶液加热回流24小时。冷却后在冰浴条件下用饱和NaOH 调节pH为7左右，然后用乙酸乙酯萃取三次，得到的有机相用无水硫酸钠干燥 后过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱，用二氯甲烷洗脱，浓缩洗脱 液得76mg暗红色化合物，产率24.7％。1H NMR(400MHz,DMSO),δ8.73(d,1H), 7.89(t,1H),7.77(d,1H),7.64(d,1H),7.58(t,1H,J＝8.0Hz),7.49(d,1H),7.08(d, 1H),6.87(s,1H),6.61(d,2H),5.99(s,2H)。
(5)苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子1的合成：将对硝基苯乙酮酸(195mg，1mmol)、N,N-二异丙基乙胺(160mL，0.2mmol)和2-(7-氧化苯 并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(228mg，0.2mmol)溶解到50mL 无水二氯甲烷中，在氮气的保护下，冰浴反应1.5小时，加入化合物2(31.1mg， 0.1mmol)，继续冰浴反应5小时后，撤去冰浴，室温下反应12h。点板确认反 应结束后，得到的反应溶液用去离子水洗三次，再用无水硫酸钠干燥并过滤，然 后减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱，用石油醚：二氯甲烷＝1.5:1洗脱， 浓缩洗脱液得41.5mg橘红色化合物，产率85.2％。1H-NMR(600MHz, d6-DMSO):δ7.015(s,1H),7.460(d,1H),7.616(t,1H),7.735(d,1H),7.805(t,3H), 7.917(m,3H),8.333(d,2H),8.405(d,2H),8.728(d,1H),11.230(s,1H).13C-NMR(600 MHz,d6-DMSO):δ60.69,107.11,116.31,117.58,117.63,119.37,119.54,120.99, 124.32,125.14,126.65,129.58,131.82,132.13,135.91,138.05,138.50,139.84, 151.02,152.52,153.38,158.66,162.03,,187.69.HRMS(ESI):calcd for C28H16N4O5 [M-H]-＝487.1121,found m/z487.1045.其中，DMSO-d6为氘代二甲基亚砜。相 关谱图见图2～4。
实施例2：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢紫外检 测的选择性
采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝7:3(v:v)溶液 控制实验条件。
将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用DMSO:PBS＝7:3(v:v) 的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L 的溶液。
将样品瓶分为14组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于 苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的DMSO:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4) ＝7:3(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它13组分别加入22μL浓度为 0.01mol/L的ClO-,H2O2,·OH,TBHP,O2 1,O2 ·-,·NO,GSH,Hcy,Cys,S2-, ONOO-,ROO·的水溶液。在37℃下静置15分钟后，将各测试工作液转移至1 cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。
基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢的紫外选择性检 测如图5所示。结果表明基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子仅对过氧 化氢在487nm处出现明显的紫外吸收峰。该结果表明本发明所涉及的基于苯并 吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢表现出高度的紫外选择性。
实施例3：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢荧光检 测的选择性
采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝7:3(v:v)溶液 控制实验条件。
将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用DMSO:PBS＝7:3(v:v) 的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L 的溶液。
将样品瓶分为14组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于 苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的DMSO:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4) ＝7:3(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它13组分别加入22μL浓度为 0.01mol/L的ClO-,H2O2,·OH,TBHP,O2 1,O2 ·-,·NO,GSH,Hcy,Cys,S2-, ONOO-,ROO·的水溶液。在37℃下静置15分钟后，将各测试工作液转移至1 cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为487nm，发射波长为653nm。基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢荧光选 择性检测如图6所示。可见基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在653 nm处仅对H2O2有明显的荧光增强现象(约22倍增强)，表明本发明所涉及的 基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢表现出高度的荧光选 择性。
我们选用了在653nm处各个离子的荧光强度值做了一个柱形图(图7)，图 7可以直观地看出探针的荧光选择性非常好。
实施例4：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢的定量 紫外检测
采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝7:3(v:v)溶液 控制实验条件。
将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用DMSO:PBS＝7:3(v:v) 的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L 的溶液。
准确移取50.2μL 30％过氧化氢溶液，用50mL去离子水溶解，配制成成浓 度为0.01mol/L的H2O2水溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于 苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的DMSO:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4) ＝7:3(v:v)溶液，再分别加入0μL～22μL浓度为0.01mol/L的H2O2水溶液， 使测试体系中过氧化氢浓度为0μmol/L～440μmol/L。在37℃下静置15分钟后， 将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。
图8为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水 溶液体系中随过氧化氢浓度变化的紫外光谱图，表明本发明所涉及的基于苯并吡 喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测过氧化氢浓度。
实施例5：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子对过氧化氢的定量 荧光检测
采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝7:3(v:v)溶液 控制实验条件。
将基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子用DMSO:PBS＝7:3(v:v) 的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为20μmol/L 的溶液。
准确移取50.2μL 30％过氧化氢溶液，用50mL去离子水溶解，配制成成浓 度为0.01mol/L的H2O2水溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为20μmol/L的基于 苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子的DMSO:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4) ＝7:3(v:v)溶液，再分别加入0μL～22μL浓度为0.01mol/L的H2O2水溶液， 使测试体系中过氧化氢浓度为0μmol/L～440μmol/L。在37℃下静置15分钟后， 将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光 测试光栅缝隙大小为5×5nm。图9为本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化 氢检测荧光探针分子在水溶液体系中随过氧化氢浓度变化的荧光光谱图。将荧光 光谱653nm处的荧光强度与相应过氧化氢浓度进行拟合，在过氧化氢浓度为0 μmol/L～440μmol/L范围内得到一拟合曲线(图10)，表明本发明所涉及的基于 苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测过氧化 氢浓度。
实施例6：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细胞内对外源 性过氧化氢的荧光识别
取三培养皿Hi-5细胞，将培养皿中的Hi-5细胞用PBS缓冲液(每升缓冲液 中含有2.90克Na2HPO4·12H2O；0.30克NaH2PO4·2H2O)清洗三次，以除去培 养液。再向这三培养皿Hi-5细胞中加入1mL PBS溶液，然后分别向Hi-5细胞 中分别加入浓度为0.01mol/L的过氧化氢溶液0μL、22μL、44μL，并将皿放 于无菌培养箱中在37℃下孵育1小时。Hi-5细胞用PBS缓冲液洗涤3次，之 后向培养皿中加入浓度为2mmol/L的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针 分子10μL，并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1小时。Hi-5细胞再次用PBS 溶液洗涤3次后，加入10μL 2mmol/L细胞核染色剂DAPI后继续孵育半小时， 然后放置在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图12。图12c中可 以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子自身在细胞质内基本无荧 光发射，当过氧化氢浓度达到440μmol/L时，细胞内发射出红色荧光(图12k)。 该实验表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以 在细胞内对外源性的过氧化氢进行荧光识别。实验所用仪器为Olympus FV-10i 激光共聚焦显微镜。
实施例7：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在细胞内对内源 性过氧化氢的荧光识别
取四培养皿Hi-5细胞，将培养皿中的Hi-5细胞用PBS缓冲液(每升缓冲液 中含有2.90克Na2HPO4·12H2O；0.30克NaH2PO4·2H2O)清洗三次，以除去培 养液。再向这三培养皿Hi-5细胞中加入1mL PBS溶液，然后分别向其中三皿 Hi-5细胞中分别加入浓度为40μmol/L丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，4μmol/L 鱼藤酮(Rotenone)，400μmol/L的百草枯(PQ)，并将培养皿放于无菌培养 箱中在37℃下孵育0.5小时。Hi-5细胞用PBS缓冲液洗涤3次，之后向培养皿 中加入浓度为2mmol/L的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子10μL， 并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1小时。Hi-5细胞再次用PBS溶液洗涤3 次后，加入10μL 2mmol/L细胞核染色剂DAPI后继续孵育半小时，然后放置 在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图13。图13e中可以看到基 于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子自身在细胞质内基本无荧光发射，当 用上述刺激物孵育后，细胞内发射出红色荧光(图13f,g,h)。该实验表明本发明 所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以在细胞内对内源性 的过氧化氢进行荧光识别。实验所用仪器为Olympus FV-10i激光共聚焦显微镜。
实施例8：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在线虫体内对过 氧化氢的荧光识别
将培养皿中的线虫用M9缓冲液(每升缓冲液中含有15.12克 Na2HPO4·12H2O；3克KH2PO4；5克NaCl；0.25克MgSO4·7H2O)洗出来， 分三组装到离心管中。再向这三组离心管中加入1mL M9溶液，然后分别向这 三组离心管中分别加入浓度为0.01mol/L的过氧化氢溶液0μL、2.2μL、4.4μL， 在室温条件下孵育2小时。线虫用M9缓冲液洗涤3次，在3000r/min速度下离 心3分钟，之后向装有线虫的离心管内加入浓度为2mmol/L的基于苯并吡喃腈 的过氧化氢检测荧光探针分子10μL，并在20℃孵育1小时。线虫再次用M9溶 液洗涤3次，在3000r/min速度下离心3分钟后转移到载玻片上进行荧光成像 实验。结果见图14。图14d中可以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探 针分子自身在线虫内基本无荧光发射；当过氧化氢浓度达到440μmol/L时，线 虫体内发射出红色荧光(图14f)。该实验表明本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的 过氧化氢检测荧光探针分子可以在线虫体内对过氧化氢进行荧光识别。实验所用
实施例9：基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子在斑马鱼体内对 过氧化氢的荧光识别
将培养皿中的刚孵化三天的AB型斑马鱼胚胎用E3缓冲液(每升缓冲液中 含有0.29克NaC；0.013克KCl；0.048克CaCl2·2H2O；0.082克MgSO4·7H2O)， 分两组装到离心管中，每组1mL。然后分别向这两组离心管中分别加入浓度为 0μmol/L，20μmol/L的硫酸铜溶液，在室温条件下孵育1h。斑马鱼胚胎用E3 缓冲液洗涤3次，之后向装有斑马鱼胚胎的离心管内加入浓度为2mmol/L的基 于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子10μL，并在20℃孵1小时。斑 马鱼胚胎再次用E3溶液洗涤3次后转移到凹槽载玻片上进行荧光成像实验。结果见图15。图15a,c中可以看到基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子 自身在斑马鱼胚胎体内基本无荧光发射；当用20μmol/L的硫酸铜溶液刺激斑马 鱼胚胎发生炎症时，斑马鱼胚胎体内发射出红色荧光(图15b,d)。该实验表明 本发明所涉及的基于苯并吡喃腈的过氧化氢检测荧光探针分子可以在斑马鱼胚 胎体内对内源性的过氧化氢进行荧光识别。实验所用仪器为Olympus IX71荧光 显微镜。
Claims (9)
1.基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子，具有如下结构：
。
2.制备如权利要求1所述的基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的方法，包括以下步骤：
（1）将1-（2-羟基苯基）乙酮和钠在乙酸乙酯中室温剧烈搅拌4小时，得到的灰绿色固体经过滤，溶解在去离子水中，调节溶液的pH至中性，用乙酸乙酯萃取三次该水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体物，为化合物5；
用乙酸溶解步骤（1）所述化合物5，缓慢加入硫酸，加热回流30分钟，倒入冰水中，用碳酸钠调节溶液的pH至中性，用二氯甲烷萃取三次水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体物，为化合物4；
用乙酸酐溶解步骤（2）所述化合物4和丙二腈，加热回流14小时，减压蒸馏，加入去离子水，继续加热回流0.5小时，用二氯甲烷萃取三次水溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂分离提纯，得到化合物3；
将步骤（3）所述化合物3和对乙酰氨基苯甲醛溶解到甲苯中，加入冰乙酸和哌啶，在氮气保护下加热回流36小时，反应液冷却至室温，得到的橙色固体经过滤后，于浓盐酸和乙醇的混合溶液加热回流24小时，在冰浴条件下用饱和NaOH调节pH至中性，用乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的固体物，为化合物2；
用无水二氯甲烷溶解对硝基苯乙酮酸、N, N-二异丙基乙胺和2-（7-氧化苯并三氮唑）-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐，在氮气保护下冰浴反应1.5小时，加入步骤（4）所述化合物2，继续冰浴反应5小时，撤去冰浴，室温下反应12 h，点板确认反应结束后，用去离子水洗三次反应溶液，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，得到固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂分离提纯，得到的固体物即为基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中1-（2-羟基苯基）乙酮与钠的质量比为10 g: 8 g。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中化合物5、冰醋酸及硫酸的质量比为6.95 g: 73.5 g: 8.46 g。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中化合物4与丙二腈的摩尔比为1: 1.2 ，所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为3:7。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中化合物3与对乙酰氨基苯甲醛的摩尔比为1: 1，浓盐酸与乙醇的混合溶液体积比为3:2，所述洗脱剂为二氯甲烷。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中对硝基苯乙酮酸、N,N-二异丙基乙胺和2-（7-氧化苯并三氮唑）- N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐及化合物2的摩尔比为10: 2 : 2: 1；所述洗脱剂为石油醚与二氯甲烷的混合物，其体积比为1.5: 1。
8.如权利要求1所述的基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：检测水体样品、细胞内、线虫体内、斑马鱼体内的过氧化氢。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811328454.6A CN109810690A (zh) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | 基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811328454.6A CN109810690A (zh) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | 基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109810690A true CN109810690A (zh) | 2019-05-28 |
Family
ID=66601874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811328454.6A Withdrawn CN109810690A (zh) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | 基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109810690A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111393401A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-07-10 | 云南大学 | 一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途 |
| CN112480052A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-12 | 山西大学 | 一种检测pH的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用 |
| CN113004310A (zh) * | 2019-12-20 | 2021-06-22 | 湖南超亟化学科技有限公司 | 一种基于dcpo母核的过氧化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用 |
| CN113121488A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-07-16 | 云南大学 | 一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用 |
| CN114763345A (zh) * | 2021-01-14 | 2022-07-19 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一种基于苯并吡喃腈的特异性识别高锰酸钾的荧光分子探针的制备方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107417654A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-12-01 | 河南农业大学 | 一种基于苯并吡喃腈的亚硫酸根荧光探针及其制备方法 |
| CN108623611A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-10-09 | 北京工业大学 | 一种检测过氧化氢的荧光探针的合成与应用 |
-
2018
- 2018-11-09 CN CN201811328454.6A patent/CN109810690A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107417654A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-12-01 | 河南农业大学 | 一种基于苯并吡喃腈的亚硫酸根荧光探针及其制备方法 |
| CN108623611A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-10-09 | 北京工业大学 | 一种检测过氧化氢的荧光探针的合成与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XUAN ZHANG ET AL.: ""A near-infrared fluorescent probe for rapid detection of hydrogen peroxide in living cells"，", 《TETRAHEDRON》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113004310A (zh) * | 2019-12-20 | 2021-06-22 | 湖南超亟化学科技有限公司 | 一种基于dcpo母核的过氧化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用 |
| CN113004310B (zh) * | 2019-12-20 | 2022-07-08 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一种基于dcpo母核的过氧化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用 |
| CN111393401A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-07-10 | 云南大学 | 一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途 |
| CN112480052A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-12 | 山西大学 | 一种检测pH的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用 |
| CN112480052B (zh) * | 2020-12-08 | 2022-05-31 | 山西大学 | 一种检测pH的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用 |
| CN114763345A (zh) * | 2021-01-14 | 2022-07-19 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一种基于苯并吡喃腈的特异性识别高锰酸钾的荧光分子探针的制备方法及其应用 |
| CN113121488A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-07-16 | 云南大学 | 一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用 |
| CN113121488B (zh) * | 2021-04-21 | 2022-05-17 | 云南大学 | 一种基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109810690A (zh) | 基于苯并吡喃腈检测过氧化氢的荧光探针分子、制备方法及用途 | |
| Wang et al. | New colorimetric and fluorometric chemosensor for selective Hg2+ sensing in a near-perfect aqueous solution and bio-imaging | |
| Chen et al. | A novel imidazo [1, 5-α] pyridine-based fluorescent probe with a large Stokes shift for imaging hydrogen sulfide | |
| Vegesna et al. | pH-activatable near-infrared fluorescent probes for detection of lysosomal pH inside living cells | |
| Chen et al. | A phenothiazine coumarin-based red emitting fluorescent probe for nanomolar detection of thiophenol with a large Stokes shift | |
| Chen et al. | Development of a novel benzothiadiazole-based fluorescent turn-on probe for highly selective detection of glutathione over cysteine/homocysteine | |
| CN105017128B (zh) | 一种花菁类化合物及其应用 | |
| Yang et al. | BODIPY-based fluorescent probe for cysteine detection and its applications in food analysis, test strips and biological imaging | |
| CN106749364B (zh) | 一种检测次氯酸根离子的荧光分子探针的制备与应用 | |
| Chen et al. | A novel fluorescent probe with red emission and a large Stokes shift for selective imaging of endogenous cysteine in living cells | |
| Ismail et al. | A mitochondria-targeted red-emitting probe for imaging hydrogen sulfide in living cells and zebrafish | |
| CN109266331A (zh) | 一种基于半花菁结构测次氯酸根离子的近红外荧光探针、其制备方法及应用 | |
| Chen et al. | A red-emitting fluorescent probe for imaging hydrogen sulphide with a large Stokes shift | |
| Ai et al. | A dual-responsive fluorescent probe for detection of H2S and Cu2+ based on rhodamine-naphthalimide and cell imaging | |
| Zhang et al. | Acryl-modified diazabenzo [ghi] perylene for fast discrimination of Cys from GSH and Hcy with high quantum yield | |
| Wang et al. | A water-soluble turn-on fluorescent probe for rapid discrimination and imaging of Cys/Hcy and GSH in cells and zebrafish through different fluorescent channels | |
| Wang et al. | A diazabenzoperylene derivative as ratiometric fluorescent probe for cysteine with super large Stokes shift | |
| KR20120110620A (ko) | 고반응성 산소종 검출용 형광 분자 영상 프로브 및 이의 제조방법 | |
| Zhang et al. | A photostable reaction-based A–A–A type two-photon fluorescent probe for rapid detection and imaging of sulfur dioxide | |
| Zhou et al. | Fluorescent probe for highly selective detection of cysteine in living cells | |
| Tang et al. | A redox reversible endoplasmic reticulum-targeted fluorescent probe for revealing the redox status of living cells | |
| Lin et al. | A ratiometric fluorescent probe for fast detection and bioimaging of formaldehyde | |
| CN113121580B (zh) | 一种过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用 | |
| Zhao et al. | A 1, 3, 4-thiadiazole functionalized Schiff base based fluorescence enhancement and colorimetric probe for detection of Cu (II) ion and its potential applications | |
| CN106544008B (zh) | 一种基于罗丹明6g的铬离子检测荧光探针分子、制备方法及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190528 |