CN106526169A - 一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，旨在解决现有技术中T3免疫测定试剂的特异性和灵敏度方面都比较差的问题。一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液；羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。本发明采中包含羊单抗包被的磁珠，磁微粒(磁珠)上包被的是生物素的抗体，抗体为羊的单克隆抗体，试剂盒的特异性和灵敏度都比之前的T3免疫测定试剂高。

Description

一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒。
背景技术
三碘甲状腺原氨酸(T3)属于小分子项目，现有T3免疫测定试剂的抗体一般为多克隆抗体或鼠的单克隆抗体，在特异性和灵敏度方面都有所欠缺。现有技术没有稀释待标记抗体至固定浓度，标记微量抗体时操作不方便，同时批间差异大，不同批次的试剂盒功能差距较大，造成稳定性较低。
发明内容
本发明提供了一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，旨在解决现有技术中T3免疫测定试剂的特异性和灵敏度方面都比较差的问题。
为了解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液；羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。ANS解离剂为含ANS的解离剂(ANS：8-苯胺-1-萘磺酸8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid)。
进一步，所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：将羊单抗稀释到设定的浓度，对稀释后的羊单抗进行生物素标记获得生物素抗体，将生物素抗体包被在裸磁珠上获得羊单抗包被的磁珠；所述设定的浓度为固定值。
在对羊单抗标记之前，将羊单抗稀释到特定的浓度，可以提高试剂盒的稳定性，不同批次的试剂盒功能相近。
进一步，设定的浓度在0.1mg/mL～0.6mg/mL内取值。
羊单抗稀释到特定的浓度在该范围内时，试剂盒的效价较高，而且稳定性好。
进一步，所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、采用PBS缓冲液对羊单抗透析，取出透析完毕后的羊单抗；将透析完毕后取出的羊单抗稀释到设定的浓度；
B、将BNHS溶于DMSO中，配置成BNHS溶液；其中BNHS(N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯；EZ-Link NHS-LC-Biotin，50mg，厂家：Thermo Prod#21336)；
C、将稀释后的羊单抗和BNHS溶液混合并反应，反应设定时间后，加入Tris缓冲液终止反应，获得生物素抗体；
E、采用PBS缓冲液对生物素抗体进行透析；
F、取出透析后的生物素抗体，生物素抗体包被裸磁珠，获得羊单抗包被的磁珠。
进一步，所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、采用0.1～0.3mol/L的PBS缓冲液对的羊单抗透析，透析的温度为2～8℃；取出透析析完毕后的羊单抗，将羊单抗稀释到设定的浓度；
B、将BNHS溶于DMSO中，配置成8～12mmol/L的BNHS溶液；
C、将步骤A解析后的羊单抗和步骤B配制的BNHS溶液混合并反应28～33分钟；
D、用0.8～1.2mol/L的Tris缓冲液终止步骤C的反应；获得生物素抗体；
E、采用浓度为0.1～0.3mol/L的PBS缓冲液对生物素抗体进行透析，透析的温度为2～8℃；
F、向透析后的生物素抗体加入丙三醇，生物素抗体与丙三醇体积比为4:5～5:4；
G、生物素抗体包被裸磁珠，获得羊单抗包被的磁珠；用0.08～0.12％BSA的缓冲液对羊单抗包被的磁珠稀释到设定浓度。
进一步，酶工作液为BSA的缓冲液和ALP标记的T3衍生物的混合溶液。ALP标记的T3衍生物为碱性磷酸酶标记的T3衍生物，在一种类似T3抗原的分子上连接碱性磷酸酶，既具有酶的高催化性，又具有T3抗原的特异性。
与现有技术相比本发明的优点是：本发明采中包含羊单抗包被的磁珠，磁微粒(磁珠)上包被的是生物素的抗体，抗体为羊的单克隆抗体，试剂盒的特异性和灵敏度都比之前的T3免疫测定试剂高。
具体实施方式
实施例一：
一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液，羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、取0.25mg羊单抗，用0.2mmol/L PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2～8℃透析过夜。
B、取出透析好的羊单抗于适当容器，准确量取体积并记录，将羊单抗稀释为0.5mg/mL备用。
C、称取1.0mg的BNHS，用217μLDMSO充分溶解，配制成10mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS与羊单抗的比例为20：1的量加入到透析后的羊单抗中，充分混匀后室温反应30min。即1.0mg的抗体加入10mmol/LBNHS 13.3μL。0.25mg加入配置好的10mmol/LBNHS 3.3μL。
E、取1mol/LTris缓冲液进行终止反应，加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一，充分混匀，室温反应10Min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋，用0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2～8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出，并准确量取体积，加入等体积的丙三醇，贴签，并记录浓度，于-20℃保存，备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠，包被量为1μg/mg，获得羊单抗包被的磁珠。用1％BSA的缓冲液Buffer稀释后，备用。
实施例二：
一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液，羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、取0.2mg羊单抗，用0.12mol/L PBS(PH7.4)缓冲液4.5L进行2～8℃透析过夜。
B、取出透析好的羊单抗于适当容器，准确量取体积并记录，将羊单抗稀释为0.2mg/mL备用。
C、将BNHS溶于DMSO中，配制成8mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS与羊单抗的比例为18：1的量加入到透析后的羊单抗中，充分混匀后室温反应28min。
E、取1mol/L的Tris缓冲液进行终止反应，加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一，充分混匀，室温反应11Min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋，用0.2mol/L的PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2～8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出，并准确量取体积，向透析后的生物素抗体加入丙三醇，生物素抗体与丙三醇体积比为4:5，贴签，并记录浓度，于-20℃保存，备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠，包被量为0.12μg/mg，获得羊单抗包被的磁珠。用1％BSA的缓冲液Buffer稀释后，备用。
实施例三：
一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液，羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、取0.3mg羊单抗，用0.12mol/LPBS(PH7.4)缓冲液6L进行2～8℃透析过夜。
B、取出透析好的羊单抗于适当容器，准确量取体积并记录，将羊单抗稀释为0.1mg/mL备用。
C、将BNHS溶于DMSO中，配制成11mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS与羊单抗的比例为21：1的量加入到透析后的羊单抗中，充分混匀后室温反应31min。
E、取1.1mol/L的Tris缓冲液进行终止反应，加入1.1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一，充分混匀，室温反应9Min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋，用0.3mol/L的PBS(PH7.5)缓冲液5.5L进行2～8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出，并准确量取体积，向透析后的生物素抗体加入丙三醇，生物素抗体与丙三醇体积比为5:4，贴签，并记录浓度，于-20℃保存，备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠，包被量为0.09μg/mg，获得羊单抗包被的磁珠。用0.11％BSA的缓冲液Buffer稀释后，备用。
下面结合实验来进一步说明本发明的有益效果：
实验一：兔多抗、鼠单抗和羊单抗在同等情况下，试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
实验材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液，1mmol/LTris缓冲液，丙三醇，DMSO，T3抗体3种(兔多抗，鼠单抗，羊单抗)，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的T3衍生物，ANS解离剂，裸磁珠，T3校准品cal-1,cal-5(将T3纯品稀释到含5％BSA的缓冲液Buffer，Cal-1到Cal-5的浓度为0，0.3，1，3，10ng/mL)，高浓度T4，底物液，清洗液，滨松光子半自动化学发光测定仪。
采用实施例一的方法，将上述兔多抗、鼠单抗和羊单抗包被的磁珠分别与解离剂，酶工作液共同组成试剂盒，测定T3校准品cal-1至cal-5，及高浓度的T4，观察不同抗体的测定曲线及特异性。
反应模式为：先加入校准品30μL，磁珠50μL，解离剂50μL37℃共同孵育15min后，再加入酶工作液37℃孵育15Min，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5Min后，于半自动化学发光测定仪上检测。
实验结果如表1所示：
表1
实验结论：采用兔多抗的试剂盒灵敏度和特异性均较差，采用鼠单抗的试剂盒曲线基本满足使用，灵敏度够用，但特异性较差。采用羊单抗的试剂盒灵敏度和特异性均有很大的提高。
实验二：不同浓度的羊单抗，试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
有三批羊单抗，浓度分别5mg/mL，2.5mg/mL，1mg/mL，分别标记生物素后，按照实验一的方法对T3校准品进行测定，观察批间差。
实验材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)缓冲液，1mol/L的Tris缓冲液，丙三醇，DMSO，T3抗体(均为羊单抗，浓度分别为5mg/mL，2.5mg/mL，1mg/mL)，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的T3衍生物，ANS解离剂，裸磁珠，T3校准品cal-1,cal-5(将T3纯品稀释到含5％BSA的缓冲液Buffer，Cal-1到Cal-5的浓度为0，0.3，1，3，10ng/mL)，底物液，清洗液，滨松光子半自动化学发光测定仪。
实验方法参照实验一；备注：将三种浓度的抗体进行透析后，回收体积基本不变，则透析后的浓度依然与原浓度一致。
实验结果如表2：
表2
实验结论：同为羊单抗，但由于标记生物素时浓度不同，按相同的标记方法所制备的试剂盒批间差较大，且抗体浓度越大，试剂盒的效价越低。
实验三：固定T3抗体浓度，试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
根据实验二所得出的结论，将羊单抗均稀释到相同的浓度，再进行生物素的标记，观察对批间差和效价的影响。
实验材料：BNHS，0.2mol/LPBS(PH7.4)缓冲液，1mol/LTris缓冲液，丙三醇，DMSO，T3抗体(均为羊单抗，浓度分别为5mg/mL，2.5mg/mL，1mg/mL)，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的T3衍生物，ANS解离剂，裸磁珠，T3校准品cal-1,cal-5(将T3纯品稀释到含5％BSA的缓冲液Buffer，Cal-1到Cal-5的浓度为0，0.3，1，3，10ng/mL)，底物液，清洗液，滨松光子半自动化学发光测定仪。
实验方法参照实验一，将实施例一步骤B中“取出透析好的羊单抗于适当容器，准确量取体积并记录，将羊单抗稀释为0.5mg/mL备用。”替换为：“取出透析好的羊单抗于适当容器，准确量取体积并记录，将三种不同浓度的抗体均稀释成0.5mg/mL备用。”
实验结果如表3：
表3
实验结论：将三种不同浓度的羊单抗均稀释到0.5mg/mL后标记生物素，然后包被磁珠构成的的三种T3试剂盒的效价基本一致，曲线基本相同，稀释后抗体标记生物素能够有效控制产品的批间差。
实验四：不同浓度的羊单抗进行生物素标记，试剂盒灵敏度与特异性比较实验。
实验材料：实验二和实验三中2.5mg/mL以及将2.5mg/mL稀释至0.5mg/mL进行生物素标记后包被的两种磁珠，酶工作液，解离剂，T3校准品，底物液，清洗液，滨松光子半自动化学发光测定仪，恒温培养箱。
实验方法：将制备好的两种磁珠，每种等体积分成两份，一份与2-8℃保存，一份于恒温培养箱中37℃保存，6天后取出。将四份磁珠分别于解离剂和酶工作液配合测定T3校准品。观察校准品的发光信号，计算信号保留率，验证磁珠的稳定性。
实验结果如表4：
表4
实验结论：抗体稀释后标记生物素抗体包被的磁珠37摄氏度存放后信号保留率更高，稳定性更好。
综上四个实验可以得出：表明T3测定试剂盒在采用羊单抗时，灵敏度和特异性均有效提高。在生物素标记之前，将羊单抗稀释为一个固定的设定浓度，可以提高试剂盒的稳定性，设定浓度太低会浪费资源。
以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (7)

1.一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：包括羊单抗包被的磁珠、ANS解离剂和酶工作液，羊单抗包被的磁珠上标记有生物素。
2.根据权利要求1所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：羊单抗包被的磁珠包被量为0.08～0.12μg/mg。
3.根据权利要求1所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：所述羊单抗包被的磁珠制备方法为：将羊单抗稀释到设定的浓度，对稀释后的羊单抗进行生物素标记获得生物素抗体，将生物素抗体包被在裸磁珠上获得羊单抗包被的磁珠；所述设定的浓度为固定值。
4.根据权利要求3所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：设定的浓度在0.1mg/mL～0.6mg/mL内取值。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、采用PBS缓冲液对羊单抗透析，取出透析完毕后的羊单抗；将透析完毕后取出的羊单抗稀释到设定的浓度；
B、将BNHS溶于DMSO中，配置成BNHS溶液；
C、将稀释后的羊单抗和BNHS溶液混合并反应，反应设定时间后，加入Tris缓冲液终止反应，获得生物素抗体；
E、采用PBS缓冲液对生物素抗体进行透析；
F、取出透析后的生物素抗体，生物素抗体包被裸磁珠，获得羊单抗包被的磁珠。
6.根据权利要求5所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：所述羊单抗包被的磁珠的制备方法为：
A、采用0.1～0.3mol/L的PBS缓冲液对的羊单抗透析，透析的温度为2～8℃；取出透析析完毕后的羊单抗，将羊单抗稀释到设定的浓度；
B、将BNHS溶于DMSO中，配置成8～12mmol/L的BNHS溶液；
C、将步骤A解析后的羊单抗和步骤B配制的BNHS溶液混合并反应28～33分钟；
D、用0.8～1.2mol/L的Tris缓冲液终止步骤C的反应；获得生物素抗体；
E、采用浓度为0.1～0.3mol/L的PBS缓冲液对生物素抗体进行透析，透析的温度为2～8℃；
F、向透析后的生物素抗体加入丙三醇，生物素抗体与丙三醇体积比为4:5～5:4；
G、生物素抗体包被裸磁珠，获得羊单抗包被的磁珠；用0.08～0.12％BSA的缓冲液对羊单抗包被的磁珠稀释到设定浓度。
7.根据权利要求1所述的一种用于测定三碘甲状腺原氨酸的试剂盒，其特征是：所述酶工作液为BSA的缓冲液和ALP标记的T3衍生物的混合溶液。
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