CN106459918A - 施加诱导多能干细胞产生过继细胞疗法产品 - Google Patents

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Abstract

本文描述了施加诱导多能干细胞(iPSC)产生过继细胞疗法产品和使用iPSC筛选免疫受体的潜在毒性。在一些方面，提供了不表达HLA基因(例如，HLA‑A)的iPSC和由其分化的细胞。

Description

施加诱导多能干细胞产生过继细胞疗法产品
描述
本申请要求2014年4月24日提交的美国临时申请No.61/983,722的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表并入
大小2KB(如在Microsoft中测量)且2015年4月15日创建的名为“UTFCP1235WO_ST25.txt”的文件中包含的序列表通过电子提交与此同时提交，并且通过引用并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明一般地涉及医药、细胞生物学和分子生物学的领域。在某些方面，本发明的领域涉及免疫治疗。更具体地，其涉及用于免疫治疗和再生医学以及用于筛选免疫受体的潜在毒性的过继细胞疗法产品。
2.相关领域描述
使用自体或人白细胞抗原(HLA)-匹配的同种异体供体细胞的细胞疗法是用于许多类型的疾病(包括癌症)和再生医学的有前途的疗法。然而，由于疾病本身或重复施用毒性药物，尤其是在患有癌症的患者中，自体细胞有时候在功能上有缺陷。在同种异体细胞的情况下，患者需要寻找合适的HLA-匹配的供体以避免同种异体免疫应答。例如，输注同种异体造血干细胞(HSC)以恢复或代替接受者中缺乏的HSC或功能障碍HSC并且用作产生特定造血细胞来源。然而，HLA***的多样性在寻找HLA-相容供体方面具有障碍，这由种族遗传多态性的作用得以加剧。为了为患者提供合适的HLA-匹配的产品，需要大量供体。甚至尽管有预保存脐带血(UCB)单位和通过国家髓供体计划(National Marrow Donor Program,NMDP)访问登记的成人供体，但是对于许多接受者，尤其是来自供体库中代表数不足的种族和少数民族的那些人，寻找合适的HLA-匹配的产品依然具有挑战。事实上，NMDP登记的9百万供体不足以覆盖美国人口。此外，制备细胞疗法产品需要大量的时间和金钱代价。因此，需要避免同种异体免疫细胞介导的排斥并且可输注到患者中而不需要扩增来自患者的细胞培养物的细胞产品。
发明概述
本公开内容提供了施加诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell)以产生用于免疫治疗再生医学以及用于筛选免疫受体的潜在毒性的过继细胞疗法产品。
在一个实施方案中，提供了用于产生HLA-Aneg HLA纯合诱导多能干细胞(iPSC)的方法，包括(a)获得来自HLA纯合供体的细胞群体；(b)工程化所述细胞以使其不表达HLA-A，从而产生HLA-Aneg细胞；以及(c)对所述HLA-Aneg细胞重编程以产生iPSC，从而产生HLA-AnegiPSC。
在一个方面，所述细胞群体可以是脐带血细胞群体。在另一个方面，供体在HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1处可为HLA纯合的。
在一些方面，工程化所述细胞以使其不表达HLA-A可包括向细胞中引入特异性靶向HLA-A基因座的人工核酸酶。在多个方面，人工核酸酶可以是锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9。在多个方面，向细胞中引入人工核酸酶可包括向细胞中引入编码人工核酸酶的mRNA。
在一些方面，细胞(例如，HLA-Aneg细胞)的重编程可包括向细胞中引入重编程因子，所述重编程因子选自由以下组成的组：Sox2、Oct3/4、Nanog、Lin-28、Klf4、myc(例如，C-myc、L-myc或转化缺陷的myc突变体)和/或SV40LT。在一些方面，细胞(例如HLA-Aneg细胞)的重编程包括向细胞中引入重编程因子Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc蛋白。在另一些方面，重编程可包括向细胞中引入Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc编码mRNA。在另一些方面，重编程可包括向细胞中引入编码Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc的一个或多个表达盒。所述一个或多个表达盒可包含在的一个或多个游离型载体中。所述一个或多个表达盒可包含在一个或多个病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体或仙台病毒载体)中。
在某些方面，所述方法还可包括向步骤(b)的细胞中引入***基因，例如诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。在一些方面，引入可包括基因转移。在一些方面，引入可包括转座子/转座酶***，例如睡美人转座子/转座酶***。
在某些方面，所述方法还可包括鉴定具有遗传安全港谱(genetically safeharbor profile)的HLA-Aneg HLA纯合iPSC。本文使用的“安全港”谱是指在维持转基因表达(即，不沉默)并且不破坏内源基因表达的位点向基因组中***外来遗传物质。例如，“遗传安全港谱”可以指定位在内源基因的编码和表达控制区外面的转基因事件。在一些方面，鉴定可包括进行全基因组测序或整合位点分析。
在某些方面，所述方法还可包括使所述HLA-Aneg HLA纯合iPSC分化。在一些方面，分化可包括使用人工抗原呈递细胞(aAPC)。在一些方面，aAPC可以是遗传修饰的K562细胞。
在一些方面，可以使iPSC分化成免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、iNKT细胞。在一些方面，免疫细胞还可包含肿瘤特异性或病毒特异性TCRαβ。在一些方面，免疫细胞还可包含肿瘤特异性嵌合抗原受体。在一些方面，可以对免疫细胞进行进一步基因编辑以消除免疫抑制分子(例如，PD-1或CTLA-4)。在一些方面，iPSC可分化成造血干细胞。在一些方面，iPSC可分化成心肌细胞、肺上皮细胞、β胰岛细胞、肾细胞或神经元细胞。
在另一些实施方案中，提供了经分离的哺乳动物细胞(例如，人细胞)，所述细胞包含至少一组纯合HLA等位基因(例如，纯合HLA-B、HLA-C和/或HLADRB1等位基因)和HLA-Aneg表型。在一些方面，具有HLA-Aneg表型的细胞包含至少一个HLA-A基因的全部或一部分的缺失，或者包含使一个或全部两个基因或基因产物无功能的HLA-A突变。例如，在一些方面，一个或全部两个HLA-A基因包含通过锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9***产生的缺失，其使得基因或基因产物无功能。在另一些方面，实施方案的包含至少一组纯合HLA等位基因的细胞包含至少两组或三组纯合HLA等位基因。例如，细胞可包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因，纯合HLA-B和HLA-DRB1等位基因、纯合HLA-C和HLA-DRB1等位基因，或者纯合HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1等位基因。
在一些方面，实施方案的包含至少一组纯合HLA等位基因和HLA-Aneg表型的经分离的哺乳动物细胞是胚胎干细胞、iPS细胞、脐带血细胞、表皮细胞、胰细胞、肝细胞、造血细胞、间充质细胞、神经细胞或免疫细胞，例如NK细胞或T细胞(例如，CD4或CD8阳性T细胞)。在另一些方面，提供了实施方案的细胞群体。例如，在一些方面，提供了约1×103至约1×104、1×106、1×106或1×107个实施方案细胞的群体。
在一些方面，实施方案的包含至少一组纯合HLA等位基因和HLA-Aneg表型的经分离的哺乳动物细胞还包含转基因。例如，细胞可包含编码报道子(reporter)、药物选择标记、嵌合抗原受体(CAR)的转基因和/或***基因(例如，腺苷激酶或诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。在另一些方面，实施方案的哺乳动物细胞还包含一种或多种内源基因的降低的表达或活性。例如，在一些方面，细胞的一种或多种免疫抑制分子(例如PD-1或CTLA-4)不表达或具有降低的表达。在另一些方面，细胞的一种或多种T细胞受体组分不表达或具有降低的表达。例如，在一些方面，细胞的TCRα、TCRβ或TCRα和TCRβ不表达或具有降低的表达。
在另一个实施方案中，提供了体外细胞系组，其包含至少第一诱导多能干细胞系和第二诱导多能干细胞系，其中所述第一系和第二系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因，其中所述第一细胞系的纯合HLA-B和/或HLA-C等位基因不同于所述第二细胞系的纯合HLA-B和/或HLA-C等位基因，其中所述第一系和第二系均为HLA-Aneg。在某些方面，细胞系组还可包含至少5至10种不同的诱导多能干细胞系，其中每个系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。在某些方面，细胞系组还包含至少20种不同的诱导多能干细胞系，其中每个系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。在某些方面，细胞系组还可包含至少27种不同的诱导诱导多能干细胞系，其中每个系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。在一个方面，细胞系组可包含27种不同的诱导诱导多能干细胞系，其中每个系包含根据表1的纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。
在一些方面，每个系还可包含***基因，例如诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。在一些方面中，细胞系可根据本发明实施方案的方法产生。
在一个实施方案中，提供了用于筛选免疫受体特异性的方法，包括：(a)获得根据本发明实施方案的体外iPSC系组；(b)任选地使所述iPSC分化成谱系特异性细胞；(c)使所述iPSC或谱系特异性细胞暴露于表达目标免疫受体的T细胞；以及(d)检测所述iPSC或谱系特异性细胞与表达目标免疫受体的T细胞之间的相互作用，从而筛选免疫受体特异性。
在一些方面，T细胞可以是仅在识别目标免疫受体的靶抗原之后表达GFP的T急性淋巴性白血病细胞系。在这个方面，步骤(d)可包括检测T急性淋巴性白血病细胞系中GFP的表达，从而鉴定表达靶抗原的iPSC或谱系特异性细胞。
在一些方面，所述方法还可包括向步骤(a)的细胞中引入细胞死亡报道构建体。在一些方面，细胞死亡报道构建体可允许检测胱天蛋白酶-3活化。在这些方面，步骤(d)可包括检测细胞死亡报道构建体的活化，从而筛选免疫受体特异性。
在一些方面，所述方法还可包括向步骤(a)的细胞中引入谱系特异性转录因子启动子驱动的报道基因。在这个方面，步骤(d)可包括检测报道基因表达的损失，从而筛选免疫受体特异性。
在一些方面，目标免疫受体可以是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，TCR可以是克隆的或操作的。
在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的患者中的疾病的方法，包括：(a)从根据本发明的任一实施方案的体外细胞系组中选择与患者HLA匹配的细胞系；(b)使所选细胞系分化成谱系特异性细胞；以及(c)向患者施用治疗有效量的分化细胞。
在某些方面，方法可以是提供免疫治疗的方法。在一些方面，谱系特异性细胞可以是造血干细胞或免疫效应细胞。在一些方面，疾病可以是癌症、自身免疫病或传染病。在一些方面，免疫效应细胞可以是T细胞、NK细胞和iNKT细胞。
在某些方面，方法还可包括向步骤(a)的细胞中引入嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。在一些方面，疾病可以是癌症，并且CAR可以靶向癌细胞抗原，例如CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素(meothelin、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链，CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。
在一些方面，疾病可以是自身免疫病，并且CAR可靶向自身免疫细胞。自身免疫病的实例包括但不限于：乳糜泻、1型糖尿病(IDDM)、***性红斑狼疮(SLE)、肖格伦综合征(syndrome)、多发性硬化(MS)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力，***性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾病、结节性红斑、大动脉炎(Takayasu's arteritis)、阿狄森氏病(Addison's disease)、类风湿关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiterans、肖格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疹、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病和纤维性肺泡炎。
在一些方面，疾病可以是病原体(例如，真菌、病毒或细菌病原体)造成的传染病，并且CAR可以靶向病原体抗原。
在某些方面，方法可以是提供再生医学的方法。在这个方面，谱系特异性细胞可以是心肌细胞、神经元、β胰岛细胞、肾细胞、肺细胞、表皮细胞、胰细胞、肝细胞、造血细胞或间充质细胞。
在一些方面，实施方案的方法还可以包括获得、产生或使用抗原呈递细胞(APC)。在一些方面，APC可以是树突细胞。在某些方面，APC是已经被工程化来起APC的作用的人工抗原呈递细胞(aAPC)。例如，在一些方面，aAPC是例如通过辐射灭活的。用于产生这样的APC的方法是本领域中已知的，并且在本文中详细描述。因此，在一些方面，实施方案的细胞(例如，具有HLA-Aneg表型的免疫细胞)与离体APC共培养有限的时期以扩增T细胞群体。细胞与APC共培养的步骤可以在包含例如白介素21(IL-21)和/或白介素2(IL-2)的培养基中进行。在一些方面，共培养在约10:1至约1:10、约3:1至约1:5或约1:1至约1:3的免疫细胞比APC的比例下进行。例如，免疫细胞和APC的共培养可以以约1:1、约1:2或约1:3的比例进行。
在一些实施方案中，提供了用于治疗患有医学病症的个体的方法，包括提供有效量的来自本文所述细胞群体的细胞的步骤，在一些方面包括超过一次，例如间隔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久。在一些特定实施方案中，医学病症是癌症或传染病。
本文使用的“HLA-Aneg”表型是指在表面上不表达功能性HLA-A的细胞。例如，具有HLA-Aneg表型的细胞可包含一个或全部两个HLA-A基因的全部或一部分的缺失。例如，HLA-A基因可以包含通过锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9***引入的缺失。同样地，在一些方面，具有HLA-Aneg表型的细胞可包含在一个或全部两个HLA-A基因中的导致基因基因或基因产物无功能的突变。
本文对于特定组分使用的“基本上不含”在本文中用于指特定组分未被有意配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选不能利用标准分析方法检测到特定组分的量的组合物。
本文在说明书和权利要求书中使用的未用数量词限定的名词意指一个/种或多个/种。在结合词语“包括”使用时，本文在说明书和权利要求书中使用的未用数量词限定的名词可意指一个/种或超过一个/种。本文在说明书和权利要求书中使用的“另一个/种”“再一个/种”可意指至少第二个/种或更多。
本文在说明书和权利要求书中使用的术语“约”用于指值包括装置、用于测定所述值的方法的误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。
通过以下详述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解的是，尽管指出了本发明的某些实施方案，但是详述和特定实施例仅以举例说明的方式给出，因为通过该详述，本发明精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图简述
以下附图形成了本发明书的一部分并且被引入以进一步证明本发明的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图，可以更好地理解本发明。
图1A-D.在NMDP中找到HLA匹配的供体的概率。图1A.8/8匹配。图1B.6/6，无HLA-A。图1C.6/6，无HLA-B。图1D.6/6，无HLA-C。每个柱的上部分表示找到8/8等位基因匹配的供体的概率。每个柱的下部分表示如果从当前的HLA匹配要求中消除相应HLA基因座，找到6/6等位基因匹配的供体的概率。X轴表示种族组。
图2.使用iPSC筛选免疫受体的毒性。iPSC将直接(左图)或在用死亡报道基因改性后(中图)或用谱系特异性报道基因(右图)改性后分化成谱系特异性细胞。使用检测免疫受体介导的识别的报道子(左图)或通过与表达免疫受体的T细胞共培养来监测分化细胞的潜在识别。
图3.图示出了通过分化HLA-Aneg HLA-B/C/DRB1纯合iPSC治疗疾病的方法。
图4A-B.SeV载体介导的报道基因表达。图4A.在指定MOI和细胞数下用编码GFP的SeV载体感染活化的T细胞。示出了第1天的流式细胞计数数据。X轴：GFP表达。Y轴：CD3。MFI：平均荧光强度。右上象限中的数字表示CD3+GFP+细胞的百分比。图4B.第1天至第7天的GFP表达。每天测量MFI并且标绘在图上。实心正方形：没有SeV，空心圆：MOI＝1,1×106，实心圆：MOI＝3,1×106,空心菱形：MOI＝1,5×105，实心菱形：MOI＝3,5×105。
图5.T细胞重编程为iPSC。iPSC的相差图。在第16天，利用Alexa Fluor 647抗TRA-1-60抗体进行TRA-1-60活染。
图6.iPS集落的免疫荧光染色。固定后，用指定的抗体和Alexa488缀合的二抗对iPS集落染色。在临荧光显微镜检之前进行DAPI染色。
图7.iPSC的核转染。通过核转染将编码eGFP报道子的DNA质粒或mRNA引入到iPSC。简单来说，将1百万个完全经分离的iPSC重悬在20μL P3缓冲液中，与mRNA或DNA混合，转移到条带上，并且使用4D Nucleofector(程序：CA-137)进行核转染。通过流式细胞计数评估iPSC中第1天的GFP表达。选通TRA-1-60阳性群体的数据。
图8.通过锌指核酸酶破坏TRAC和TRBC基因。凝胶图中的箭头表示Cel-1酶介导消化的PCR产物，表明TRAC和TRBC靶向的ZFN在ZFN靶位点引入了期望突变。
图9.通过测序分析TRAC基因破坏。WT＝SEQ ID NO:1；#13-1＝SEQ ID NO:2；#13-2＝SEQ ID NO:3。
图10.通过ssODN+ZFN破坏TCR基因。为了向TRAC靶位点中引入终止密码子，向细胞中引入具有TRAC靶向ZFN和单链寡核苷酸。在培养10-14天后，通过数字微滴式PCR(digitaldroplet PCR)检测ZFN靶位点中的预期突变。
图11.同于通过睡美人和慢病毒的CAR引入的构建体。图示出了用于引入iCasp9和CD19靶向CAR的SB***和慢病毒的质粒的示意图。
图12.睡美人和慢病毒的CAR引入的分析。
图13.用于由iPS细胞再分化T细胞的方案和分析。对于iPSC到造血干细胞的体外分化，在包含合适的细胞因子的AggreWellTM平板中的培养物中形成胚状体。在第13天，通过流式细胞技术检测CD34pos和CD43pos造血干细胞。
示例性实施方案的描述
I.实施方案的方面
本文描述了施加诱导多能干细胞(iPSC)产生适用于大的患者群体的过继细胞疗法产品。还描述使用这样的iPSC筛选潜在毒性(例如，免疫受体的)。本文详细描述的细胞提供了用于治疗多种疾病的治疗剂。特别地，细胞包含经修饰HLA基因，使得其可用于比其他方式治疗更多的患者群体。在一些特定方面，实施方案的细胞是一对或更多对HLA等位基因的纯合子并且包含HLA-Aneg表型。这些特征允许细胞有效地免疫匹配于大量患者，从而提供基于细胞的疗法，其可比利用为个体患者开发的疗法低得多的成本产生。
如图3中概括的，HLA-Aneg细胞(例如，iCasp9+HLA-Aneg细胞)可由HLA纯合细胞通过选择性破坏HLA-A编码基因产生。例如，通过HLA纯合脐带血细胞的遗传修饰：i)利用睡美人(SB)转座子/转座酶***(或其他基因转移方式)以引入iCasp9基因(或其他***基因)和ii)利用锌指核酸酶(ZFN)或其他人工核酸酶(例如，TALEN、CRISPR/Cas9)以消除HLA-A。可以通过引入重编程因子(例如，使用编码Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc的仙台病毒)将这些细胞重编程为iPSC。或者，可以利用SB和ZFN对iPSC克隆直接进行遗传修饰，换言之，可以将细胞先重编程然后遗传修饰。在分离被鉴定为具有遗传安全港谱的iPSC克隆后，可以使细胞分化成谱系特异性细胞，其可以向患者施用用于免疫治疗和/或再生医学。使iPSC分化的一种方法涉及使用人工抗原呈递细胞(aAPC)，例如来源于遗传修饰的K-562细胞的那些。
A.产生HLA-Aneg HLA纯合iPSC及其使用方法
本发明的实施方案提供了用于免疫治疗和再生医学的同种异体细胞疗法的同种异体iPSC库。产生可以根据需要预制备并且输注的典型产品具有很大的吸引力，因为其能够根据需要集中基于细胞的疗法的制造和递送，而不是在可获得时。此外，iPSC的基因操作和克隆表征将能够产生下游临床级产品。这种技术将通过允许临床医生根据需要输注同种异体治疗细胞来加快细胞疗法过程，降低供体-供体异质性，并且还降低制备细胞疗法产品的成本。
提高对现有供体库的访问的方法具有临床影响。事实上，国家脊髓供体计划(NMDP)预测在美国约10,000位患者将从不相关的同种异体造血干细胞移植(HSCT)中受益。如果对同种异体HSC进行基因编辑以消除HLA-A基因座的表达，已经登记的供体的临床应用将显著提高。由NMDP建模表明，当消除HLA-A匹配的需要而仅留下HLA-B、HLA-C和HLA-DR时，非裔美国接受者找到HLA匹配的供体的机会从18％增加到了73％。工程化锌指核酸酶(ZFN)(或任何其他人工核酸酶，例如TALEN、CRISPR/Cas9)可消除基因编辑的T细胞和细胞系中HLA-A的表达。使用ZFN消除HSC中HLA-A的表达提供了有吸引力的方法以找到寻找HLA匹配的供体的机会。预期这将扩大同种异体HSCT的临床应用，尤其是对属于少数人种群体的患者来说。
HLA-Aneg HLA纯合iPSC库的产生将解决这些问题，因为其可输注到多种接受者中。这可以通过从约27种独特供体(HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1纯合子，参见表1)如来源于脐带血的iPSC中敲除HLA-A(例如，使用设计的锌指核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9)来实现。可以工程化这些iPSC库以***和移除基因来改善免疫治疗和再生医学。这些HLA-Aneg iPSC和由其分化的细胞(例如，免疫细胞、心肌细胞、肾细胞)是可用于产生免疫细胞和其他治疗细胞的非常有价值的来源，所述治疗细胞包括但不限于心肌细胞、胰细胞、肾细胞、NK细胞、iNKT细胞和T细胞，包括亚型。这将产生用于疾病(例如，癌症、自身免疫病、感染)和再生医学的治疗。
表1.覆盖美国人群所需的独特HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1纯合子
然而，输注的同种异体T细胞上的内源αβT细胞受体(TCR)可识别接受者中的主要和次要组织相容性抗原，导致移植物抗宿主疾病(GVHD)。为了克服这个问题，可以消除造成有害的同种异体免疫疾病的内源TCRαβ和γδ表达。这些步骤通过合适的方法进行，包括引入例如靶向TCRα恒定区或β恒定区的锌指核酸酶(ZFN)。
B.使用iPSC防止脱靶毒性和接受者的识别
当前鉴定靶抗原表达的筛选方法有限。本发明的实施方案提供了iPSC/iPSC来源细胞的筛选，其将解决当前预测免疫受体的潜在毒性中的问题。因此，HLA-Aneg HLA纯合iPSC库可用作细胞来源以筛选由具有免疫治疗潜力的免疫细胞引起的毒性。使用iPSC筛选非期望的不良事件(目标毒性和脱靶毒性)将通过降低内源或引入的免疫受体的不可预测的脱靶毒性的可能性来改善过继T细胞疗法(以及输注其他免疫细胞的疗法)。例如，在人施用之前，需要筛选克隆的/操作的T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)的潜在毒性。这可以在体外使用工程化iPSC及其分化后代群实现。
II.实施方案的细胞
在本发明的某些实施方案中，通过引入重编程因子对体细胞重编程以产生诱导多能干细胞。在下述多个方面并且如本领域中周知的，这些细胞的后代可能与胚胎干细胞相同。理解胚胎干细胞特征可能有助于选择通过这些方法产生的诱导多能干细胞。从干细胞重编程研究中了解的重编程因子可用于这些方法。
术语“细胞”在本文中以其在本领域中最广义使用，是指为这样的活体：其为多细胞生物体组织的结构单元，由将其与外部分开的膜结构包围，具有知我复制能力，并且具有用于其表达的遗传信息和机制。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、遗传修饰细胞等)。
本文使用的术语“分化细胞”可指已经由非特化(unspecialized)表型发育成特化(specialized)表型的细胞。例如，胚细胞可以分化成肠衬里的上皮细胞。例如，可以从胎儿或活产动物中分离分化细胞。
本文使用的术语“未分化细胞”可指具有非特化表型并且能够分化的祖细胞。未分化细胞的一个实例是干细胞。
本文使用的术语“干细胞”是指能够自我复制的多能细胞。“多能”意味着细胞能够通过其后代产生所有细胞类型，包括成年动物，包括生殖细胞和所有三个胚层：内胚层(内部胃衬里、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)或外胚层(表皮组织和神经组织)。本文的干细胞可以是但不限于：胚胎干(ES)细胞、组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞)或诱导多能干细胞。任何具有上述能力的人工产生的细胞(例如，融合细胞、重编程细胞或本文使用的其他细胞)可以是干细胞。
本文使用的术语“胚胎干(ES)细胞”可指由胚胎经分离的保持在体外细胞培养物中的多能细胞。这样的细胞是从培养的胚胎经分离的快速***的培养细胞，其在培养物中保持了在体内产生全部细胞类型的能力，所述细胞类型包括成年动物，包括生殖细胞。胚胎干细胞可具有圆形细胞形态并且可生长在饲养层上的圆形细胞团块中。胚胎干细胞是本领域技术人员周知的。
组织干细胞根据得到细胞的部位分类，例如皮肤***(例如，表皮干细胞、毛囊干细胞等)、消化***(例如，胰(普通)干细胞、肝干细胞等)、骨髓***(例如，造血干细胞、间充质干细胞等)、神经***(例如，神经干细胞、视网膜干细胞等)等。
“诱导多能干细胞”常缩写为iPS细胞或iPSC，是指由非多能细胞，通常是成体细胞或终末分化细胞如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等通过表达重编程因子人工制备的多能干细胞类型。
“自我更新”是指经过多个细胞***周期同时保持未分化状态的能力。
本文使用的术语“体细胞”是指生殖细胞(例如***、***等)以外的任何细胞，其不能将其DNA直接转移到下一代的。通常，体细胞具有有限的多能性或没有多能性。本文使用的体细胞可以是天然存在的或遗传修饰的。
本文关于细胞使用的术语“培养的”可指在体外环境中经历细胞***或不经历细胞***的一种或多种细胞。体外环境可以是本领域已知的适合于在体外维持细胞的任何培养基，例如合适的液体培养基或例如琼脂。
根据本发明实施方案的培养基可以是含血清或无血清培养基。无血清培养基是指不具有未经处理或未纯化血清的培养基，因此可以包括具有纯化血液来源组分或动物组织来源组分(例如生长因子)的培养基。从防止异源动物来源组分污染的方面，血清可以与干细胞来源于相同动物。
根据本发明实施方案的培养基可包含或不含血清的任何替代品。血清替代品可包括适当地包含以下的材料：白蛋白(例如，富脂质白蛋白、白蛋白替代品如重组白蛋白、植物淀粉、右旋糖酐和蛋白水解物)、运铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油或其等同物。
A.干细胞
干细胞是存在于大多数(如果不是全部的话)多细胞生物体中的细胞。其特征在于通过有丝细胞***自我更新以及分化成多种特化细胞类型的能力。两个主要的哺乳动物细胞类型是：存在于胚泡中的胚胎干细胞和存在于成体组织中的成体干细胞。在发育的胚胎中，干细胞可以分化成所有特化胚组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复***，补充特化细胞，但是也维持再生器官例如血液、皮肤或肠组织的正常运转。
因为干细胞可以通过细胞培养生长并且转化成具有与多种组织细胞(例如肌肉或神经)一致的特征的特化细胞，已经提出了其在医学治疗中的用途。成体细胞重编程为多能干细胞具有巨大潜力。
几乎迄今为止的所有研究都是使用小鼠胚胎干细胞(mES)或人胚胎干细胞(hES)进行的。二者具有必要的干细胞特征，但是其需要迥然不同的环境以维持未分化状态。小鼠ES细胞可以在明胶层上生长并且需要白血病抑制因子(LIF)的存在。人ES细胞可在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层上生长并且通常需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)的存在。没有最佳培养条件或遗传操作(Chambers等,2003)，胚胎干细胞将迅速分化。
人胚胎干细胞也可通过多种转录因子和细胞表面蛋白的存在限定。转录因子Oct4、Nanog和Sox2形成了中央调控网络，其确保导致分化的基因的抑制并且维持多能性(Boyer等,2005)。最常用于鉴定hES细胞的细胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4和硫酸角质素抗原Tra-1-60和Tra-1-81。
B.重编程因子
iPS细胞的产生依赖于用于诱导的基因。可以使用以下因子或其组合：Oct3/4、KLF4、Sox2和/或c-myc。编码这些重编程因子的核损可包含在单顺反子或多顺反子表达盒中。同样地，编码所述单顺反子或多顺反子表达盒的核酸可包含在一个重编程载体中或多个重编程载体中。
Oct3/4在维持多能性中具有重要作用。Oct3/4+细胞如卵裂球和胚胎干细胞中缺少Oct3/4导致自发的滋养层分化，Oct3/4的存在导致胚胎干细胞的多能性和分化潜力。
Klf家族基因的KLF4最初被认为是用于产生小鼠iPS细胞的因子，随后被证明是用于产生人iPS细胞的因子。Klf2和Klf4被发现是能够产生iPS细胞的因子，相关基因Klf1和Klf5也是如此，但是其具有降低的效率。
Sox家族基因与维持多能性有关，类似于Oct3/4，但是其与多能干细胞和单能干细胞有关，相比之下Oct3/4仅在多能干细胞中表达。尽管Sox2是Yamanaka等,(2007)，Jaenisch等,(1988)和Yu等,(2007)最初用于诱导的基因，但是已经发现Sox家族的其他基因也同样用于诱导过程。Sox1与Sox2以类似效率产生iPS细胞，基因Sox3、Sox15和Sox18也产生iPS细胞，但是具有降低的效率。
Myc家族基因是参与癌症的原癌基因。Yamanaka等,(2007)和Jaenisch等,(1988)证明c-myc是参与小鼠iPS细胞的产生的因子，Yamanaka等,(2007)证明其为参与人iPS细胞的产生的因子。N-myc和L-myc被认为以与c-myc类似的效率诱导多能性。
在某些实施方案中，除了向细胞引入一种或多种重编程因子以外，还用重编程培养基处理细胞，所述培养基包含：HDAC抑制剂、Wnt通路抑制剂、Oct4活化剂、氢化可的松、干细胞因子、EPO、IL-3、CHIR99021、A-83-01、hLIF和/或bFGF。使用这样的分子可导致改善的重编程效率和动力学，因此有利于原始重编程培养基中iPS细胞的鉴定和防止iPS细胞克隆性。
C.产生诱导多能干细胞的方法
通常通过将某些干细胞相关基因转染成非多能细胞如成年成纤维细胞或脐带血细胞来获得iPS细胞。转染可以通过整合病毒载体如逆转录病毒或非整合病毒载体如仙台病毒实现。在关键时期之后，少量转染细胞开始在形态和生物化学方面与多能干细胞类似，并且可以通过形态选择、倍增时间、报道基因表达和/或抗生素抗性选择。
在使用编码KLF4、cMYC、OCT4、SOX2的逆转录病毒初始产生诱导多能干细胞(iPSC)之后，已经开发了多种方法来将这些因子引入到多种细胞中。其中，仙台病毒(SeV)载体已用于由分化T细胞高效产生iPSC。SeV是具有～15kb的单链、反义、非节段化RNA基因组的包膜病毒。重组仙台病毒载体仅在感染细胞的细胞质内复制，不经历DNA阶段或整合到宿主基因组中。在维持期间，SeV载体将在T细胞重编程为iPSC之后减少。
用于产生诱导多能干细胞的方法缓慢并且低效，大部分细胞都会失败。为了提高这种方法的效率，利用含重编程因子和任选的报道基因的构建体的载体可用于优化转染效率，其首先选择报道子的存在，然后对报道基因表达选择，因为多能细胞中的转基因沉默非常有效。
异位重编程因子的强制持久表达可能与提高的肿瘤形成频率有关，该问题的一个解决方案是产生无转基因的iPS细胞。一系列引入的基因对于开始重编程程序可能是必要的，但是逐渐地细胞自己的内源多能基因开始活化，引入的基因被沉默，并且具有随机再活化的潜力。细胞可能需要外源因子至少约10-16天以进入自我维持的多能状态(Brambrink等,2008；Stadtfeld等,2008)。转基因表达的最小长度的确定使得能够开发非整合递送方法来递送iPS细胞。
已经使用逆转录病毒或慢病毒实现由人体细胞诱导多能干细胞，用于异位表达重编程基因。由于逆转录酶的作用，重组逆转录病毒如莫洛尼鼠白血病病毒具有以稳定形式整合到宿主基因组中的能力。慢病毒是逆转录病毒的亚类。由于其整合到非***细胞和***细胞的基因组中的能力，其被广泛用作载体。使用病毒载体对iPS细胞重编程的方法是本领域中周知的。
因为病毒介导基因整合到宿主细胞染色体的随机位置，使用整合病毒载体可造成内源基因突变或可造成内源癌基因活化。因此，可以在没有基因组整合重编程因子的情况下制备iPS细胞。这样的方法描述在美国专利No.8,546,140和8,268,620中，其通过引用整体并入本文。例如，可使用游离型载体元件，包括EBV或其变体。在另一些方面，在重编程后可以移除iPS细胞中的游离型载体元件。
避免向靶细胞中引入外源遗传修饰的一种可能的方法是将重编程蛋白质直接递送到细胞中，而不依赖于递送基因的转录。之前的研究已经证明，通过与介导蛋白质转导的短肽如HIV Tat和聚精氨酸缀合，可以将多种蛋白质递送到体外和体内细胞中。最近的研究证明，通过直接递送重组重编程蛋白可以将鼠成纤维细胞完全重编程为多能干细胞(Zhou等,2009)。
初始细胞和分化细胞对于培养基和条件通常具有不同要求。在引入分化因子之后，通常在已知适合于初始细胞生长的培养条件和培养基的存在下进行培养的至少初始阶段。然后是在已知适合于分化细胞的培养条件和培养基的存在下培养的随后阶段。在分化足够时间之后，可在扩增培养基中进一步培养分化细胞以扩增分化细胞。这样的扩增培养基可以包含一种或多种信号抑制剂或包含基本不含这些抑制剂的培养基。分化条件可以基本上不含饲养细胞。在另一些方面，分化培养基可以是化学确定的。
D.重编程细胞的选择
在实施方案的某些方面，在重编程载体引入到体细胞中之后，培养这些细胞以扩增。选择存在载体元件如报道基因或选择标记的细胞，以浓缩感染细胞。重编程载体将在这些细胞中表达重编程因子，并且随着细胞***复制和分开。这些表达的重编程因子将对体细胞重编程以建立自我维持的多能状态，并且同时或者在除去存在载体的阳性选择后，使用非整合载体的实施方案中的外源遗传元件将逐渐丢失。这种转基因表达的沉默使得能够通过单独关闭报道基因表达或者与其他胚胎干细胞特征(例如，形态、生长特性、干细胞标记、干细胞基因、端粒酶活性、多能性、畸形瘤形成、拟胚体形成、胚泡注射、启动子脱甲基化和组蛋白脱甲基化)的选择组合来选择诱导多能干细胞，这是因为预期其与多能胚胎干细胞基本相同。也可以是使用额外的阴性选择步骤通过测试重编程载体DNA的缺失或使用选择标记来加速或帮助选择基本上不含外源遗传元件的iPS细胞。
根据实施方案方法中使用的报道基因的性质，可以若干方法中的任一种产生可检测信号。例如，可检测信号可以是荧光信号，例如GFP。流式细胞计数如荧光活化细胞分选(FACS)常用于基于报道基因的表达选择可检测信号。荧光素酶也可用作测定的基础。以类似于荧光素酶基测定的方式进行酶基测定，只是不必通过发光检测。检测技术取决于酶，因此可以是光学的(例如，在β-半乳糖苷酶的情况下)。物理和生物化学方法也可用于鉴定或量化实施方案的报道基因的表达。这些方法是本领域技术人员周知的。
在体细胞重编程为iPSC后，可能希望从细胞群体中基本上纯化或分离一种或多种细胞亚群。使用流式细胞计数如FACS或磁性活化细胞分选分离细胞的方法可用于从异源细胞群体中分离iPS细胞。以下实施例中也示出了示例性细胞分离方案。
E.重编程细胞的培养
可以使用多种方法培养多能细胞并且维持未分化状态。在某些实施方案中，可以使用确定的不依赖于饲养层的培养***如TeSR或E8培养基来培养多能细胞并且维持基本未分化状态(参见，例如，Chen等,(2011)，通过引用并入本文)。例如，TeSR培养基是可用于培养未分化人胚胎干细胞的成分确定的培养基(defined media)。TeSR培养基包括TeSR1培养基和mTeSR培养基二者。TeSR包含bFGF、LiCl、γ-氨基丁酸(GABA)、哌啶酸和TGFβ，之前已经描述了多种利用TeSR的方法，例如在美国专利No.7,449,334和Ludwig等,(2006a；2006b)中，其通过引用整体并入本文。或者，可以使用不确定条件；例如，多能细胞可以培养在成纤维细胞饲养细胞上或已经暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上，以便维持干细胞的未分化状态。
不依赖于饲养细胞的培养***和培养基可用于培养和维持多能细胞，例如hESC或iPSC。这些方法允许人胚胎干细胞保持基本未分化状体而不需要小鼠成纤维细胞“饲养层”。如本文所述，可以根据需要将这些方法进行各种修改以降低成本。
在一些方面，用于培养和维持多能干细胞的基本或大致未分化状体的成分确定的培养基中可以包含基体组分(matrix component)。当培养在合适的半固体基体中时，被称为集落形成细胞(CFC)的独立前体可扩增形成离散细胞簇或集落。可以通过将细胞悬液放置到半固体培养基如补充有营养素和细胞因子的甲基纤维素或胶原蛋白中然后例如在约37℃孵育来进行CFC测定。
多种基体组分可用于培养和维持多能细胞，例如hESC或iPSC。例如，胶原蛋白IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白组合可用于提供用于胚细胞培养和维持的固体支持物，如Ludwig等,(2006a)中所述。
MatrigelTM可用于提供用于多能细胞的细胞培养和维持的基质。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，可由BD Biosciences(New Jersey,USA)商购。所述混合物类似于许多组织中存在的复杂细胞外环境并且被细胞生物学家用作细胞培养的基质。在具有MatrigelTM的成分确定的培养基中培养和维持人胚胎干细胞的方法描述在例如Ludwig等,(2006a)中，并且可用于培养多能细胞。应理解的，技术人员已知的其他用于培养和维持人胚胎干细胞的方法可用于本发明实施方案。
F.重编程细胞的分化
“分化”是与没有分化的相同条件下相比，培养基中或体内特化度较低细胞变为特化度较高细胞的过程。在某些条件下，由特化度较低细胞形成的具有特化度较高细胞的特征的后代的比例可以是至少约1％、5％、25％或更高，以优选性增加的顺序。
根据实施方案，多种方法可用于使iPS细胞分化成细胞谱系，包括但不限于造血干细胞、免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、iNKT细胞)、肌肉细胞(例如，心肌细胞)、神经元、β胰岛细胞、肾细胞、肺细胞、成纤维细胞和表皮细胞，以及由其得到的组织或器官。
1.造血干细胞
iPSC可以培养和/或分化成造血祖细胞或造血干细胞。然而，技术人员将承认，多种方法可用于由多能细胞产生造血祖细胞。例如，美国专利No.8,372,642(通过引用并入本文)详细描述了产生造血祖细胞的高效培养***。
可以使用确定培养条件并使用后饲养细胞产生造血祖细胞。例如，在多能细胞部分、基本上或完全分离或个性化(individualizing)之后，细胞可继续培养在成分确定的培养基中以有利于造血分化。已经发现特定生长因子组合可大幅促进多能细胞分化成造血祖细胞和造血细胞谱系。特定生长因子组合的顺序使用可用于进一步促进多能细胞的分化。在某些实施方案中，生长因子的特定组合对于多能细胞的造血分化很关键。例如，BMP4、VEGF、Flt3配体、IL-3和GMCSF的组合可用于促进造血分化。在某些方面，顺序地将细胞培养物暴露于包含BMP4和VEGF(以及任选的FGF-2)的第一培养基，然后暴露于包含Flt3配体、IL-3和GMCSF的第二培养基中的培养可提高多能细胞分化成造血祖细胞和造血细胞。
尽管可以使用确定条件或不确定条件使多能细胞分化为造血祖细胞，但是应理解的是，在旨在将所得细胞向人对象施用的实施方案中，确定条件通常是优选的。可以在确定条件下(例如，使用TeSR培养基和基体组分如MatrigelTM或者在E8培养基中)由多能干细胞培养造血干细胞。
例如，成分确定的培养基可用于诱导造血CD34+分化。如上文详细说明的，成分确定的培养基可包含生长因子BMP-4、VEGF、Flt3配体、IL-3和/或GMCSF。基本上低氧条件(例如，低于20％O2)可进一步促进造血或内皮分化。
尽管使用确定方法使多能细胞分化成造血祖细胞在某些情况下可能是优选的，但是不确定条件也可用于多个实施方案。用于由iPSC分化造血干细胞的一种不确定方法涉及在饲养细胞上培养iPSC，例如，小鼠成纤维细胞(MEF)饲养层或小鼠基质细胞系OP9，其诱导强烈分化CD34+。与确定条件形成对比，OP9细胞的使用通常不需要额外生长因子来诱导CD34+分化。
2.造血细胞
多能干细胞如iPSC能够无限自我更新，同时保持当在合适的条件下诱导或支持分化时得到骨髓细胞、红细胞和巨核细胞造血细胞谱系的能力。
使iPS分化成造血细胞的示例性方法可包括例如美国专利No.8,557,580和8,372,642以及WO 12/109208(全部通过引用整体并入本文)中公开的方法，或其他方法(Chadwick等,2003；Ng等,2005)。纤连蛋白分化方法也可用于血液谱系分化，如Wang等,(2007)中示例的。也可以通过利用造血细胞因子和骨形态发生蛋白培养干细胞来制备造血细胞，如美国专利公开2003/0153082中所述的。
a.嵌合抗原受体和T细胞受体
本文使用的术语“抗原”是能够与抗体或T细胞受体结合的分子。抗原还能够引起体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致产生B淋巴细胞和/或T淋巴细胞。术语“肿瘤相关抗原”和“癌细胞抗原”在本文可互换使用。在每一种情况下，所述术语指癌细胞特异性或优先表达的蛋白质、糖蛋白或碳水化合物。
本文使用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并且包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可用于赋予T细胞单克隆抗体特异性，从而允许产生大量特异性T细胞例如用于过继细胞疗法。在一些特定实施方案中，CAR例如指导细胞对肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施方案中，CAR包括细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在一些特定方面，CAR包括与CD3-ξ跨膜结构域和内部结构域融合的来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合。其他CAR设计的特异性可来自受体的配体(例如，肽)或来自模式识别受体，例如Dectins。例如，可以通过使用B谱系分子CD19的特异性CAR将T细胞的特异性重新定向以靶向恶性B细胞。在某些情况下，可修饰抗原识别结构域的间隔以降低活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含额外共刺激信号的结构域，例如CD3-ξ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像的报道基因(例如，用于正电子发射断层摄影)、在添加前药后有条件地消除T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
本发明的实施方案涉及核酸，包括编码抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的核酸，所述嵌合抗原受体包括经人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号基序的细胞外结构域。在某些实施方案中，CAR可识别包含一种或多种抗原之间共享的空间的表位。模式识别受体如Dectin-1可用于驱动对于碳水化合物抗原的特异性。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，特异性来源于与受体结合的肽(例如，细胞因子)。互补决定区(CDR)是存在于抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白质的可变结构域中的与抗原互补的短氨基酸序列，因此为受体提供对于所述特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链包括三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。由于抗原受体通常由两条多肽链组成，因此每个抗原受体有6个可以与抗原接触的CDR，重链和轻链各含三个CDR。由于与免疫球蛋白和T细胞受体有关的大部分序列变异性存在于CDR中，这些区域有时候也称为超变区。其中，CDR3表现出最高变异性，因为其由VJ(在重链和TCRαβ链的情况下VDJ)区域的重组编码。
本文使用的术语“T细胞受体(TCR)”是指T细胞上的蛋白质受体，其由阿尔法(α)链和贝塔(β)链的异二聚体构成，但是在一些细胞中TCR由伽马和德尔塔(γ/δ)链构成。在本发明的一些实施方案中，任何包含TCR的细胞上的TCR可以修饰，所述细胞包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。“嵌合TCR”意指包含细胞内信号结构域、跨膜结构域和细胞外结构域的受体，其中细胞外结构域能够以不受MHC限制的方式与抗原特异性结合，而T细胞受体不能以所述方式与所述受体结合。合适条件下抗原对T细胞的刺激导致细胞增殖(扩增)和/或产生IL-2。所述方法适于利用靶抗原的特异性嵌合TCR转染，例如HER2/Neu、ERBB2、盐酸结合蛋白、肾细胞癌以及HIV-1包膜糖蛋白gp120和gp41的特异性的嵌合TCR。其他细胞表面靶抗原包括但不限于CD20、癌胚抗原、间皮素、ROR1、c-Met、CD56、GD2、GD3、甲胎蛋白、CD23、CD30、CD123，IL-11Rα、κ链、λ链、CD70、CA-125、MUC-1、EGFR和变体、上皮肿瘤抗原等。
预期人源化CAR核酸来源于人基因以增强对于人患者的细胞免疫治疗。在一个特定实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可包含来自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，例如美国专利No.7,109,304中描述的那些，其通过引用并入本文。片段也可以是任何数目的人抗原特异性抗体的不同抗原结合结构域。在一个更特定的实施方案中，片段是由用于在人细胞中表达进行了用于人密码子使用的优化的序列所编码的抗原特异性scFv。
排列可以多聚体的，例如二聚抗体或多聚体。多聚体最可能由轻链和重链的可变部分的交叉配对成二聚抗体形成。构建体的铰链部分可具有多重选择，从完全缺失，到保持第一半胱苷酸，到脯氨酸替换而非丝氨酸替换，到缩短至第一半胱氨酸。Fc区可以缺失。任何稳定和/或二聚化的蛋白质可用于该目的。可以使用来自人免疫球蛋白的仅一个Fc结构域，例如CH2或CH3结构域。也可以使用人免疫球蛋白的铰链区、CH2区和CH3区，其已经被修饰以提高二聚化。也可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。还可以使用CD8α部分。
实施方案的嵌合受体的细胞内信号结构域(其可以称为胞质结构域)负责活化嵌合受体所处的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指分化细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，例如分泌细胞因子。幼稚、记忆或记忆型T细胞中的效应功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“细胞内信号结构域”是指转导效应功能信号并且指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。尽管通常使用整个细胞内信号结构域，但是在许多情况下，不必使用整个细胞内多肽。在细胞内信号结构域的截短部分依然转导效应功能信号的程度上，可以使用这样的截短部分代替完整链。因此，术语细胞内信号结构域意在包括细胞内信号结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。实例包括T细胞受体的ζ链或其任意同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc RI，以及一种或多种信号分子中的全部或一部分的组合，例如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB(CD137)、DAP10、DAP12、OX40(CD134)、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、CD40及其组合，以及其他类似分子和片段。可以使用活化蛋白家族的其他成员的细胞内信号部分，例如FcγRIII和FcεRI。在一些实施方案中，在细胞内结构域中使用内源T细胞受体复合物的任何部分。可以使用一个或多个胞质结构域，所谓的第三代CAR具有融合在一起的至少两个或三个信号结构域，用于例如累加效应或协同效应。
抗原特异性细胞外结构域和细胞内信号结构域可通过跨膜结构域连接，例如人IgG4Fc铰链和Fc区。替代品包括人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域或半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域，或者来自其他人跨膜信号蛋白(例如，CD16和CD8以及***受体)的其他跨膜结构域。
在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其他共刺激受体的序列，例如跨膜结构域和经修饰CD28细胞内信号结构域。其他刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX40(CD134)、DAP10和4-1BB(CD137)中的一种或多种。由***在人CAR中的人共刺激受体提供的额外信号对于T细胞的完全活化很重要，并且可有助于提高过继免疫治疗的体内持久性和治疗成功率。
在一些特定实施方案中，本发明涉及并入有编码CAR的DNA序列的经分离的核酸片段和表达盒。实施方案的载体主要设计来在可调节的真核启动子的控制下向细胞递送基因，所述启动子例如MNDU3启动子、CMV启动子、EF1α启动子或泛素启动子。另外，载体可包含选择标记以有助于其体外操作(如果没有其他原因的话)。在另一些实施方案中，CAR可以由DNA模板转录的体外mRNA表达。
嵌合抗原受体分子是重组体并且以结合抗原和通过存在于胞质尾区中的免疫受体活化基序(ITAM)转导活化信号两种能力来区别。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scFv)产生)的受体构建体赋予了“通用”的额外优点，其中其以不依赖于HLA的方式与靶细胞表面的天然抗原结合。重定向的T细胞效应机制包括通过CTL的肿瘤识别和裂解。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含：a)细胞内信号结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合区的细胞外结构域。使用人抗体作用抗原结合区的来源是优选的。在CAR中使用人序列可以避免通过存在于接受者中的内源T细胞的免疫介导的识别和因此的消除并且识别HLA背景下的经加工抗原。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可以称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域，任选地包括通过模式识别受体(例如，Dectin-1)识别碳水化合物抗原。
肿瘤相关抗原可以是任何类型，例如在肿瘤细胞的细胞表面表达的那些。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变p53、突变ras等。在某些实施方案中，当只有少量肿瘤相关抗原时，CAR可与膜结合细胞因子共表达以提高持久性。例如，CAR可以与膜结合IL-15共表达。
在某些实施方案中，可以靶向细胞内肿瘤相关抗原，例如HA-1、生存素、WT1和p53。这可以通过识别HLA背景下由细胞内肿瘤相关抗原转录的经加工肽的CAR实现。此外，可对通用T细胞进行遗传修饰以表达识别HLA背景下细胞内经加工的肿瘤相关抗原的T细胞受体对。
病原体可以是任意类型，但是在一些特定实施方案中，病原体是例如真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括以下那些：腺病毒科(Adenoviridae)、Epstein-Barr病毒(EBV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV科病毒、小RNA病毒科(Picornaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、肝病毒科(Hepadnaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)、乳多孔病毒科(Papovaviridae)、多瘤病毒科(Polyomavirus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。示例性致病病毒引起天花、流感、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性致病真菌包括假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和葡萄状穗霉属(Stachybotrys)。示例性致病细菌包括链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺菌属(Shigella)、弯曲菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、大肠杆菌(E.coli)、立克次体属(Rickettsia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鲍特菌属(Bordetella)、衣原体属(Chlamydia)、螺旋菌属(Spirochetes)和沙门氏菌属(Salmonella)。在一个实施方案中，病原体受体Dectin-1可用于产生识别真菌细胞壁上的碳水化合物结构的CAR。基于Dectin-1的特异性进行遗传修饰以表达CAR的T细胞可识别曲霉属并且靶向生长菌丝。在另一个实施方案中，可基于识别病毒决定簇(例如，来自CMV和埃博拉病毒的糖蛋白)的抗体制备CAR以中断病毒感染和病理。
根据实施方案的嵌合抗原受体可通过本领域中已知的任何方法产生，但是优选地使用重组DNA技术产生。可通过标准分子克隆技术制备编码嵌合受体的多个区域的核酸序列并且组装成完整编码序列(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scFv文库、定点诱变等)。所得编码区可***到表达载体中并且用于转染目标细胞，例如iPSC。
b.抗原呈递细胞
在一些实施方案中，APC可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞疗法产品。关于制备和使用抗原呈递细胞如使用人工APC的***的通用指南，参见例如美国专利No.6,225,042、6,355,479、6,362,001、6,790,662、7,993,638和8,124,408；以及美国专利公开No.2009/0004142。
通常利用最佳长度的肽孵育APC，所述最佳长度允许肽直接与MHC分子结合而不需要额外加工。或者，细胞可表达目标抗原(即，在不依赖于MHC的抗原识别的情况下)。除了肽-MHC分子或目标抗原之外，APC***还可包含至少一种外源辅助分子。可以使用任何合适数目和组合的辅助分子。辅助分子可以由诸如共刺激分子和粘附分子的辅助分子中选择。示例性共刺激分子包括CD86和B7.1(B7.1之前称为B7，也称为CD80)，其除了其他方面以外，与T细胞表面的CD28和/或CTLA-4分子结合，从而影响例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活和细胞因子分泌(例如，白介素(IL)-2)(参见，Kim等,2004)。粘附分子可包括碳水化合物结合糖蛋如选择素、跨膜结合糖蛋白如整合素、钙依赖性蛋白如钙粘素和单跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白质如细胞内粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质接触。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，例如ICAM-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术列举在例如美国专利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001中。
选择成为人工APC的细胞优选地在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHC I类或II类分子-肽负载中具有缺陷，或者是冷血的(poikilothermic)(即，与哺乳动物细胞系相比对于温度刺激较不敏感)，或具有缺陷特性和冷血特性二者。在一些方面，对于引入到细胞中的外源MHC I类或II类分子和辅助分子组分，选择成为APC的细胞还缺乏表达其至少一种内源对应物(如如上所述的内源MHC I类或II类分子和/或外源辅助分子)的能力。此外，在一些情况下，人工APC保留了对细胞进行修饰以产生aAPC之前细胞所具有的缺陷特性和冷血特性。示例性aAPC构成或来源于抗原加工相关的转运蛋白(transporterassociated with antigen processing，TAP)缺陷细胞系，例如昆虫细胞系。示例性冷血昆虫细胞是Drosophila细胞系，例如Schneider 2细胞系(参见，例如Schneider,1972)。用于制备、生长和培养Schneider 2细胞的示例性方法提供在美国专利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001中。
在一个实施方案中，还对APC进行冻融循环。在一个示例性冻融循环中，可以通过使含APC的合适的容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即，干冰)或类似低温物质接触来冷冻APC，以使得快速冷冻。然后通过从低温物质中移出APC并且暴露于环境室温条件来解冻APC，或者通过使用温水浴或温暖手促进的解冻过程以缩短解冻时间。或者，可以冷冻APC并且在储存延长的时期之后解冻。也可以将冷冻APC解冻然后在进一步使用之前冻干。优选地，进行冻融循环的含APC的培养基不含可能不利地影响冻融程序的防腐剂如二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)等防腐剂，或者基本移除这些防腐剂，例如通过将APC转移到基本缺少这些防腐剂的培养基中。
在另外某些实施方案中，可以通过交联使aAPC的异种核酸(xenogenic nucleicacid)和内源核酸灭活，使得在灭活后基本不发生细胞生长、核酸复制或表达。在一个实施方案中，在外源MHC和辅助分子表达，将这些分子呈递在aAPC的表面，并且使呈递MHC分子负载选择的肽之后的时间点灭活aAPC。因此，这种灭活并且负载选择的肽的aAPC尽管基本不能扩增和复制，但是保留了选择的肽呈递功能。优选地，交联还产生了基本没有污染微生物(例如细菌和病毒)的aAPC，而基本不降低aAPC的抗原呈递功能。因此，交联保持了aAPC的重要APC功能，同时有助于减轻关于使用aAPC开发的细胞疗法产品的安全性的担心。对于与交联和aAPC有关的方法，参见例如美国专利No.8,124,408，其通过引用并入本文。
3.肝细胞
可使用组蛋白脱乙酰酶的抑制剂由多能干细胞分化肝细胞，如美国专利No.6,458,589和6,506,574中所述。用于使多能细胞分化成肝细胞的分阶段方案描述在美国专利No.7,473,555中。在本发明的某些方面，可以如美国专利No.8,283,168中所述通过在培养基中培养多能干细胞以指导分化成肝细胞来制备干肝细胞。在本发明的某些方面，可以通过在将细胞内肝细胞重编程因子的水平提高到足以促进细胞重编程为肝细胞的条件下，在培养基中培养多能干细胞来制备肝细胞。
4.神经细胞
可以根据以下中所述的方法由多能干细胞产生神经细胞：美国专利No.6,833,269和7,250,294，美国专利公开No.2012/0276063；以及Carpenter等,2001。可以由多能干细胞产生少突胶质细胞，参见美国专利No.7,285,415和Keirstead等,2005。也报道了视网膜色素上皮细胞的获得(Klimanskaya等,2004)。
5.心脏细胞
本文提供的iPS细胞可以根据美国专利No.8,415,155中所述的方法分化成心肌细胞。可根据美国专利No.7,763,464中所述的方法由多能干细胞如iPS细胞产生心肌细胞或心肌细胞前体。iPS细胞的心脏分化的示例性方法可包括拟胚体(EB)方法(Zhang等,2009)、OP9基质细胞方法(Narazaki等,2008)或生长因子/化学方法(参见美国专利No.7,897,389、7,955,849和8,951,798，其全部通过引用整体并入本文)
6.胰腺细胞
可以由多能干细胞分化胰岛细胞(WO 03/050249)。
7.其他细胞类型
可以根据WO 03/004605中所述的方法由多能干细胞产生间充质祖细胞和成纤维细胞。干细胞来源间充质细胞可在培养基中进一步分化成成骨细胞谱系细胞，所述培养基含有成骨因子，例如骨形态发生蛋白(特别是BMP4)、人TGF-β受体的配体，或人维生素D受体的配体(WO 03/004605)。
G.生物反应器和自动化
培养干细胞和/或由其分化的细胞的一个或多个步骤可以自动化。使用机器人或其他自动化技术使工艺自动化可允许更有效和经济的细胞生产、培养和分化方法。例如，机器人自动化技术可结合诱导多能干细胞的培养、传代、添加培养基、添加分化培养基、在分化培养基中培养以及使用例如磁力分离或FACS分离细胞类型中的一种或多种使用。
生物反应器也可结合本发明实施方案使用以培养、维持和/或分化根据本发明实施方案的细胞。生物反应器提供了允许将工艺“按比例放大”的优点，以产生增加量的细胞。多种生物反应器可用于本发明的实施方案，包括浴生物反应器、分批进料生物反应器、连续生物反应器(例如，连续搅拌釜反应器模型)和/或恒化器。例如，旋转瓶可用于多能细胞的维持和/或分化的大规模化方法，以允许产生增数目的细胞。
特别设想用于本发明实施方案的机器人自动化可由例如Tecan(CA,USA)获得。机器人可包括液体装卸工具，例如刺穿盖的探针和一次性吸头以使样品之间的结转最小化。在多个实施方案中，机器人可结合用于培养细胞的一个或多个生物反应器使用(例如，在iPSC维持或生长，iPSC分化成造血细胞，或者造血细胞分化成随后的谱系如红细胞等的过程中)。
在某些实施方案中，其可用于将本发明实施方案的方法小型化或“按比例缩小”。例如，在方法包括高通量筛选时，这可能特别有用。高通量筛选可用于评估嵌合抗原受体的一个或多个特性。方法的小型化可涉及使用低粘附板(low-attachment plate)(例如，96孔板)和/或在低氧(低于约25％O2或约5％O2)条件下培养细胞。
使用机器人自动化，通过在培养基中包含ROCK抑制剂HA100和/或H1152以诱导细胞作为单细胞粘附在板上，本发明实施方案的方法可用于单细胞测定。向培养***中添加小分子HA100或H1152或Y-27632可极大提高多能细胞(包括iPSC)的存活率。在某些实施方案中，特别是在细胞已经蛋白酶解或机械分离成块或个性化之后，可以通过包含ROCK抑制剂或PKC抑制剂来提高TeSR培养基中多能细胞的存活率。ROCK抑制剂可促进个性化iPS细胞附着在表面并且生长。多能细胞的维持或增值过程，以及分化成造血祖细胞或特定造血谱系过程中的一些或全部可以自动化。所有自动化方法中的一部分可利用确定条件。
III.治疗方法
A.免疫***和免疫治疗
在一些实施方案中，通过转移引起特异性免疫应答的免疫效应细胞(例如，T细胞)治疗医学病症。因此，有必要对免疫应答进行基本了解。
适应性免疫***的细胞是白细胞的类型，称为淋巴细胞。B细胞和T细胞是淋巴细胞的主要类型。B细胞和T细胞来源于相同的多能造血干细胞，直到分化后才彼此区分开来。B细胞在体液免疫应答中具有重要作用，而T细胞与细胞介导的免疫应答密切相关。T细胞可通过其细胞表面被称为T细胞受体(TCR)的特定受体的存在而区别于其他淋巴细胞，例如B细胞和NK细胞。在几乎所有其他脊椎动物中，B细胞和T细胞有骨髓中的干细胞产生。T细胞运输到胸腺中并且在那里发育，由此得到了其名称。在人中，淋巴细胞库中的约1％-2％每小时再循环以优化抗原特异性淋巴细胞在次级淋巴组织中找到其特异性抗原的机会。
T淋巴细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并且通常迁移到胸腺中成熟。T细胞在其膜上表达独特的抗原结合受体(T细胞受体)，其仅可以识别与其他细胞表面的主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原。有至少两群T细胞，称为T辅助细胞和T细胞毒性细胞。T辅助细胞与T细胞毒性细胞的主要区别在于其分别展示膜结合蛋白CD4和CD8。T辅助细胞分泌多种对于活化B细胞、T细胞毒性细胞、巨噬细胞和免疫***的其他细胞重要的细胞因子。相比之下，识别抗原-MHC复合物的T细胞毒性细胞增殖并分化成被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应细胞。CTL通过产生导致细胞裂解的物质来消除展示抗原的身体细胞，例如各种感染细胞和肿瘤细胞。自然杀伤细胞(例如，NK细胞)细胞毒性淋巴细胞的类型，后者构成了先天免疫***的主要成分。NK细胞在排斥肿瘤和病毒感染细胞中具有主要作用。细胞通过释放被称为穿孔素的小细胞质颗粒蛋白和导致靶细胞通过凋亡死亡的颗粒酶来进行杀伤。
包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞的抗原呈递细胞通过表达特定MHC分子进行区分。APC内化抗原并且与其细胞外膜上的HMC分子一起再表达所述抗原的一部分。主要组织相容性复合物(MHC)具有多个基因座的大的遗传复合物。MHC基因座编码两大类MHC膜分子，称为I类和II类MHC。T辅助淋巴细胞通常识别与MHC II类分子结合的抗原，而T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子结合的抗原。在人中，MHC称为HLA复合物，在小鼠中称为H-2复合物。
T细胞受体或TCR是T淋巴细胞(或T细胞)表面的分子，其通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在95％的T细胞其为由α链和β链构成的异二聚体，而5％的T细胞具有由γ链和δ链构成的TCR。TCR与抗原和MHC的结合导致通过由相关酶、共受体和专门辅助分子介导的一系列生物化学事件活化其T淋巴细胞。
自身免疫病或自身免疫疾性是生物体不能识别其自身组成部分(下至亚分子水平)为“自身”，引起针对其自身细胞和组织的免疫应答。这种异常免疫应答导致的任何疾病均称为“自身免疫病”。
B.细胞的生长和施用
在某些方面，细胞由iPSC分化。在一个方面，由iPSC分化的T细胞可通过例如基因转移引入CAR或TCR来进行重组。在某些方面，可在基因转移后约1、2、3、4、5天或更久时间内使细胞离体繁殖数天、数周、数月成为大的群体。在另一些方面，可克隆重组T细胞并且将表现出存在以整合或附加体形式维持的单表达盒或质粒或表达嵌合受体的克隆离体扩增。可以通过用IL-2或与共同γ链结合的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩增重组T细胞。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩增重组T细胞。可以在人工抗原呈递细胞上或利用抗体如与T细胞编码的CD3交联的OKT3来扩增重组T细胞。在另一些方面，遗传修饰细胞可以冷冻保存。
在本发明的某些实施方案中，将CAR+细胞递送到有此需要的个体中，例如患有癌症、自身免疫病或感染的个体中。所述细胞然后增强个体的免疫***以攻击各自的癌症或致病细胞。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的抗原特异性CAR+T细胞。在向个体提供两个或更多个剂量的抗原特异性CAR+T细胞的情况下，施用之间的持续时间应该足够以允许在个体中繁殖的时间，在特定实施方案中，给药之间的时间为1、2、3、4、5、6、7或更多天。
用于治疗效果的免疫效应细胞的合适的剂量可以为例如每剂量至少105个细胞或105至1010个细胞，优选在一系列给药周期中。示例性给药方案由逐步增加剂量的4个一周给药周期组成，例如在第0天以至少105个细胞开始，在开始患者内剂量递增方案的数周内逐渐增加到约1010个细胞的目标剂量。合适的施用方式包括静脉内、皮下、腔内(例如，通过容器进入装置(reservoir-access device))、腹膜内以及直接注射到肿瘤块中。
根据实施方案的药物组合物可单独使用或者与可用于治疗癌症或感染疾病的其他成功确认的药剂联合使用。无论是单独递送还是与其他药剂联合递送，本发明的药物组合物可通过多种途径递送到哺乳动物(特别是人)身体的多个部位以实现特定效果。本领域技术人员将承认，尽管可使用超过一种途径递送，特定途径可比另外的途径提供更便利和更有效的反应。例如，对于治疗黑色素瘤，真皮内递送的使用可优于吸入。可以通过施用实现局部或全身递送，包括将制剂施用或滴注到体腔中，吸入或吹入气雾剂，或通过胃肠外引入，包括肌肉内、静脉内、门内(intraportal)、肝内、腹膜、皮下或真皮内施用。
实施方案的组合物可以以单位剂量提供，其中每个剂量单位(例如，一次注射)包含预定量的组合物，所述组合物单独或与其他活性剂适当联合。本文使用的术语单位剂型是指适合于作为单一剂量用于人和动物对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的实施方案组合物，所述组合物单独或与其他活性剂适当联合，所述预定量以足以产生期望效果的量计算，当合适时与药学上可接受的稀释剂、载体或载剂组合。实施方案新单位剂型的规格取决于与特定对象中的特定组合物相关的特定药效动力学。
理想地，有效量的或足够数量的细胞存在于组合物中并且引入到对象中从而建立长期特异性抗肿瘤应答，与不存在这样的治疗的结果相比减小肿瘤的大小或者消除肿瘤生长或再生。理想地，与不存在所述细胞的其他方面相同的条件相比，引入到对象中的细胞的量导致肿瘤大小降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。
因此，施用的细胞量应考虑施用途径并且应使得引入足够数量的细胞以实现期望的治疗应答。此外，本文所述组合物中包含的每一种活性剂的量(例如，量/每个待接触细胞或量/某体重)在不同施加中可能变化。一般地，理想的细胞浓度应足以在被治疗对象中提供至少约1×106至约1×109个转导细胞，甚至更理想地，约1×107至约5×108个转导细胞，但是可以使用任何合适的量，或者在其之上，例如大于5×108个转导细胞，或者在其之下，例如小于约1×107个转导细胞。给药方案可以基于充分确定的基于细胞的治疗(参见，例如Topalian和Rosenberg,1987；美国专利No.4,690,915)，或者可以使用连续输注策略。
这些值提供了从业者在优化实施方案的方法之后使用的细胞范围的通用指南。本文对这样的范围的记载绝没有排除更高或更低量组分的使用，如在特定施加中可能考虑的。例如，实际剂量和时间安排可根据组合物是否与其他药物组合物联合施用或者根据个体药代动力学、药物处置和代谢的差异改变。本领域技术人员可容易地根据特殊情况的紧急状态进行任何必要的调节。
IV.载体构建和递送
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送或基因转移“载剂”)是指包含待递送到体外或体内的宿主细胞中的多核苷酸的大分子或分子复合物。“质粒”(一种类型的载体)是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。在某些情况下，其为环形和双链。
在某些实施方案中，载体(例如重编程载体或CAR载体)可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体以在细胞中表达这些蛋白质。在某些实施方案中，载体可以是染色体外复制型载体，其不整合到宿主细胞基因组中并且可能在世代复制期间丢失。下面详细公开这些载体的组件和的和递送方法的细节。
本领域技术人员将通过标准重组技术熟练构建载体(参见，例如Sambrook等,2001和Ausubel等,1994，二者均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒(cosmid)、病毒(例如，噬菌体、动物病毒和植物病毒)、人工染色体(例如，YAC)、逆转录病毒载体(例如，来源于莫罗尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如，来源于HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)；腺病毒(Ad)载体，包括其能够复制的、复制缺陷的及裸形式(replication gutless)；腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV40)载体、牛***瘤病毒载体、Epstein-Barr病毒、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、Harvey鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体和劳斯肉瘤病毒载体。
A.调控元件
载体还可以包含其他组分和功能，其进一步调节基因递送和/或表达，或者以其他方式为靶细胞提供有益特性。这样的其他组分包括例如影响对细胞的结合或靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞对载体核酸的摄取的组分；影响摄取后细胞内多核苷酸的定位的组分(例如调节核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。
载体中包含的真核表达盒可包含(5′-至-3′方向)：与蛋白质编码序列可操作地连接的真核转录启动子，包含***序列的剪接信号，和转录终止子/多腺苷酸化序列。
1.启动子/增强子
“启动子”是控制序列，其为控制转录的开始和速率的核酸序列区域。语句“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制之下”和“在转录控制之下”意指启动子相对于核酸序列处于正确功能位置和/或方向，以控制所述序列的转录开始和/或表达。启动子可以结合或不结合“增强子”使用，后者是指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调控序列。
使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或可在合适的条件下使用以指导引入的DNA序列的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白质和/或肽中有利。启动子可以是异源或内源。启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期启动子或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子如真核延长抑制1α启动子；和串联应答元件启动子。
2.起始信号
特异性起始信号可能也是编码序列的有效翻译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源转录控制信号，包括ATG起始密码子。众所周知起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框“同框”以确保整个***序列的翻译。
3.剪接位点
大部分转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物中移除内含子。含真核基因组序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白质表达的转录物的适当加工。
4.终止信号和多腺苷酸化信号
实施方案的载体或构建体可包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与通过RNA聚合酶的RNA转录的特定终止的DNA序列组成。终止子可能是体内必要的以实现期望的信息水平。在真核***中，终止子区域还可包含允许新转录物进行位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点的特定DNA序列。预期根据实施方案使用的终止子包括本文所述的任何已知或本领域技术人员已知的，包括但不限于例如基因终止序列，例如，牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。
B.多克隆位点
载体可包含多克隆位点(MCS)，其为包含多个限制酶位点的核酸区域，其中任一个都可结合标准重组技术用于设计载体。“限制酶消化”是指利用仅作用于核酸分子的特定区域的酶催化裂解核酸分子。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是彼此连续的或不连续的。涉及限制酶和连接反应的随机数是重组技术领域技术人员周知的。
C.复制起点
为了在宿主细胞中繁殖载体，其可包含一个或多个复制起点(常称为“ori”)，例如，对应于上述EBV的oriP的核酸序列，或者在重编程中具有类似或提高的功能的基因工程oriP，其为开始复制的特定核酸序列。或者，可使用上述其他染色体外复制病毒或自主复制序列(ARS)的复制起点。
D.内部核糖体进入位点(IRES)和蛋白酶切割位点/自我切割肽(Self-CleavingPeptide)
实施方案的一些方面种包含IRES以允许产生多顺反子转录物。IRES序列允许由单遗传基因座同时表达多种蛋白质。IRES元件可与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可一起转录，各自由IRES分开，产生多顺反子信息。借助IRES元件，每个开放阅读都可以与核糖体结合用于有效翻译。可使用单个启动子/增强子有效表达多个基因以转录单一信息。在一些情况下，IRES依赖性多顺反子***可用于增强产生iPS细胞的效率。
一个实施方案涉及在同一多顺反子转录物中包含期望重组产物和报道子二者的编码序列。成功转化事件的特点是期望重编程因子和易检测报道子二者的表达，有助于选择成功转染的细胞。
E.报道子
在本发明的某些实施方案中，通过在表达载体中包含标记，可在体外或体内鉴定实施方案的含核酸构建体的细胞。这样的标记将赋予细胞可鉴定的变化，使得能够容易鉴定含表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予允许选择之特性的标记。阳性选择标记是其中标记的存在允许对其选择的标记，而阴性选择标记是标记的存在阻止对其选择的标记。阳性选择标记的一个实例是抗药性标记。
通常，包含药物选择标记有助于克隆和识别转化子，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于实施条件辨别转化子的表型的标记以外，还预期了其他类型的标记，包括可筛选标记，例如荧光蛋白和β-半乳糖苷酶。或者，可使用可筛选酶作为阴性选择标记，例如单纯疱疹病毒胸腺激酶(tk)或赤霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标记(例如，细胞表面蛋白)，可能结合FACS分析。不认为所使用的标记是重要的，只要其能够随编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标记和可筛选标记的其他实例是本领域技术人员周知的。实施方案的一个特征包括在重编程因子对细胞的重编程起效后使用选择标记和可筛选标记来选择不含载体的细胞。另一个优点是富集具有沉默的报道子表达的诱导多能干细胞。
F.载体递送
可使用任何用于递送核酸转化细胞的合适方法将重编程载体引入到根据实施方案的体细胞中，如本文所述或如本领域技术人员已知。这样的方法包括但不限于通过离体转染直接递送DNA；通过注射，包括显微注射；通过电穿孔；通过磷酸钙沉淀；通过DEAE-右旋糖酐然后聚乙二醇；通过直接声波负载(direct sonic loading)；通过脂质体介导的转染；通过受体介导的转染；通过微粒轰击；通过碳化硅纤维搅动；通过土壤杆菌介导的转化；通过PEG介导的原生质体转化；通过干燥/抑制介导的DNA摄取；以及这样的方法的任意组合。通过应用诸如这些的技术，可稳定或瞬时转染细胞。
V.实施方案的试剂盒
本文所述的任何组合物可包含在试剂盒中。在一些实施方案中，HLA-Aneg iPSC提供在试剂盒中，所述试剂盒还包含适合于扩增和/或分化细胞的试剂，例如培养基、aAPC、生长因子、抗体(例如，用于细胞的分化或表征)和/或编码CAR的质粒或转座酶。
在一个非限制性实施例中，试剂盒包含嵌合受体表达构建体、用于产生嵌合受体表达构建体的一种或多种试剂，用于表达构建体转染的细胞，和/或获得用于表达构建体转染的同种异体细胞的一种或多种器械(例如，所述器械可以是注射器、移液器、钳子和/或任何这样的医学安全设备)。
在一些实施方案中，试剂盒中提供用于消除内源HLA-A表达的表达构建体，产生表达构建体的一种或多种试剂，和/或CAR表达构建体。在一些实施方案中，包括编码锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9的表达构建体。
在一些方面，试剂盒包含用于细胞的电穿孔的试剂或设备。
试剂盒可包含一种或多种适当等分的实施方案组合物或者产生实施方案的组合物的试剂。试剂盒的组分可包装在水介质中或为冻干形式。试剂盒的容器装置可包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，其中可以放置组分，并且优选地适当等分。当试剂盒中有超过一种组分时，试剂盒通常还包含第二、第三或其他额外容器，其中可以单独放置额外组分。然而，组分的多种组合可以包含在小瓶中。实施方案的试剂盒通常还包括用来紧密容纳细胞、构建体和其他试剂容器的装置，用于商业销售。这样的容器可包括注射或吹塑成型塑料容器，其中容纳例如期望的小瓶。
VI.实施例
以下具体的非限制性实施例仅解释为说明性的，而无论如何不限制本公开内容。无须赘述，相信本领域技术人员基于本文的描述能够最大程度利用本公开内容。本文引用的所有出版物均通过引用整体并入本文。当引用URL或其他这样的标识符或地址时，应理解这样的标识符可改变并且在因特网上的信息可能变来变去，但是通过在因特网上搜索可找到等效信息。对其的参考证明了此类信息的可获得性和公众传播。
实施例1.HLA-Aneg造血干细胞的产生
如果对同种异体HSC进行基因编辑以消除HLA-A基因座的表达，登记的NMDP供体的临床使用可显著提高。工程化锌指核酸酶(ZFN)(或任何人工核酸酶，例如TALEN、CRISPR/Cas9)可用于消除基因编辑的T细胞和细胞系中HLA-A的表达。为了将基因编辑延伸到造血干细胞(HSC)，通过引入靶向该基因座的ZFN来破坏HLA-A表达。如下从脐带血(UCB)中分离CD34+谱系neg HSC(99％纯度)：首先使用针对CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD61和CD235a(血型糖蛋白A)的生物素化抗人抗体的混合物消耗谱系pos细胞并且使用生物素结合的顺磁珠消耗。接着，使用抗CD34磁珠分离CD34+细胞。在利用确定细胞因子(FLT3-L、SCF、TPO和IL-6)和芳烃受体拮抗剂(stem reginin-1,SR-1)离体培养1周后，体外转录的编码HLA-A特异性ZFN的mRNA物质的电转移产生30％HLA-Aneg HSC。DNA序列分析表明，HLA-Aneg HSC在ZFN靶位点处表现出预期的核苷酸变化。体外测定表明HLA-Apos HSC和HLA-AnegHSC之间的谱系特异性集落形成之间没有显著差异。此外，使用NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠的体内移植测定证明，工程化HLA-Aneg HSC保持了移植和分化成HLA-Aneg多谱系造血细胞的能力。
实施例2.HLA-Aneg iPSC的产生
使所需供体数目最小化的一种方法是从HLA纯合供体中消除一个HLA基因座。已经确定，从供体细胞中消除HLA-A可对找到合适的HLA匹配供体的机会具有显著影响(图1)。因此，从HLA纯合供体中消除HLA-A表达将降低所需的可输注到HLA-匹配患者中的库存iPSC的数目。可对造成有害的同种异体免疫反应的内源TCRαβ和γδ表达进行进一步消除以减少移植物抗宿主病。iPSC可经进一步修饰以表达***基因(例如，iCasp9，诱导型胱天蛋白酶9)以确保用于疾病和再生医学的同种异体iPSC疗法的安全性。分离具有“安全港”遗传谱的iPSC克隆(Papapetrou等,2011，通过引用并入本文)，如通过全基因组测序和整合位点分析(例如，转基因表达持续并且不破坏内源基因表达的整合位点)测定。这种***基因+，TCRneg，HLA-Aneg，HLA-纯合iPSC库可用于制备在大范围患者中有用的同种异体细胞产品。这种iPSC库将改善治疗剂潜力，能够将有限的起始细胞库施用到大量接受者中。这些iPSC的一种潜在立即应用是i)免疫细胞(包括T细胞(Themeli等,2013)、NK细胞(Knorr等,2013)、NKT细胞等)，其表达用于免疫治疗的肿瘤-或病毒-特异性免疫受体(例如，TCRαβ或嵌合抗原受体(CAR))；和ii)用于恶性血液病或先天病症造血干细胞移植。此外，同种异体iPSC可用于产生例如用于再生医学的心肌细胞、肺上皮细胞、肾细胞和神经元细胞。由于相对高的克隆效率和稳健增殖，iPSC还可用于安全的细胞工程化。例如，iPSC可被修饰以表达治疗基因(例如，CAR)，且还可通过人工核酸酶(例如，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9)基因编辑以消除免疫抑制分子(例如，PD-1、CTLA-4、TCRα恒定区)。
仙台病毒载体介导的T细胞基因转导至T细胞内.仙台病毒载体用于由来源于HLA纯合UCB的T细胞产生iPSC(表2)。首先，通过使用携带GFP报道基因的SeV载体在T细胞中测试SeV的效率。在用抗-CD3单克隆抗体(moAb)和抗-CD28moAb活化T细胞2天之后，用GFP-SeV颗粒感染细胞。来自SeV的GFP表达非常高，并且其表达在1周后还维持(比非转染T细胞的MFI几乎高3log)(图4)。
由来源于HLA纯合UCB的T细胞产生iPSC。由安德森癌症中心(MD Anderson CancerCenter)的脐血库(Cord Blood Bank)获得HLA纯合UCB。在一种方法中，在分离T细胞之后，用SeV载体以MOI(分别为5、5、3)感染细胞，所述载体编码i)KLF4、OCT4、SOX2(多顺反子载体)，ii)cMYC和iii)KLF4。在MEF饲养培养物(MEF feeder culture)或Matrigel上12天后，iPS集落出现并且在第16天利用TRA-1-60染色评估这些集落(图5)。在MEF饲养条件初始诱导之后，将iPSC继续培养在具有mTeSR1培养基的无饲养细胞(feeder free)(Matrigel涂覆)的板上。iPSC在这种条件下保持多能细胞样形态，并且通过免疫荧光染色确认iPSC对多能性标记的表达(图6)。
DNA质粒或体外转录的mRNA电穿孔到iPSC中。采用睡美人转座子/转座酶***产生嵌合抗原受体表达T细胞，用于癌症的过继免疫治疗。这种***比基于病毒的遗传修饰便宜得多。由于这种***依赖于通过核转染的DNA质粒(或mRNA)转染，所以利用编码CMV启动子驱动的GFP和编码GFP的mRNA在iPSC中测试核转染。利用4D Amaxa Nucleofector(程序：CA-137)，将DNA质粒和mRNA引入到iPSC中(图7)。当使用利用条带的小规模转染(20μL)时，实现了这种高转染效率。
通过锌指核酸酶破坏TRAC基因。图8提供了用于通过mRNA-编码的锌指核酸酶的转染破坏TRAC基因(TCRα恒定区)的示例性方案。分离TRAC基因破坏的iPS克隆并且通过基因组DNA测序进行分析以鉴定具有被破坏的TRAC基因的克隆(图9)。发现TRAC基因破坏的iPS克隆表达多能标记，包括OCT3/4、Nanog、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81。
通过锌指核酸酶破坏TCR基因。将锌指核酸酶结合单链供体寡核苷酸(ssODN)(Chen等,2011)使用以破坏iPS细胞中的TCR基因。然后，使用微滴式数字PCR(dropletdigital PCR，ddPCR)(Miyakoa等,2014)筛选突变体(图10)。
CAR的引入。使用睡美人和慢病毒进行CAR的引入(图11)。发现在iPS细胞中SB-介导的CAR转导与慢病毒-介导的CAR转导相当(图12)。利用抗-FC(利用IgG茎检测CAR)诱导的iPS细胞的分化或死亡的阳性选择可用于富集CAR+群体。
由iPS细胞再分化T细胞。图13提供了在无饲养细胞的条件下由iPS细胞分化造血祖细胞(HPC)的示例性方案。
实施例3.报道基因介导的免疫受体的潜在脱靶毒性筛选
由于其根除癌细胞的潜力，使用靶向肿瘤的免疫受体的过继T细胞疗法已经在临床中显露。然而，用于将免疫细胞特异性重定向至肿瘤的主要问题是计划外且不可预测的脱靶毒性，其已经在接受“肿瘤特异性”过继细胞疗法的患者中观察到(Cameron等,2013；Morgan等,2010)。目前基于组织委员会(tissue panel)中基因或蛋白质表达的检测来预测靶抗原的组织分布的方法不足以预测这些毒性。为了克服该问题并且改善潜在脱靶毒性的鉴定，本发明者将使用iPSC和/或iPSC来源的分化细胞筛选免疫受体的特异性。首先，将由健康供体细胞产生iPSC，并且通过人工核酸酶(例如，锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9)消除内源HLA表达以降低目标免疫受体的背景识别。使这些iPSC分化成谱系特异性细胞并且使用源自T急性淋巴性白血病细胞系的报道子细胞系筛选，其具有消除的内源TCR表达和引入的目标免疫受体(图2，左图)。这种报道子细胞系将仅在通过引入的免疫受体识别靶抗原之后表达GFP。因此，如果iPSC来源的分化细胞表达靶抗原，就可以通过GFP表达检测它们。或者，可引入死亡报道基因(图2，中图)或谱系特异性转录因子启动子-驱动的报道基因(图2，右图)到iPSC中。这些细胞可用于通过与免疫受体-表达T细胞共培养来筛选免疫受体介导的识别。
***
根据本公开内容，可以进行和实施本文公开和要求保护的所有方法而不需要过多实验。尽管根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，可对本文所述方法或者方法中的步骤或步骤顺序做出改变而不脱离本发明的理念、精神和范围。更具体地，将明显的是可用某些化学和生理学相关的药剂代替本文所述的试剂，同时实现相同或类似结果。所有这样的对于本领域技术人员来说明显的类似替换或修改被认为在本发明吧的精神、范围和理念中。
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序列表
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<120> 施加诱导多能干细胞产生过继细胞疗法产品
<130> UTFC.P1235WO
<150> US 61/983,722
<151> 2014-04-24
<160> 7
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaac 57
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
agtgctgtgg cctggatgtg caaacgcctt caacaac 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
agtgctgtgg cctgcatgtg caaacgcctt caacaac 37
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac 60
gccttcaaca ac 72
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe
1 5 10 15
Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
20
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac 60
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
1 5 10

Claims (82)

1.一种产生HLA-Aneg HLA纯合诱导多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：
(a)获得来自HLA纯合供体的细胞群体；
(b)工程化所述细胞以使其不表达HLA-A，从而产生HLA-Aneg细胞；以及
(c)对所述HLA-Aneg细胞重编程以产生iPSC，从而产生HLA-AnegiPSC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群体是脐带血细胞群体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体在HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1处是HLA纯合的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中工程化所述细胞以使其不表达HLA-A包括向所述细胞中引入特异性靶向HLA-A基因座的人工核酸酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述人工核酸酶是锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9。
6.根据权利要求4所述的方法，其中向所述细胞中引入人工核酸酶包括向所述细胞中引入编码所述人工核酸酶的mRNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中重编程包括向所述细胞中引入Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其中重编程包括向所述细胞中引入Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc编码mRNA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中重编程包括向所述细胞中引入编码Oct3/4、KLF4、Sox2和c-myc的一个或多个表达盒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一个或多个表达盒包含在一个或多个游离型载体中。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述表达盒包含在病毒载体中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体或仙台病毒。
13.根据权利要求1所述的方法，其还包括向步骤(b)的细胞中引入***基因。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述***基因是诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。
15.根据权利要求13所述的方法，其中引入包括基因转移。
16.根据权利要求13所述的方法，其中引入包括转座子/转座酶***。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述转座子/转座酶***是睡美人转座子/转座酶***。
18.根据权利要求1所述的方法，其还包括破坏所述iPSC中的所述TRAC基因。
19.根据权利要求18所述的方法，其中破坏包括向所述细胞中引入特异性靶向所述TRAC基因座的人工核酸酶。
20.根据权利要求1所述的方法，其还包括利用嵌合抗原受体转导所述iPSC。
21.根据权利要求1所述的方法，其还包括鉴定具有遗传安全港谱的HLA-AnegHLA-纯合iPSC。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述鉴定通过全基因组测序或整合位点分析进行。
23.根据权利要求1所述的方法，其还包括使所述HLA-Aneg HLA-纯合-iPSC分化。
24.根据权利要求23所述的方法，其中分化包括使用抗原呈递细胞(APC)。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述APC包括人工APC(aAPC)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述aAPC是遗传修饰的K562细胞。
27.根据权利要求23所述的方法，其中使所述iPSC分化成免疫细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、iNKT细胞。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫细胞还包含肿瘤特异性或病毒特异性TCRαβ。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫细胞还包含肿瘤特异性嵌合抗原受体。
31.根据权利要求27所述的方法，其中还对所述免疫细胞进行进一步基因编辑以消除免疫抑制分子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述免疫抑制分子是PD-1或CTLA-4。
33.根据权利要求27所述的方法，其中使所述iPSC分化成造血干细胞。
34.根据权利要求27所述的方法，其中使所述iPSC分化成心肌细胞、肺上皮细胞、β胰岛细胞、肾细胞或神经元细胞。
35.一种经分离的哺乳动物细胞，所述细胞包含至少一组纯合HLA等位基因和HLA-Aneg表型。
36.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中所述细胞是脐带血细胞、心肌细胞、肾细胞、肺细胞、表皮细胞、胰细胞、β胰岛细胞、肝细胞、造血细胞、间充质细胞或肾细胞。
37.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞或iPS细胞。
38.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
39.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中所述细胞包含至少两组纯合HLA等位基因。
40.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中细胞包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因，纯合HLA-B和HLA-DRB1等位基因，或者纯合HLA-C和HLA-HLA-DRB1等位基因。
41.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中所述细胞包含至少一个HLA-A基因的全部或部分的缺失。
42.根据权利要求35所述的经分离的细胞，其中细胞包含至少一个HLA-A基因，所述HLA-A基因具有使所述基因无功能的突变。
43.根据权利要求35所述的细胞，其中所述细胞包含转基因。
44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述转基因包含***基因。
45.根据权利要求44所述的细胞，其中所述***基因是诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。
46.根据权利要求35所述的细胞，其中所述细胞缺少功能性TCRα和/或TCRβ基因。
47.根据权利要求35所述的细胞，其中所述细胞还包含肿瘤特异性或病毒特异性TCRαβ。
48.根据权利要求35所述的细胞，其中所述细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。
49.根据权利要求35所述的细胞，其中所述细胞缺少一种或多种免疫抑制分子的表达。
50.根据权利要求49所述的细胞，其中所述免疫抑制分子是PD-1或CTLA-4。
51.一种根据权利要求35所述的细胞的群体。
52.一种体外细胞系组，其包含至少第一和第二诱导多能干细胞系，其中所述第一系和所述第二系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因，其中所述第一细胞系的纯合HLA-B和/或HLA-C等位基因不同于所述第二细胞系的纯合HLA-B和/或HLA-C等位基因，其中所述第一系和第二系两者均为HLA-Aneg。
53.根据权利要求52所述的体外细胞系组，其还包含至少5至10种不同的诱导多能干细胞系，其中每个系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。
54.根据权利要求53所述的体外细胞系组，其还包含至少20种不同的诱导多能干细胞系，其中每个系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。
55.根据权利要求54所述的体外细胞系组，其还包含至少27种不同的诱导多能干细胞系，其中每个系包含纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。
56.根据权利要求54所述的体外细胞系组，其中所述组包含27种不同的诱导诱导多能干细胞系，其中每个系包含根据表1的纯合HLA-B和HLA-C等位基因的独特组合，其中每个系均为HLA-Aneg。
57.根据权利要求52所述的体外细胞系组，其中每个系还包含***基因。
58.根据权利要求57所述的体外细胞系组，其中所述***基因是诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。
59.根据权利要求52所述的体外细胞系组，其中所述细胞系根据根据权利要求1所述的方法产生。
60.一种筛选免疫受体特异性的方法，其包括：
(a)获得根据权利要求52所述的体外iPSC系组；
(b)任选地使所述iPSC分化成谱系特异性细胞；
(c)使所述iPSC或谱系特异性细胞暴露于表达目标免疫受体的T细胞；以及
(d)检测所述iPSC或谱系特异性细胞与表达目标免疫受体的所述T细胞之间的相互作用，从而筛选免疫受体特异性。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述T细胞是仅在识别所述目标免疫受体的靶抗原之后表达GFP的T急性淋巴性白血病细胞系。
62.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(d)包括检测所述T急性淋巴性白血病细胞系中GFP的表达，从而鉴定表达所述靶抗原的iPSC或谱系特异性细胞。
63.根据权利要求60所述的方法，其还包括向步骤(a)的细胞中引入细胞死亡报道构建体。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞死亡报道构建体允许检测胱天蛋白酶-3活化。
65.根据权利要求63所述的方法，其中步骤(d)包括检测细胞死亡报道构建体的活化，从而筛选免疫受体特异性。
66.根据权利要求60所述的方法，其还包括向步骤(a)的细胞中引入谱系特异性转录因子启动子驱动的报道基因。
67.根据权利要求66所述的方法，其中步骤(d)包括检测所述报道基因表达的损失，从而筛选免疫受体特异性。
68.根据权利要求60所述的方法，其中所述目标免疫受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述TCR被克隆或操作。
70.一种治疗有此需要的患者中的疾病的方法，其包括：
(a)从根据权利要求52所述的体外细胞系组中选择与所述患者HLA匹配的细胞系；
(b)使所选细胞系分化成谱系特异性细胞；以及
(c)向所述患者施用治疗有效量的分化细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述方法是提供免疫治疗的方法。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述谱系特异性细胞是造血干细胞或免疫效应细胞。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述疾病是癌症、自身免疫病或传染病。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞和iNKT细胞。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述方法还包括向步骤(a)的细胞中引入嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述疾病是癌症，并且其中所述CAR靶向癌细胞抗原。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述癌细胞抗原是CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K，IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。
78.根据权利要求75所述的方法，其中所述疾病是自身免疫病，并且其中所述CAR靶向自身免疫细胞。
79.根据权利要求75所述的方法，其中所述疾病是由病原体造成的传染病并且其中所述CAR靶向病原体抗原。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述病原体是真菌病原体、病毒病原体或细菌病原体。
81.根据权利要求70所述的方法，其中所述方法是提供再生医学的方法。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述谱系特异性细胞是心肌细胞、神经元、β胰岛细胞、肾细胞或肺细胞。
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