CN106526169A - 一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,旨在解决现有技术中T3免疫测定试剂的特异性和灵敏度方面都比较差的问题。一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液;羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。本发明采中包含羊单抗包被的磁珠,磁微粒(磁珠)上包被的是生物素的抗体,抗体为羊的单克隆抗体,试剂盒的特异性和灵敏度都比之前的T3免疫测定试剂高。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒,尤其涉及一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒。
背景技术
三碘甲状腺原氨酸(T3)属于小分子项目,现有T3免疫测定试剂的抗体一般为多克隆抗体或鼠的单克隆抗体,在特异性和灵敏度方面都有所欠缺。现有技术没有稀释待标记抗体至固定浓度,标记微量抗体时操作不方便,同时批间差异大,不同批次的试剂盒功能差距较大,造成稳定性较低。
发明内容
本发明提供了一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,旨在解决现有技术中T3免疫测定试剂的特异性和灵敏度方面都比较差的问题。
为了解决以上技术问题,本发明通过以下技术方案实现:一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液;羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。ANS解离剂为含ANS的解离剂(ANS:8-苯胺-1-萘磺酸8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid)。
进一步,所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:将羊单抗稀释到设定的浓度,对稀释后的羊单抗进行生物素标记获得生物素抗体,将生物素抗体包被在裸磁珠上获得羊单抗包被的磁珠;所述设定的浓度为固定值。
在对羊单抗标记之前,将羊单抗稀释到特定的浓度,可以提高试剂盒的稳定性,不同批次的试剂盒功能相近。
进一步,设定的浓度在0.1mg/mL~0.6mg/mL内取值。
羊单抗稀释到特定的浓度在该范围内时,试剂盒的效价较高,而且稳定性好。
进一步,所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、采用PBS缓冲液对羊单抗透析,取出透析完毕后的羊单抗;将透析完毕后取出的羊单抗稀释到设定的浓度;
B、将BNHS溶于DMSO中,配置成BNHS溶液;其中BNHS(N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯;EZ-Link NHS-LC-Biotin,50mg,厂家:Thermo Prod#21336);
C、将稀释后的羊单抗和BNHS溶液混合并反应,反应设定时间后,加入Tris缓冲液终止反应,获得生物素抗体;
E、采用PBS缓冲液对生物素抗体进行透析;
F、取出透析后的生物素抗体,生物素抗体包被裸磁珠,获得羊单抗包被的磁珠。
进一步,所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、采用0.1~0.3mol/L的PBS缓冲液对的羊单抗透析,透析的温度为2~8℃;取出透析析完毕后的羊单抗,将羊单抗稀释到设定的浓度;
B、将BNHS溶于DMSO中,配置成8~12mmol/L的BNHS溶液;
C、将步骤A解析后的羊单抗和步骤B配制的BNHS溶液混合并反应28~33分钟;
D、用0.8~1.2mol/L的Tris缓冲液终止步骤C的反应;获得生物素抗体;
E、采用浓度为0.1~0.3mol/L的PBS缓冲液对生物素抗体进行透析,透析的温度为2~8℃;
F、向透析后的生物素抗体加入丙三醇,生物素抗体与丙三醇体积比为4:5~5:4;
G、生物素抗体包被裸磁珠,获得羊单抗包被的磁珠;用0.08~0.12%BSA的缓冲液对羊单抗包被的磁珠稀释到设定浓度。
进一步,酶工作液为BSA的缓冲液和ALP标记的T3衍生物的混合溶液。ALP标记的T3衍生物为碱性磷酸酶标记的T3衍生物,在一种类似T3抗原的分子上连接碱性磷酸酶,既具有酶的高催化性,又具有T3抗原的特异性。
与现有技术相比本发明的优点是:本发明采中包含羊单抗包被的磁珠,磁微粒(磁珠)上包被的是生物素的抗体,抗体为羊的单克隆抗体,试剂盒的特异性和灵敏度都比之前的T3免疫测定试剂高。
具体实施方式
实施例一:
一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液,羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、取0.25mg羊单抗,用0.2mmol/L PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
B、取出透析好的羊单抗于适当容器,准确量取体积并记录,将羊单抗稀释为0.5mg/mL备用。
C、称取1.0mg的BNHS,用217μLDMSO充分溶解,配制成10mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS与羊单抗的比例为20:1的量加入到透析后的羊单抗中,充分混匀后室温反应30min。即1.0mg的抗体加入10mmol/LBNHS 13.3μL。0.25mg加入配置好的10mmol/LBNHS 3.3μL。
E、取1mol/LTris缓冲液进行终止反应,加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一,充分混匀,室温反应10Min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋,用0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出,并准确量取体积,加入等体积的丙三醇,贴签,并记录浓度,于-20℃保存,备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠,包被量为1μg/mg,获得羊单抗包被的磁珠。用1%BSA的缓冲液Buffer稀释后,备用。
实施例二:
一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液,羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、取0.2mg羊单抗,用0.12mol/L PBS(PH7.4)缓冲液4.5L进行2~8℃透析过夜。
B、取出透析好的羊单抗于适当容器,准确量取体积并记录,将羊单抗稀释为0.2mg/mL备用。
C、将BNHS溶于DMSO中,配制成8mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS与羊单抗的比例为18:1的量加入到透析后的羊单抗中,充分混匀后室温反应28min。
E、取1mol/L的Tris缓冲液进行终止反应,加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一,充分混匀,室温反应11Min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋,用0.2mol/L的PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出,并准确量取体积,向透析后的生物素抗体加入丙三醇,生物素抗体与丙三醇体积比为4:5,贴签,并记录浓度,于-20℃保存,备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠,包被量为0.12μg/mg,获得羊单抗包被的磁珠。用1%BSA的缓冲液Buffer稀释后,备用。
实施例三:
一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液,羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、取0.3mg羊单抗,用0.12mol/LPBS(PH7.4)缓冲液6L进行2~8℃透析过夜。
B、取出透析好的羊单抗于适当容器,准确量取体积并记录,将羊单抗稀释为0.1mg/mL备用。
C、将BNHS溶于DMSO中,配制成11mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS与羊单抗的比例为21:1的量加入到透析后的羊单抗中,充分混匀后室温反应31min。
E、取1.1mol/L的Tris缓冲液进行终止反应,加入1.1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一,充分混匀,室温反应9Min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋,用0.3mol/L的PBS(PH7.5)缓冲液5.5L进行2~8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出,并准确量取体积,向透析后的生物素抗体加入丙三醇,生物素抗体与丙三醇体积比为5:4,贴签,并记录浓度,于-20℃保存,备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠,包被量为0.09μg/mg,获得羊单抗包被的磁珠。用0.11%BSA的缓冲液Buffer稀释后,备用。
下面结合实验来进一步说明本发明的有益效果:
实验一:兔多抗、鼠单抗和羊单抗在同等情况下,试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
实验材料:BNHS,0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液,1mmol/LTris缓冲液,丙三醇,DMSO,T3抗体3种(兔多抗,鼠单抗,羊单抗),含有1%BSA的缓冲液Buffer,ALP标记的T3衍生物,ANS解离剂,裸磁珠,T3校准品cal-1,cal-5(将T3纯品稀释到含5%BSA的缓冲液Buffer,Cal-1到Cal-5的浓度为0,0.3,1,3,10ng/mL),高浓度T4,底物液,清洗液,滨松光子半自动化学发光测定仪。
采用实施例一的方法,将上述兔多抗、鼠单抗和羊单抗包被的磁珠分别与解离剂,酶工作液共同组成试剂盒,测定T3校准品cal-1至cal-5,及高浓度的T4,观察不同抗体的测定曲线及特异性。
反应模式为:先加入校准品30μL,磁珠50μL,解离剂50μL37℃共同孵育15min后,再加入酶工作液37℃孵育15Min,加入清洗液在磁场中清洗分离三次后,加入底物液37℃孵育5Min后,于半自动化学发光测定仪上检测。
实验结果如表1所示:
表1
实验结论:采用兔多抗的试剂盒灵敏度和特异性均较差,采用鼠单抗的试剂盒曲线基本满足使用,灵敏度够用,但特异性较差。采用羊单抗的试剂盒灵敏度和特异性均有很大的提高。
实验二:不同浓度的羊单抗,试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
有三批羊单抗,浓度分别5mg/mL,2.5mg/mL,1mg/mL,分别标记生物素后,按照实验一的方法对T3校准品进行测定,观察批间差。
实验材料:BNHS,0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液,1mol/L的Tris缓冲液,丙三醇,DMSO,T3抗体(均为羊单抗,浓度分别为5mg/mL,2.5mg/mL,1mg/mL),含有1%BSA的缓冲液Buffer,ALP标记的T3衍生物,ANS解离剂,裸磁珠,T3校准品cal-1,cal-5(将T3纯品稀释到含5%BSA的缓冲液Buffer,Cal-1到Cal-5的浓度为0,0.3,1,3,10ng/mL),底物液,清洗液,滨松光子半自动化学发光测定仪。
实验方法参照实验一;备注:将三种浓度的抗体进行透析后,回收体积基本不变,则透析后的浓度依然与原浓度一致。
实验结果如表2:
表2
实验结论:同为羊单抗,但由于标记生物素时浓度不同,按相同的标记方法所制备的试剂盒批间差较大,且抗体浓度越大,试剂盒的效价越低。
实验三:固定T3抗体浓度,试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
根据实验二所得出的结论,将羊单抗均稀释到相同的浓度,再进行生物素的标记,观察对批间差和效价的影响。
实验材料:BNHS,0.2mol/LPBS(PH7.4)缓冲液,1mol/LTris缓冲液,丙三醇,DMSO,T3抗体(均为羊单抗,浓度分别为5mg/mL,2.5mg/mL,1mg/mL),含有1%BSA的缓冲液Buffer,ALP标记的T3衍生物,ANS解离剂,裸磁珠,T3校准品cal-1,cal-5(将T3纯品稀释到含5%BSA的缓冲液Buffer,Cal-1到Cal-5的浓度为0,0.3,1,3,10ng/mL),底物液,清洗液,滨松光子半自动化学发光测定仪。
实验方法参照实验一,将实施例一步骤B中“取出透析好的羊单抗于适当容器,准确量取体积并记录,将羊单抗稀释为0.5mg/mL备用。”替换为:“取出透析好的羊单抗于适当容器,准确量取体积并记录,将三种不同浓度的抗体均稀释成0.5mg/mL备用。”
实验结果如表3:
表3
实验结论:将三种不同浓度的羊单抗均稀释到0.5mg/mL后标记生物素,然后包被磁珠构成的的三种T3试剂盒的效价基本一致,曲线基本相同,稀释后抗体标记生物素能够有效控制产品的批间差。
实验四:不同浓度的羊单抗进行生物素标记,试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
实验材料:实验二和实验三中2.5mg/mL以及将2.5mg/mL稀释至0.5mg/mL进行生物素标记后包被的两种磁珠,酶工作液,解离剂,T3校准品,底物液,清洗液,滨松光子半自动化学发光测定仪,恒温培养箱。
实验方法:将制备好的两种磁珠,每种等体积分成两份,一份与2-8℃保存,一份于恒温培养箱中37℃保存,6天后取出。将四份磁珠分别于解离剂和酶工作液配合测定T3校准品。观察校准品的发光信号,计算信号保留率,验证磁珠的稳定性。
实验结果如表4:
表4
实验结论:抗体稀释后标记生物素抗体包被的磁珠37摄氏度存放后信号保留率更高,稳定性更好。
综上四个实验可以得出:表明T3测定试剂盒在采用羊单抗时,灵敏度和特异性均有效提高。在生物素标记之前,将羊单抗稀释为一个固定的设定浓度,可以提高试剂盒的稳定性,设定浓度太低会浪费资源。
以上所述仅为本发明的具体实施例,但本发明的技术特征并不局限于此,任何本领域的技术人员在本发明的领域内,所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (7)
1.一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液,羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
2.根据权利要求1所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:羊单抗包被的磁珠包被量为0.08~0.12μg/mg。
3.根据权利要求1所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:所述羊单抗包被的磁珠制备方法为:将羊单抗稀释到设定的浓度,对稀释后的羊单抗进行生物素标记获得生物素抗体,将生物素抗体包被在裸磁珠上获得羊单抗包被的磁珠;所述设定的浓度为固定值。
4.根据权利要求3所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:设定的浓度在0.1mg/mL~0.6mg/mL内取值。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、采用PBS缓冲液对羊单抗透析,取出透析完毕后的羊单抗;将透析完毕后取出的羊单抗稀释到设定的浓度;
B、将BNHS溶于DMSO中,配置成BNHS溶液;
C、将稀释后的羊单抗和BNHS溶液混合并反应,反应设定时间后,加入Tris缓冲液终止反应,获得生物素抗体;
E、采用PBS缓冲液对生物素抗体进行透析;
F、取出透析后的生物素抗体,生物素抗体包被裸磁珠,获得羊单抗包被的磁珠。
6.根据权利要求5所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为:
A、采用0.1~0.3mol/L的PBS缓冲液对的羊单抗透析,透析的温度为2~8℃;取出透析析完毕后的羊单抗,将羊单抗稀释到设定的浓度;
B、将BNHS溶于DMSO中,配置成8~12mmol/L的BNHS溶液;
C、将步骤A解析后的羊单抗和步骤B配制的BNHS溶液混合并反应28~33分钟;
D、用0.8~1.2mol/L的Tris缓冲液终止步骤C的反应;获得生物素抗体;
E、采用浓度为0.1~0.3mol/L的PBS缓冲液对生物素抗体进行透析,透析的温度为2~8℃;
F、向透析后的生物素抗体加入丙三醇,生物素抗体与丙三醇体积比为4:5~5:4;
G、生物素抗体包被裸磁珠,获得羊单抗包被的磁珠;用0.08~0.12%BSA的缓冲液对羊单抗包被的磁珠稀释到设定浓度。
7.根据权利要求1所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒,其特征是:所述酶工作液为BSA的缓冲液和ALP标记的T3衍生物的混合溶液。
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