RU2189396C2 - Способ обнаружения и дифференциации рнк энтеровирусов - Google Patents
Способ обнаружения и дифференциации рнк энтеровирусов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2189396C2 RU2189396C2 RU2000126996A RU2000126996A RU2189396C2 RU 2189396 C2 RU2189396 C2 RU 2189396C2 RU 2000126996 A RU2000126996 A RU 2000126996A RU 2000126996 A RU2000126996 A RU 2000126996A RU 2189396 C2 RU2189396 C2 RU 2189396C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- enteroviruses
- differentiation
- evr
- enterovirus
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано при диагностике энтеровирусных инфекций в эпидемиологических исследованиях. Способ включает проведение реакций обратной транскрипции ДНК методом "полугнездовой" ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров следующего состава: EVR 1:5' - caccggatggccaatccaa; EVF: 5' - cggtacctttgtgcgcctgtttt; EVR 2: 5' - aattgtcaccataagcagcca, в результате чего получают участок длиной 546 п.н., содержащий сайты для дифференцирующих рестриктаз. Полученную кДНК гидролизуют последовательно набором рестриктаз Sty I, Bam H I, Ava I, Sma I (Cla I), Pvu II. Путем сравнения электрофоретических профилей гидролизатов определяют принадлежность выявленной РНК к тому или иному типу энтеровирусов или штамму. Представленное изобретение позволяет более просто и точно выявить и дифференцировать РНК энтеровирусов. 1 ил.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к методу диагностики энтеровирусных инфекций, основанному на детекции и анализе генетического материала возбудителя.
Известны следующие способы выявления и дифференциации энтеровирусов, основанные на анализе генетического материала:
1. Выявление энтеровирусов методом одноступенчатой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационной детекцией продукта реакции. Пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд принадлежат к консервативной 5'-NTR области генома и являются универсальными для всех представителей рода Enterovirus (Rotbart H.A. Enzimatic RNA Ampliphication of the Enterovirus. Clin. Microbiol. - 1990.- Mar.-P. 438-442; Chapman N.H., Tracy S., Gountt C. I. , Fortmuller U. Molecular Detection and Identification of Enteroviruses Using Enzimatic Ampliphication and Nucleic Acid Hybridazation. Clin. Microbiol. -1990.-May.-P. 843-850).
1. Выявление энтеровирусов методом одноступенчатой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационной детекцией продукта реакции. Пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд принадлежат к консервативной 5'-NTR области генома и являются универсальными для всех представителей рода Enterovirus (Rotbart H.A. Enzimatic RNA Ampliphication of the Enterovirus. Clin. Microbiol. - 1990.- Mar.-P. 438-442; Chapman N.H., Tracy S., Gountt C. I. , Fortmuller U. Molecular Detection and Identification of Enteroviruses Using Enzimatic Ampliphication and Nucleic Acid Hybridazation. Clin. Microbiol. -1990.-May.-P. 843-850).
2. Выявление отдельных представителей рода и идентификация штаммов методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных для каждого серотипа или штамма (Weiss L.M., Movahed L.A., Billigham M. E., Clary M.L. Detection of Coxsacievirus B3 RNA in Myocardiol Tissues by the Polimerase Chein Reaction. Virus Res. -1991.- V.20, 2. - P. 159-179; Черкасова Е.А., Липская Г.Ю., Белова Г.И. и др. Обнаружение штаммов вируса полиомиелита в природных изолятах и их идентификация с помощью полимеразной цепной реакции. Мол. генетика, микробиология, вирусология.- 1996.- 2.-С.25-32).
3. Выявление всех энтеровирусов методом ПЦР с дифференциацией на полио- и неполиовирусы методом молекулярной гибридизации (Egger D., Pasamontes L., Ostermayer M. , Biens К. Reverse transcription multiplex PCR for differentiation between polio- and enterovirus from clinical and environmental samples. Clin. Microbiol. -1995.- V. 33, 6. -Р. 1442-1447).
4. Дифференциация энтеровирусов путем частичного секвенирования участков генома (Oberste M.S., Maher К., Kilpatrick D.L., Flemister M.R., Broun B.A., Pallansh M. A. Typing of human enteroviruses by partial seguencing of VP1. Clin. Microbiol.-1999.-V.37, 5. -P. 1288-1293).
Однако, эти методы преследуют цель или только выявления всей группы энтеровирусов (1), или приблизительной дифференциации выявленных энтеровирусов на группы полио- и неполиовирусов (3), или идентификацию отдельных представителей энтеровирусов, где для каждого серотипа или штамма используется специфичный набор праймеров. Способ (4) требует дополнительного оборудования и достаточно продолжителен.
Наиболее близким предлагаемому изобретению является метод полимеразной цепной реакции - полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР - ПДРФ), используемый при дифференциации диких и вакцинных штаммов полиовирусов. В этом случае осуществляют обратную транскрипцию геномного сегмента полиовируса (480 нуклеотидов, принадлежащих району, кодирующему N-концевую половину капсидного белка VP1) и его амплификацию в ПЦР. При ПДРФ анализе образующейся двуцепочечной ДНК производится ее гидролиз специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофоретическим разделением образующихся ДНК фрагментов различной длины. Таким образом, профили ПДРФ, полученные из эквивалентных геномных сегментов разных вирусных штаммов, можно быстро сравнивать при высоком уровне специфичности. Однако, в этом случае решается узкая задача: идентификация диких и вакцинных штаммов полиовирусов, исключая остальных представителей рода Enterovirus (Новые подходы к лабораторной диагностике полиовирусных инфекций: меморандум совещания ВОЗ. Бюлл. ВОЗ. -1992.- 2,- С. 23-29).
Цель изобретения - упрощение и унификация дифференциального выявления РНК энтеровирусов, повышение точности дифференциации.
Сущность изобретения заключается в том, что при выявлении РНК энтеровирусов для проведения обратной транскрипции и амплификации методом "полугнездовой" ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры следующего состава: EVR 1: 5' - caccggatggccaatccaa; EVF: 5' - cggtacctttgtgcgcctgtttt; EVR 2: 5' - aattgtcaccataagcagcca; принадлежащие 5' - NTR области генома энтеровирусов, в результате чего получают участок длиной 546 п.н., содержащий сайты для дифференцирующих рестриктаз. Полученную кДНК гидролизуют последовательно набором рестриктаз Sty I, Bam НI, Ava I, Sma I (Cla I), Pvu II. Путем сравнения электрофоретических профилей гидролизатов определяют принадлежность выявленной РНК к тому или иному типу энтеровирусов или штамму.
Пример 1. Выбор последовательности праймеров и рестриктаз. Выбор олигонуклеотидных праймеров проводят по следующим критериям:
1. универсальность для рода Enterovirus;
2. возможность амплификации в "гнездовом" или "полугнездовом" вариантах ПЦР, имеющих более высокую чувствительность и специфичность при выявлении НК в сравнении с однораундовой ПЦР;
3. наличие в амплифицируемом фрагменте ДНК сайтов рестрикции, по которым можно проводить дифференцировку.
1. универсальность для рода Enterovirus;
2. возможность амплификации в "гнездовом" или "полугнездовом" вариантах ПЦР, имеющих более высокую чувствительность и специфичность при выявлении НК в сравнении с однораундовой ПЦР;
3. наличие в амплифицируемом фрагменте ДНК сайтов рестрикции, по которым можно проводить дифференцировку.
Основой для поиска праймеров является компьютерный анализ с помощью программы "Primer-Master l. 0" (Japan, 1989), полных нуклеотидных последовательностей геномных РHК энтеровирусов, собранных в базах данных Entrez, Gene Bank, EMBL.
С использованием программы "Microgenie" (Bekman, USA, 1987) для каждого энтеровируса составляют рестриктные карты фрагмента, ограничиваемого выбранными праймерами. Путем сравнения полученных карт выбирают дифференцирующие рестриктазы, составляют алгоритмы типирования энтеровирусов.
Пример 2. Выявление РНК энтеровирусов в ПЦР. Дифференциация на геногруппы полио- и неполиовирусов с использованием рестриктаз Sty I и Ваm HI.
Выделение РНК энтеровирусов из исследуемой пробы (культуральная жидкость, фекальный экстракт, сыворотка крови, спиномозговая жидкость, смыв носоглотки) проводят стандартно (Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. -М.: Мир.- 1984.-С. 186-192).
В качестве положительного контроля используют культуральную жидкость, содержащую полиовирусы вакцинных штаммов Sabin I, Sabin II, Sabin III.
Обратную транскрипцию проводят с ревертазой M-MulV и статистическими гексануклеотидами или праймером ERV1. Амплификацию кДНК осуществляют, используя Tag-полимеразу и праймеры VRE 1 и EVF в первом раунде ПЦР и VRE2 и EVF - во втором раунде. Положительные пробы содержат фрагменты кДНК энтеровирусов длиной 546 п. н., выявляемую методом гель-электрофореза с окраской бромидом этидия. Проводят гидролиз выявленных кДНК рестриктазой Sty I. После электрофореза в 2,5% агарозном геле сравнивают электрофоретические профили. При гидролизе кДНК полиовируса 1 образуются фрагменты длиной 222 и 324 п.н., полиовируса 2 - 198 и 348 п.н., полиовируса 3 - 133 и 413 п.н. (см. чертеж). Подобные электрофоретические профили кДПК не встречаются у других энтеровирусов за исключением энтеровируса 70, который имеет сходный профиль с кДНК полиовируса 1. В связи с этим, для исключения ошибки проводят гидролиз исходного фрагмента кДНК рестриктазой Bam HI, которая имеет сайт рестрикции только на кДНК полиовируса 1, и делают окончательное определение принадлежности выявленной РНК к тому или иному типу энтеровирусов.
Пример 3. Определение принадлежности 5'- NTR генома полиовирусов к штаммам вакцинного происхождения.
Для определения принадлежности выявленных участков 5'- NTR генома полиовирусов к штаммам вакцинного происхождения проводят гидролиз фрагментов кДНК, полученных в ПЦР, рестриктазами Ava I для полиовируса 1, Sma I или Cla I для полиовируса 2, Pvu II для полиовируса 3, которые имеют сайты рестрикции только на кДНК вакцинных штаммов (см. чертеж).
Таким образом, использование предлагаемого набора праймеров и рестриктаз позволяет унифицировать выявление энтеровирусов с одновременной их дифференциацией, основываясь на анализе одного и того же геномного фрагмента; упростить дифференциацию энтеровирусов, исключая подбор праймеров для каждого типа вируса; использовать стандартное оборудование ПЦР лаборатории.
Изобретение может быть применено для выявления энтеровирусов, для дифференциального выявления энтеровирусов, для идентификации 5'- NTR генома вакцинных штаммов полиовирусов в лабораториях ПЦР - диагностики и при научных исследованиях.
Метод разработан и апробирован в лаборатории кишечных вирусных инфекций Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной.
Claims (1)
- Способ выявления и дифференциации РНК энтеровирусов, включающий проведение реакций обратной транскрипции ДНК методом "полугнездовой" ПЦР с последующим сравнением электрофоретических профилей кДНК, гидролизованной специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), отличающийся тем, что используют олигонуклеотидные праймеры следующего состава: EVR 1: 5'-caccggatggccaatccaa; EVF: 5'-cggtacctttgtgcgcctgtttt; EVR 2: 5'-aattgtcaccataagcagcca; ограничивающие участок 546 нуклеотидов 5'-NTR области генома энтеровирусов, содержащий сайты для дифференцирующих рестриктаз, и набор рестриктаз, применяемых для дифференциации: Sty I (для идентификации геногруппы полиовирусов), Bam H1 (для идентификации РНК полиовируса 1), Ava I, Sma I (Cla I), Pvu II (для идентификации РНК штаммов полиовирусов вакцинного происхождения I, II, III типов).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000126996A RU2189396C2 (ru) | 2000-10-27 | 2000-10-27 | Способ обнаружения и дифференциации рнк энтеровирусов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000126996A RU2189396C2 (ru) | 2000-10-27 | 2000-10-27 | Способ обнаружения и дифференциации рнк энтеровирусов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2189396C2 true RU2189396C2 (ru) | 2002-09-20 |
RU2000126996A RU2000126996A (ru) | 2002-11-10 |
Family
ID=20241467
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000126996A RU2189396C2 (ru) | 2000-10-27 | 2000-10-27 | Способ обнаружения и дифференциации рнк энтеровирусов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2189396C2 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2459830C1 (ru) * | 2011-06-17 | 2012-08-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк энтеровирусов методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией |
EP3137634A4 (en) * | 2014-04-28 | 2018-04-11 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Molecular detection of enterovirus and parechovirus |
RU2795703C1 (ru) * | 2022-09-08 | 2023-05-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ выявления РНК модифицированного вакцинного полиовируса типа 2 (nOPV2) методом ОТ-ПЦР в реальном времени |
-
2000
- 2000-10-27 RU RU2000126996A patent/RU2189396C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
БЮЛЛЮТЕНЬ ВОЗ "Новые подходы к лабораторной диагностике полиовирусных инфекций: меморандум совещания ВОЗ", 1992, №2, с.23-29. * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2459830C1 (ru) * | 2011-06-17 | 2012-08-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк энтеровирусов методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией |
EP3137634A4 (en) * | 2014-04-28 | 2018-04-11 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Molecular detection of enterovirus and parechovirus |
US10072308B2 (en) | 2014-04-28 | 2018-09-11 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Molecular detection of enterovirus and parechovirus |
US10316372B2 (en) | 2014-04-28 | 2019-06-11 | Quest Diagnostics Investments Llc | Molecular detection of enterovirus and parechovirus |
US10724111B2 (en) | 2014-04-28 | 2020-07-28 | Quest Diagnostics Investments Llc | Molecular detection of enterovirus and parechovirus |
CN113774163A (zh) * | 2014-04-28 | 2021-12-10 | 奎斯特诊断投资股份有限公司 | 肠道病毒和双埃柯病毒的分子检测 |
EP3878979A3 (en) * | 2014-04-28 | 2022-01-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Molecular detection of enterovirus and parechovirus |
RU2795703C1 (ru) * | 2022-09-08 | 2023-05-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ выявления РНК модифицированного вакцинного полиовируса типа 2 (nOPV2) методом ОТ-ПЦР в реальном времени |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111500771B (zh) | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒 | |
US8785130B2 (en) | Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material | |
US20180112209A1 (en) | Systems and methods for isolating nucleic acids | |
US20220136075A1 (en) | Method for multiplex nucleic acid detection based on clustered regularly interspaced short palindromic repeat | |
CN107988340B (zh) | 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用 | |
CN111315884A (zh) | 测序文库的归一化 | |
Diggle et al. | Pyrosequencing™: Sequence typing at the speed of light | |
CN112375847A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas13a***的乙型肝炎病毒基因分型检测方法 | |
CN104611422A (zh) | 一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变方法 | |
CN116287388A (zh) | 一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒 | |
CN101182585B (zh) | 一种鉴别hbv基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒 | |
US7381547B2 (en) | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR | |
CN111518955A (zh) | 快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的hrm引物对、试剂盒及方法 | |
AU2011209624B2 (en) | Methods and kits used in the detection of fungus | |
RU2189396C2 (ru) | Способ обнаружения и дифференциации рнк энтеровирусов | |
Ihira et al. | Loop-mediated isothermal amplification for discriminating between human herpesvirus 6 A and B | |
CN116334280A (zh) | 一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒 | |
CN115896316A (zh) | 一种结核病的检测方法 | |
CN111004869B (zh) | 用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量pcr引物和参考标准品 | |
CN115707775A (zh) | 一种基于crispr技术检测非洲猪瘟病毒的方法 | |
CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
CN113817870A (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
Javaheri Tehrani et al. | Rolling Circle Amplification (RCA): an approach for quick detection and identification of fungal species | |
EP2834369B1 (en) | Compositions and methods for detection of mycobacterium avium paratuberculosis | |
KR20100012319A (ko) | 패혈증유발 미생물의 분류 및 동정 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20061028 |