JP2024500858A - 細胞中のｈｌａ－ａを低減するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
例えば、養子細胞移植療法で使用するためのＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することを含む、細胞中のＨＬＡ－Ａタンパク質発現を低減するための組成物及び方法。【選択図】図１Ａ
Description
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年１２月２３日に出願された米国仮出願第６３／１３０，０９５号、２０２１年９月３０日に出願された米国仮出願第６３／２５０，９９６号、２０２１年１０月１２日に出願された米国仮出願第６３／２５４，９７０号、及び２０２１年１２月１０日に出願された米国仮出願第６３／２８８，４９２号の利益を主張し、これらの開示は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２１年１２月２０日に作成された「２０２１－１２－２０＿０１１５５－００３６－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するファイルとして提供され、サイズは３２０，５１１バイトである。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｉ．緒言及び概要
ＭＨＣクラスＩを下方制御する能力は、例えば、移植のために、及び／または例えば、Ｔ細胞を活性化しない細胞集団をインビトロで作成するために（ドナーに由来する）同種異系細胞を使用する場合、多くのインビボ及びエクスビボ有用性にとって重要である。特に、対象への同種異系細胞の移植は、細胞療法の分野にとって大きな関心事である。移植された細胞を異物として認識し、攻撃を仕掛けるレシピエント対象の免疫細胞による拒絶反応の問題により、同種異系細胞の使用は制限されている。免疫拒絶の問題を回避するために、細胞ベースの療法は、療法のための細胞源として対象自身の細胞を使用する自家アプローチに焦点を当てており、このアプローチは時間がかかり、費用がかかる。
ＭＨＣクラスＩを下方制御する能力は、例えば、移植のために、及び／または例えば、Ｔ細胞を活性化しない細胞集団をインビトロで作成するために（ドナーに由来する）同種異系細胞を使用する場合、多くのインビボ及びエクスビボ有用性にとって重要である。特に、対象への同種異系細胞の移植は、細胞療法の分野にとって大きな関心事である。移植された細胞を異物として認識し、攻撃を仕掛けるレシピエント対象の免疫細胞による拒絶反応の問題により、同種異系細胞の使用は制限されている。免疫拒絶の問題を回避するために、細胞ベースの療法は、療法のための細胞源として対象自身の細胞を使用する自家アプローチに焦点を当てており、このアプローチは時間がかかり、費用がかかる。
典型的には、同種異系細胞の免疫拒絶は、ドナーとレシピエントとの間の主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子のミスマッチングから生じる。ヒト集団内では、ＭＨＣ分子は、例えば、異なる形態のＭＨＣタンパク質をコードする任意の所与のＭＨＣ遺伝子の多数の遺伝子バリアント、すなわち対立遺伝子を含む、様々な形態で存在する。ＭＨＣ分子の一次クラスは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩと称される。ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）は、全ての核化細胞上で発現され、抗原を提示して、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬ）を活性化する。ＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）は、特定の細胞型（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマクロファージ）上でのみ発現され、抗原を提示して、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ細胞）を活性化し、これにより、次に、Ｂ細胞にシグナルを提供して抗体を産生する。
個体間のＭＨＣ対立遺伝子におけるわずかな違い、例えばミスマッチは、レシピエント内のＴ細胞を活性化させることができる。Ｔ細胞発達の間、個体のＴ細胞レパートリーは、自身のＭＨＣ分子に対して許容されるが、別の個体のＭＨＣ分子を認識するＴ細胞は、循環中に持続することがあり、アロ反応性Ｔ細胞と称される。アロ反応性Ｔ細胞は、例えば、体内でＭＨＣ分子を発現する別の個体の細胞の存在によって活性化され得、例えば、移植片対宿主病及び移植拒絶反応を引き起こす。
ドナーとレシピエントとの間でＨＬＡタイプを完全にマッチさせることは、移植拒絶反応を低減する手段として理論的には可能であるが、そのようなアプローチにより、例えば、１０個の対立遺伝子のうちの１０個（すなわち、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１の各々に対して２個の対立遺伝子）に完全にマッチさせることは、集団全体にわたるＨＬＡ対立遺伝子の多様性を考慮すると、論理的にも実践的にも困難である。
例えば、レシピエントＴ細胞応答を回避するために、細胞のＭＨＣタンパク質の発現を低減することを含む、同種異系細胞の拒絶反応に対する感受性を低減するための方法及び組成物は、関心対象である。実際には、対象への移植のために同種異系細胞を遺伝子修飾する能力は、同時に他の有害なレシピエント免疫応答を回避しながら、全てのＭＨＣタンパク質発現を低減するための複数の遺伝子編集の要件によって妨げられてきた。例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質を枯渇させる戦略は、ＣＴＬの活性化を低減し得るが、それらの表面にＭＨＣクラスＩを欠く細胞は、ＮＫ細胞活性化がＭＨＣクラスＩ特異的阻害受容体によって調節されるため、免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による溶解に感受性である。したがって、ＭＨＣクラスＩの発現を安全に低減または排除することは困難であることが証明されている。
ＭＨＣクラスＩＩ分子を枯渇させるための遺伝子編集戦略はまた、低い編集効率及び低い細胞生存率を含む理由のために、特に特定の細胞型において困難であることが証明されており、細胞療法としての実用化が妨げられている。
したがって、レシピエント免疫拒絶反応の問題、及び移植のためのより安全な細胞を産生するために必要な複数の遺伝子修飾に関連する技術的困難を克服するために、同種異系細胞を修飾するための改善された方法及び組成物の必要性が存在する。
本開示は、非修飾細胞と比較して、ＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除された操作されたヒト細胞を提供し、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。したがって、本明細書に開示される操作されたヒト細胞は、同種異系細胞移植及びＭＨＣクラスＩ適合性の問題に対する「部分的マッチング」アプローチを提供する。ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である細胞の使用は、細胞内でのＨＬＡ－Ａの発現を低減または排除することに加えて、開示された部分的マッチングアプローチは、（２つではなく）１つのマッチングＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子のみ及び（２つではなく）１つのＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子のみを必要とするため、集団のレシピエントの大多数をカバーする療法を提供するために必要なドナーの数を制限する。驚くべきことに、本明細書に開示される、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除した操作されたヒト細胞は、持続性を示し、ＮＫ媒介性拒絶に対して、特にＢ２Ｍ発現が低減または排除された操作された細胞と比較して、保護的である。本開示は、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除された、そのような操作されたヒト細胞を生成するための方法及び組成物を提供し、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたヒト細胞、ならびに操作されたヒト細胞を生成するための方法及び組成物を提供し、細胞は、細胞の表面上でＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現がさらに低減され、例えば、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子において遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、内因性Ｔ細胞受容体タンパク質（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ）の発現を低減または排除すること、及び外因性核酸を導入すること、例えば、細胞表面上に発現されたポリペプチドまたは細胞によって分泌されるポリペプチドをコードすることを含む、細胞のさらなる操作を提供する。したがって、本開示は、様々な所望の養子細胞療法の目的のためにヒト細胞を遺伝子操作するための柔軟なプラットフォームを提供する。
本明細書で提供されるのは、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であり、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。また、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
本明細書で提供されるのは、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であり、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
本明細書で提供されるのは、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であり、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
本明細書で提供されるのは、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除し、操作されたヒト細胞を作製する方法であって、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、細胞を、（ａ）（ｉ）配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは（ｉｖ）表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは（ｖ）表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは（ｖｉ）（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、方法である。
本明細書で提供されるのは、非修飾細胞と比較してヒト細胞におけるＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減する方法であって、細胞を、（ａ）（ｉ）配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは（ｉｖ）表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは（ｖ）表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは（ｖｉ）（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、方法である。
本明細書で提供されるのは、操作された細胞を、それを必要とするレシピエント対象に投与する方法であって、（ａ）レシピエント対象のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を決定することと、（ｂ）先行実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞もしくは細胞集団、または先行実施形態のうちのいずれか１つの方法によって産生される操作された細胞もしくは細胞集団を選択することであって、操作された細胞が、レシピエント対象と同じＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、選択することと、（ｃ）選択された操作された細胞をレシピエント対象に投与することと、を含む、方法である。
さらなる実施形態が、特許請求の範囲及び図面全体を通して提供され、記載される。
本開示は、操作されたヒト細胞、ならびにヒト細胞を遺伝子修飾して、例えば、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法に有用である、操作されたヒト細胞を作製するための方法及び組成物を提供する。本開示は、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除された、操作されたヒト細胞を提供し、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。したがって、本明細書に開示される操作されたヒト細胞は、同種異系細胞移植に関連するハードルに対する「部分的マッチング」溶液を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾の結果として、ＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除された、操作されたヒト細胞を提供し、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、本開示は、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するための組成物及び方法、ならびに免疫拒絶反応に対する細胞の感受性を低減するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現が低減または排除された、操作されたヒト細胞は、ＭＨＣクラスＩタンパク質発現を低減または排除する他のアプローチで観察される問題である、ＮＫ細胞による溶解に対して感受性ではない。いくつかの実施形態では、方法及び組成物は、遺伝子編集系を用いてＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって、ＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除することと、遺伝子修飾によって標的化受容体をコードする外因性核酸、または他のポリペプチド（細胞表面上に発現された、または分泌された）を細胞に挿入することと、を含む。本明細書に開示される方法によって産生された操作された細胞組成物は、例えば、ＨＬＡ－Ａの発現の低減、インビトロ及びインビボでの免疫原性の低減、生存期間の増加、ならびに移植のためのより大きな対象との遺伝的適合性の増加を含む、望ましい特性を有する。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定もしくは決定されるか、または記載された主題の特性に実質的に影響を与えない変動の程度、または当該技術分野において受け入れられる許容範囲（例えば、１０％、５％、２％、もしくは１％以内）に部分的に依存する。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、及び均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
Ａ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
本明細書で使用される「またはそれらの組み合わせ」という用語は、この用語の前に列挙される用語の全ての置換及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢでもある。この例に続いて、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＣＢＢＡ、ＣＡＢＡなどの１つ以上の項目または用語の繰り返しを含有する組み合わせが明示的に含まれる。当業者は、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせの項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、１つ以上のポリヌクレオチドまたは組成物、及び１つ以上の関連材料、例えば、送達デバイス（例えば、シリンジ）、溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤などの関連構成要素のパッケージ化されたセットを指す。
「同種異系」細胞は、本明細書で使用される場合、レシピエント対象と同じ種のドナー対象に由来する細胞を指し、ドナー対象及びレシピエント対象は、遺伝的相違性、例えば、同一ではない１つ以上の遺伝子座にある遺伝子を有する。したがって、例えば、細胞は、細胞を投与される対象に対して同種異系である。本明細書で使用される場合、元のドナーに再導入されないドナーから除去または単離される細胞は、同種異系細胞とみなされる。
「自家」細胞は、本明細書で使用される場合、材料が後で再導入される同じ対象に由来する細胞を指す。したがって、例えば、細胞が対象から除去され、次いで同じ対象に再導入される場合、細胞は自家であるとみなされる。
「β２Ｍ」または「Ｂ２Ｍ」は、本明細書で使用される場合、「β－２ミクログロブリン」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿００００１５（範囲４４７１１４９２．．４４７１８８７７）、参照ＧＲＣｈ３８．ｐ１３を有する。Ｂ２Ｍタンパク質は、核化細胞の表面上のヘテロ二量体としてＭＨＣクラスＩ分子と関連しており、ＭＨＣクラスＩタンパク質発現に必要である。
「ＣＩＩＴＡ」または「ＣＩＩＴＡ」または「Ｃ２ＴＡ」は、本明細書で使用される場合、「クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿００００１６．１０（範囲１０８６６２０８．．１０９４１５６２）、参照ＧＲＣｈ３８．ｐ１３を有する。核内のＣＩＩＴＡタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子転写の陽性調節因子として作用し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現に必要である。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ」または「ＭＨＣ分子（複数可）」または「ＭＨＣタンパク質」または「ＭＨＣ複合体（複数可）」は、主要な組織適合性複合体分子（または複数）を指し、例えば、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。ヒトでは、ＭＨＣ分子は、「ヒト白血球抗原」複合体または「ＨＬＡ分子」または「ＨＬＡタンパク質」と称される。「ＭＨＣ」及び「ＨＬＡ」という用語の使用は、限定することを意味するものではなく、本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ」という用語は、ヒトＭＨＣ分子、すなわち、ＨＬＡ分子を指すために使用され得る。したがって、「ＭＨＣ」及び「ＨＬＡ」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、ＨＬＡ－Ａタンパク質の文脈で本明細書で使用される場合、重鎖（ＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされる）及び軽鎖（すなわち、ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である、ＭＨＣクラスＩタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ－Ａ」または「ＨＬＡ－Ａ遺伝子」という用語は、核酸の文脈で本明細書で使用される場合、ＨＬＡ－Ａタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、「ＨＬＡクラスＩ組織適合性、Ａアルファ鎖」とも称され、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（２９９４２５３２．．２９９４５８７０）を有する。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、集団全体にわたって何千もの異なる遺伝子型バージョンのＨＬＡ－Ａ遺伝子を有することが知られている（また個体は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を受け取ることができる）。配列情報を含むＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の公開データベースは、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／でアクセスすることができる。ＨＬＡ－Ａの全ての対立遺伝子は、「ＨＬＡ－Ａ」及び「ＨＬＡ－Ａ遺伝子」という用語によって包含される。
「ＨＬＡ－Ｂ」は、核酸の文脈で本明細書で使用される場合、ＨＬＡ－Ｂタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ｂは、「ＨＬＡクラスＩ組織適合性、Ｂアルファ鎖」とも称され、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（３１３５３８７５．．３１３５７１７９）を有する。
「ＨＬＡ－Ｃ」は、核酸の文脈で本明細書で使用される場合、ＨＬＡ－Ｃタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ｃは、「ＨＬＡクラスＩ組織適合性、Ｃアルファ鎖」とも称され、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（３１２６８７４９．．３１２７２０９２）を有する。
本明細書で使用される場合、「ゲノム座標内」という用語は、与えられたゲノム座標範囲の境界を含む。例えば、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３が与えられた場合、座標ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３が包含される。本出願を通して、参照されるゲノム座標は、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能なゲノム参照コンソーシアムからのヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８とも称される）アセンブリにおけるゲノム注釈に基づいている。１つのアセンブリと別のアセンブリとの間でゲノム座標を変換するためのツール及び方法は、当該技術分野において既知であり、同じ機関によって、または同じアルゴリズムを使用して生成された以前のアセンブリへの変換（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７への）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって生成されたアセンブリの変換（例えば、ＧＲＣｈ３８から国際ヒトゲノムシークエンシングコンソーシアムによって生成されたＮＣＢＩ３３への）を含む、本明細書に提供されるゲノム座標をヒトゲノムの別のアセンブリの対応する座標に変換するために使用され得る。当該技術分野において既知の利用可能な方法及びツールとしては、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能なＮＣＢＩゲノム再マッピングサービス、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒのウェブサイトで入手可能なＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ、及びＥｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで入手可能なＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ホモ接合性」という用語は、特定の遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有することを指す。
本明細書で使用される場合、ＨＬＡ「対立遺伝子」は、名前付きＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子を指すことができ、「ＨＬＡ－Ａ」、「ＨＬＡ－Ｂ」、または「ＨＬＡ－Ｃ」に続く名前の最初の４桁（またはコロンで区切られた最初の２桁のセット、例えば、
（最初の２組の桁が太字及び斜体で示される）が指定されている。当該技術分野において既知のように、最初の４桁（またはコロンで区切られた最初の２組の桁）は、対立遺伝子のタンパク質を特定する。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ａ＊０１：０２は、異なるＨＬＡ－Ａ対立遺伝子である。各対立遺伝子のさらなる遺伝子型、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０２：０１が存在する。所与の対立遺伝子のさらなる遺伝子型は、同一の対立遺伝子であると考えられ、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０２：０１及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は、同一の対立遺伝子である。したがって、ＨＬＡ対立遺伝子は、対立遺伝子が同一であるとき（すなわち、対立遺伝子が同じ最初の４桁またはコロンで区切られた同じ最初の２組の桁を有するとき）、ホモ接合性である。
「マッチング」または「マッチした」は、ドナーとレシピエントとの間で共有される対立遺伝子、例えば、同一の対立遺伝子を指す。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそれらの類似体であるポリマーを含む）を含む多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはＮ１－メチルシュードウリジン等の修飾ウリジン）、イノシン、プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－もしくはアザ－プリン、デアザ－もしくはアザ－ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．編集、第１１版、１９９２を参照）。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基及び連結のみを含んでいてもよく、または従来の構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ連結を有する従来の塩基、または従来の塩基及び１つ以上の塩基類似体の両方を含有するポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体である「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはその類似体及びＤＮＡ内のチミンもしくはその類似体の存在によって異なり得る。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、例えば、標的ＤＮＡに対してＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を指向させるガイドを指すために、本明細書で互換的に使用され、単一のガイドＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）であり得る。例示的なｇＲＮＡとしては、修飾または非修飾形態のクラスＩＩ ＣａｓヌクレアーゼガイドＲＮＡが挙げられる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または２つの別々のＲＮＡ鎖（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは多様性を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９））及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用できる。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、例えば、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列と標的領域とは、少なくとも１個のミスマッチを含有していてもよい。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１～４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるので、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、ガイド配列は、標的配列の逆相補体に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列においてＴがＵで置換されることを除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びその不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれる。本明細書で使用される「Ｃａｓタンパク質」とも称される「Ｃａｓヌクレアーゼ」には、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が包含される。Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤には、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはそのＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼには、さらにＲＮＡガイドＤＮＡクリベースまたはニッカーゼ活性を有するクラス２ Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されている、クラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が含まれる。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照のこと。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。
本明細書で使用されるとき、「エディター」という用語は、ＤＮＡ配列内で修飾を行うことができるポリペプチドを含む薬剤を指す。いくつかの実施形態では、エディターは、Ｃａｓ９クリベースなどのクリベースである。いくつかの実施形態では、エディターは、ＤＮＡ分子内の塩基を脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態では、エディターは、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）を脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態では、エディターは、シチジンデアミナーゼに融合されたＲＮＡガイドニッカーゼを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エディターは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）に融合したＲＮＡガイドニッカーゼを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エディターは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）に融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、エディターは、シチジンデアミナーゼ及びＵＧＩに融合されたＲＮＡガイドニッカーゼを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エディターは、ＵＧＩを欠く。
本明細書で使用される場合、「シチジンデアミナーゼ」は、シチジンデアミナーゼ活性を可能にするポリペプチドまたはポリペプチドの複合体を意味し、これは、シチジンまたはデオキシシチジンの加水分解脱アミノ化を触媒し、典型的には、ウリジンまたはデオキシウリジンをもたらす。シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼスーパーファミリー内の酵素、特に、ＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素（酵素のＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ４、及びＡＰＯＢＥＣ３下位群）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤまたはＡＩＣＤＡ）、ならびにＣＭＰデアミナーゼを包含する（例えば、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２２：３６７－７７，２００５、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．９：２２９，２００８、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８４７０－６，１９９９）、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ ９：１６９０（２０２０）を参照）。
本明細書で使用される場合、「ＡＰＯＢＥＣ３」という用語は、ヒトＡＰＯＢＥＣ３遺伝子座の７つの遺伝子（Ａ３Ａ～Ａ３Ｈ）のうちのいずれかによって発現されたＡＰＯＢＥＣ３タンパク質などのＡＰＯＢＥＣ３タンパク質を指す。ＡＰＯＢＥＣ３は、触媒ＤＮＡまたはＲＮＡ編集活性を有し得る。ＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、記載されており（ＵｎｉＰＲＯＴ受託ＩＤ：ｐ３１９４１）、配列番号４０として本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質は、ヒトＡＰＯＢＥＣ３タンパク質及び／または野生型タンパク質である。バリアントとしては、１つまたは複数の変異（すなわち、置換、欠失、挿入）によって野生型ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質とは異なる配列、例えば、１つまたは複数の一点置換を有するタンパク質が挙げられる。例えば、短縮されたＡＰＯＢＥＣ３配列を、例えば、いくつかのＮ末端またはＣ末端アミノ酸、好ましくは配列のＣ末端で１～４個のアミノ酸を欠失させることによって使用することができる。本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、ＡＰＯＢＥＣ３参照配列に対して相同である対立遺伝子バリアント、スプライシングバリアント、及び天然または人工変異体を指す。バリアントは、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集の触媒活性を示すという点で「機能的」である。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３（例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ）は、野生型アミノ酸位置５７（野生型配列で番号付けされる）を有する。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３（例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ）は、アミノ酸位置５７（野生型配列で番号付けされる）にアスパラギンを有する。
本明細書で使用される場合、「ニッカーゼ」は、二本鎖ＤＮＡ内で一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を作成する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖は切断しない。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡニッカーゼ」は、ＤＮＡニッカーゼ活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体を意味し、ＤＮＡニッカーゼ活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡニッカーゼには、Ｃａｓニッカーゼが含まれる。Ｃａｓニッカーゼには、ニッカーゼ形態のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはそのＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。クラス２ Ｃａｓニッカーゼには、ＲＮＡガイドＤＮＡニッカーゼ活性を有する、２つの触媒ドメインのうちの１つのみが不活性化されているバリアントが含まれる。クラス２ Ｃａｓニッカーゼには、例えば、Ｃａｓ９（例えば、ＳｐｙＣａｓ９のＨ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様タンパク質ドメインを含有する。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照のこと。「Ｃａｓ９」は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９、本明細書に列挙されるＣａｓ９のバリアント、及びそれらの等価物を包含する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含む、ハイブリッドポリペプチドを指す。１つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置してもよく、したがって、それぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成する。本明細書で提供されるタンパク質のうちのいずれかは、当該技術分野において既知の任意の方法によって産生され得る。例えば、本明細書で提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適した組換えタンパク質発現及び精製を介して産生され得る。組換えタンパク質発現及び精製の方法は周知であり、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されるものを含む。
「リンカー」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの隣接する分子または部分を連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置付けられるか、またはそれらに隣接し、共有結合を介して各々に接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸、または１６アミノ酸残基「ＸＴＥＮ」リンカーなどの複数のアミノ酸（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）、またはそのバリアントである（例えば、実施例、及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｍａｎｎｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１１８６－１１９０（２００９）を参照）。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮリンカーは、配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９００）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号９０１）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９０２）を含む。
本明細書で使用される場合、「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「ＵＧＩ」という用語は、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）塩基切除修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を特定する一連のコドンからなる配列を指す。ＯＲＦは、開始コドン（例えば、ＤＮＡ中のＡＴＧまたはＲＮＡ中のＡＵＧ）で始まり、終止コドン、例えば、ＤＮＡ中のＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡ、またはＲＮＡ中のＵＡＡ、ＵＡＧもしくはＵＧＡで終わる。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をともに含むガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９等のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へとガイドし、ガイドＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、薬剤は標的配列に結合し、その場合、この薬剤はクリベースまたはニッカーゼであり、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。
本明細書で使用される場合、第２の配列に対する第１の配列のアラインメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列「に対して少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧに対して１００％の同一性を有する配列を含むが、その理由は、アラインメントが、第２の配列の３つの全ての位置において一致があるという点で１００％の同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、及び修飾ウリジン等のヌクレオシド類似体の存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジン等）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン；別の例は、シトシン及び５－メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、配列５’－ＡＸＧ（Ｘが任意の修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである）は、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知である、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アラインメントされる配列の所与の対について、適切なアルゴリズム及びパラメータ設定の選択を理解するであろう。一般的に類似する長さ及び予想される同一性がアミノ酸について５０％超の配列、またはヌクレオチドについて７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
「ｍＲＮＡ」は、ポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用され、ポリペプチドへと翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能し得る）オープンリーディングフレームを含む。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体を含むリン酸糖骨格（例えば、２’－メトキシリボース残基）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の、例えば二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかである多数のヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
本明細書で使用される場合、細胞上のタンパク質の「低減または排除された」発現は、非修飾細胞に対するタンパク質の発現の部分的または完全な喪失を指す。いくつかの実施形態では、細胞上のタンパク質の表面発現は、フローサイトメトリーによって測定され、タンパク質に対する同じ抗体で染色したときの蛍光シグナルの低減によって証明されるように、非修飾細胞と比較して「低減または排除された」表面発現を有する。非修飾細胞と比較してフローサイトメトリーによってタンパク質の表面発現を「低減または排除」した細胞は、アイソタイプ対照抗体で染色された細胞と同様の蛍光シグナルによって証明されるように、そのタンパク質の発現について「陰性」と称され得る。タンパク質発現の「低減または排除」は、当業者に既知の適切な制御を用いて、当該分野における他の既知の技法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」は、例えば、非編集の標的配列の発現と比較して、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはその両方）の発現の減少を指す。タンパク質のノックダウンは、目的の組織、流体、または細胞集団等の試料からタンパク質の総細胞量を検出することによって測定することができる。これは、タンパク質の代替物、マーカー、または活性を測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定するための方法は既知であり、目的の試料から単離されたｍＲＮＡを分析することを含む。いくつかの実施形態では、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現のいくつかの喪失、例えば、転写されるｍＲＮＡの量の減少、または細胞もしくは細胞集団（組織中に見出されるものなどのインビボ集団を含む）によって発現されたタンパク質の量の減少を指し得る。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、細胞における特定の遺伝子からの発現の喪失、または特定のタンパク質の喪失を指す。ノックアウトは、アッセイの検出レベル未満の発現の減少をもたらし得る。ノックアウトは、細胞、組織、または細胞集団のいずれかにおけるタンパク質の総細胞量を検出することによって測定することができる。
本明細書で使用される場合、「標的配列」または「ゲノム標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子内の核酸の配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニックを形成するかまたは切断するように指向される。
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患または障害のための治療の任意の投与または適用を指し、その疾患を阻害すること、その進行を止めること、その疾患の１つ以上の症状を緩和すること、その疾患を治癒させること、または症状の再発を含む、その疾患の１つ以上の症状を予防することを含む。
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照する。本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本発明は例示される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲及び含まれる実施形態によって定義される、本発明内に含まれ得る全ての代替物、改変物、及び均等物を網羅することが意図される。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「コンジュゲート（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数のコンジュゲートを含み、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含む。
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値及び測定可能な値は、有意な桁及び測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。
本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「及び／または」に等しい意味で使用される。
本明細書で使用される章の見出しは、構成的な目的のみのためであり、決して所望の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の材料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書を優先する。本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、改変物、及び均等物を包含する。
Ｂ．遺伝子修飾細胞
１．操作されたヒト細胞組成物
本開示は、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞組成物を提供し、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、低減したＨＬＡ－Ａ発現を有する操作されたヒト細胞は、養子細胞移植療法に有用である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、細胞のゲノムにおける追加の遺伝子修飾（例えば、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の低減もしくは排除、及び／または内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質の低減もしくは排除、及び／または発現のための外因性核酸の導入）を含み、同種異系移植の目的のために望ましい細胞を産生する。
１．操作されたヒト細胞組成物
本開示は、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞組成物を提供し、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、低減したＨＬＡ－Ａ発現を有する操作されたヒト細胞は、養子細胞移植療法に有用である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、細胞のゲノムにおける追加の遺伝子修飾（例えば、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の低減もしくは排除、及び／または内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質の低減もしくは排除、及び／または発現のための外因性核酸の導入）を含み、同種異系移植の目的のために望ましい細胞を産生する。
いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、同種異系細胞療法である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、操作されたヒト細胞と同じＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子を有するレシピエントに移される。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、操作されたヒト細胞と同じＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有するレシピエントに移される。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、操作されたヒト細胞と同じＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有するレシピエントに移される。したがって、本明細書に開示される操作されたヒト細胞は、レシピエントに部分的なＨＬＡマッチを提供し、それによって有害な免疫応答のリスクを低減する。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、ゲノム座標の所与の各範囲について、範囲は、指定された座標のいずれかの末端上の＋／－１０個のヌクレオチドを包含してもよい。例えば、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３が与えられる場合、いくつかの実施形態では、ゲノム標的配列または遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８４４－ｃｈｒ６：２９９４２９２３内に収まることができる。いくつかの実施形態では、ゲノム座標の所与の各範囲について、範囲は、その範囲のいずれかの末端上の＋／－５個のヌクレオチドを包含してもよい。
いくつかの実施形態では、ゲノム座標の所与の範囲は、ＤＮＡの両方の鎖（すなわち、プラス（＋）鎖及びマイナス（－）鎖）上に標的配列を含み得る。
ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾が、本明細書でさらに記載される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ａ遺伝子における遺伝子修飾は、標的配列における少なくとも１個のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、または脱アミノ化のうちのいずれか１つ以上を含む。
本明細書に記載の操作されたヒト細胞は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の任意のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子における遺伝子修飾を含み得る。ＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ超遺伝子座と称されるゲノム領域内の第６染色体に位置し、数百個のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子が、当該技術分野で報告されている（例えば、Ｓｈｉｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４：１５－３９（２００９）を参照）。ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の配列は、当該技術分野において入手可能である（例えば、特定のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の配列を検索するためのＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｌｅｌｅ．ｈｔｍｌを参照）。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ１１、及びＨＬＡ－Ａ２４から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の発現を低減または排除した。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ１の発現を低減または排除した。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ２の発現を低減または排除した。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ３の発現を低減または排除した。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ１１の発現を低減または排除した。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ２４の発現を低減または排除した。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内のインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含み、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含み、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含み、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも６、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも６個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも７個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも９個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含み、遺伝子修飾は、ゲノム座標内に少なくとも１つのＣ－Ｔ置換または少なくとも１つのＡ－Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、及びｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４５２９０－２９９４５３１０、ｃｈｒ６：２９９４５２９６－２９９４５３１６、ｃｈｒ６：２９９４５２９７－２９９４５３１７、及びｃｈｒ６：２９９４５３００－２９９４５３２０から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。対立遺伝子多型のために、いくつかの実施形態では、標的配列は、ｈｇ３８のゲノム配列からの１、２、または３個のミスマッチを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９８９０１１７－２９８９０１３７、ｃｈｒ６：２９９２７０５８－２９９２７０７８、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４２５４１－２９９４２５６１、ｃｈｒ６：２９９４２５４２－２９９４２５６２、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５５０－２９９４２５７０、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３０６２－２９９４３０８２、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０９２－２９９４３１１２、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１１８－２９９４３１３８、ｃｈｒ６：２９９４３１１９－２９９４３１３９、ｃｈｒ６：２９９４３１２０－２９９４３１４０、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３１２８－２９９４３１４８、ｃｈｒ６：２９９４３１２９－２９９４３１４９、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１３６－２９９４３１５６、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３１４２－２９９４３１６２、ｃｈｒ６：２９９４３１４３－２９９４３１６３、ｃｈｒ６：２９９４３１８８－２９９４３２０８、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３６－２９９４３５５６、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５５８、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５７６、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９９－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２０、ｃｈｒ６：２９９４３６０１－２９９４３６２１、ｃｈｒ６：２９９４３６０２－２９９４３６２２、ｃｈｒ６：２９９４３６０３－２９９４３６２３、ｃｈｒ６：２９９４３７７４－２９９４３７９４、ｃｈｒ６：２９９４３７７９－２９９４３７９９、ｃｈｒ６：２９９４３７８０－２９９４３８００、ｃｈｒ６：２９９４３８２２－２９９４３８４２、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５７－２９９４３８７７、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４３８５９－２９９４３８７９、ｃｈｒ６：２９９４３８６０－２９９４３８８０、ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９４４０７７－２９９４４０９７、ｃｈｒ６：２９９４４０７８－２９９４４０９８、ｃｈｒ６：２９９４４４５８－２９９４４４７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、ｃｈｒ６：２９９４４５９７－２９９４４６１７、ｃｈｒ６：２９９４４６４２－２９９４４６６２、ｃｈｒ６：２９９４４６４３－２９９４４６６３、ｃｈｒ６：２９９４４７７２－２９９４４７９２、ｃｈｒ６：２９９４４７８２－２９９４４８０２、ｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、ｃｈｒ６：２９９４４９０７－２９９４４９２７、ｃｈｒ６：２９９４５０２４－２９９４５０４４、ｃｈｒ６：２９９４５０９７－２９９４５１１７、ｃｈｒ６：２９９４５１０４－２９９４５１２４、ｃｈｒ６：２９９４５１０５－２９９４５１２５、ｃｈｒ６：２９９４５１１６－２９９４５１３６、ｃｈｒ６：２９９４５１１８－２９９４５１３８、ｃｈｒ６：２９９４５１１９－２９９４５１３９、ｃｈｒ６：２９９４５１２４－２９９４５１４４、ｃｈｒ６：２９９４５１７６－２９９４５１９６、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１８０－２９９４５２００、ｃｈｒ６：２９９４５１８７－２９９４５２０７、ｃｈｒ６：２９９４５１８８－２９９４５２０８、ｃｈｒ６：２９９４５２２８－２９９４５２４８、ｃｈｒ６：２９９４５２３０－２９９４５２５０、ｃｈｒ６：２９９４５２３１－２９９４５２５１、ｃｈｒ６：２９９４５２３２－２９９４５２５２、ｃｈｒ６：２９９４５３０８－２９９４５３２８、ｃｈｒ６：２９９４５３６１－２９９４５３８１、ｃｈｒ６：２９９４５３６２－２９９４５３８２、及びｃｈｒ６：３１３８２５４３－３１３８２５６３から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼを含む塩基エディターを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、ｃｈｒ６：２９９４２８１６－２９９４２８３６、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８２８－２９９４２８４８、ｃｈｒ６：２９９４２８３７－２９９４２８５７、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４２９０５－２９９４２９２５、ｃｈｒ６：２９９４２９１２－２９９４２９３２、ｃｈｒ６：２９９４２９１３－２９９４２９３３、ｃｈｒ６：２９９４３４９０－２９９４３５１０、ｃｈｒ６：２９９４３４９７－２９９４３５１７、ｃｈｒ６：２９９４３４９８－２９９４３５１８、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、及びｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現は、ｃｈｒ６：２９９４２８８４－２９９４２９０４、ｃｈｒ６：２９９４３５１９－２９９４３５３９、ｃｈｒ６：２９９４２８６３－２９９４２８８３から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現は、ｃｈｒ６：２９９４３５１７－２９９４３５３７、及びｃｈｒ６：２９９４３５２３－２９９４３５４３から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ＣａｓＸなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８４５－２９９４２８６９、ｃｈｒ６：２９９４２８５２－２９９４２８７６、ｃｈｒ６：２９９４２８６５－２９９４２８８９、ｃｈｒ６：２９９４２８９１－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９０３－２９９４２９２７、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２８、ｃｈｒ６：２９９４３５１８－２９９４３５４２、ｃｈｒ６：２９９４３５２５－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３５－２９９４３５５９、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５６２、ｃｈｒ６：２９９４３５３９－２９９４３５６３、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４８－２９９４３５７２、ｃｈｒ６：２９９４３５５５－２９９４３５７９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５８０、ｃｈｒ６：２９９４３５５７－２９９４３５８１、ｃｈｒ６：２９９４３５５８－２９９４３５８２、ｃｈｒ６：２９９４３５５９－２９９４３５８３、ｃｈｒ６：２９９４３５６３－２９９４３５８７、ｃｈｒ６：２９９４３５６４－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６５－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５９２、ｃｈｒ６：２９９４３５７１－２９９４３５９５、ｃｈｒ６：２９９４３５７２－２９９４３５９６、ｃｈｒ６：２９９４３５９５－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３５９６－２９９４３６２０、及びｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２４から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、Ｎｍｅ２ Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えばデアミナーゼ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼを含む塩基エディターを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２４６９－２９９４２４８９、ｃｈｒ６：２９９４３０５８－２９９４３０７８、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０８０－２９９４３１００、ｃｈｒ６：２９９４３１８７－２９９４３２０７、ｃｈｒ６：２９９４３１９２－２９９４３２１２、ｃｈｒ６：２９９４３１９７－２９９４３２１７、ｃｈｒ６：２９９４３８１２－２９９４３８３２、ｃｈｒ６：２９９４４３４９－２９９４４３６９、ｃｈｒ６：２９９４４９９６－２９９４５０１６、ｃｈｒ６：２９９４５０１８－２９９４５０３８、ｃｈｒ６：２９９４５３４１－２９９４５３６１、及びｃｈｒ６：２９９４５５２６－２９９４５５４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標：ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現は、ゲノム座標：ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列は、ゲノム座標内に少なくとも１７、１９、１８、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、クラス２系などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む。
例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を以下の表１Ａに示す。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１、Ｃ－Ｔ塩基エディター、Ａ－Ｇ塩基エディター、Ｃａｓ１２ａ、Ｍａｄ７ヌクレアーゼ、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ、及びＣａｓＸのうちの１つから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１、Ｃ－Ｔ塩基エディター、Ａ－Ｇ塩基エディター、Ｃａｓ１２ａ、及びＣａｓＸのうちの１つから選択されるポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｃ－Ｔ塩基エディターである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ａ－Ｇ塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼ及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドニッカーゼは、ＳｐｙＣａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドニッカーゼは、ＮｍｅＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、Ｃａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、ＣａｓＸである。
上記実施形態のうちのいずれかでは、遺伝子編集系は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、Ｃ－Ｔデアミナーゼ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、Ａ－Ｇデアミナーゼ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＲＮＡガイドニッカーゼを含む。
いくつかの実施形態では、操作された細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である場合、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、操作された細胞がＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である場合、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択され、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２である。
本明細書に開示されるＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子の組み合わせは、累積的に、集団の約８８％をカバーする。ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子対の累積頻度を以下の表１Ｂに示す。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、操作されたヒト細胞は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現をさらに低減または排除した。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または排除する遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＲＦＸ遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、ＣＲＥＢ遺伝子における遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞は、核因子（ＮＦ）－ガンマ遺伝子における遺伝子修飾を有する。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、操作されたヒト細胞は、ＴＲＡＣタンパク質の表面発現をさらに低減または排除した。いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、操作されたヒト細胞は、ＴＲＢＣタンパク質の表面発現をさらに低減または排除した。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、操作された細胞は、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または排除する遺伝子における遺伝子修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、操作された細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子における遺伝子修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、操作された細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子における遺伝子修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、操作された細胞は、ＴＲＢＣ遺伝子における遺伝子修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞が提供され、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、操作された細胞は、外因性核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、操作された細胞の表面上で発現される、標的化受容体をコードする外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ＣＡＲまたはユニバーサルＣＡＲである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ＷＴ１ ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、受容体に対するリガンドである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン）及びＴＣＲのサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、操作された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸（すなわち、可溶性ポリペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、分泌されたポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、分泌されたポリペプチドは、酵素である。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、サイトカインをコードする抗体をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、融合タンパク質をコードする。
操作されたヒト細胞は、本明細書に開示される例示的な細胞型のうちのいずれかであり得る。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子は、全ての核化細胞上で発現されるため、操作されたヒト細胞は、任意の核化細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、辺縁幹細胞（ＬＳＣ）である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、前駆細胞、例えば、内皮前駆細胞または神経前駆細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、組織特異的一次細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、軟骨細胞、筋細胞、及び角質細胞から選択される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、単球である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、肥満細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、顆粒球である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、メモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、血漿Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、メモリーＢ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、マクロファージである。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される操作されたヒト細胞のうちのいずれか１つを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示される操作された細胞のうちのいずれか１つの集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも６５％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも７０％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも８０％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９０％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９１％陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９２％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９３％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９４％のＨＬＡ－Ａ陰性である操作された細胞集団を含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９５％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９７％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９８％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９９％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である操作された細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９９．５％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である操作された細胞集団を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたヒト細胞または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたヒト細胞または薬学的組成物を、ＡＣＴ療法として対象に投与するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたヒト細胞または薬学的組成物を、がんの治療として対象に投与するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたヒト細胞または薬学的組成物を、自己免疫疾患の治療として対象に投与するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたヒト細胞または薬学的組成物を、感染性疾患の治療として対象に投与するための方法が提供される。
Ｃ．ＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除するための方法及び組成物
本開示は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を遺伝子修飾することによって、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除するための方法及び組成物を提供する。得られた遺伝子修飾された細胞は、本明細書では操作された細胞とも称され得る。いくつかの実施形態では、既に遺伝子修飾された（または操作された）細胞は、本明細書で提供される方法または組成物を使用する、さらなる遺伝子修飾のための開始細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が低減した細胞は、養子細胞移植療法に有用である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の編集は、同種異系移植の目的のために望ましい細胞を産生するために、追加の遺伝子修飾と組み合わされる。
本開示は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を遺伝子修飾することによって、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除するための方法及び組成物を提供する。得られた遺伝子修飾された細胞は、本明細書では操作された細胞とも称され得る。いくつかの実施形態では、既に遺伝子修飾された（または操作された）細胞は、本明細書で提供される方法または組成物を使用する、さらなる遺伝子修飾のための開始細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ発現が低減した細胞は、養子細胞移植療法に有用である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の編集は、同種異系移植の目的のために望ましい細胞を産生するために、追加の遺伝子修飾と組み合わされる。
いくつかの実施形態では、方法は、非修飾細胞と比較してヒト細胞におけるＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減することを含み、ａ）ｉ．配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいはｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいはｉｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいはｉｖ．表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいはｖ．表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列、あるいはｖｉ．（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含む、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１、Ｃ－Ｔ塩基エディター、Ａ－Ｇ塩基エディター、Ｃａｓ１２ａ、及びＣａｓＸのうちの１つから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１、Ｃ－Ｔ塩基エディター、Ａ－Ｇ塩基エディター、Ｃａｓ１２ａ、及びＣａｓＸのうちの１つから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃ－Ｔ塩基エディターである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ａ－Ｇ塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼ及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドニッカーゼは、ＳｐｙＣａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドニッカーゼは、ＮｍｅＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＣａｓＸである。いくつかの実施形態では、細胞（すなわち、操作された細胞）の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現は、それによって低減される。
いくつかの実施形態では、方法は、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除した、操作されたヒト細胞を作製することを含み、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、ａ）ｉ．配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいはｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいはｉｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいはｉｖ．表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいはｖ．表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列、あるいはｖｉ．（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含む、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、細胞（すなわち、操作された細胞）の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現は、それによって低減される。
いくつかの実施形態では、細胞の表面上の発現ＨＬＡ－Ａタンパク質を低減または排除する方法は、細胞を、本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡのうちのいずれか１つ以上と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択されるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ａ）ｉ．配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいはｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいはｉｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいはｉｖ．表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいはｖ．表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列、あるいはｖｉ．（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含む、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９であるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列とのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変換を生成する、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列とのアデノシン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への変換を生成する、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される、操作されたヒト細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物によって産生される操作されたヒト細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ａ発現を低減または排除した、操作されたヒト細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生される操作されたヒト細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するインビトロ細胞培養アッセイにおいて測定したとき、非修飾細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞からの応答の低下を誘発する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体を含む、本明細書に開示される組成物によって産生される細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞を含む、組成物が提供される。
１．ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ
本明細書に提供される方法及び組成物は、ヒト細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するのに有用なガイドＲＮＡを開示する。いくつかの実施形態では、そのようなガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に指向し、本明細書では「ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ」と称され得る。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をヒトＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に指向する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択されるガイド配列を含む。
本明細書に提供される方法及び組成物は、ヒト細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するのに有用なガイドＲＮＡを開示する。いくつかの実施形態では、そのようなガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に指向し、本明細書では「ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ」と称され得る。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をヒトＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に指向する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択されるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号１～２１１から選択されるガイド配列を含むＨＬＡ－Ａ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＬＡ－Ａ ｓｇＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号１～２１１から選択されるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＬＡ－ａ ｄｇＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号１～２１１のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。例示的なＨＬＡ－Ａガイド配列は、以下の表２（配列番号１～９５、対応するガイドＲＮＡ配列配列番号２４９～３４３及び３４４～４３８）、表３（配列番号９６～１２８、対応するガイドＲＮＡ配列配列番号４３９～４７１及び４７２～５０４）、表４（配列番号１２９～１８２）、ならびに表５（配列番号１８３～２１１、対応するガイドＲＮＡ配列配列番号５０５～５３２及び５３３～５６０）に示される。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号１～９５のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号７、１３～１８、２２、２６、３１、３３、３７～４１、４３、４５、４７、５７、５９、６２、６６、８７のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号１３～１８、２６、３７～３９、４１、４３、４５、６２のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号１３～１８のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号１３～１７のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号３７～３９、４１、４３、及び４５のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ ｇＲＮＡは、配列番号３７～３９のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１～２１１のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、もしくは８５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％同一であるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、表２～５に列挙されるゲノム座標の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含むガイド配列を含む。本明細書で使用される場合、ゲノム座標の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドは、例えば、ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを意味し、ゲノム座標は、表２～５に列挙される範囲から５’方向に１０個のヌクレオチド及び３’方向に１０個のヌクレオチドを含む。例えば、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３またはｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９（これらの範囲の境界ヌクレオチドを含む）内に１０個の連続ヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、表１～２及び５に列挙されるゲノム座標の１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム座標の１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、表１～２及び５に列挙されるゲノム座標の１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列の１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドである配列から選択される配列に対して少なくとも９５％、９０％、もしくは８５％同一であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム座標の１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、表２～５のガイドＲＮＡは、表２～５に列挙されるゲノム座標の少なくとも１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、表２～５に列挙されるゲノム座標の少なくとも２０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含むガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号３９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号４９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号５９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号６９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号８９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号９９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１００を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１０９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１１９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１２９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１３９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４５を含む。いくつかの実施形
態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２００を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２１０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２１１を含む。
態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１４９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１５９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１６９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１８９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号１９９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２００を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０２を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０３を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０４を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０５を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０６を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０７を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０８を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２０９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２１０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、配列番号２１１を含む。
例えば、ガイドＲＮＡに対する例示的な修飾を含む、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの追加の実施形態が本明細書に提供される。
２．ＨＬＡ－Ａに対する遺伝子修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、細胞内のＨＬＡ－Ａ遺伝子における少なくとも１個のヌクレオチドを遺伝子修飾する。遺伝子修飾は、遺伝子編集系との接触から生じる修飾の集合（例えば、Ｃａｓ９及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡから生じる編集の集合、またはＢＣ２２及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡから生じる編集の集合）を包含する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、細胞内のＨＬＡ－Ａ遺伝子における少なくとも１個のヌクレオチドを遺伝子修飾する。遺伝子修飾は、遺伝子編集系との接触から生じる修飾の集合（例えば、Ｃａｓ９及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡから生じる編集の集合、またはＢＣ２２及びＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡから生じる編集の集合）を包含する。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、及びｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９８９０１１７－２９８９０１３７、ｃｈｒ６：２９９２７０５８－２９９２７０７８、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４２５４１－２９９４２５６１、ｃｈｒ６：２９９４２５４２－２９９４２５６２、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５５０－２９９４２５７０、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３０６２－２９９４３０８２、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０９２－２９９４３１１２、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１１８－２９９４３１３８、ｃｈｒ６：２９９４３１１９－２９９４３１３９、ｃｈｒ６：２９９４３１２０－２９９４３１４０、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３１２８－２９９４３１４８、ｃｈｒ６：２９９４３１２９－２９９４３１４９、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１３６－２９９４３１５６、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３１４２－２９９４３１６２、ｃｈｒ６：２９９４３１４３－２９９４３１６３、ｃｈｒ６：２９９４３１８８－２９９４３２０８、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３６－２９９４３５５６、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５５８、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５７６、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９９－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２０、ｃｈｒ６：２９９４３６０１－２９９４３６２１、ｃｈｒ６：２９９４３６０２－２９９４３６２２、ｃｈｒ６：２９９４３６０３－２９９４３６２３、ｃｈｒ６：２９９４３７７４－２９９４３７９４、ｃｈｒ６：２９９４３７７９－２９９４３７９９、ｃｈｒ６：２９９４３７８０－２９９４３８００、ｃｈｒ６：２９９４３８２２－２９９４３８４２、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５７－２９９４３８７７、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４３８５９－２９９４３８７９、ｃｈｒ６：２９９４３８６０－２９９４３８８０、ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９４４０７７－２９９４４０９７、ｃｈｒ６：２９９４４０７８－２９９４４０９８、ｃｈｒ６：２９９４４４５８－２９９４４４７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、ｃｈｒ６：２９９４４５９７－２９９４４６１７、ｃｈｒ６：２９９４４６４２－２９９４４６６２、ｃｈｒ６：２９９４４６４３－２９９４４６６３、ｃｈｒ６：２９９４４７７２－２９９４４７９２、ｃｈｒ６：２９９４４７８２－２９９４４８０２、ｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、ｃｈｒ６：２９９４４９０７－２９９４４９２７、ｃｈｒ６：２９９４５０２４－２９９４５０４４、ｃｈｒ６：２９９４５０９７－２９９４５１１７、ｃｈｒ６：２９９４５１０４－２９９４５１２４、ｃｈｒ６：２９９４５１０５－２９９４５１２５、ｃｈｒ６：２９９４５１１６－２９９４５１３６、ｃｈｒ６：２９９４５１１８－２９９４５１３８、ｃｈｒ６：２９９４５１１９－２９９４５１３９、ｃｈｒ６：２９９４５１２４－２９９４５１４４、ｃｈｒ６：２９９４５１７６－２９９４５１９６、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１８０－２９９４５２００、ｃｈｒ６：２９９４５１８７－２９９４５２０７、ｃｈｒ６：２９９４５１８８－２９９４５２０８、ｃｈｒ６：２９９４５２２８－２９９４５２４８、ｃｈｒ６：２９９４５２３０－２９９４５２５０、ｃｈｒ６：２９９４５２３１－２９９４５２５１、ｃｈｒ６：２９９４５２３２－２９９４５２５２、ｃｈｒ６：２９９４５３０８－２９９４５３２８、ｃｈｒ６：２９９４５３６１－２９９４５３８１、ｃｈｒ６：２９９４５３６２－２９９４５３８２、及びｃｈｒ６：３１３８２５４３－３１３８２５６３から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、ｃｈｒ６：２９９４２８１６－２９９４２８３６、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８２８－２９９４２８４８、ｃｈｒ６：２９９４２８３７－２９９４２８５７、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４２９０５－２９９４２９２５、ｃｈｒ６：２９９４２９１２－２９９４２９３２、ｃｈｒ６：２９９４２９１３－２９９４２９３３、ｃｈｒ６：２９９４３４９０－２９９４３５１０、ｃｈｒ６：２９９４３４９７－２９９４３５１７、ｃｈｒ６：２９９４３４９８－２９９４３５１８、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、及びｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８８４－２９９４２９０４、ｃｈｒ６：２９９４３５１９－２９９４３５３９、ｃｈｒ６：２９９４２８６３－２９９４２８８３から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５１７－２９９４３５３７、及びｃｈｒ６：２９９４３５２３－２９９４３５４３から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８４５－２９９４２８６９、ｃｈｒ６：２９９４２８５２－２９９４２８７６、ｃｈｒ６：２９９４２８６５－２９９４２８８９、ｃｈｒ６：２９９４２８９１－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９０３－２９９４２９２７、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２８、ｃｈｒ６：２９９４３５１８－２９９４３５４２、ｃｈｒ６：２９９４３５２５－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３５－２９９４３５５９、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５６２、ｃｈｒ６：２９９４３５３９－２９９４３５６３、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４８－２９９４３５７２、ｃｈｒ６：２９９４３５５５－２９９４３５７９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５８０、ｃｈｒ６：２９９４３５５７－２９９４３５８１、ｃｈｒ６：２９９４３５５８－２９９４３５８２、ｃｈｒ６：２９９４３５５９－２９９４３５８３、ｃｈｒ６：２９９４３５６３－２９９４３５８７、ｃｈｒ６：２９９４３５６４－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６５－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５９２、ｃｈｒ６：２９９４３５７１－２９９４３５９５、ｃｈｒ６：２９９４３５７２－２９９４３５９６、ｃｈｒ６：２９９４３５９５－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３５９６－２９９４３６２０、ｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２４から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２４６９－２９９４２４８９、ｃｈｒ６：２９９４３０５８－２９９４３０７８、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０８０－２９９４３１００、ｃｈｒ６：２９９４３１８７－２９９４３２０７、ｃｈｒ６：２９９４３１９２－２９９４３２１２、ｃｈｒ６：２９９４３１９７－２９９４３２１７、ｃｈｒ６：２９９４３８１２－２９９４３８３２、ｃｈｒ６：２９９４４３４９－２９９４４３６９、ｃｈｒ６：２９９４４９９６－２９９４５０１６、ｃｈｒ６：２９９４５０１８－２９９４５０３８、ｃｈｒ６：２９９４５３４１－２９９４５３６１、ｃｈｒ６：２９９４５５２６－２９９４５５４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾は、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列における少なくとも１個のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、または脱アミノ化のうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列における１、２、３、４、または５個以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列における１、２、３、４、または５個以上のヌクレオチドの欠失を含む。他の実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個以上のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、インデルを含み、これは、当該技術分野では、一般に、１０００塩基対（ｂｐ）未満の挿入または欠失として定義される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列におけるフレームシフト変異をもたらすインデルを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、テンプレート核酸の組み込みに起因するヌクレオチドの挿入、欠失、または置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、標的配列におけるドナー核酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａに対する修飾は、一過性ではない。
３．ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの有効性
ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの有効性は、ガイドＲＮＡの編集効率、及び細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を評価する、当技術分野において利用可能な技法によって決定され得る。いくつかの実施形態では、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の低減または排除は、非修飾細胞との比較によって（または「非修飾細胞に対して」）決定され得る。操作された細胞または細胞集団を、非修飾細胞の集団と比較することもできる。
ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの有効性は、ガイドＲＮＡの編集効率、及び細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を評価する、当技術分野において利用可能な技法によって決定され得る。いくつかの実施形態では、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の低減または排除は、非修飾細胞との比較によって（または「非修飾細胞に対して」）決定され得る。操作された細胞または細胞集団を、非修飾細胞の集団と比較することもできる。
「非修飾細胞」（または「非修飾細胞（複数）」）は、実験または試験における同じタイプの細胞の対照細胞（または細胞（複数））を指し、「非修飾」対照細胞は、ＨＬＡ－Ａガイドと接触していない。したがって、非修飾細胞（または細胞（複数））は、ガイドＲＮＡと接触していない細胞、またはＨＬＡ－Ａを標的としないガイドＲＮＡと接触している細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの有効性は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質のレベルを測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質レベルは、フローサイトメトリーによって測定される（例えば、ＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－Ａ３に対する抗体を用いて）。いくつかの実施形態では、細胞集団は、（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）濃縮され、非修飾細胞集団に対してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％のＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）濃縮されず、非修飾細胞集団に対してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％のＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％のＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも７０％のＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも８０％のＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９０％のＨＬＡ－Ａ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９５％のＭＨＣ Ｉ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも１００％のＨＬＡ－Ａ陰性である。
いくつかの実施形態では、有効なＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡは、遺伝子修飾された標的細胞に対するインビトロまたはインビボ（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の免疫細胞の応答を測定することによって決定され得る。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞からの応答の低減は、有効なＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化応答、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、活性化マーカーの発現、及び／またはサイトカイン産生（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）（例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ）を測定するアッセイによって評価されてもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、インビトロまたはインビボで評価され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、インビトロで遺伝子修飾細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養することによって評価されてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性は、インビボモデル、例えば、げっ歯類モデルで評価されてもよい。インビボモデルでは、例えば、遺伝子修飾細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞で投与してもよく、遺伝子修飾細胞の生存は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解を回避する能力を示す。いくつかの実施形態では、方法は、１、２、３、４、５、または６週間以上、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でインビボで生存する細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１週間～６週間、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でインビボで生存する細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２～４週間、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でインビボで生存する細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも４～６週間、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でインビボで生存する細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、６週間超、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下でインビボで生存する細胞を含む組成物を産生する。
ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡの有効性は、細胞の編集後の生存によっても評価され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも１週間～６週間生存する。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも２週間生存する。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも３週間生存する。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも４週間生存する。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも５週間生存する。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも６週間生存する。いくつかの実施形態では、細胞は、編集後少なくとも１週間～１２週間生存する。遺伝子修飾細胞の生存率は、例えば、細胞死の尺度、フローサイトメトリーによる生／死染色、または細胞増殖を含む、標準的な技法を使用して測定され得る。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＨＬＡ－Ａ発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、操作されたヒト細胞の持続性によって評価される。本明細書で使用される場合、「持続性」は、反応性または応答性のＴ細胞及び／またはＮＫ細胞が存在するインビトロ及び／またはインビボ環境で存在する操作された細胞の能力、例えば、レシピエントへの移植後にインビボで存在する能力を指す。いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、ＮＫ媒介拒絶反応に対して保護的である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の非存在下でインビボで生存可能な操作された細胞に対するＮＫ細胞の存在下でインビボで生存可能な操作された細胞の比は、本明細書で実証されるように、レシピエントへの移植後、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、または少なくとも９０日に少なくとも０．３：１以上である。いくつかの実施形態では、レシピエントへの移植から少なくとも９０日後、ＮＫ細胞の非存在下でインビボで生存可能な操作された細胞に対するＮＫ細胞の存在下でインビボで生存可能な操作された細胞の比は、本明細書で実証されるように、少なくとも０．４：１以上、０．５：１以上、０．６：１以上、０．７：１以上、０．８：１以上、または０．９：１以上である。いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性拒絶反応に対して保護的である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用して評価されてもよい。（例えば、ＤｅＷｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １００：１６３９－１６４９（２０１７）を参照）。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞を、標識された非編集（操作されていない）応答性Ｔ細胞と混合し、ＭＬＲアッセイは、アロ認識によって（すなわち、操作されたヒト細胞の表面上のミスマッチＨＬＡ分子を介して）活性化された応答性Ｔ細胞の増殖を測定する。
Ｄ．ＭＨＣクラスＩＩを低減または排除するための方法及び組成物、ならびに追加の修飾
いくつかの実施形態では、多重遺伝子編集は、細胞内で行われてもよい。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を遺伝子修飾することを含み、細胞を、本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、任意選択で、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む組成物と接触させることを含み、この方法は、（ａ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＣＩＩＴＡ遺伝子に指向するガイドＲＮＡ、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＨＬＡ－ＡまたはＣＩＩＴＡ以外の細胞のゲノム内の遺伝子座に指向するガイドＲＮＡ、及び（ｃ）細胞のゲノム内に挿入するためのドナー核酸から選択される１つ以上の組成物と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、多重遺伝子編集は、細胞内で行われてもよい。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除することを含み、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を遺伝子修飾することを含み、細胞を、本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、任意選択で、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む組成物と接触させることを含み、この方法は、（ａ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＣＩＩＴＡ遺伝子に指向するガイドＲＮＡ、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＨＬＡ－ＡまたはＣＩＩＴＡ以外の細胞のゲノム内の遺伝子座に指向するガイドＲＮＡ、及び（ｃ）細胞のゲノム内に挿入するためのドナー核酸から選択される１つ以上の組成物と接触させることをさらに含む。
１．ＭＨＣクラスＩＩノックアウト
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するための方法が提供され、方法及び組成物は、非修飾細胞と比較して、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、細胞をＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと接触させることによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するための方法が提供され、方法及び組成物は、非修飾細胞と比較して、細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、細胞をＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと接触させることによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞上のＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減するための方法が提供される。ＭＨＣクラスＩＩの発現は、様々なタンパク質の影響を受ける。（例えば、Ｃｒｉｖｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０２：１８９５－１９０３（２０１９）を参照。）例えば、ＣＩＩＴＡタンパク質は、転写活性化因子（ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを活性化する）として機能し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現に不可欠である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＲＦＸ５遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＲＦＸＡＰ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＣＲＥＢ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＮＫ－ＹＡ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質現は、ＮＫ－ＹＢ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、ＮＫ－ＹＣ遺伝子を遺伝子修飾することによって低減または排除される。
いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除した、操作されたヒト細胞を作製するための方法が提供され、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、非修飾細胞と比較して、細胞内のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞をＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの有効性は、細胞におけるＣＩＩＴＡタンパク質のレベルを測定することによって決定される。ＣＩＩＴＡタンパク質のレベルは、例えば、抗ＣＩＩＴＡ抗体を用いた細胞溶解物及びウエスタンブロットによって検出され得る。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの有効性は、細胞核におけるＣＩＩＴＡタンパク質のレベルを測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの有効性は、細胞におけるＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。ＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベルは、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによって検出され得る。いくつかの実施形態では、非修飾細胞と比較した、標的細胞内のＣＩＩＴＡタンパク質及び／またはＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡのレベルの減少は、有効なＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを示す。
いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡの有効性は、標的細胞によるＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現の低減または排除を測定することによって決定される。ＣＩＩＴＡタンパク質は、トランスアクチベーターとして機能し、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを活性化し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現に不可欠である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、標的細胞の表面上で検出され得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、フローサイトメトリーによって測定される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（例えば、抗ＨＬＡ－ＤＲ、－ＤＱ、－ＤＰ）に対する抗体は、例えば、フローサイトメトリーによって、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、非修飾細胞（または非修飾細胞集団）と比較した、細胞（または細胞集団）の表面上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の低減または排除は、有効なＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを示す。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対して陰性である特定のＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と接触させた細胞（または細胞集団）は、有効なＣＩＩＴＡガイドＲＮＡを示す。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現は、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、細胞集団において低減または排除される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）濃縮され、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）濃縮されず、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％のＭＨＣ ＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも７０％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも８０％のＭＨＣ ＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９０％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９１％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９２％のＭＨＣ ＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９３％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団と比較してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも９４％のＭＨＣクラスＩＩ陰性である。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、インビトロまたはインビボでの免疫細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）からの応答の低減を誘発する。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化応答、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖、活性化マーカーの発現、及び／またはサイトカイン産生（ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ）（例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ）を測定するアッセイによって評価され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は、遺伝子修飾細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む細胞と共培養される、インビトロ細胞培養アッセイにおいて評価され得る。例えば、操作された細胞は、例えば、ＰＢＭＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む精製ＣＤ３＋Ｔ細胞、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞株と共培養され得る。操作された細胞から誘発されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、非修飾細胞から誘発される応答と比較してもよい。
いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞が提供され、細胞は、細胞表面上でＨＬＡ－Ａ及びＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除し、細胞は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含み、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子における修飾を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からの応答の低減を誘発し、ＣＤ８＋Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
２．外因性核酸ノックイン
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するための方法及び組成物を提供し、方法及び組成物は、外因性核酸（例えば、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、ケモカインもしくはケモカイン受容体、酵素、融合タンパク質、または他のタイプの細胞表面結合もしくは可溶性ポリペプチド）によってコードされるタンパク質の発現をさらに提供する。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞表面上で発現されるタンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞表面上で発現される標的化受容体をコードする（本明細書でさらに記載される）。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、例えば、インビボでのポリペプチドの連続産生のための供給源としてのもの（本明細書でさらに記載されるように）を含む、外因性核酸によってコードされる分泌されたポリペプチドの発現のための「細胞工場」として機能し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するための方法及び組成物を提供し、方法及び組成物は、外因性核酸（例えば、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、ケモカインもしくはケモカイン受容体、酵素、融合タンパク質、または他のタイプの細胞表面結合もしくは可溶性ポリペプチド）によってコードされるタンパク質の発現をさらに提供する。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞表面上で発現されるタンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞表面上で発現される標的化受容体をコードする（本明細書でさらに記載される）。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、例えば、インビボでのポリペプチドの連続産生のための供給源としてのもの（本明細書でさらに記載されるように）を含む、外因性核酸によってコードされる分泌されたポリペプチドの発現のための「細胞工場」として機能し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減することを含み、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を遺伝子修飾することを含み、細胞を本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡを含む組成物と接触させることを含み、方法は、細胞を外因性核酸と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、ポリペプチド（例えば、標的化受容体）をコードする外因性核酸、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物で細胞を遺伝子修飾することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質及びＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、ポリペプチド（例えば、標的化受容体）をコードする外因性核酸、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物で細胞を遺伝子修飾することを含む。
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞の表面上に発現されたポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、可溶性ポリペプチドをコードする。本明細書で使用される場合、「可溶性」ポリペプチドは、細胞によって分泌されるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチドは、酵素である。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチドは、サイトカインである。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチドは、ケモカインである。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチドは、融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２）をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、完全長抗体をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、エフェクター機能を低減することが知られている変異を含有する。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、エフェクター機能を増強することが知られている変異を含有する。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメインのみの抗体）である。
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、中和抗体をコードする。中和抗体は、その標的抗原の活性を中和する。いくつかの実施形態では、抗体は、ウイルス抗原に対する中和抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、標的ウイルス抗原を中和し、ウイルスが細胞に感染する能力を遮断する。いくつかの実施形態では、細胞ベースの中和アッセイは、抗体の中和活性を測定するために使用され得る。特定の細胞及び読み出しは、中和抗体の標的抗原に依存する。抗体の半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、細胞ベースの中和アッセイで測定することができ、より低いＥＣ５０は、より強力な中和抗体を示す。
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、疾患または障害と関連する抗原に結合する抗体をコードする（例えば、セクションＩＶに記載される疾患及び障害を参照）。
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞の表面上で発現されたポリペプチド（すなわち、細胞表面結合タンパク質）をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、標的化受容体をコードする。「標的化受容体」は、細胞、例えば、Ｔ細胞の表面上に存在し、標的部位、例えば、生物内の特定の細胞または組織への細胞の結合を可能にする受容体である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ＴＲｕＣである。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（例えば、Ｂ細胞上で発現される）である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、ケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、サイトカイン受容体である。
いくつかの実施形態では、標的化受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び細胞外受容体部分の結合時にＴ細胞を活性化することができる内部シグナル伝達ドメイン内の少なくとも膜貫通ドメインを通して作動可能に連結された細胞表面分子の受容体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、例えば、抗原が結合されるときにＴ細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結される、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ナノボディを指す。ＣＡＲは、抗原認識ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの４つの領域で構成される。そのような受容体は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ２０２００９２０５７、ＷＯ２０１９１９１１１４、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１８２０８８３７を参照）。様々な抗原を認識するためのユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣＡＲ）（例えば、ＥＰ２９９０４１６Ａ１を参照）、及びアダプター分子を介して標的細胞への免疫細胞の結合を促進する逆ユニバーサルＣＡＲ（ＲｅｖＣＡＲ）（例えば、ＷＯ２０１９２３８７２２を参照）も企図される。ＣＡＲは、抗体が開発され得る任意の抗原を標的とすることができ、典型的には、標的とされる細胞または組織の表面上に示される分子を対象とする。いくつかの実施形態では、標的化受容体は、抗原認識ドメイン（例えば、がん抗原認識ドメイン及びＴＣＲのサブユニット（例えば、ＴＲｕＣ）を含む。（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０８７（２０１９）を参照。）
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ＴＣＲをコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、遺伝子修飾ＴＣＲをコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、がん細胞によって発現されたポリペプチドに対する特異性を有する遺伝子修飾ＴＣＲをコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）抗原に特異的な標的化受容体をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ＷＴ１特異的ＴＣＲをコードする（例えば、ＷＯ２０２０／０８１６１３Ａ１を参照）。
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、標的細胞のゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、標的細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、相同組換え（ＨＲ）によって標的細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、平滑末端挿入によって標的細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、非相同末端接合によって標的細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、細胞のゲノム内のセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＡＡＶＳ１遺伝子座、及び／またはＣＩＩＴＡ遺伝子座のうちの１つに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、脂質核酸アセンブリ組成物中で細胞に提供される。いくつかの実施形態では、脂質核酸アセンブリ組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ａ発現を低減または排除し、操作された細胞を含み、外因性核酸を含む、組成物を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ａ発現を低減または排除し、細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸によってコードされるポリペプチドを分泌及び／または発現する、操作された細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現を低減もしくは排除し、及び／または細胞核内のＨＬＡ－Ａレベルを低減もしくは排除し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現が低減し、細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸によってコードされるポリペプチドを分泌及び／または発現する、操作された細胞を含む組成物を産生する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞からの応答の低減を誘発する。
いくつかの実施形態では、同種異系細胞が提供され、細胞は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩ及びＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除しており、細胞は、本明細書に開示されるＨＬＡ－Ａ遺伝子における修飾を含み、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子における修飾を含み、細胞は、ポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、標的化受容体）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるようなＨＬＡ－Ａを遺伝子修飾することによって、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除するための方法を提供し、方法は、１つ以上の追加の標的遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ）の発現を低減することをさらに提供する。いくつかの実施形態では、追加の遺伝子修飾は、養子細胞移植用途のための遺伝子修飾細胞の使用のためのさらなる利点を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の表面上のＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減または排除することを含み、本明細書に開示されるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡ、ポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、標的化受容体）、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を別の遺伝子内に位置する標的配列に指向し、それによって他の遺伝子の発現を低減または排除するガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む１つ以上の組成物で、細胞を遺伝子修飾することを含む。いくつかの実施形態では、追加の標的遺伝子は、ＴＲＡＣである。いくつかの実施形態では、追加の標的遺伝子は、ＴＲＢＣである。
Ｅ．例示的な細胞型
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、ヒト細胞を遺伝子修飾する。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、操作された細胞と称される。操作された細胞は、操作された遺伝子修飾を含む、例えば、遺伝子編集系と接触し、遺伝子編集系によって遺伝子修飾された細胞（または細胞の子孫）を指す。「操作された細胞」及び「遺伝子修飾細胞」という用語は、全体を通して交換可能に使用される。操作されたヒト細胞は、本明細書に開示される例示的な細胞型のうちのいずれかであり得る。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子は、全ての核化細胞上で発現されるため、操作されたヒト細胞は、任意の核化細胞であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、ヒト細胞を遺伝子修飾する。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、操作された細胞と称される。操作された細胞は、操作された遺伝子修飾を含む、例えば、遺伝子編集系と接触し、遺伝子編集系によって遺伝子修飾された細胞（または細胞の子孫）を指す。「操作された細胞」及び「遺伝子修飾細胞」という用語は、全体を通して交換可能に使用される。操作されたヒト細胞は、本明細書に開示される例示的な細胞型のうちのいずれかであり得る。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子は、全ての核化細胞上で発現されるため、操作されたヒト細胞は、任意の核化細胞であってもよい。
いくつかの実施形態では、細胞がＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性である場合、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、細胞がＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である場合、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択され、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、操作されたヒト細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、以下のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２である。
いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」、及びＮＫＴ細胞、またはｉＮＫＴ細胞））、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球（例えば、好中球、好酸球、及び好塩基球）を含む、免疫系の細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、一次免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）から選択され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、同種異系である。
いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、適応免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、リンパ球は、同種異系である。
本明細書で使用される場合、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」または「αβ ＴＣＲ」または「γδ ＴＣＲ」）を発現する細胞として定義され得るが、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のＴＣＲは、その発現を低減させるために（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子への遺伝子修飾によって）遺伝子修飾されてもよく、したがって、タンパク質ＣＤ３の発現は、標準的なフローサイトメトリー法によってＴ細胞を同定するためのマーカーとして使用されてもよい。ＣＤ３は、ＴＣＲと会合するマルチサブユニットシグナル伝達複合体である。したがって、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋と称され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋マーカー及びＣＤ４＋またはＣＤ８＋マーカーのいずれかを発現する細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、同種異系である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、糖タンパク質ＣＤ８を発現し、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によってＣＤ８＋であり、「細胞傷害性」Ｔ細胞と称され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、糖タンパク質ＣＤ４を発現し、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によってＣＤ４＋であり、「ヘルパー」Ｔ細胞と称され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サブセットに分化することができ、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、Ｔ調節（「Ｔｒｅｇ」）細胞、またはＴ濾胞性ヘルパー細胞（「Ｔｆｈ」）と称され得る。各ＣＤ４＋サブセットは、炎症誘発または抗炎症機能、生存または保護機能のいずれかを有し得る特定のサイトカインを放出する。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択方法によって対象から単離されてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。体内では、メモリーＴ細胞が、抗原に遭遇している。メモリーＴ細胞は、二次リンパ器官（セントラルメモリーＴ細胞）または最近感染した組織（エフェクターメモリーＴ細胞）に位置することができる。メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。
本明細書で使用される場合、「セントラルメモリーＴ細胞」は、抗原経験Ｔ細胞として定義することができ、例えば、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。セントラルメモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞によってＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋として検出されてもよく、ＣＣＲ７も発現し、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によってＣＣＲ７＋として検出されてもよい。
本明細書で使用される場合、「初期幹細胞メモリーＴ細胞」（または「Ｔｓｃｍ」）は、ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＡを発現するＴ細胞として定義することができ、したがって、標準的なフローサイトメトリー法によって、ＣＤ２７＋及びＣＤ４５ＲＡ＋である。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５アイソフォームＣＤ４５ＲＯを発現しないため、標準的なフローサイトメトリー法によってこのアイソフォームについて染色された場合、Ｔｓｃｍは、さらにＣＤ４５ＲＯ－となる。したがって、ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ２７＋細胞はまた、初期幹細胞メモリーＴ細胞である。Ｔｓｃｍ細胞は、さらにＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７を発現するため、標準的なフローサイトメトリー法によってＣＤ６２Ｌ＋及びＣＣＲ７＋として検出され得る。初期幹細胞メモリーＴ細胞は、細胞療法製品の持続性及び治療有効性の増加と相関することが示されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ細胞である。本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞」は、ＣＤ１９及び／またはＣＤ２０、及び／またはＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）を発現する細胞として定義することができ、したがって、Ｂ細胞は、標準的なフローサイトメトリー法によって、ＣＤ１９＋、及び／またはＣＤ２０＋、及び／またはＢＣＭＡ＋である。Ｂ細胞はさらに、標準的なフローサイトメトリー法によって、ＣＤ３及びＣＤ５６について陰性である。Ｂ細胞は、血漿細胞であってもよい。Ｂ細胞は、メモリーＢ細胞であってもよい。Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞であってもよい。Ｂ細胞は、ＩｇＭ＋であり得るか、またはクラススイッチＢ細胞受容体（例えば、ＩｇＧ＋もしくはＩｇＡ＋）を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、同種異系である。
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、骨髄または末梢血に由来する単核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＢＭＣ、例えば、リンパ球または単球である。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）である。いくつかの実施形態では、単核細胞は、同種異系である。
ＡＣＴ及び／または組織再生療法で使用される細胞、例えば、幹細胞、前駆細胞、及び一次細胞が含まれる。幹細胞には、例えば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ、例えば、骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）、胎盤、臍帯（ＵＣ）、または脂肪から単離される）、造血幹細胞（ＨＳＣ、例えば、ＢＭまたはＵＣから単離される）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、組織特異的前駆幹細胞（ＴＳＰＳＣ）、及び辺縁幹細胞（ＬＳＣ）が含まれる。前駆細胞及び一次細胞としては、単核細胞（ＭＮＣ、例えば、ＢＭまたはＰＢから単離される）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ、例えば、ＢＭ、ＰＢ、及びＵＣから単離される）、神経前駆細胞（ＮＰＣ）、ならびに軟骨細胞、筋細胞、及び角質細胞を含む組織特異的一次細胞またはそれらに由来する細胞（ＴＳＣ）が挙げられる。膵島細胞、心筋細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、神経細胞、皮膚細胞、及び網膜細胞などの臓器移植または組織移植のための細胞も含まれる。
いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト対象から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトドナーＰＢＭＣまたはロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、病態、障害、または疾患を有する対象由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）を有するヒトドナー由来である。
いくつかの実施形態では、方法は、エクスビボで実行される。本明細書で使用される場合、「エクスビボ」は、細胞を対象に移すことが可能であるインビトロ方法、例えば、ＡＣＴ療法を指す。いくつかの実施形態では、エクスビボ法は、ＡＣＴ療法細胞または細胞集団を含むインビトロ法である。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株由来である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、細胞株は、リンパ芽球様細胞株（「ＬＣＬ」）である。細胞は、凍結保存され、解凍されてもよい。細胞は、以前に凍結保存されていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞バンク由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子修飾され、次いで細胞バンクに移される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から除去され、エクスビボで遺伝子修飾され、細胞バンクに移される。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された細胞集団は、細胞バンクに移される。いくつかの実施形態では、免疫細胞の遺伝子修飾集団は、細胞バンクに移される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の亜集団を含む免疫細胞の遺伝子修飾集団であって、第１及び第２の亜集団は、少なくとも１つの共通の遺伝子修飾及び少なくとも１つの異なる遺伝子修飾を有する、遺伝子修飾集団が細胞バンクに移される。
Ｆ．例示的な遺伝子編集系
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含むが、これらに限定されない、本明細書に開示される操作された細胞を作製するために、様々な好適な遺伝子編集系が使用されてもよい。一般に、遺伝子編集系は、操作された切断系の使用を伴い、標的ＤＮＡ配列において二本鎖破断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖破断、もしくはＳＳＢ）を誘導する。切断またはニッキングは、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮなどの特定のヌクレアーゼを使用して、または操作されたガイドＲＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ＤＮＡ配列の特定の切断またはニッキングを誘導することによって起こり得る。さらに、標的ヌクレアーゼは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ系に基づいて開発されており（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られているＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照）、これもまた、遺伝子編集及び遺伝子療法における使用の可能性を有し得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含むが、これらに限定されない、本明細書に開示される操作された細胞を作製するために、様々な好適な遺伝子編集系が使用されてもよい。一般に、遺伝子編集系は、操作された切断系の使用を伴い、標的ＤＮＡ配列において二本鎖破断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖破断、もしくはＳＳＢ）を誘導する。切断またはニッキングは、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮなどの特定のヌクレアーゼを使用して、または操作されたガイドＲＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ＤＮＡ配列の特定の切断またはニッキングを誘導することによって起こり得る。さらに、標的ヌクレアーゼは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ系に基づいて開発されており（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られているＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照）、これもまた、遺伝子編集及び遺伝子療法における使用の可能性を有し得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ＴＡＬＥＮ系である。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することができる制限酵素である。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、所望のＤＮＡ配列に結合し、特定の位置でのＤＮＡ切断を促進するように操作することができる（例えば、Ｂｏｃｈ，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈを参照）。制限酵素は、遺伝子編集で使用するために、または操作されたヌクレアーゼを用いた遺伝子編集として知られている技法である、原位置での遺伝子編集のために、細胞に導入することができる。そこで使用するためのかかる方法及び組成物は、当該技術分野において既知である。例えば、それらの内容全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１４０４０３７０、ＷＯ２０１８０７３３９３を参照のこと。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、ジンクフィンガー系である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の独自の配列を標的とすることができるように、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができる。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的切断ドメインは、典型的には、ＺＦＮにおける切断ドメインとして使用される。切断は、内因性ＤＮＡ修復機構によって修復され、ＺＦＮが高等生物のゲノムを正確に改変するのを可能にする。そこで使用するためのかかる方法及び組成物は、当該技術分野において既知である。例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１０９１３２４を参照のこと。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集系は、例えば、ガイド配列及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含むＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり、本明細書にさらに記載される。
Ｇ．ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ
本明細書で提供されるのは、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を有する開示されるガイド配列を含むガイドＲＮＡを使用して、標的配列を修飾するのに有用なガイド配列である。
本明細書で提供されるのは、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を有する開示されるガイド配列を含むガイドＲＮＡを使用して、標的配列を修飾するのに有用なガイド配列である。
本明細書に開示されるガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する：５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２１３）。ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチド（足場配列）をさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する：５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２１４）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２１５、４個の末端部のＵを含まない配列番号２１４である）。いくつかの実施形態では、配列番号２１４の４個の末端部のＵは存在しない。いくつかの実施形態では、配列番号２１４の４個の末端部のＵのうちの１、２、または３個のみが存在する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号１～２１１のガイド配列のうちのいずれか１つと、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドと、を含み、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的な足場ヌクレオチド配列を有する：５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２１６）。配列番号２１６は、以下の野生型ガイドＲＮＡ保存配列を参照して、８個のヌクレオチドを欠いている：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２１５）。他の例示的な足場ヌクレオチド配列を表６に提供する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、示されるように、配列番号１～２１１のガイド配列のうちのいずれか１つと、足場配列の修飾バージョンを含む、表６の５’～３’配向の追加のガイド足場配列とを含む。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、表２（配列番号２４９～３４３及び３４４～４３８）、表３（配列番号４３９～４７１及び４７２～５０４）、ならびに表５（配列番号５０５～５３２及び５３３～５６０）に示される配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学修飾されたガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学修飾された単一のガイドＲＮＡである。化学修飾されたガイドＲＮＡは、表２、３、５、及び６に示されるような修飾のうちの１つ以上を含んでもよい。化学修飾されたガイドＲＮＡは、配列番号１００３、１００７～１００９、及び１０１１～１０１４のうちのいずれか１つの修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、本明細書に開示される少なくとも１つの化学修飾を伴う、配列番号２４９～３４３、４３９～４７１、及び５０５～５３２のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２４９～３４３、４３９～４７１、及び５０５～５３２のうちのいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であり、本明細書に開示される少なくとも１つの化学修飾を伴う配列を含むｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１０１３または１０１４に示される修飾パターンを含むｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４４～４３８、４７２～５０４、及び５３３～５６０の核酸のうちのいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含むｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１００３に示される修飾パターンを含むｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～２１１から選択される配列を含むガイド配列を含む、配列番号１００３の修飾ヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１０１６の配列、または配列番号１０１６と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含むｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４４～４３８、４７２～５０４、及び５３３～５６０、及び１０１６の配列のうちのいずれか１つ、または配列番号３４４～４３８、４７２～５０４、及び５３３～５６０、及び１０１６の配列のうちのいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である配列を含む単一のガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１３～１８、２６、３７～３９、４１、４３、４５、及び６２のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３５６～３６１、３６９、３８０～３８２、３８４、３８６、３８８、及び４０５の配列のうちのいずれか１つ、または配列番号３５６～３６１、３６９、３８０～３８２、３８４、３８６、３８８、及び４０５の配列のうちのいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含む単一のガイドＲＮＡを含む。
ガイドＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各々の組成物及び方法の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、シングルＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合していてもよく、または別個のＲＮＡ上にあってもよい（ｄｇＲＮＡ）。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの「足場」または「保存された部分」と称され得る。
本明細書に記載される組成物、使用及び方法の実施形態の各々では、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表２～５に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子は共有結合していなくてもよいが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によってＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。
本明細書に記載される組成物、使用及び方法の実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」としてシングルＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合した表２～５に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表２～５に示されるガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存する。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００個超のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、例えば１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造等の特定の二次構造を含み得る。
いくつかの実施形態では、表２～５におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、表２～５におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物であって、配列番号２１３～２１６のヌクレオチドが、その３’末端にあるガイド配列の後にある、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、表２～５におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡであって、配列番号２１３～２１６のヌクレオチドが、その３’末端にあるガイド配列の後にあるガイドＲＮＡは、配列番号１００３、１００７～１００９、及び１０１１～１０１４のうちのいずれか１つの修飾パターンに従って修飾される。
いくつかの実施形態では、表２～５におけるいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物が提供される。一態様では、本発明は、配列番号１～２１１の核酸のうちのいずれかに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む、１つ以上のｇＲＮＡを含む組成物が提供される。
他の実施形態では、表２～５に示されるガイド配列のうちのいずれか２つ以上から選択されるガイド配列を含む、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、表２～５に示されるガイド配列のうちのいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を各々含む、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のガイドＲＮＡ組成物は、ＨＬＡ－Ａ内の標的配列を認識する（例えば、それに対してハイブリダイズする）ように設計される。例えば、ＨＬＡ－Ａ標的配列は、ガイドＲＮＡを含む提供されるＣａｓクリベースによって認識及び切断され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリベースは、ガイドＲＮＡによってＨＬＡ－Ａにおける標的配列に対して指向させてもよく、ガイドＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリベースは、標的配列を切断する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＨＬＡ－Ａ内の標的配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列を含む組成物は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８からの座標に従って、表２～５に示される対応するゲノム領域に対して相補的であるガイド配列を含む。さらなる実施形態のガイド配列は、ＨＬＡ－Ａ内の表２～５のうちのいずれかに列挙されるゲノム座標の近傍の配列に対して相補的であり得る。例えば、さらなる実施形態のガイド配列は、表２～５に列挙されるゲノム座標の１０個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列に対して相補的であり得る。
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、標的遺伝子の特定の領域における修飾（例えば、ヌクレアーゼ媒介性ＤＳＢの結果として生じるインデルに起因するフレームシフト変異）は、他の領域における変異よりも許容性が低くてもよく、したがって、ＤＳＢの位置は、もたらされ得るタンパク質ノックダウンの量または種類における重要な因子である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的遺伝子内の特定の位置に指向させるために使用される。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的遺伝子内に存在する標的配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ヒトＨＬＡ－Ａ遺伝子内に存在する標的配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡのガイド配列に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１００％相補的であるか、または同一であり得る。他の実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、少なくとも１個のミスマッチを含んでいてもよい。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列の全長は、２０である。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１～４個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。
Ｈ．修飾ｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、修飾されている。本明細書に記載されるｇＲＮＡの文脈における「修飾された」または「修飾」という用語は、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’または３’保護末端修飾を含む、５’末端修飾または３’末端修飾、（ｂ）塩基の置換または除去を含む、核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’、及び／または４’位における修飾を含む、糖修飾、（ｄ）ヌクレオシド間結合修飾、ならびに（ｅ）ホスホジエステル結合及び／またはリボース糖の修飾または置換を含むことができる、骨格修飾を含む、上記の修飾を含む。所与の位置におけるヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの糖の直ぐ３’側のホスホジエステル結合の修飾または置換を含む。したがって、例えば、５’末端から１番目と２番目の糖の間にホスホロチオエートを含む核酸は、１位に修飾を含むとみなされる。「修飾されたｇＲＮＡ」という用語は、全て本明細書に詳細に記載されかつ例示される、ヌクレオチドホスフェートを含む、塩基、糖、及びホスホジエステル結合または骨格部分のうちの１つ以上の化学構造の修飾を有する、ｇＲＮＡを指す。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、修飾されている。本明細書に記載されるｇＲＮＡの文脈における「修飾された」または「修飾」という用語は、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’または３’保護末端修飾を含む、５’末端修飾または３’末端修飾、（ｂ）塩基の置換または除去を含む、核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’、及び／または４’位における修飾を含む、糖修飾、（ｄ）ヌクレオシド間結合修飾、ならびに（ｅ）ホスホジエステル結合及び／またはリボース糖の修飾または置換を含むことができる、骨格修飾を含む、上記の修飾を含む。所与の位置におけるヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの糖の直ぐ３’側のホスホジエステル結合の修飾または置換を含む。したがって、例えば、５’末端から１番目と２番目の糖の間にホスホロチオエートを含む核酸は、１位に修飾を含むとみなされる。「修飾されたｇＲＮＡ」という用語は、全て本明細書に詳細に記載されかつ例示される、ヌクレオチドホスフェートを含む、塩基、糖、及びホスホジエステル結合または骨格部分のうちの１つ以上の化学構造の修飾を有する、ｇＲＮＡを指す。
修飾のさらなる説明及び例示的なパターンは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月１２日に発行されたＷＯ２０１９／２３７０６９の表１に提供される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のＹＡ部位における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンは、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニンは修飾（アデニンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン及びアデニンは、糖、塩基、またはヌクレオシド間連結の修飾等の修飾を含む。ＹＡ修飾は、本明細書に記載されるいずれかの種類の修飾であり得る。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’－ＯＭｅ、または２’－フルオロのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’－ＯＭｅ、２’－Ｈ、イノシン、または２’－フルオロのうちの１つ以上を含むピリミジン修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、１つ以上のＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボースアナログ（例えばＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボースアナログ（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含み、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのガイド配列（またはガイド領域）は、ＹＡ修飾を含み得る、１、２、３、４、５つまたはそれ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する１つ以上のＹＡ部位（「５末端」等は、ガイド領域の３’末端に対して５位、すなわち、ガイド領域内の最も３’のヌクレオチドを指す）は、ＹＡ修飾を含む。修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある。例えば、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１０個のヌクレオチド内にあり、ガイド領域が、２０個のヌクレオチド長である場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位の修飾ヌクレオチドは、１１～２０位のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４、５、６、７、８、９、１０、または１１番目、またはその後である。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端修飾以外である。例えば、ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載される５’末端修飾を含むことができ、修飾ガイド領域ＹＡ部位をさらに含むことができる。あるいは、ｓｇＲＮＡは、非修飾５’末端及び修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。あるいは、短いｓｇＲＮＡは、修飾５’末端及び非修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドを含まない修飾を含む。例えば、ヌクレオチド１～３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４が２’－ＯＭｅ修飾のみを含み、ヌクレオチド５がＹＡ部位のピリミジンであり、ホスホロチオエートを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位（ヌクレオチド４）の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチドを含まない修飾（ホスホロチオエート）を含む。別の例では、ヌクレオチド１～３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４がＹＡ部位のピリミジンであり、２’－ＯＭｅを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチド（ヌクレオチド１～３のいずれか）を含まない修飾（２’－ＯＭｅ）を含む。この条件はまた、非修飾ヌクレオチドが修飾ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する場合には、常に満たされる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、上のＹＡ部位について記載される修飾を含む。ｇＲＮＡのガイド領域は、本明細書に記載される修飾ガイド領域を含む任意の実施形態に従って修飾され得る。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、上記実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’及び／または３’末端部領域は修飾されている。
いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドが修飾されている。全体を通して、この修飾は「３’末端修飾」と称され得る。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドは、２個以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ｇＲＮＡの３’末端における１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、結合は、最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の３個のヌクレオチド間の２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の４個のヌクレオチド間の４個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｇＲＮＡは、３’テールを含むかまたはさらに含み、３’テールは、３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’テールは完全に修飾されている。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、または１～１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態では、３’保護末端修飾を含むｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、３’テールは、１～約２０個のヌクレオチド、１～約１５個のヌクレオチド、１～約１０個のヌクレオチド、１～約５個のヌクレオチド、１～約４個のヌクレオチド、１～約３個のヌクレオチド、及び１～約２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’テールを含まない。
いくつかの実施形態では、５’末端部領域が修飾され、例えば、ｇＲＮＡの最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドが修飾されている。全体を通して、この修飾は「５’末端修飾」と称され得る。いくつかの実施形態では、５’末端部領域の最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端の末端における、末端（すなわち、最初の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’及び３’末端部領域（例えば、末端）の両方が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端部領域のみが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの保存部分の３’末端部領域（プラスまたはマイナス３’テール）のみが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端部領域における最初の７個のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端部領域における７個の末端部のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部領域における最初の４個のヌクレオチドのうちの２、３、もしくは４個、及び／または３’末端部領域における末端部の４個のヌクレオチドのうちの２、３、もしくは４個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部領域における最初の４個のヌクレオチドのうちの２、３、または４個は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている。いくつかの実施形態では、５’末端及び／または３’末端の修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）または２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチドへの２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、保護末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、保護末端修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｏ－ｍｏｅ、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、及び反転した脱塩基ヌクレオチドから選択される２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、等価な修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾及び３’末端修飾を含む、ｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’または３’末端におけるものではない修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域におけるＵＳ１～ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、ＹＡ部位における１、２、３、４、または５つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾は、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’－Ｆ修飾ヌクレオチド、及び／またはそれらの組み合わせを含む。５’末端修飾及び／または３’末端修飾などの、本明細書に記載の他の修飾は、上部ステム修飾と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、及び／またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、ヘアピン１領域内にある。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、ヘアピン２領域内にある。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾は、ＹＡ部位に１、２、または３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾は、少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＹＡ修飾を含む。上部ステム修飾、５’末端修飾、及び／または３’末端修飾などの本明細書に記載の他の修飾は、ヘアピン領域における修飾と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、置換されかつ任意選択により短縮されたヘアピン１領域を含み、以下のヌクレオチド対のうちの少なくとも１つは、置換されかつ任意選択により短縮されたヘアピン１においてワトソン－クリック対形成ヌクレオチドで置換されている：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、及び／またはＨ１－４及びＨ１－９。「ワトソン－クリック対形成ヌクレオチド」には、Ａ－Ｔ、Ａ－Ｕ、Ｔ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ｇ、及びＧ－Ｃ対を含むワトソン－クリック塩基対を形成することができる任意の対、ならびに同じ塩基対形成の好みを有する前述のヌクレオチドのいずれかの修飾形態を含む対が含まれる。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、Ｈ１－５～Ｈ１－８のうちのいずれか１つまたは２つを欠いている。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、以下のヌクレオチド対のうちの１つ、２つ、または３つを欠いている：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、及び／またはＨ１－４及びＨ１－９。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、ヘアピン１領域の１～８個のヌクレオチドを欠いている。前述の実施形態のいずれかでは、欠いているヌクレオチドは、ワトソン－クリック対形成ヌクレオチド（Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、及び／またはＨ１－４及びＨ１－９）で置換された１つ以上のヌクレオチド対がｇＲＮＡにおいて塩基対を形成するためのものであり得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも１個のヌクレオチドを欠いている上部ステム領域、例えば、米国出願第６２／９４６，９０５号の表７に示される短縮された上部ステム領域のうちのいずれかをさらに含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるか、または本明細書の他の箇所に記載され、これは、本明細書に記載の短縮されたまたは置換されたヘアピン１領域のうちのいずれかと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するｓｇＲＮＡは、例えばヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む、短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）であり、ヘアピン領域は、少なくとも５～１０個のヌクレオチドまたは６～１０個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、５～１０個のヌクレオチドまたは６～１０個のヌクレオチドが連続している。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４～５８（ＡＡＡＡＡ）を欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、例えばペアワイズまたは構造アラインメントによって決定されるように、ｓｐｙＣａｓ９の保存部分のヌクレオチド５４～５８（ＡＡＡＡＡ）に対応するヌクレオチドを欠いている非ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域を含む保存された部分を含み、ヘアピン領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、欠いているヌクレオチドは、５～１０個の欠いているヌクレオチドまたは６～１０個の欠いているヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、欠いているヌクレオチドは、連続している。いくつかの実施形態では、欠いているヌクレオチドは、少なくともヘアピン１の一部及びヘアピン２の一部に及ぶ。いくつかの実施形態では、５～１０個の欠いているヌクレオチドは、配列番号２１５のヌクレオチド５４～５８、５４～６１、または５３～６０を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡは、ネクサス領域をさらに含み、ネクサス領域は、少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、ネクサス領域内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド）を欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ネクサス領域における各ヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳｐｙＣａｓ９短いｓｇＲＮＡは、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１００２）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡは、配列番号１００３：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵｍＧｍＣ＊ｍＵ（配列番号１００３）に示される修飾パターンを含み、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、及びＮはそれぞれ、別段の指示がない限り、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、及び任意のリボヌクレオチドである。ｍは、２’Ｏ－メチル修飾を示し、＊は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示す。
特定の実施形態では、配列番号２１５（「例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１」）を例として使用して、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１は、以下のうちの１つ以上をさらに含む。
Ａ．短縮されたヘアピン１領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１領域であって、
１．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９のうちの少なくとも１つが、ヘアピン１においてワトソン－クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、ヘアピン１領域が、任意選択で、
ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のうちのいずれか１つもしくは２つ、
ｂ．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９のうちの１つ、２つ、もしくは３つ、または
ｃ．ヘアピン１領域の１～８個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
２．短縮されたヘアピン１領域が、６～８個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドを欠いており、
ａ．位置Ｈ１－１、Ｈ１－２、もしくはＨ１－３のうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して欠失もしくは置換されているか、または
ｂ．位置Ｈ１－６～Ｈ１－１０のうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して置換されているか、あるいは
３．短縮されたヘアピン１領域が、５～１０個のヌクレオチド、好ましくは５～６個のヌクレオチドを欠いており、位置Ｎ１８、Ｈ１－１２、もしくはｎのうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して置換されている、短縮されたヘアピン１領域、あるいは
Ｂ．短縮された上部ステム領域であって、短縮された上部ステム領域が、１～６個のヌクレオチドを欠いており、短縮された上部ステム領域の６、７、８、９、１０、または１１個のヌクレオチドが、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して４個以下の置換を含む、短縮された上部ステム領域、あるいは
Ｃ．ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２及びＨ２－１４のうちのいずれか１つ以上における例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較した置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、置換、あるいは
Ｄ．上部ステム領域を有する例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）であって、上部ステム修飾が、上部ステム領域におけるＵＳ１～ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含み、
１．修飾ヌクレオチドが、任意選択で、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせから選択されるか、または
２．修飾ヌクレオチドが、任意選択で、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１。
Ａ．短縮されたヘアピン１領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１領域であって、
１．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９のうちの少なくとも１つが、ヘアピン１においてワトソン－クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、ヘアピン１領域が、任意選択で、
ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のうちのいずれか１つもしくは２つ、
ｂ．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９のうちの１つ、２つ、もしくは３つ、または
ｃ．ヘアピン１領域の１～８個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
２．短縮されたヘアピン１領域が、６～８個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドを欠いており、
ａ．位置Ｈ１－１、Ｈ１－２、もしくはＨ１－３のうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して欠失もしくは置換されているか、または
ｂ．位置Ｈ１－６～Ｈ１－１０のうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して置換されているか、あるいは
３．短縮されたヘアピン１領域が、５～１０個のヌクレオチド、好ましくは５～６個のヌクレオチドを欠いており、位置Ｎ１８、Ｈ１－１２、もしくはｎのうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して置換されている、短縮されたヘアピン１領域、あるいは
Ｂ．短縮された上部ステム領域であって、短縮された上部ステム領域が、１～６個のヌクレオチドを欠いており、短縮された上部ステム領域の６、７、８、９、１０、または１１個のヌクレオチドが、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較して４個以下の置換を含む、短縮された上部ステム領域、あるいは
Ｃ．ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２及びＨ２－１４のうちのいずれか１つ以上における例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）と比較した置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、置換、あるいは
Ｄ．上部ステム領域を有する例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２１５）であって、上部ステム修飾が、上部ステム領域におけるＵＳ１～ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含み、
１．修飾ヌクレオチドが、任意選択で、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせから選択されるか、または
２．修飾ヌクレオチドが、任意選択で、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１。
特定の実施形態では、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１、または例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１を含むｓｇＲＮＡなどのｓｇＲＮＡは、３’テール、例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のヌクレオチドの３’テールをさらに含む。特定の実施形態では、テールは、１個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、及び反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間にＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、ネクサス領域をさらに含み、ネクサス領域は、少なくとも１個のヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在する成分または構造の存在を記載するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋リン酸酸素の１つもしくは両方、及び／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖及び／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。
上に列挙されるものなどの化学修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエート基等の修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１、２、３、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）が、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。
リン酸リンカー及びリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられている核酸を模倣できる足場もまた構築できる。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例は、非限定的に、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物を含み得る。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖に対する１つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されていてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’－アルコキシドイオンを形成するようにさらに脱プロトン化されることがもはや起こり得ないので、核酸の安定性を増強し得る。２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールもしくは糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲを挙げることができ、式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０の整数であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基をフッ素で置き換える２’－フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１～６アルキレンまたはＣ１～６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に接続され得る「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＬＮＡ）を含み得、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠失している「アンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は，メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を含み得る。
「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（ここでアミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここでＲは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、任意選択で、例えば本明細書において記載されるようなアミノによって置換されていてもよい。
糖修飾は、１つ以上の炭素を含み、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えばＬ－ヌクレオシドを含み得る。
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書において記載される修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことのできる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、及び塩基の合成誘導体を含み得る。
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態において、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基は、化学修飾されていてもよく、またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾されていてもよい。特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の一本鎖突出におけるヌクレオチドのうちの１つ以上または全ては、デオキシヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、２０１８年６月１４日に公開されたＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示された修飾パターンのうちの１つを含む。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを表すために使用され得る。「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’－Ｆで置換されたヌクレオチドを表すために使用され得る。「＊」は、ＰＳ修飾を表すために使用され得る。Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語を使用して、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを表すことができる。「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」という用語を使用して、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを表すことができる。
Ｉ．リボ核タンパク質複合体
いくつかの実施形態では、本開示は、表２～５からの１つ以上のガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡと、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照）、ならびにそれらの修飾（例えば、操作型または変異体）バージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、またはＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはそのＣｍｒ２サブユニット、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系に由来していてもよい。様々なＣＲＩＳＰＲ系及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．９：４６７－４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ，１３：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＥＬＬ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドニッカーゼは、修飾されるか、またはＣａｓタンパク質、例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、もしくはＶＩ型のＣａｓヌクレアーゼであってもよい）に由来する。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３タンパク質、ならびにそれらの修飾物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、表２～５からの１つ以上のガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡと、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照）、ならびにそれらの修飾（例えば、操作型または変異体）バージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、またはＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはそのＣｍｒ２サブユニット、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系に由来していてもよい。様々なＣＲＩＳＰＲ系及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．９：４６７－４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ，１３：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＥＬＬ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドニッカーゼは、修飾されるか、またはＣａｓタンパク質、例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、もしくはＶＩ型のＣａｓヌクレアーゼであってもよい）に由来する。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３タンパク質、ならびにそれらの修飾物が挙げられる。
ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼのニッカーゼ形態である。例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ Ｄ１６Ａニッカーゼ融合タンパク質を記載するＷＯ／２０２００８１５６８を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼに由来する。さらなる実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼに由来する。他の箇所で考察されるように、ニッカーゼは、例えば、Ｓｐｙ Ｃａｓ９中のＮ８６３の核酸分解に不可欠な活性部位残基（Ｄ１０、Ｈ８４０など）を変異させることによって、２つの触媒ドメインのうちの１つを不活性化することによって、ヌクレアーゼに由来し得る。当業者は、下で詳述される、配列アラインメント及び構造アラインメントなどの他のＣａｓタンパク質中の対応する残基を容易に同定するための技法に精通するであろう。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をともに含むｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼをともに含むｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をともに含むｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは、ＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、１個より多いＲｕｖＣドメイン及び／または１個より多いＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用及び方法の実施形態の各々において、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を産生することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作製する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で考察されるＣａｓヌクレアーゼ）の１つのバージョンである。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ等のＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個の機能的ヌクレアーゼドメインのみを含有するように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、その核酸切断活性を低減させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低減したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低減したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、または改変させるように置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖にニックを生成することによって（すなわち、ダブルニッキング）、ニッカーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減し得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡとともに使用され、標的ＤＮＡ内にダブルニックを産生する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された２つの別個のガイドＲＮＡとともに使用され、標的ＤＮＡ内にダブルニックを産生する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性及びニッカーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、触媒（クリベース／ニッカーゼ）活性を本質的に欠く一方で、ＤＮＡ結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリベース活性及びニッカーゼ活性を欠くＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、その触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、そのエンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で考察されるＣａｓヌクレアーゼ）の１つのバージョンである。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６９５８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１６６９８０Ａ１を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、またはそれを含む）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）である。いくつかの実施形態では、Ａ３Ａは、ヒトＡ３Ａである。いくつかの実施形態では、Ａ３Ａは、野生型Ａ３Ａである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ａ３Ａをコードするシークエンシングを、ＲＮＡガイドニッカーゼをコードする配列シークエンシングに連結するリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、またはそれ以上のアミノ酸を有するアミノ酸の任意の伸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１６残基「ＸＴＥＮ」リンカー、またはそのバリアントである（例えば、実施例、及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｍａｎｎｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１１８６－１１９０（２００９）を参照）。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮリンカーは、配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号９００）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号９０１）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９０２）を含む。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で融合され得る。これをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個より多いＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部において融合される２個のＮＬＳ配列（例えば、ＳＶ４０）に融合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合していてもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳと融合しない場合がある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）などの単一部分配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）等の二部分配列であってもよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部において融合され得る。１つ以上のリンカーは、任意選択で、融合部位に含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、エディターを含む。例示的なエディターは、ＸＴＥＮリンカーによってＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ－Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼに融合されたＨ．ｓａｐｉｅｎｓ ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、及びＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡを含む、ＢＣ２２ｎである。ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡが提供される（配列番号８０６）。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞内半減期を修正することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が増加し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が低減し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を低減させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして機能し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子－１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子－１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞が発現する発達的に下方制御されたタンパク質－８（ＮＥＤＤ８、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー－８（ＡＴＧ８）及び－１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜固定ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折りたたみ修飾因子－１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質－５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、マーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグ及び／またはエピトープタグであってもよい。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ－Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を特定のオルガネラ、細胞型、組織、または臓器に標的化し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をミトコンドリアに標的化し得る。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、エディタードメインなどのエフェクタードメインであってもよい。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤がその標的配列に指向されるとき、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼが、ｇＲＮＡによって標的配列に指向されるとき、エディタードメインなどのエフェクターは、標的配列を修飾するか、またはそれに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、エディタードメインなどのエフェクターは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－６（２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”，Ｃｅｌｌ １５４：４４２－５１（２０１３）を参照のこと。したがって、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、本質的に、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列に結合するように指向され得る転写因子になる。
Ｊ．ガイドＲＮＡの有効性の決定
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、送達されたとき、またはＲＮＰを形成する他の構成要素（例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）とともに発現されたときに決定される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９とともに発現される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼを既に安定に発現する細胞株に送達されるか、またはその細胞株において発現される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＰの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするｍＲＮＡとともに細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、送達されたとき、またはＲＮＰを形成する他の構成要素（例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤）とともに発現されたときに決定される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９とともに発現される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼを既に安定に発現する細胞株に送達されるか、またはその細胞株において発現される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＰの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするｍＲＮＡとともに細胞に送達される。
本明細書に記載される場合、本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの使用は、ＤＳＢ、ＳＳＢ、及び／またはＤＮＡもしくはプレ－ｍＲＮＡにおいて核酸修飾を引き起こす部位特異的結合につながる場合があり、細胞機構による修復時に挿入／欠失（インデル）変異の形態でエラーを生じ得る。インデルに起因する多くの変異は、リーディングフレームを改変するか、未成熟終止コドンを導入するか、またはエクソンスキッピングを誘導し、したがって、非機能性タンパク質を産生する。
いくつかの実施形態では、特定のガイドＲＮＡの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、Ｔ細胞株である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、Ｃａｓ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞である（ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、リンパ芽球様細胞株である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、一次ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、一次ヒトＢ細胞である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、一次ヒト末梢血リンパ球である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、一次ヒト末梢血単核細胞である。
いくつかの実施形態では、インビトロモデルにおいて欠失または挿入が起こるオフターゲット部位の数は、例えば、インビトロでＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡを分析することによって決定される。いくつかの実施形態では、そのような決定は、インビトロでＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びドナーオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することを含む。そのような決定のための例示的な手順を以下の実施例に提供する。
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの有効性は、ガイドＲＮＡ選択プロセスのための複数のインビトロ細胞モデルにわたって決定される。いくつかの実施形態では、選択されたガイドＲＮＡとのデータの細胞株比較が行われる。いくつかの実施形態では、複数の細胞モデルで交差スクリーニングを実施する。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的切断効率によって評価される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的位置、例えば、ＨＬＡ－ＡまたはＣＩＩＴＡにおける編集パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された修飾（例えば、挿入、欠失）の存在を同定することができる。インデルのパーセンテージは、次世代シークエンシング「ＮＧＳ」から計算することができる。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルの数及び／または頻度によって測定される。いくつかの実施形態では、細胞集団において、及び／または標的部位におけるインデル生成の頻度と比較して、非常に低い頻度（例えば、５％未満）で、オフターゲット部位でインデルを生成する有効なガイドＲＮＡが提供される。したがって、本開示は、標的細胞型（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞）においてオフターゲットインデル形成を示さないか、または細胞集団体において、及び／または標的部位でのインデル生成の頻度と比較して、オフターゲットインデル形成の頻度が５％未満であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞型（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）において任意のオフターゲットインデル形成を示さないガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、５個未満のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、４、３、２、または１個以下のオフターゲット部位（複数可）においてインデルを生成するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、オフターゲット部位（複数可）は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）ゲノム内のタンパク質コード領域内では発生しない。
いくつかの実施形態では、線形増幅は、標的ＤＮＡにおける挿入／欠失（「インデル」）変異、転座、及び相同組換え修復（ＨＤＲ）事象の形成等の遺伝子編集事象を検出するために使用される。例えば、固有の配列タグ化プライマーを用いた線形増幅、及びタグ化された増幅産物を単離すること（本明細書では、「ＵｎＩＴ」、または「固有識別子タグ化（Ｕｎｉｑｕｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」方法と称する）を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的細胞型内の染色体再配列の数によって測定される。Ｋｒｏｍａｔｉｄ ｄＧＨアッセイは、例えば、転座、相互転座、オフターゲット染色体への転座、欠失（すなわち、編集事象のために細胞複製サイクル中に断片が失われた染色体再配列）を含む、染色体再配列を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、標的細胞型は、１０個未満、８個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、または１個未満の染色体再配列を有する。いくつかの実施形態では、標的細胞型は、染色体再配列を有しない。
Ｋ．ｇＲＮＡ組成物の送達
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ組成物）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤の送達に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質とともに送達する。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ組成物）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤の送達に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質とともに送達する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを対象に送達するための方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰとして製剤化される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、開示されるｇＲＮＡ及びＬＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、陽イオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、または別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４の脂質及びその中に記載される参照文献を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約４．５、５．０、５．５、６．０、または６．５の陽イオン性脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ脂質の文脈において、陽イオン性及びイオン化可能という用語は、互換可能であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じて陽イオン性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、疾患または障害を治療するための医薬の調製に使用するためのＬＮＰ組成物として製剤化される。
エレクトロポレーションは、カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達のために、任意のエレクトロポレーション方法論が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、本明細書に開示されるｇＲＮＡ及びＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡのうちのいずれか１つを送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つをエクスビボで細胞に送達するための方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰとして製剤化されるか、またはＬＮＰとして製剤化されない。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ組成物は、単独で、または１つ以上のベクターにコードされて、脂質ナノ粒子に製剤化され、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、その内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ／２０１７／１７３０５４及びＷＯ２０１９／０６７９９２を参照のこと。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、及びＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等のヌクレアーゼであってもよい）をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９であってもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、さらにベクター配列を含んでいてもよく、ここで、ベクター配列は、自然状態ではｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡとともに見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
Ｌ．治療方法及び用途
本明細書に記載の操作されたヒト細胞及び組成物のうちのいずれかは、本明細書に記載されるような、様々な疾患及び障害を治療する方法において使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞（操作された細胞）及び／または遺伝子修飾細胞（操作された細胞）及び組成物の集団は、様々な疾患及び障害を治療する方法において使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または障害のうちのいずれか１つを治療する方法であって、本明細書に記載のいずれか１つ以上の組成物を投与することを含む、方法が包含される。
本明細書に記載の操作されたヒト細胞及び組成物のうちのいずれかは、本明細書に記載されるような、様々な疾患及び障害を治療する方法において使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞（操作された細胞）及び／または遺伝子修飾細胞（操作された細胞）及び組成物の集団は、様々な疾患及び障害を治療する方法において使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または障害のうちのいずれか１つを治療する方法であって、本明細書に記載のいずれか１つ以上の組成物を投与することを含む、方法が包含される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、治療薬の送達を必要とする疾患または障害を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、対象に免疫療法を提供する方法であって、有効量の本明細書に記載の操作された細胞（または操作された細胞集団）、例えば、前述の細胞の態様及び実施形態のうちのいずれかの細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、養子細胞移植療法として本明細書に記載される操作された細胞を含む組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種異系細胞である。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の操作された細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、細胞は、対象における疾患または障害の治療に有用なポリペプチド（例えば、標的化受容体）を産生、分泌、及び／または発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、可溶性ポリペプチドを産生する細胞工場として作用する。いくつかの実施形態では、細胞は、抗体を産生する細胞工場として作用する。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボでポリペプチドを継続的に分泌する。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボでの移植後、ポリペプチドを少なくとも１、２、３、４、５、または６週間継続的に分泌する。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボでの移植後、ポリペプチドを６週間超にわたって継続的に分泌する。いくつかの実施形態では、可溶性ポリペプチド（例えば、抗体）は、１日当たり少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８コピーの濃度で細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体であり、１日当たり少なくとも１０８コピーの濃度で細胞によって産生される。
方法のいくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるような有効量の操作された細胞（または操作された細胞（複数））例えば、前述の細胞の態様及び実施形態のうちのいずれかの細胞を対象に投与する前に、リンパ球枯渇剤（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または免疫抑制剤を投与することを含む。別の態様では、本発明は、操作された細胞（例えば、操作された細胞集団）を調製する方法を提供する。
免疫療法は、免疫系を活性化または抑制することによる疾患の治療である。免疫応答を誘発または増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類される。細胞ベースの免疫療法は、いくつかのがんの治療に有効であることが実証されている。リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞などの免疫エフェクター細胞、または造血幹細胞（ＨＳＣ）もしくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などのそれらの前駆細胞は、腫瘍細胞の表面上に発現された異常な抗原に応答して作用するようにプログラムすることができる。したがって、がん免疫療法は、免疫系の成分が腫瘍または他のがん細胞を破壊するのを可能にする。細胞ベースの免疫療法はまた、自己免疫疾患または移植拒絶反応の治療に有効であることが実証されている。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または間葉系幹細胞などの免疫エフェクター細胞は、正常組織の表面上に発現された自己抗原または移植抗原に応答して作用するようにプログラムすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作された細胞（例えば、操作された細胞集団）を調製する方法を提供する。操作された細胞集団は、免疫療法に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の細胞を調製する方法、例えば、細胞を調製する方法の前述の態様及び実施形態のうちのいずれかの方法によって調製される操作された細胞を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、操作された細胞を使用して、がん、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、眼科疾患、腎疾患、肝疾患、筋骨格疾患、赤血球疾患、または移植拒絶反応を治療することができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚、または脳への細胞移植において使用され得る。（例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７：２５２－２５８（２０１９）を参照。）
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種異系幹細胞療法を含む細胞療法として使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞療法は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。ｉＰＳＣは、例えば、ベータ膵島細胞、ニューロン、及び血液細胞を含む他の細胞型に分化するように誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞療法は、造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、骨、軟骨、筋肉、及び脂肪細胞に発達することができる間葉系幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、眼幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、同種異系幹細胞移植は、同種異系骨髄移植を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、誘導胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む。
本明細書に開示される操作されたヒト細胞は、例えば、さらに編集された、または修飾された遺伝子または対立遺伝子の導入によって、さらなる操作に好適である。本発明の細胞はまた、例えば、標的化受容体、例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＵｎｉＣＡＲをコードする外因性核酸の導入によって、さらなる操作に好適であり得る。ＣＡＲは、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、野生型またはバリアントＴＣＲである。
いくつかの実施形態では、細胞療法は、トランスジェニックＴ細胞療法である。いくつかの実施形態では、細胞療法は、トランスジェニックＴ細胞を標的とするウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を含む。いくつかの実施形態では、細胞療法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法などの市販のＴ細胞療法の標的化受容体をコードする標的化受容体またはドナー核酸を含む。現在、細胞療法のために承認されているいくつかの標的化受容体がある。本明細書に提供される細胞及び方法は、これらの既知の構築物とともに使用することができる。細胞療法として使用するための標的化受容体構築物を含む市販の承認された細胞製品としては、例えば、Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標）（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）、Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標）（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）、Ｔｅｃａｒｔｕｓ（商標）（ｂｒｅｘｕｃａｂｔａｇｅｎｅ ａｕｔｏｌｅｕｃｅｌ）、Ｔａｂｅｌｅｃｌｅｕｃｅｌ（Ｔａｂ－ｃｅｌ（登録商標））、Ｖｉｒａｌｙｍ－Ｍ（ＡＬＶＲ１０５）、及びＶｉｒａｌｙｍ－Ｃが挙げられる。
いくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞を対象に投与することを提供し、投与は、注射である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞を対象に投与することを提供し、投与は、血管内注射または注入である。いくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞を対象に投与することを提供し、投与は、単回投与である。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示される組成物で治療される対象の疾患に関連する徴候または症状を低減することを提供する。いくつかの実施形態では、対象は、１週間超持続する、本明細書に開示される組成物による治療に対する応答を有する。いくつかの実施形態では、対象は、２週間超持続する、本明細書に開示される組成物による治療に対する応答を有する。いくつかの実施形態では、対象は、３週間超持続する、本明細書に開示される組成物による治療に対する応答を有する。いくつかの実施形態では、対象は、１ヶ月超持続する、本明細書に開示される組成物による治療に対する応答を有する。
いくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞を対象に投与することを提供し、対象は、細胞療法によって治療される疾患に関連する徴候または症状の低減を含む、投与された細胞に対する応答を有する。いくつかの実施形態では、対象は、１週間超持続する応答を有する。いくつかの実施形態では、対象は、１ヶ月超持続する応答を有する。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１～６週間持続する応答を有する。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、決して本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：一般的な方法
１．１．次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の分析。
ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して、製造者のプロトコルに従って抽出した。
１．１．次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の分析。
ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して、製造者のプロトコルに従って抽出した。
ゲノム中の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入、欠失、及び置換の存在を同定した。目的の遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ）内の標的部位の周辺でＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。現場で標準的であるプライマー配列設計を行った。
シークエンシングのため、化学的性質を付加するために製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシークエンシングした。低品質スコアを有する読み取りを排除した後に、読み取りをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインメントした。目的の標的領域と重なり合う読み取りを、アラインメントを改善するために、局所ゲノム配列に再アラインメントした。次いで、Ｃ－Ｔ変異、Ｃ－Ａ／Ｇ変異またはインデルを含む読み取りの数に対する、野生型読み取りの数を計算した。予測されるＣａｓ９切断部位を中心とする２０ｂｐ領域において、挿入及び欠失をスコア化した。インデルパーセンテージは、２０ｂｐスコア領域内に１つ以上の塩基が挿入または欠失された配列読み取りの総数を、野生型を含むシークエンシング読み取りの総数で割ったものとして定義される。Ｃ－Ｔ変異またはＣ－Ａ／Ｇ変異を、２０ｂｐ ｓｇＲＮＡ標的配列の１０ｂｐ上流及び１０ｂｐ下流を含む４０ｂｐ領域でスコア化した。Ｃ－Ｔ編集パーセンテージは、４０ｂｐ領域内に１つまたは複数のＣ－Ｔ変異を有するシークエンシング読み取りの総数を、野生型を含むシークエンシング読み取りの総数で割ったものとして定義される。Ｃ－Ａ／Ｇ変異のパーセンテージは、同様に計算される。
１．２．Ｔ細胞培養培地の調製。
以下で使用されるＴ細胞培養培地組成物をここに記載する。「Ｘ－ＶＩＶＯベース培地」は、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地、１％ Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、５０μＭのベータ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮＡＣからなる。上述の構成要素に加えて、使用される他の可変培地構成要素は以下のとおりであった。１．血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、及び２．サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）。
以下で使用されるＴ細胞培養培地組成物をここに記載する。「Ｘ－ＶＩＶＯベース培地」は、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地、１％ Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、５０μＭのベータ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮＡＣからなる。上述の構成要素に加えて、使用される他の可変培地構成要素は以下のとおりであった。１．血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、及び２．サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）。
１．３．脂質ナノ粒子の調製。
脂質構成要素を、様々なモル比で、１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を、２５ｍＭのクエン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、およそ０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。
脂質構成要素を、様々なモル比で、１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を、２５ｍＭのクエン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、およそ０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。
脂質核酸アセンブリは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、イオン化可能な脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で含んでいた。約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１または１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、脂質核酸アセンブリを製剤化した。
クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水と衝突噴流混合することによって、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ組成物）を調製した。エタノール中の脂質を、交差混合により、２体積部のＲＮＡ溶液と混合する。第４の水の流れを、直列のティー（ｔｅｅ）を通る交差の出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照）。ＬＮＰ組成物を室温（ＲＴ）で１時間保持し、さらに水で希釈した（およそ１：１ｖ／ｖ）。ＬＮＰ組成物を、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）でタンジェンシャルフロー濾過を使用して濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用い、緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）に交換した。あるいは、ＬＮＰを、任意選択で、１００ｋＤａのアミコンスピンフィルターを使用して濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を使用して緩衝液をＴＳＳに交換した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または－８０℃で保存した。
１．４．ｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むキャップされたポリアデニル化ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。Ｔ７プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化配列を含有するプラスミドＤＮＡを、以下の条件下、ＸｂａＩと３７℃で２時間インキュベートすることによって線状化した。２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応緩衝液。ＸｂａＩを、反応物を６５℃で２０分間加熱することによって不活性化した。線状プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件下、３７℃で１．５～４時間インキュベートすることによって行った。５０ｎｇ／μＬの線状プラスミド、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々の２～５ｍＭ、１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１×反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用し、ｍＲＮＡを精製した。あるいは、ｍＲＮＡを沈殿プロトコルにより精製し、いくつかの場合では、これに続いてＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅ消化後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、ｍＲＮＡを精製する。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡについて、ＬｉＣｌ沈殿及び再構成後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照）。プールのために選択された画分を合わせ、上記の酢酸ナトリウム／エタノール沈殿によって脱塩した。さらなる代替方法において、ＬｉＣｌ沈殿法、続いてタンジェンシャルフロー濾過によるさらなる精製によって、ｍＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むキャップされたポリアデニル化ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。Ｔ７プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化配列を含有するプラスミドＤＮＡを、以下の条件下、ＸｂａＩと３７℃で２時間インキュベートすることによって線状化した。２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応緩衝液。ＸｂａＩを、反応物を６５℃で２０分間加熱することによって不活性化した。線状プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件下、３７℃で１．５～４時間インキュベートすることによって行った。５０ｎｇ／μＬの線状プラスミド、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々の２～５ｍＭ、１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１×反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用し、ｍＲＮＡを精製した。あるいは、ｍＲＮＡを沈殿プロトコルにより精製し、いくつかの場合では、これに続いてＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅ消化後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、ｍＲＮＡを精製する。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡについて、ＬｉＣｌ沈殿及び再構成後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照）。プールのために選択された画分を合わせ、上記の酢酸ナトリウム／エタノール沈殿によって脱塩した。さらなる代替方法において、ＬｉＣｌ沈殿法、続いてタンジェンシャルフロー濾過によるさらなる精製によって、ｍＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
配列番号８０１～８０３に従って、オープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡからＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを生成した（表６の配列を参照）。配列番号８０４～８０５に従って、オープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡからＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡを生成した。配列番号８０７～８０８に従って、オープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡからＵＧＩ ｍＲＮＡを生成した。配列番号８０１～８０８がＲＮＡに関して以下で言及される場合、Ｔは、Ｕ（上記のようなＮ１－メチルシュードウリジンであった）で置き換えられるべきであることが理解される。実施例で使用されるメッセンジャーＲＮＡは、５’キャップ及び３’ポリアデニル化領域、例えば、最大１００ｎｔを含み、表６の配列番号８０１～８０８によって同定される。
実施例２：Ｃａｓ９によるＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡのスクリーニング
ＨＬＡ－Ａ遺伝子の破壊のために設計された８８個のｓｇＲＮＡを、ＭＨＣ Ｉ表面タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ３の２つの対立遺伝子バージョンの喪失を評価することによって、Ｔ細胞における有効性についてスクリーニングした。ドナーのＨＬＡ－Ａ表現型は、Ａ＊０２：０１：０１Ｇ及び０３：０１：０１Ｇであった。ＨＬＡ－Ａ２及びＡ３（「％Ａ２－／Ａ３－」）の二重陰性のＴ細胞のパーセンテージを、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）及び各試験ガイドによるエレクトロポレーションによるＨＬＡ－Ａ遺伝子座での編集後のフローサイトメトリーによって決定した。一般に、別途示されない限り、「ＧＸＸＸＸＸＸ」として同定される実施例全体で使用されるガイドＲＮＡは、別途示されない限り、本明細書で提供される表に示されるものなどの１００ｎｔ修飾ｓｇＲＮＡフォーマットを指す。
ＨＬＡ－Ａ遺伝子の破壊のために設計された８８個のｓｇＲＮＡを、ＭＨＣ Ｉ表面タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ３の２つの対立遺伝子バージョンの喪失を評価することによって、Ｔ細胞における有効性についてスクリーニングした。ドナーのＨＬＡ－Ａ表現型は、Ａ＊０２：０１：０１Ｇ及び０３：０１：０１Ｇであった。ＨＬＡ－Ａ２及びＡ３（「％Ａ２－／Ａ３－」）の二重陰性のＴ細胞のパーセンテージを、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）及び各試験ガイドによるエレクトロポレーションによるＨＬＡ－Ａ遺伝子座での編集後のフローサイトメトリーによって決定した。一般に、別途示されない限り、「ＧＸＸＸＸＸＸ」として同定される実施例全体で使用されるガイドＲＮＡは、別途示されない限り、本明細書で提供される表に示されるものなどの１００ｎｔ修飾ｓｇＲＮＡフォーマットを指す。
２．１．Ｔ細胞のＲＮＰエレクトロポレーション
Ｃａｓ９編集活性は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のエレクトロポレーションを使用して評価した。解凍時に、Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０３．０１）を、５％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１１４０－０５０）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－２）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ２２４００－０８９）で構成されたＴ細胞ＲＰＭＩ培地中、０．５×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ＲＮＰトランスフェクションの前に、細胞をＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で７２時間増殖させた。
Ｃａｓ９編集活性は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のエレクトロポレーションを使用して評価した。解凍時に、Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０３．０１）を、５％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１１４０－０５０）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－２）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ２２４００－０８９）で構成されたＴ細胞ＲＰＭＩ培地中、０．５×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ＲＮＰトランスフェクションの前に、細胞をＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で７２時間増殖させた。
ＨＬＡ－Ａ標的化ｓｇＲＮＡをそれらの保管プレートから除去し、９５℃で２分間変性させた後、室温で１０分間冷却した。２０μＭのｓｇＲＮＡと１０μＭのＣａｓ９－ＮＬＳタンパク質（配列番号８００）のＲＮＰ混合物を調製し、２５℃で１０分間インキュベートした。５μＬのＲＮＰ混合物を、２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中で１００，０００個の細胞と組み合わせた。２２μＬのＲＮＰ／細胞混合物を、Ｌｏｎｚａシャトル９６ウェルエレクトロポレーションプレートの対応するウェルに移した。細胞を、製造者のパルスコードを用いて二重にエレクトロポレーションした。Ｔ細胞ＲＰＭＩ培地を、エレクトロポレーション直後に細胞に添加した。エレクトロポレーションしたＴ細胞を、その後、編集後２日で、実施例１に記載されるようにＮＧＳシークエンシングのために培養し、収集した。
２．２．フローサイトメトリー
編集後７日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって表現型決定して、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座での編集後のＨＬＡ－Ａタンパク質発現を決定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を、細胞ドナーの遺伝子型ＨＬＡ－Ａ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１７－９８７６－４２）及びＨＬＡ－Ａ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１２－５７５４－４２）に対応するＭＨＣ Ｉ表面タンパク質の２つの対立遺伝子バージョンを標的とする抗体のカクテルでインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、サイズ、形状、生存率、ならびにＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ３の発現に基づいてゲートした。表７は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座での編集後のＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ３について二重陰性細胞の平均パーセンテージを示す。
編集後７日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって表現型決定して、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座での編集後のＨＬＡ－Ａタンパク質発現を決定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を、細胞ドナーの遺伝子型ＨＬＡ－Ａ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１７－９８７６－４２）及びＨＬＡ－Ａ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１２－５７５４－４２）に対応するＭＨＣ Ｉ表面タンパク質の２つの対立遺伝子バージョンを標的とする抗体のカクテルでインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、サイズ、形状、生存率、ならびにＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ３の発現に基づいてゲートした。表７は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座での編集後のＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ３について二重陰性細胞の平均パーセンテージを示す。
実施例３：ＢＣ２２ｎ及びＣａｓ９を用いたＨＬＡ－Ａガイドのスクリーニング
ＨＬＡ－Ａ細胞表面発現の喪失を評価することによって、Ｔ細胞における有効性についてＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡをスクリーニングした。ＨＬＡ－Ａ２バックグラウンドにおいてＨＬＡ－Ａタンパク質について陰性であるＴ細胞のパーセンテージ（「％ ＨＬＡ－Ａ２－」）を、ｍＲＮＡ送達によるＨＬＡ－Ａ編集後のフローサイトメトリーによってアッセイした。
ＨＬＡ－Ａ細胞表面発現の喪失を評価することによって、Ｔ細胞における有効性についてＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡをスクリーニングした。ＨＬＡ－Ａ２バックグラウンドにおいてＨＬＡ－Ａタンパク質について陰性であるＴ細胞のパーセンテージ（「％ ＨＬＡ－Ａ２－」）を、ｍＲＮＡ送達によるＨＬＡ－Ａ編集後のフローサイトメトリーによってアッセイした。
３．１．Ｔ細胞のｍＲＮＡエレクトロポレーション
Ｃａｓ９及びＢＣ２２ｎ編集活性は、以下に提供されるように、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）、ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０６）、またはＵＧＩをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０７）のエレクトロポレーションを使用して評価した。解凍時に、Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０２．０１）を、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１））、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、１×ペニシリン－ストレプトマイシンを補充し、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２０００－１５）をさらに補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）で構成されたＴＣＧＭ中に１×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ｍＲＮＡエレクトロポレーションの前に、Ｔ細胞ＲＰＭＩ培地中３７℃で７２時間、細胞を増殖した。
Ｃａｓ９及びＢＣ２２ｎ編集活性は、以下に提供されるように、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）、ＢＣ２２ｎをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０６）、またはＵＧＩをコードするｍＲＮＡ（配列番号８０７）のエレクトロポレーションを使用して評価した。解凍時に、Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０２．０１）を、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１））、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、１×ペニシリン－ストレプトマイシンを補充し、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２０００－１５）をさらに補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）で構成されたＴＣＧＭ中に１×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ｍＲＮＡエレクトロポレーションの前に、Ｔ細胞ＲＰＭＩ培地中３７℃で７２時間、細胞を増殖した。
ＨＬＡ－Ａ ｓｇＲＮＡを、それらの保管プレートから取り出し、９５℃で２分間変性させた後、室温で５分間インキュベートした。ＢＣ２２ｎエレクトロポレーション混合物を、Ｐ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中の１００，０００個のＴ細胞、ＵＧＩをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡ、ＢＣ２２ｎをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡ、及び２０ｐｍｏｌｅのｓｇＲＮＡで調製した。Ｃａｓ９エレクトロポレーション混合物を、Ｐ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中の１００，０００個のＴ細胞、ＵＧＩをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡ、Ｃａｓ９をコードする２００ｎｇのｍＲＮＡ、及び２０ｐｍｏｌｅのｓｇＲＮＡで調製した。各混合物を、Ｌｏｎｚａシャトル９６ウェルエレクトロポレーションプレートの対応するウェルに移した。細胞を、製造者のパルスコードを使用し、Ｌｏｎｚａシャトル９６ｗを使用して、二重にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後、細胞を、サイトカインを含まない事前加温したＴＣＧＭ中で回収し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、エレクトロポレーションしたＴ細胞を、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）をさらに補充したＴＣＧＭ中で培養し、編集後８日でフローサイトメトリーのために収集した。
３．２．フローサイトメトリー
編集後８日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって表現型決定して、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現を決定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ａ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１７－９８７６－４２）を標的化する抗体でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、サイズ、形状、生存率、及びＨＬＡ－Ａ２発現に基づいてゲートした。表８は、ＢＣ２２ｎまたはＣａｓ９によるＨＬＡ－Ａのゲノム編集後のＨＬＡ－Ａ表面タンパク質について陰性の細胞のパーセンテージを示す。
編集後８日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって表現型決定して、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現を決定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ａ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１７－９８７６－４２）を標的化する抗体でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、サイズ、形状、生存率、及びＨＬＡ－Ａ２発現に基づいてゲートした。表８は、ＢＣ２２ｎまたはＣａｓ９によるＨＬＡ－Ａのゲノム編集後のＨＬＡ－Ａ表面タンパク質について陰性の細胞のパーセンテージを示す。
実施例４：ＮＫ細胞機能殺傷アッセイ
ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、またはＢ２Ｍを破壊するか、またはＨＬＡ－Ｅを過剰発現するために様々な組み合わせで編集されたＴ細胞を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介殺傷に抵抗する能力について試験した。
ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、またはＢ２Ｍを破壊するか、またはＨＬＡ－Ｅを過剰発現するために様々な組み合わせで編集されたＴ細胞を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介殺傷に抵抗する能力について試験した。
４．１．Ｔ細胞の操作及び精製
解凍時に、Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０３．０１）を、５％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１１４０－０５０）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ２２４００－０８９）で構成されたＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で、０．５×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。
解凍時に、Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、ＨＬＡ－Ａ＊０２．０１／Ａ＊０３．０１）を、５％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１１１４０－０５０）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ２２４００－０８９）で構成されたＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で、０．５×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。
表９に記載されるように、活性化の１日後に、Ｔ細胞を編集してＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。簡潔に述べると、Ｂ２Ｍを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０００５２９（配列番号２４５）を含有するＬＮＰ組成物を、実施例１に記載されるように製剤化した。ＬＮＰ組成物を、１ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を補充した上記のサイトカインを含むＲＰＭＩベースの培地中、３７℃で１５分間インキュベートした。ＬＮＰ混合物を２００万個の活性化Ｔ細胞に添加して、２．５ｕｇ総ＬＮＰ／ｍＬの最終濃度を得た。
活性化の２日後、追加のＴ細胞をＬＮＰ組成物で編集して、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊した。これを、ＣＩＩＴＡを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１３６７５（配列番号２４６）を含有するＬＮＰ組成物を使用して、Ｂ２Ｍ編集について説明したように実施した。このステップで使用されるＬＮＰ組成物は、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５モル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。
活性化の３日後、全ての編集細胞及び非編集細胞を、ＴｒａｎｓＡｃｔを含まない新鮮な培地に再懸濁した。Ｂ２Ｍ編集Ｔ細胞試料を、１０のＭＯＩでＥＦ１ａプロモーター（配列番号１０００）からＨＬＡ－Ｅを発現するレンチウイルスを用いて、１０００ｇで３７℃で１時間遠心分離することによって形質導入した。ＣＩＩＴＡ編集Ｔ細胞試料を、ＬＮＰ組成物でさらに編集して、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を破壊した。脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧをそれぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した、ＨＬＡ－Ａを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１９０００を含有するＬＮＰ組成物を使用して、上記のＢ２Ｍ編集のために記載されるように編集を行った。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。活性化の４日後、全ての細胞を増殖のためにＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ８０２４０Ｍ）に移した。
活性化の７日後、ＨＬＡ－Ｅ感染Ｔ細胞を、製造者のプロトコルに従って、ビオチン化抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９０－４８５）、ならびに磁気ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０４２－４０１）を使用して、ＨＬＡ－Ｅ発現のために選択した。
同様に、活性化の９日後、ＣＩＩＴＡ編集Ｔ細胞を、製造者のプロトコルに従って、ビオチン化抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１０４－８２３）、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ１３０－０９０－４８５）、及び磁気ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ１３０－０４２－４０１）を使用して、ＭＨＣ ＩＩ発現の欠如のために陰性選択した。
４．２フローサイトメトリー
操作されたＴ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性をアッセイした。このため、Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｂ／ＣマッチしたＣＴＶ標識ＮＫとともに、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１及び０．６２５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で２１時間共培養した。細胞を７ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ５５９９２５）で染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、ＣＴＶ陰性度、サイズ、ならびに形状及び生存能に基づいてゲートした。表１０及び図２は、ＮＫ細胞チャレンジ後のＴ細胞溶解のパーセンテージを示す。
操作されたＴ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性をアッセイした。このため、Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｂ／ＣマッチしたＣＴＶ標識ＮＫとともに、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１及び０．６２５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で２１時間共培養した。細胞を７ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ５５９９２５）で染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、ＣＴＶ陰性度、サイズ、ならびに形状及び生存能に基づいてゲートした。表１０及び図２は、ＮＫ細胞チャレンジ後のＴ細胞溶解のパーセンテージを示す。
実施例５：上位ＨＬＡ－ＡガイドのＬＮＰ用量応答曲線
５．１ Ｔ細胞調製
ロイコパック（Ｈｅｍａｃａｒｅ）から単離された凍結保存されたＣＤ８／ＣＤ４＋選択されたＴ細胞を解凍し、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）で構成されたＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に１．５×１０＾６細胞／ｍｌで一晩静置した。
５．１ Ｔ細胞調製
ロイコパック（Ｈｅｍａｃａｒｅ）から単離された凍結保存されたＣＤ８／ＣＤ４＋選択されたＴ細胞を解凍し、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）で構成されたＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に１．５×１０＾６細胞／ｍｌで一晩静置した。
Ｔ細胞を、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１１１－１６０）を使用して１：５０の希釈で活性化し、３７℃のインキュベーター内で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＶｉ細胞上でカウントし、上記のように、ただし、最終濃度が０．５×１０＾６細胞／ｍｌになるように２．５％の血清でＴＣＧＭ中に再懸濁した。２４時間後、細胞をＶｉ細胞上でカウントし、５％血清ＴＣＧＭ中に再懸濁し、９６ウェルプレートに移した。一方、ＡＰＯＥ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を、無血清ＴＣＧＭに、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、滴定ＬＮＰ総ＲＮＡ濃度（１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌ、０．１５６２５μｇ／ｍｌ、及び０．０７８１２５μｇ／ｍｌ）で１５分間、異なるＨＬＡ－Ａ ＬＮＰ組成物（表１１を参照）でインキュベートした。ＬＮＰ組成物は、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）、及び表１１に指定されるガイドを含み、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとそれぞれ５０：３９．５：９：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。ＡＰＯＥでのインキュベーション後、ＬＮＰ懸濁液をＴ細胞に１：１の比で添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞をＶｉ細胞上でカウントし、１：５の比で分割し、９６時間培養した。インキュベーション後、０．１～０．５×１０＾６細胞のアリコートを、フローサイトメトリー分析のために採取した。
５．２フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析のために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗浄し、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）、３４３３０８）及びＰＣ５．５コンジュゲートＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）、カタログ３１７３３６）とともに、１：２００の希釈、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏｆｌｅｘＳを使用して処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。表１２及び図１Ａ～１Ｂは、各ＬＮＰ用量での編集パーセントを示す。
フローサイトメトリー分析のために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗浄し、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）、３４３３０８）及びＰＣ５．５コンジュゲートＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）、カタログ３１７３３６）とともに、１：２００の希釈、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏｆｌｅｘＳを使用して処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。表１２及び図１Ａ～１Ｂは、各ＬＮＰ用量での編集パーセントを示す。
実施例６：連続したＬＮＰ送達を伴う多重編集ＷＴ１ Ｔ細胞
Ｔ細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健常なドナー細胞を、４つのＬＮＰ組成物で順次に処理し、各ＬＮＰは、ＴＲＡＣ（Ｇ０１３００６）（配列番号２４３）、ＴＲＢＣ（Ｇ０１６２３９）（配列番号２４７）、ＣＩＩＴＡ（Ｇ０１３６７６）（配列番号２４８）、またはＨＬＡ－Ａ（Ｇ０１８９９５）のいずれかを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ（表２に示されるように、配列番号１３を含むｓｇＲＮＡ）と共配合された。ＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１ ＴＣＲ）を標的とするトランスジェニックＴ細胞受容体（配列番号１００１）を、ＡＡＶを使用して相同組換え修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に組み込んだ。
Ｔ細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健常なドナー細胞を、４つのＬＮＰ組成物で順次に処理し、各ＬＮＰは、ＴＲＡＣ（Ｇ０１３００６）（配列番号２４３）、ＴＲＢＣ（Ｇ０１６２３９）（配列番号２４７）、ＣＩＩＴＡ（Ｇ０１３６７６）（配列番号２４８）、またはＨＬＡ－Ａ（Ｇ０１８９９５）のいずれかを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ（表２に示されるように、配列番号１３を含むｓｇＲＮＡ）と共配合された。ＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１ ＴＣＲ）を標的とするトランスジェニックＴ細胞受容体（配列番号１００１）を、ＡＡＶを使用して相同組換え修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に組み込んだ。
６．１．Ｔ細胞調製
Ｔ細胞を、３名の健常なＨＬＡ－Ａ２＋ドナーの白血球アフェレーシス産物（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離した。Ｔ細胞を、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、Ｔ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ）：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）（２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を補充した）中で一晩静置した。
Ｔ細胞を、３名の健常なＨＬＡ－Ａ２＋ドナーの白血球アフェレーシス産物（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離した。Ｔ細胞を、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、Ｔ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ）：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）（２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を補充した）中で一晩静置した。
６．２．ＬＮＰ処理及びＴ細胞の増殖
ＬＮＰ組成物を、各日にＡｐｏＥ含有培地中で調製し、表１３及び以下に記載されるように、Ｔ細胞に送達した。
ＬＮＰ組成物を、各日にＡｐｏＥ含有培地中で調製し、表１３及び以下に記載されるように、Ｔ細胞に送達した。
１日目に、表１３に示されるＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１１１－１６０）の１：５０希釈で、ＴＣＡＭ中に２×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
１日目に、表１３に示されるＬＮＰ組成物を、２０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で２５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１：１０の比で適切な培養物に添加した。
３日目に、ＴＲＡＣ－ＬＮＰ組成物を、１０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中でプレーティングした。次いで、ＷＴ１ ＡＡＶを、３×１０＾５ゲノムコピー／細胞のＭＯＩで各群に添加した。
４日目に、表１３に示されるＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１：１の比で適切な培養物に添加した。
５～１１日目に、Ｔ細胞を、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ）：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）（５％ ＣＴＳ免疫細胞血清置換（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ２５９６１０１）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及びＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を補充した）中で２４ウェルＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ８０１９２）に移した。製造者のプロトコルに従って、細胞を増殖させた。Ｔ細胞を６日間増殖させ、培地を１日おきに交換した。細胞を、Ｖｉ－ＣＥＬＬ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントし、表１４に示されるように、細胞収率を出発物質で割ることによって増殖倍率を計算した。
６．３．フローサイトメトリー及びＮＧＳによるＴ細胞編集の定量化
増殖後、編集されたＴ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＨＬＡ－Ａ２発現（ＨＬＡ－Ａ＋）、ノックダウンＣＩＩＴＡ後のＨＬＡ－ＤＲ－ＤＰ－ＤＱ発現（ＭＨＣ ＩＩ＋）、ＷＴ１－ＴＣＲ発現（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残留内因性ＴＣＲの発現（ＣＤ３＋Ｖｂ８－）または誤対合ＴＣＲ（ＣＤ３＋Ｖｂ８ｌｏｗ）の発現を決定した。Ｔ細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとともにインキュベートした。ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００５２４）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０１０４５）、Ｖｂ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４８１０６）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００３２７）、ＨＬＡ－Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４３３０６）、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３６１７０６）、ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４８４４）、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４２３０）。その後、細胞を洗浄し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。Ｔ細胞を、編集マーカー及び挿入マーカーの発現が決定される前に、サイズ及びＣＤ４／ＣＤ８状態でゲートした。連続Ｔ細胞操作後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋Ｔ細胞については表１５及び図３Ａ～Ｆに、ＣＤ４＋Ｔ細胞については表１６及び図４Ａ～Ｆに示す。完全に編集されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、％ＣＤ３＋Ｖｂ８＋ＨＬＡ－Ａ－ＭＨＣ ＩＩ－としてゲートした。高レベルのＨＬＡ－Ａ及びＭＨＣ ＩＩノックダウン、ならびにＷＴ１－ＴＣＲ挿入及び内因性ＴＣＲ ＫＯが、編集された試料中で観察される。フローサイトメトリー分析に加えて、実施例１に記載されるようにゲノムＤＮＡを調製し、ＮＧＳ分析を実施して、各標的部位における編集速度を決定した。表１７及び図５Ａ～Ｄは、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及びＴＲＢＣ１／２遺伝子座での編集パーセントの結果を示し、フローサイトメトリーによって同定されたものと一致する群全体のパターンを示す。ＴＲＢＣ１／２遺伝子座を、全ての群において＞９０～９５％に編集した。
増殖後、編集されたＴ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＨＬＡ－Ａ２発現（ＨＬＡ－Ａ＋）、ノックダウンＣＩＩＴＡ後のＨＬＡ－ＤＲ－ＤＰ－ＤＱ発現（ＭＨＣ ＩＩ＋）、ＷＴ１－ＴＣＲ発現（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残留内因性ＴＣＲの発現（ＣＤ３＋Ｖｂ８－）または誤対合ＴＣＲ（ＣＤ３＋Ｖｂ８ｌｏｗ）の発現を決定した。Ｔ細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとともにインキュベートした。ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００５２４）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０１０４５）、Ｖｂ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４８１０６）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００３２７）、ＨＬＡ－Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４３３０６）、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３６１７０６）、ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４８４４）、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４２３０）。その後、細胞を洗浄し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。Ｔ細胞を、編集マーカー及び挿入マーカーの発現が決定される前に、サイズ及びＣＤ４／ＣＤ８状態でゲートした。連続Ｔ細胞操作後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋Ｔ細胞については表１５及び図３Ａ～Ｆに、ＣＤ４＋Ｔ細胞については表１６及び図４Ａ～Ｆに示す。完全に編集されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを、％ＣＤ３＋Ｖｂ８＋ＨＬＡ－Ａ－ＭＨＣ ＩＩ－としてゲートした。高レベルのＨＬＡ－Ａ及びＭＨＣ ＩＩノックダウン、ならびにＷＴ１－ＴＣＲ挿入及び内因性ＴＣＲ ＫＯが、編集された試料中で観察される。フローサイトメトリー分析に加えて、実施例１に記載されるようにゲノムＤＮＡを調製し、ＮＧＳ分析を実施して、各標的部位における編集速度を決定した。表１７及び図５Ａ～Ｄは、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及びＴＲＢＣ１／２遺伝子座での編集パーセントの結果を示し、フローサイトメトリーによって同定されたものと一致する群全体のパターンを示す。ＴＲＢＣ１／２遺伝子座を、全ての群において＞９０～９５％に編集した。
実施例７：ＨＬＡ－Ａヒトガイドのオフターゲット分析
ＨＬＡ－Ａを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位のスクリーニングを実施した。（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００－６０６；２０１７を参照）。この実験では、既知のオフターゲットプロファイルを有するヒトＨＬＡ－Ａを標的とする１０個のｓｇＲＮＡ、ならびにＥＭＸ１、ＶＥＧＦＡ、及びＲＡＧ１Ｂを標的とする３つの対照ガイドを、リンパ芽球細胞株ＮＡ２４３８５（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）由来の精製ゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングした。潜在的なオフターゲット部位の数は、生化学アッセイにおいて１９２ｎＭのｓｇＲＮＡ及び６４ｎＭのＲＮＰの濃度で、表１８に示されるｓｇＲＮＡを使用して検出した。このアッセイは、試験したｓｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
ＨＬＡ－Ａを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位のスクリーニングを実施した。（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００－６０６；２０１７を参照）。この実験では、既知のオフターゲットプロファイルを有するヒトＨＬＡ－Ａを標的とする１０個のｓｇＲＮＡ、ならびにＥＭＸ１、ＶＥＧＦＡ、及びＲＡＧ１Ｂを標的とする３つの対照ガイドを、リンパ芽球細胞株ＮＡ２４３８５（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）由来の精製ゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングした。潜在的なオフターゲット部位の数は、生化学アッセイにおいて１９２ｎＭのｓｇＲＮＡ及び６４ｎＭのＲＮＰの濃度で、表１８に示されるｓｇＲＮＡを使用して検出した。このアッセイは、試験したｓｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
上で使用される生化学的方法などの既知のオフターゲット検出アッセイでは、多数の潜在的なオフターゲット部位が、典型的には、設計によって回収され、他の状況、例えば目的の一次細胞において検証することができる潜在的な部位に対して「ワイドネットをキャストする」ようにする。例えば、この生化学的方法は、典型的には、このアッセイが細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、使用されるＣａｓ９ ＲＮＰの用量に依存するため、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、これらの方法によって特定された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的シークエンシングを使用して検証され得る。
実施例８：ＮＫ細胞インビボ殺傷マウスモデルにおけるＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡの部分マッチング
雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに１．５×１０＾６の一次ＮＫ細胞を移植した後、４週間後にルシフェラーゼ＋／－ＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ、またはＨＬＡ－Ａ／ＣＩＩＴＡ ＫＯを含有する操作されたＴ細胞を注射して、１）移植されたＮＫ細胞が対照Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ－／－）を容易に溶解できるかどうか、及び２）部分マッチング編集（ＨＬＡ－ＡまたはＣＩＩＴＡ）の追加がインビボでのＮＫ細胞溶解からのＴ細胞に対する保護効果をもたらすかどうかを判定した。
雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに１．５×１０＾６の一次ＮＫ細胞を移植した後、４週間後にルシフェラーゼ＋／－ＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ、またはＨＬＡ－Ａ／ＣＩＩＴＡ ＫＯを含有する操作されたＴ細胞を注射して、１）移植されたＮＫ細胞が対照Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ－／－）を容易に溶解できるかどうか、及び２）部分マッチング編集（ＨＬＡ－ＡまたはＣＩＩＴＡ）の追加がインビボでのＮＫ細胞溶解からのＴ細胞に対する保護効果をもたらすかどうかを判定した。
８．１．ルシフェラーゼ＋／－ＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ、またはＨＬＡ－Ａ／ＣＩＩＴＡ ＫＯを含有するＴ細胞の調製
Ｔ細胞を、以下のＭＨＣ Ｉ表現型を有する健常なヒトドナーの末梢血から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２：０１Ｇ。簡潔に述べると、白血球アフェレーシスパック（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塩化アンモニウムＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７８００）中で１５分間処理して、赤血球を溶解した。溶解後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）カウントを決定し、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して、Ｔ細胞単離を行った。単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
Ｔ細胞を、以下のＭＨＣ Ｉ表現型を有する健常なヒトドナーの末梢血から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２：０１Ｇ。簡潔に述べると、白血球アフェレーシスパック（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塩化アンモニウムＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７８００）中で１５分間処理して、赤血球を溶解した。溶解後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）カウントを決定し、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して、Ｔ細胞単離を行った。単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
凍結Ｔ細胞を、１×１０＾６細胞／ｍｌの細胞濃度で、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）がさらに補充された、実施例３に記載されるＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭで構成されたＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）に解凍した。細胞を、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ１３０－１１１－１６０）を使用して、１：１００の希釈で３７℃で２４時間活性化した。
活性化の２４時間後、サイトカインを含まない５００μｌの新鮮なＴＣＧＭ中の１×１０＾６個のＴ細胞を、１５０μｌのルシフェラーゼレンチウイルス（Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＬＶ０５０Ｌ）を用いて、１０００ｘＧで３７℃で６０分間の遠心分離によって形質導入した。形質導入細胞を、サイトカインを含むＴＣＧＭ中、２４ウェルのＧ－Ｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ８０１９２Ｍ）において、３７℃で２４時間増殖させた。
活性化から４８時間後、ルシフェラーゼＬＶ感染Ｔ細胞を編集して、Ｂ２ＭまたはＨＬＡ－Ａ遺伝子を破壊した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－Ａを標的とする、ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１９０００（配列番号１８）を含有するＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。Ｂ２Ｍを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０００５２９（配列番号２４５）を含有するＬＮＰ組成物を、実施例１に記載されるように製剤化した。ＬＮＰ組成物を、１ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）をさらに補充した、血清またはサイトカインを含まないＯｐｔｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭ中で、３７℃で１５分間インキュベートした。Ｔ細胞を洗浄し、サイトカインを含むＴＣＧＭ中に懸濁した。事前にインキュベートされたＬＮＰ及びＴ細胞を混合して、５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＧＭ中の最終濃度０．５×１０＾６Ｔ細胞／ｍｌ及び２．５μｇ総ＲＮＡ／ｍＬのＬＮＰを得た。追加の細胞群を、ＡｐｏＥ３を含有するがＬＮＰ組成物を含まない培地で模擬編集した。全ての細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
活性化の７２時間後、細胞を編集してＣＩＩＴＡを破壊し、ＬＮＰをルシフェラーゼ及びＨＬＡ－Ａ編集細胞またはルシフェラーゼ細胞単独のいずれかに投与した。簡潔に述べると、細胞を、ＨＬＡ－Ａ編集について記載されているように、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１３６７５（配列番号２４６）を含有するＬＮＰ組成物を用いて形質導入した。ＣＩＩＴＡを標的とするＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。活性化の９６時間後、細胞を洗浄し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘに移した。新鮮なサイトカインを含む培地を、２日ごとに交換した。活性化後１５日目に、編集されたＴ細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローソーターを使用してＧＦＰ＋細胞で選別して、ルシフェラーゼ発現細胞を濃縮した。Ｂ２Ｍ ＫＯルシフェラーゼ群について、細胞をＧＦＰ＋及びＭＨＣ－Ｉ－で選別した。選別した細胞を、３７℃のインキュベーター中のサイトカインを含むＴＣＧＭ培地中で一晩静置した。翌日、Ｔ細胞を、Ｔ細胞ＴｒａｓｎＡｃｔ（商標）により１：１００希釈で２４時間再刺激した。再刺激の２４時間後、ＴｒａｎｓＡｃｔを洗浄し、Ｔ細胞を培養し、Ｇ－Ｒｅｘプレート中で１５日間維持し、培地及びサイトカインを定期的に交換した。
再刺激の１５日後、操作されたＴ細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を、以下を例外として除いて、実施例４のようにインビトロでアッセイした。アッセイは、１００μｌ／ｍｌのＩＬ－２を有するＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭを使用して実施した。Ｔ細胞を、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、及び０．６２５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で、ＨＬＡ－Ｂ／ＣマッチしたＣＴＶ標識ＮＫ細胞とともに一晩共培養した。細胞をＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログＥ２６２０）でインキュベートし、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏプログラムで処理して、ルシフェラーゼシグナルに基づいてＮＫ細胞によるＴ細胞の溶解を決定した。表１９及び図６Ａは、ＮＫ細胞チャレンジ後のＴ細胞溶解のパーセンテージを示す。インビトロでは、Ｂ２Ｍ編集細胞はＮＫ殺傷に感受性を示し、一方ＨＬＡ－Ａ編集、ＣＩＩＴＡ編集及びＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ二重編集細胞は、ＮＫ媒介性溶解からの保護を示した。
８．２．ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡダブルノックアウトＴ細胞は、ＮＫ殺傷から保護される
インビボ研究のために、当該技術分野において既知の方法によってロイコパックから単離されたＮＫ細胞を、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０９２）で洗浄し、注射のために１５０μＬのＨＢＳＳ中に１０×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁した。２２匹の雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、１．５×１０＾６個の単離されたＮＫ細胞を尾静脈注射することによって投与した。追加の２７匹の雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５を、ＮＫ非注射対照とした。
インビボ研究のために、当該技術分野において既知の方法によってロイコパックから単離されたＮＫ細胞を、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０９２）で洗浄し、注射のために１５０μＬのＨＢＳＳ中に１０×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁した。２２匹の雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、１．５×１０＾６個の単離されたＮＫ細胞を尾静脈注射することによって投与した。追加の２７匹の雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５を、ＮＫ非注射対照とした。
ＮＫ細胞注射の２８日後、マウスに、表１９に記載の非編集または操作されたＴ細胞を注射した。簡潔に述べると、操作されたＴ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、６×１０＾６細胞／１５０μＬの濃度でＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した後、第２の活性化の１６日後に注射した。
生きたマウスのＩＶＩＳイメージングを実施して、ＩＶＩＳスペクトルによってルシフェラーゼ陽性Ｔ細胞を同定した。Ｔ細胞注射の６時間、２４時間、４８時間、８日、１３日、１８日、及び２７日後に、ＩＶＩＳイメージングを行った。製造者の推奨に従って、体重１ｇ当たり１０μＬ、１匹当たり約１５０μＬのＤ－ルシフェリンｉ．ｐ．注射を用いて、イメージングのためにマウスを調製した。動物を麻酔し、次いでＩＶＩＳイメージングユニットに配置した。オートに設定された露光時間、視野Ｄ、媒体ビニング、及び１に設定したＦ／ｓｔｏｐを用いて、可視化を実施した。表２０及び図６Ａは、注射後の様々な時点に存在するルシフェラーゼ発現Ｔ細胞からの輝度（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｂは、２７日後の様々なマウス群に存在するルシフェラーゼ発現Ｔ細胞からの輝度（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。インビボでは、Ｂ２Ｍ編集細胞は、ＮＫ殺傷に対する感受性を示し、ＨＬＡ－Ａ編集、ＣＩＩＴＡ編集、及びＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ二重編集細胞は、ＮＫ媒介性溶解からの保護を示した。予想外に、３つの高度に多型なＭＨＣクラスＩタンパク質（ＨＬＡ－Ａ）のうちの１つの低減後でさえ、細胞は、ＮＫ媒介性拒絶に対して保護される。
実施例９：ＮＫ細胞インビボ殺傷マウスモデルにおけるＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡの部分マッチング
雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに１．５×１０＾６の一次ＮＫ細胞を移植した後、４週間後にＨＤ１ ＴＣＲでルシフェラーゼ＋／－ＨＬＡ－Ａ／ＣＩＩＴＡ ＫＯを含有する操作されたＴ細胞を注射して、１）移植されたＮＫ細胞が対照Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ－／－）を容易に溶解できるかどうか、及び２）部分マッチング編集（ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ）の添加がインビボでのＮＫ細胞溶解からの外因性ＨＤ１ ＴＣＲでＴ細胞に対する保護効果を提供するかどうかを判定した。
雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに１．５×１０＾６の一次ＮＫ細胞を移植した後、４週間後にＨＤ１ ＴＣＲでルシフェラーゼ＋／－ＨＬＡ－Ａ／ＣＩＩＴＡ ＫＯを含有する操作されたＴ細胞を注射して、１）移植されたＮＫ細胞が対照Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ－／－）を容易に溶解できるかどうか、及び２）部分マッチング編集（ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ）の添加がインビボでのＮＫ細胞溶解からの外因性ＨＤ１ ＴＣＲでＴ細胞に対する保護効果を提供するかどうかを判定した。
９．１．ルシフェラーゼ＋／－ＨＬＡ－Ａ／ＣＩＩＴＡ ＫＯ及びＨＤ１ ＴＣＲを含有するＴ細胞の調製
Ｔ細胞を、以下のＭＨＣ Ｉ表現型を有する健常なヒトドナーの末梢血から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２：０１Ｇ。簡潔に述べると、白血球アフェレーシスパック（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塩化アンモニウム赤血球溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７８００）中で１５分間処理して、赤血球を溶解した。溶解後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）カウントを決定し、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して、Ｔ細胞単離を実施した。単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
Ｔ細胞を、以下のＭＨＣ Ｉ表現型を有する健常なヒトドナーの末梢血から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２：０１Ｇ。簡潔に述べると、白血球アフェレーシスパック（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塩化アンモニウム赤血球溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７８００）中で１５分間処理して、赤血球を溶解した。溶解後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）カウントを決定し、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して、Ｔ細胞単離を実施した。単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
凍結Ｔ細胞を、実施例３に記載されるように、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）をさらに補充した、ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭで構成されたＴ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ）に、１．５×１０＾６細胞／ｍｌの細胞濃度で解凍した。細胞を３７℃で２４時間静置した。
解凍の２４時間後、Ｔ細胞をカウントし、ＴＣＡＭ培地中で２×１０＾６細胞／ｍｌで再懸濁し、１：５０のＴｒａｎｓａｃｔを添加した。細胞を混合し、３７℃で２０～３０分間インキュベートした。ＣＩＩＴＡを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１３６７５（配列番号２４６）を含有するＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。５ｕｇ／ｍｌのＬＮＰ組成物をＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＡＭ中でインキュベートし、５ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を３７℃で１５分間さらに補充した。事前にインキュベートされたＬＮＰ組成物、及びＴｒａｎｓａｃｔを含むＴ細胞を混合して、２．５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＡＭ培地中の最終濃度１×１０＾６Ｔ細胞／ｍｌ及び２．５μｇ総ＲＮＡ／ｍＬのＬＮＰを得た。追加の細胞群を、ＡｐｏＥ３を含有するがＬＮＰ組成物を含まない培地で模擬編集した。全ての細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
活性化の４８時間後、全ての群をＥＦ１α－ＧＦＰ－Ｌｕｃレンチウイルスで形質導入した。レンチウイルスを－８０℃から除去し、氷上で解凍した。細胞を群ごとに収集し、５００Ｘｇで５分間遠心分離して、ＬＮＰ組成物及び培地を洗い流した。ＴＣＡＭ培地中２×１０＾６細胞／ｍｌで、群に応じて個々に細胞を再懸濁した。次いで、５００ｕｌの細胞懸濁液を滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（合計１×１０＾６細胞）に移し、１００ｕｌのレンチウイルスを添加した。細胞を、１０００ＸＧで３７℃で６０分間遠心分離した。遠心分離後、細胞をそれらの群に従って合わせ、最終濃度２．５％のヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含有する１×１０＾６細胞／ｍｌのＴＣＡＭ培地で再懸濁し、続いて３７℃で２４時間インキュベートした。
活性化の７２時間後、ルシフェラーゼ形質導入Ｔ細胞をＬＮＰ組成物で処理してＴＲＡＣ遺伝子を破壊し、さらにＨＤ１ ＡＡＶで処理してＴＲＡＣ遺伝子座にＨＤ１ ＴＣＲを挿入した。細胞を群ごとに収集し、５００Ｘｇで５分間遠心分離して、レンチウイルス及び培地を洗い流した。次いで、細胞をＴＣＡＭ培地中１×１０＾６細胞／ｍｌでＴＣＡＭ培地中に再懸濁した。ＴＲＡＣを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１３００６（配列番号２４３）を含有するＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。５ｕｇ／ｍｌのＬＮＰ組成物をＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＡＭ中でインキュベートし、５ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を３７℃で１５分間さらに補充した。事前にインキュベートされたＬＮＰ組成物及びＴｒａｎｓａｃｔを含むＴ細胞を混合して、２．５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＡＭ中の最終濃度１×１０＾６Ｔ細胞／ｍｌ及び２．５μｇ総ＲＮＡ／ｍＬのＬＮＰを得た。ＥＦ１α－ＨＤ１ ＡＡＶのバイアルをベンチトップ上で解凍し、ＴＲＡＣ ＬＮＰ処理細胞に３×１０＾５ＧＣ／細胞で添加した。次いで、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
次いで、活性化の９６時間後の細胞を、ＴＲＢＣ ＬＮＰ単独またはＨＬＡ－Ａ ＬＮＰとの組み合わせのいずれかで最終の編集ラウンドのために処理した。Ｂ２Ｍ ＫＯ群を、Ｂ２Ｍ ＬＮＰで処理した。細胞を群ごとに収集し、５００Ｘｇで５分間遠心分離して、ＬＮＰ組成物及び培地を洗い流した。次いで、細胞をＴＣＡＭ培地中１×１０＾６細胞／ｍｌでＴＣＡＭ培地中に再懸濁した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－Ａを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１８９９５（表２に示されるような、配列番号１３を含むｓｇＲＮＡ）を含有するＬＮＰ組成物を、実施例１に記載されるように製剤化した。Ｂ２Ｍを標的とする、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０００５２９（配列番号２４５）を含有するＬＮＰ組成物、ならびにＴＲＢＣを標的とする、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１６２３９（配列番号２４７）を含有するＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。５ｕｇ／ｍｌのＬＮＰ組成物をＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＡＭ中でインキュベートし、５ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を３７℃で１５分間さらに補充した。事前にインキュベートされたＬＮＰ組成物及びＴｒａｎｓａｃｔを含むＴ細胞を混合して、２．５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＡＭ中の最終濃度１×１０＾６Ｔ細胞／ｍｌ及び２．５μｇ総ＲＮＡ／ｍＬのＬＮＰを得た。同時ＴＲＢＣ及びＨＬＡ－Ａ編集のために、ＬＮＰ及びＡｐｏＥ３を、最終濃度の４倍で配合し、続いて、ＴＲＢＣ ＬＮＰを最初にＴ細胞に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、事前に配合されたＨＬＡ－Ａ ＬＮＰ組成物を添加し、細胞を２４時間インキュベートした。
最終の編集ラウンド後、細胞を５００ＸＧで５分間回転させることによって洗浄し、５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＧＭ培地中に再懸濁した。
活性化後５日目に、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｌｏｗソーターを使用して、編集されたＴ細胞をＧＦＰ＋細胞で選別して、ルシフェラーゼ発現細胞を濃縮した。選別した細胞を、３７℃のインキュベーター中のサイトカインを含むＴＣＧＭ培地中で一晩静置した。翌日、Ｔ細胞を、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）により１：１００希釈で２４時間再刺激した。再刺激の２４時間後、ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を洗い流し、Ｔ細胞を培養し、Ｇ－Ｒｅｘプレート中で１５日間維持し、培地及びサイトカインを定期的に交換した。
最初の再刺激の１５日後、編集レベルをフローサイトメトリーにより確認し、細胞を洗浄し、注射のためにＨＢＳＳ緩衝液中に再懸濁した。
９．２．ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡダブルノックアウトＴ細胞は、ＮＫ殺傷からの保護を示す
インビボ研究のために、当該技術分野において既知の方法によってロイコパックから単離されたＮＫ細胞を、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０９２）で洗浄し、注射のために１５０μＬのＨＢＳＳ中に１０×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁した。３０匹の雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、１．５×１０＾６個の単離されたＮＫ細胞を尾静脈注射によって投与した。追加の２５匹の雌ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５を、ＮＫ非注入対照とした。
インビボ研究のために、当該技術分野において既知の方法によってロイコパックから単離されたＮＫ細胞を、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０９２）で洗浄し、注射のために１５０μＬのＨＢＳＳ中に１０×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁した。３０匹の雌のＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、１．５×１０＾６個の単離されたＮＫ細胞を尾静脈注射によって投与した。追加の２５匹の雌ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５を、ＮＫ非注入対照とした。
ＮＫ細胞注射の２８日後、マウスに、表２１に記載の非編集または操作されたＴ細胞を注射した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中で洗浄し、６．０×１０＾６細胞／１５０μＬの濃度でＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した後、０．２×１０＾６個の操作されたＴ細胞を、第２の活性化の１６日後に注射した。
生きたマウスのＩＶＩＳイメージングを実施して、ＩＶＩＳスペクトルによってルシフェラーゼ陽性Ｔ細胞を同定した。ＩＶＩＳイメージングは、Ｔ細胞注射の２４時間、４８時間、７２時間、６日、１０日、１３日、１７日、２０日、２４日、２７日、３１日、３４日、３８日、４２日、４４日、４８日、５５日、６３日、７２日、７７日、８５日、及び９１日後に行った。製造者の推奨に従って、体重１ｇ当たり１０μＬ、１匹当たり約１５０μＬのＤ－ルシフェリンｉ．ｐ．注射を用いて、イメージングのためにマウスを調製した。動物を麻酔し、次いでＩＶＩＳイメージングユニットに配置した。オートに設定された露光時間、視野Ｄ、媒体ビニング、及び１に設定したＦ／ｓｔｏｐを用いて、可視化を実施した。表２２及び図７Ａは、９１日までの注射後の様々な時点に存在するルシフェラーゼ発現Ｔ細胞からの輝度（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図７Ｂは、３１日後の様々なマウス群に存在するルシフェラーゼ発現Ｔ細胞からの輝度（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。インビボでは、Ｂ２Ｍ編集細胞は、ＮＫ殺傷に対する感受性を示し、一方、ＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ二重編集細胞は、ＮＫ媒介性溶解からの保護を示した。
実施例１０：ＨＤ１ Ｔ細胞のＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ ＫＯインビボ有効性
雌ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに、０．２×１０＾６ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株６９７－Ｌｕｃ２を移植した後、様々な編集を伴う１０×１０＾６個の操作されたＴ細胞の注射を行い、編集が特定の抗腫瘍効果をもたらすかどうかを判定した。研究したＴ細胞の群としては、編集なしのＴ細胞の対照群（６９７のみ）、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集を有するＴ細胞（ＴＣＲ ＫＯ）；ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集及びＨＤ１の挿入を有するＴ細胞（ＴＣＲ ＫＯ／ＷＴ１挿入物）；ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集、ＨＤ１の挿入、ＨＬＡ－Ａ中の破壊を有するＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ ＫＯ）；ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集、ＨＤ１の挿入、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ中の編集を有するＴ細胞（ＡｌｌｏＷＴ１）；ならびにＤＮＡ ＰＫｉ化合物の存在下でのＴＲＡＣとＴＲＢＣ中の編集、及びＨＤ１の挿入、ならびにＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ中の編集を有するＴ細胞（ＡｌｌｏＷＴ１＋ＰＫｉ化合物１）が挙げられる。
雌ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５マウスに、０．２×１０＾６ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株６９７－Ｌｕｃ２を移植した後、様々な編集を伴う１０×１０＾６個の操作されたＴ細胞の注射を行い、編集が特定の抗腫瘍効果をもたらすかどうかを判定した。研究したＴ細胞の群としては、編集なしのＴ細胞の対照群（６９７のみ）、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集を有するＴ細胞（ＴＣＲ ＫＯ）；ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集及びＨＤ１の挿入を有するＴ細胞（ＴＣＲ ＫＯ／ＷＴ１挿入物）；ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集、ＨＤ１の挿入、ＨＬＡ－Ａ中の破壊を有するＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ ＫＯ）；ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ中の編集、ＨＤ１の挿入、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ中の編集を有するＴ細胞（ＡｌｌｏＷＴ１）；ならびにＤＮＡ ＰＫｉ化合物の存在下でのＴＲＡＣとＴＲＢＣ中の編集、及びＨＤ１の挿入、ならびにＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ中の編集を有するＴ細胞（ＡｌｌｏＷＴ１＋ＰＫｉ化合物１）が挙げられる。
１０．１．Ｔ細胞調製
ＨＬＡ－Ａ２＋ドナー（１１００４６９６７）由来のＴ細胞を、健常なドナー（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の白血球アフェレーシス産物から単離した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を製造者のプロトコルに従って使用して単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－１５）を補充したＴ細胞活性化培地ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中で一晩静置した。
ＨＬＡ－Ａ２＋ドナー（１１００４６９６７）由来のＴ細胞を、健常なドナー（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の白血球アフェレーシス産物から単離した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を製造者のプロトコルに従って使用して単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－１５）を補充したＴ細胞活性化培地ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中で一晩静置した。
１０．２ 連続ＬＮＰ送達を伴う多重編集Ｔ細胞
Ｔ細胞は、健常なドナー細胞を、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ、及びＨＬＡ－Ａのいずれかを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡと共配合された４つのＬＮＰ組成物で順次に処理することによって調製した。ＬＮＰ組成物の脂質部分は、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含んだ。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。トランスジェニックＷＴ１標的化ＴＣＲを、ｔｇＴＣＲ挿入速度を向上させるために、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼの小分子阻害剤と組み合わせて、表２４に示されるＡＡＶを使用して相同組換え修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に部位特異的に組み込んだ。以下、「ＤＮＡＰＫＩ化合物１」と称される阻害剤は、９－（４，４－ジフルオロシクロヘキシル）－７－メチル－２－（（７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）アミノ）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オンであり、また、以下のように示される。
Ｔ細胞は、健常なドナー細胞を、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ、及びＨＬＡ－Ａのいずれかを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡと共配合された４つのＬＮＰ組成物で順次に処理することによって調製した。ＬＮＰ組成物の脂質部分は、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含んだ。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。トランスジェニックＷＴ１標的化ＴＣＲを、ｔｇＴＣＲ挿入速度を向上させるために、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼの小分子阻害剤と組み合わせて、表２４に示されるＡＡＶを使用して相同組換え修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に部位特異的に組み込んだ。以下、「ＤＮＡＰＫＩ化合物１」と称される阻害剤は、９－（４，４－ジフルオロシクロヘキシル）－７－メチル－２－（（７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）アミノ）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オンであり、また、以下のように示される。
ＤＮＡＰＫＩ化合物１を、以下のように調製した。
一般情報
全ての試薬及び溶媒は、商業供給業者から購入し、受け取ったまま使用するか、引用する手順に従って合成した。全ての中間体及び最終化合物は、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。ＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒまたはＶａｒｉａｎの４００ＭＨｚの分光計で記録し、ＮＭＲデータは、周囲温度で、ＣＤＣｌ３中で収集した。化学シフトは、ＣＤＣｌ３（７．２６）と比較した１００万分の１（ｐｐｍ）単位で報告する。１Ｈ ＮＭＲのデータは、化学シフト、多重度（ｂｒ＝広域、ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｄｄ＝二重項の二重項、ｄｔ＝三重項の二重項、ｍ＝多重項）、結合定数、及び積分として報告する。ＭＳデータは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを備えたＷａｔｅｒｓ ＳＱＤ２質量分析計で記録した。最終化合物の純度は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）及び蒸発光散乱（ＥＬＳ）検出器を有するＳＱＤ２質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ液体クロマトグラフィー計器を使用したＵＰＬＣ－ＭＳ－ＥＬＳによって決定した。
実施例１－化合物１
中間体１ａ：（Ｅ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ’－（４－メチル－５－ニトロピリジン－２－イル）ホルムイミドアミド
トルエン（０．３Ｍ）中の４－メチル－５－ニトロ－ピリジン－２－アミン（５ｇ、１．０当量）の溶液に、ＤＭＦ－ＤＭＡ（３．０当量）を添加した。混合物を１１０℃で２時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得て、カラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体の生成物を得た（５９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ６．７４ （ｓ， １Ｈ）， ３．２１ （ｍ， ６Ｈ）．
中間体１ｂ：（Ｅ）－Ｎ－ヒドロキシ－Ｎ’－（４－メチル－５－ニトロピリジン－２－イル）ホルムイミドアミド
ＭｅＯＨ（０．２Ｍ）中の中間体１ａ（４ｇ、１．０当量）の溶液に、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（２．０当量）を添加した。反応混合物を８０℃で１時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物をＨ２ＯとＥｔＯＡｃとに分割し、続いてＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を減圧下で濃縮して残留物を得て、カラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体の生成物を得た（６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １０．５２ （ｄ，Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １０．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．９， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．７， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）．
中間体１ｃ：７－メチル－６－ニトロ－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン
ＴＨＦ（０．４Ｍ）中の中間体１ｂ（２．５ｇ、１．０当量）の溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（１．０当量）を０℃で添加した。混合物を２５℃で１８時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体の生成物を得た（４４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ２．７８ （ｄ， Ｊ ＝ １．０Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体１ｄ：７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－アミン
ＥｔＯＨ（０．１Ｍ）中のＰｄ／Ｃ（１０％ ｗ／ｗ、０．２当量）の混合物に、中間体１ｃ（１．０当量）及びギ酸アンモニウム（５．０当量）を添加した。混合物を１０５℃で２時間加熱した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、薄茶色固体の生成物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ８．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）．
中間体１ｅ：８－メチレン－１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン
ＴＨＦ（０．６Ｍ）中のメチル（トリフェニル）ホスホニウムブロミド（１．１５当量）の溶液に、ｎ－ＢｕＬｉ（１．１当量）を－７８℃で滴下添加し、混合物を０℃で１時間攪拌した。次いで、１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－オン（５０ｇ、１．０当量）を反応混合物に添加した。混合物を２５℃で１２時間攪拌した。反応混合物を、ＮＨ４Ｃｌ水溶液中に０℃で注ぎ、Ｈ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮して残留物を得て、カラムクロマトグラフィーにより精製して、無色油状の生成物を得た（５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．６７ （ｓ， １Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ４Ｈ）， ２．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体１ｆ：７，１０－ジオキサジスピロ［２．２．４６．２３］ドデカン
トルエン（３Ｍ）中の中間体４ａ（５ｇ、１．０当量）の溶液に、ＺｎＥｔ２（２．５７当量）を－４０℃で滴下添加し、混合物を－４０℃で１時間攪拌した。次いで、ジヨードメタン（６．０当量）を、Ｎ２下、－４０℃で混合物に滴下添加した。混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０℃で１７時間攪拌した。反応混合物を、ＮＨ４Ｃｌ水溶液中に０℃で注ぎ、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を真空濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色油状の生成物を得た（７３％）。
中間体１ｇ：スピロ［２．５］オクタン－６－オン
１：１のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１．０Ｍ）中の中間体４ｂ（４ｇ、１．０当量）の溶液に、ＴＦＡ（３．０当量）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下２０℃で２時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、残留物を２ＭのＮａＯＨ（水溶液）でｐＨ７に調整した。混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を真空濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色油状の生成物を得た（６８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ２．３５（ｔ， Ｊ ＝ ６．６Ｈｚ， ４Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６Ｈｚ， ４Ｈ）， ０．４２（ｓ， ４Ｈ）．
中間体１ｈ：Ｎ－（４－メトキシベンジル）スピロ［２．５］オクタン－６－アミン
ＤＣＭ（０．３Ｍ）中の中間体４ｃ（２ｇ、１．０当量）及び（４－メトキシフェニル）メタンアミン（１．１当量）の混合物に、ＡｃＯＨ（１．３当量）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下２０℃で１時間攪拌した。次いで、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３．３当量）を混合物に０℃で添加し、混合物をＮ２雰囲気下、２０℃で１７時間攪拌した。反応混合物を、減圧下で濃縮してＤＣＭを除去し、得られた残留物をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、灰色固体の生成物を得た（５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ７．１５－７．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７７ － ６．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １０．１， ７．３， ３．７Ｈｚ， １Ｈ）， １．６９ － １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．３７ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．５Ｈｚ， ２Ｈ）， １．１２ － １．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８７ － ０．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．１３ － ０．０４ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体１ｉ：スピロ［２．５］オクタン－６－アミン
ＭｅＯＨ（０．２５Ｍ）中のＰｄ／Ｃ（１０％ ｗ／ｗ、１．０当量）の懸濁液に、中間体４ｄ（２ｇ、１．０当量）を添加し、混合物をＨ２雰囲気下、８０℃で５０Ｐｓｉで２４時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残留物を得て、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体の生成物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ２．６１ （ｔｔ， Ｊ ＝ １０．８， ３．９Ｈｚ， １Ｈ）， １．６３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ９．６， ５．１， ２．２Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．８， ３．５Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２１ － １．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８２ － ０．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．１４ － ０．０５ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体１ｊ：２－クロロ－４－（スピロ［２．５］オクタン－６－イルアミノ）ピリミジン－５－カルボン酸エチル
ＡＣＮ（０．５～０．６Ｍ）中の２，４－ジクロロピリミジン－５－カルボン酸エチル（２．７ｇ、１．０当量）及び中間体１ｉ（１．０当量）の混合物に、Ｋ２ＣＯ３（２．５当量）をＮ２下で一度に添加した。混合物を２０℃で１２時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体の生成物を得た（５４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１Ｈｚ， ２Ｈ） ，４．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８Ｈｚ， １Ｈ）， １．９０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ４．８Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６４ （ｔ， Ｊ ＝ １２．３Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５２ （ｑ， Ｊ ＝ １０．７， ９．１Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １３．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．４０ － ０．２１ （ｍ， ４Ｈ）．
中間体１ｋ：２－クロロ－４－（スピロ［２．５］オクタン－６－イルアミノ）ピリミジン－５－カルボン酸
１：１のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（０．３Ｍ）中の中間体１ｊ（２ｇ、１．０当量）の溶液に、ＬｉＯＨ（２．０当量）を添加した。混合物を２０℃で１２時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を２ＭのＨＣｌでｐＨ２に調整し、沈殿物を濾過によって収集し、水で洗浄し、真空下で試した。生成物を、追加で精製することなく直接次のステップに使用した（８２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １３．５４ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３５ （ｓ， １Ｈ）， ３．８２（ｑｔ， Ｊ ＝ ８．２， ３．７Ｈｚ， １Ｈ）， １．６６ （ｄｑ， Ｊ ＝ １２．８， ４．１Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３４ （ｍ， ２Ｈ）， １．３３－１．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８６ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．６， ４．２Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ４．８Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体１ｌ：２－クロロ－９－（スピロ［２．５］オクタン－６－イル）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オン
ＤＭＦ（０．３Ｍ）中の中間体１ｋ（１．５ｇ、１．０当量）及びＥｔ３Ｎ（１．０当量）の混合物に、ＤＰＰＡ（１．０当量）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下１２０℃で８時間攪拌した。反応混合物を水に注いだ。沈殿物を濾過により収集し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて残留物を得て、これを追加で精製することなく、次のステップに直接使用した（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １１．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ４．２６ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １２．３， ７．５， ３．７Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４２ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．７Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９５ （ｔｄ， Ｊ ＝ １３．３， ３．５Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８２ － １．６９ （ｍ， ２Ｈ）， １．０８ － ０．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ０．３９ （ｔｄｑ， Ｊ ＝ １１．６， ８．７， ４．２， ３．５Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体１ｍ：２－クロロ－７－メチル－９－（スピロ［２．５］オクタン－６－イル）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オン
１：１のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（０．３～０．５Ｍ）中の中間体１ｌ（１．０ｇ、１．０当量）及びＮａＯＨ（５．０当量）の混合物に、ＭｅＩ（２．０当量）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下２０℃で１２時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得て、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、薄黄色固体の生成物を得た（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．５７ （ｓ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．５， ３．９Ｈｚ， １Ｈ）， ３．０３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１７ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．８Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６０ （ｔｄ， Ｊ ＝ １３．４， ３．６Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３４ （ｍ， ２Ｈ）， １．０７ （ｓ， １Ｈ）， ０．６３ （ｄｐ， Ｊ ＝ １４．０， ２．５Ｈｚ， ２Ｈ）， －０．０５ （ｓ， ４Ｈ）．
化合物１：７－メチル－２－（（７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）アミノ）－９－（スピロ［２．５］オクタン－６－イル）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オン
中間体１ｍ（１．０当量）及び中間体１ｄ（１．０当量）の混合物に、ＤＭＦ（０．２～０．３Ｍ）中のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．２当量）、ＸａｎｔＰｈｏｓ（０．４当量）、及びＣｓ２ＣＯ３（２．０当量）を脱気し、Ｎ２で３回パージし、混合物をＮ２雰囲気下、１３０℃で１２時間攪拌した。次いで、混合物を水に注ぎ、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を真空濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製して、オフホワイト固体の生成物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．０９ （ｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１６ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ １２．５Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．０， ６．５Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９３ － １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， １．７７ － １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．２Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ４０５．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
表２３に例示されるように、各群について順次編集が起こった。
１０．３．ＬＮＰ処理及びＴ細胞の増殖
ＬＮＰ組成物を、ＡｐｏＥ含有培地中で製剤化し、以下のようにＴ細胞に送達した：１日目に、表２４に示されるＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔを１：５０希釈したＴＣＡＭ中に２×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－１１１－１６０）。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
ＬＮＰ組成物を、ＡｐｏＥ含有培地中で製剤化し、以下のようにＴ細胞に送達した：１日目に、表２４に示されるＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔを１：５０希釈したＴＣＡＭ中に２×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－１１１－１６０）。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
２日目に、表２３に示されるＬＮＰ組成物を、２０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で２５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１：１０の比で適切な培養物に添加した。
３日目に、ＴＲＡＣ－ＬＮＰ組成物（表２３）を、１０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコに入れた。次いで、ＷＴ１ ＡＡＶを、３×１０＾５ＧＣ／細胞のＭＯＩで関連する群に添加した。化合物１を、０．２５ｕＭの最終濃度で、関連する群に添加した。
４日目に、表２３に示されるＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。Ｔ細胞を遠心分離によって洗浄し、１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１：１の比で適切な培養物に添加した。
５～１１日目に、Ｔ細胞を、５％ ＣＴＳ免疫細胞血清置換液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ２５９６１０１）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－１５）を補充した、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中でＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移し、増殖させた。簡潔に述べると、Ｔ細胞を６日間増殖させ、新鮮なサイトカインを１日おきに補充した。細胞を、Ｖｉ－ＣＥＬＬ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントし、細胞収率を出発物質で割ることによって増殖倍率を計算した。
１０．４．フローサイトメトリー及びＮＧＳによるＴ細胞編集の定量化
増殖後、編集されたＴ細胞を抗体カクテル中で染色して、ＨＬＡ－Ａ２ノックアウト（ＨＬＡ－Ａ２－）、ＣＩＩＴＡノックアウトによるＨＬＡ－ＤＲ－ＤＰ－ＤＱノックダウン（ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ－）、ＷＴ１－ＴＣＲ挿入（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残留内因性を発現する細胞（ＣＤ３＋Ｖｂ８－）のパーセンテージを決定した。その後、細胞を洗浄し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。Ｔ細胞を、編集及び挿入速度が決定される前に、サイズ及びＣＤ８＋状態でゲートした。編集及び挿入速度は、表２４及び図９Ａ～９Ｆに見出すことができる。ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウトを伴うＷＴ１－ＴＣＲを発現する完全に編集されたＡｌｌｏＷＴ１－Ｔ細胞のパーセントを、％ＣＤ３＋Ｖｂ８＋ＨＬＡ－Ａ－ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ－としてゲートした。高レベルのＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡノックアウト、ならびにＷＴ１－ＴＣＲ挿入及び内因性ＴＣＲ ＫＯが、編集された試料中で観察された。特に、ＤＮＡ ＰＫ阻害剤化合物１を受けたＴ細胞は、改良された編集効率を示した。
増殖後、編集されたＴ細胞を抗体カクテル中で染色して、ＨＬＡ－Ａ２ノックアウト（ＨＬＡ－Ａ２－）、ＣＩＩＴＡノックアウトによるＨＬＡ－ＤＲ－ＤＰ－ＤＱノックダウン（ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ－）、ＷＴ１－ＴＣＲ挿入（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残留内因性を発現する細胞（ＣＤ３＋Ｖｂ８－）のパーセンテージを決定した。その後、細胞を洗浄し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。Ｔ細胞を、編集及び挿入速度が決定される前に、サイズ及びＣＤ８＋状態でゲートした。編集及び挿入速度は、表２４及び図９Ａ～９Ｆに見出すことができる。ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウトを伴うＷＴ１－ＴＣＲを発現する完全に編集されたＡｌｌｏＷＴ１－Ｔ細胞のパーセントを、％ＣＤ３＋Ｖｂ８＋ＨＬＡ－Ａ－ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ－としてゲートした。高レベルのＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡノックアウト、ならびにＷＴ１－ＴＣＲ挿入及び内因性ＴＣＲ ＫＯが、編集された試料中で観察された。特に、ＤＮＡ ＰＫ阻害剤化合物１を受けたＴ細胞は、改良された編集効率を示した。
生きたマウスのＩＶＩＳイメージングを実施して、ＩＶＩＳスペクトルによってルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞を同定した。Ｔ細胞注射の２日、６日、９日、１３日、１６日、及び１８日後に、ＩＶＩＳイメージングを行った。製造者の推奨に従って、体重１ｇ当たり１０μＬ、１匹当たり約１５０μＬのＤ－ルシフェリンｉ．ｐ．注射を用いて、イメージングのためにマウスを調製した。動物を麻酔し、次いでＩＶＩＳイメージングユニットに配置した。オートに設定された露光時間、視野Ｄ、媒体ビニング、及び１に設定したＦ／ｓｔｏｐを用いて、可視化を実施した。表２５及び図１０は、１８日までの注射後の様々な時点に存在するルシフェラーゼ発現Ｔ細胞からの輝度（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。
１０．５．操作されたＴ細胞サイトカイン放出
実施例１０．１及び１０．２に記載されるように調製された操作されたＴ細胞を、それらのサイトカイン放出プロファイルについてアッセイした。インビトロＯＣＩ－ＡＭＬ３腫瘍細胞殺傷アッセイを、操作されたＴ細胞を使用して別々に実施した（データは示されない）。腫瘍細胞殺傷アッセイからの上清を使用して、各操作されたＴ細胞のサイトカイン放出プロファイルを評価した。
実施例１０．１及び１０．２に記載されるように調製された操作されたＴ細胞を、それらのサイトカイン放出プロファイルについてアッセイした。インビトロＯＣＩ－ＡＭＬ３腫瘍細胞殺傷アッセイを、操作されたＴ細胞を使用して別々に実施した（データは示されない）。腫瘍細胞殺傷アッセイからの上清を使用して、各操作されたＴ細胞のサイトカイン放出プロファイルを評価した。
簡潔に述べると、ＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞、自家ＷＴ１ Ｔ細胞（ＴＣＲ ＫＯ＋ＷＴ１ ＴＣＲ挿入物）、及び同種異系ＷＴ１ Ｔ細胞（表２４に示される）を解凍し、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５を補充したＴＣＧＭ中で一晩静置した。翌日、操作されたＴ細胞の各群をＯＣＩ－ＡＭＬ３標的腫瘍と共培養する共培養アッセイを設定した。最初に、ＯＣＩ－ＡＭＬ３標的腫瘍細胞を、異なる濃度（５００、５０、５、０．５、０．０５、及び０．００５ｎＭ）のＶＬＤペプチドで１時間パルスした。次に、各群のＴ細胞をカウントし、サイトカインを含まないＴＣＧＭ培地に再懸濁し、パルスＯＣＩ－ＡＭＬ３と１：１のＥ：Ｔ比で共培養した。共培養中のＴ細胞数を挿入速度に対して正規化して、異なる群間でＥ：Ｔを一貫させた。共培養の２４時間後、各共培養試料からの上清を、Ｕ－ＰＬＥＸ免疫腫瘍学群１（ｈｕ）アッセイキット（ＭＳＤ、カタログ番号Ｋ１５１ＡＥＬ－２）由来の希釈液２中で５倍希釈した。各群からの５０μＬの希釈試料をメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）プレートに装填し、１時間インキュベートした。
測定した各サイトカインについて、Ｕ－ＰＬＥＸ免疫腫瘍学群１（ｈｕ）アッセイ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｋ１５１ＡＥＬ－２）からのビオチン化捕捉抗体を、キットのプロトコルに従って割り当てられたリンカーに添加した。抗体－リンカー混合物をボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄し、密封し、一晩保存した。
翌日、アッセイされる各サイトカイン（ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ）の標準物を含有するキャリブレーターを、製造者の指示に従って再構成し、希釈して、４倍標準曲線を作成した。
プレートを洗浄し、５０μＬの検出抗体溶液（キットの指示に従って調製）をＭＳＤプレートの各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートを洗浄し、ＭＳＤ装置上で直ちに読み取った。サイトカイン放出を表２６～２７及び図１１Ａ～１１Ｂに示す。
実施例１１：混合リンパ球反応アッセイ
Ｔ細胞を、以下のＭＨＣ Ｉ表現型を有する健常なヒトドナーの末梢血から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２：０１Ｇ。簡潔に述べると、白血球アフェレーシスパック（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塩化アンモニウムＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７８００）中で１５分間処理して、赤血球を溶解した。溶解後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）カウントを決定し、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して、Ｔ細胞単離を実施した。単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
Ｔ細胞を、以下のＭＨＣ Ｉ表現型を有する健常なヒトドナーの末梢血から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２：０１Ｇ。簡潔に述べると、白血球アフェレーシスパック（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を塩化アンモニウムＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７８００）中で１５分間処理して、赤血球を溶解した。溶解後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）カウントを決定し、製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ１７９５１）を使用して、Ｔ細胞単離を実施した。単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
凍結Ｔ細胞を、１．５×１０＾６細胞／ｍｌの細胞濃度で、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）をさらに補充した、実施例３に記載されるようなＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭで構成されたＴ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ）に解凍した。細胞を３７℃で２４時間静置した。
解凍の２４時間後にＴ細胞をカウントし、ＴＣＡＭ培地中で２×１０＾６細胞／ｍｌで再懸濁し、１：５０ｖ／ｖのＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ３０－１１１－１６０）を添加した。２４ウェルの組織培養プレートの各ウェルに１×１０＾６個の細胞を添加し、操作される各群について２ウェル、及び非編集対照として２ウェルを保持した（操作された群：非編集またはＷＴ、Ｂ２Ｍ ＫＯ（ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡクラスＩとしても示される）、ＣＩＩＴＡ（ＨＬＡクラスＩＩまたはＨＬＡ－ＩＩとしても示される）ＫＯ、Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ、ＨＬＡ－Ａ ＫＯ、ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ）。プレートを３７℃のインキュベーターに移した。ＣＩＩＴＡを標的とする、ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１３６７５（配列番号２３６）を含有するＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。５ｕｇ／ｍｌのＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）をさらに補充したＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＡＭ中で、３７℃で１５分間インキュベートした。１２ウェルのうち６ウェルで、Ｔｒａｎｓａｃｔを用いて事前にインキュベートされたＬＮＰ及びＴ細胞を混合して、２．５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＡＭ培地中の最終濃度１×１０＾６Ｔ細胞／ｍｌ及び２．５μｇ総ＲＮＡ／ｍＬのＬＮＰを得た（これらは、ＣＩＩＴＡ ＫＯ群では２ウェル、ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ群では２ウェル、Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ群では２ウェルである）。追加のウェル全てを、ＡｐｏＥ３を含有するがＬＮＰ組成物を含まない培地で模擬編集した。全ての細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
活性化の２４時間後、２つの以前に処理されていないウェル及び２つのＣＩＩＴＡ ＬＮＰ含有ウェルを、Ｂ２Ｍ用（Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ群用）のＬＮＰ組成物で処理し、２つの以前に処理されていないウェル及び２つのＣＩＩＴＡ ＬＮＰ含有ウェルを、ＨＬＡ－Ａ用（ＨＬＡ－Ａ ＫＯ及びＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ群用）のＬＮＰ組成物で処理した。Ｂ２Ｍを標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ Ｇ０００５２９（配列番号２４５）を含むＬＮＰ組成物、ならびにＨＬＡ－Ａを標的とする、ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ Ｇ０１８９９５（表２に示されるように、配列番号１３を含むｓｇＲＮＡ）を含有するＬＮＰ組成物を、脂質Ａ、コレステロールｌ、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧと、それぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で配合した。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。２５ｕｇ／ｍｌのＬＮＰ組成物を、２０ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）をさらに補充したＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＡＭ中で、３７℃で１５分間インキュベートした。上述のように、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ ＬＮＰ組成物を２４ウェルプレートの適切なウェルに添加して、２．５％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含むＴＣＡＭ培地中２．５μｇ総ＲＮＡ／ｍＬのＬＮＰの最終濃度を得た。追加の細胞群を、ＡｐｏＥ３を含有するがＬＮＰ組成物を含まない培地で模擬編集して、非編集またはＷＴ対照とした。全ての細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
第２の編集ラウンドの２４時間後、細胞を５００ＸＧで５分間回転させることによって洗浄し、５％ ＣＴＳ（商標）免疫細胞ＳＲ（ＧｉｂｃｏカタログＡ２５９６１０１）、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５を含有するＴＣＥＭ培地中に再懸濁した。細胞を培養し、培地及びサイトカインを定期的に交換しながらＧ－Ｒｅｘプレート中で７日間維持し、その後、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）中に再懸濁し、さらなる使用まで液体窒素中で凍結した。
６つのドナーＴ細胞群（野生型非編集、Ｂ２Ｍ ＫＯ、ＨＬＡ－Ａ ＫＯ、ＣＩＩＴＡ ＫＯ、ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ、Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ）を解凍し、１×１０＾６／ｍＬ＋１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２、０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５でＴＣＧＭ中に再懸濁した（ドナー及び宿主ＨＬＡ遺伝子型を以下の表２８に示す）。３つの宿主（自家宿主、同種異系宿主（ＨＬＡ－Ｂ及びＣマッチ宿主）、及び陽性対照宿主（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃミスマッチ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、１×１０＾６／ｍＬ＋１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２、０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５でＴＣＧＭ中に再懸濁した。ドナー細胞及び宿主細胞を、３７℃のインキュベーター中で一晩静置した。翌日、ドナー細胞フラスコを４０００ｒａｄで照射し、スピンダウンし、各群をサイトカインを含まないＴＣＧＭ中に１×１０＾６／ｍＬで再懸濁した。２つの宿主からの宿主ＰＢＭＣを、ＣＤ５６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０５０－４０１）を使用して、ＣＤ５６＋細胞枯渇させた。各宿主からの約１×１０＾６個の細胞を、非標識フロー制御のために１５ｍＬチューブに保存した。各宿主の１８×１０＾６個の細胞を標識するには、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５７１）のバイアルを室温にし、２０μＬのＤＭＳＯを使用して再構築して、５ｍＭのＣＴＶストックを生成した。宿主細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２１－０４０－ＣＶ）中に約１×１０＾６／ｍＬで再懸濁して、別の５０ｍＬコニカルチューブに移した。１８μＬのＣＴＶをチューブに添加して宿主細胞を染色した後、チューブを３７℃のインキュベーターに１５分間移した。その後、チューブを、サイトカインを含まないＴＣＧＭで４０ｍＬまで満たして、結合していない染料を吸収した。次いで、標識された宿主細胞を５００ｘｇで５分間スピンダウンし、サイトカインを含まないＴＣＧＭ中で１×１０＾６／ｍＬで再懸濁した。宿主ＰＢＭＣの１ウェル当たり５０μＬ当たり５０，０００個の細胞を、適切な宿主から１ウェル当たりにプレーティングした。４×宿主細胞（データを正規化するための対照試料）を必要とするウェルでは、１ウェル当たり２００μＬ当たり２００，０００個の宿主細胞をプレーティングした。「宿主＋ＴｒａｎｓＡｃｔ」（増殖陽性対照）と標識された宿主細胞において、宿主ＰＢＭＣの１ウェル当たり５０μＬ当たり５０，０００細胞を播種した後、１μＬのＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）を添加し、これらのウェルの体積を、サイトカインを含まないＴＣＧＭで最大２００μＬにした。照射したドナー細胞を、１ウェル当たり１５０μＬ当たり１５０，０００個の細胞で、プレートレイアウトに従ってプレーティングした。フロー制御のために、１つのドナー及び宿主からの５０，０００個の細胞を、各々一緒にプレーティングした。全てのウェルの体積を、サイトカインを含まないＴＣＧＭで２００μＬまで充填した。
共培養後５日目に、各ウェルからの培地の半分（約１００μＬ）を新鮮な培地（サイトカインを含まないＴＣＧＭ）で置き換えた。
共培養後８日目に、アッセイプレートを染色し、フローサイトメトリーによって分析した。染色の目的で、プレートを６００ｘｇで３分間回転させ、フリックして培地を除去し、１００μＬのＦｃブロッカー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）のＦＡＣＳ緩衝液中の１：１００ｖ／ｖ溶液を各ウェルに添加した。細胞をＦｃブロッカー中に再懸濁し、プレートを室温で５分間インキュベートした。各抗体が１：１００ｖ／ｖ希釈で存在するように、抗体カクテルを調製し、１００μＬのこの抗体混合物を各試料ウェルに添加した。プレートをアルミ箔で覆うことによって光から保護し、２～８℃で２０～３０分間インキュベートした。染色後、プレートを６００ｘｇで３分間回転させ、フリックして培地を除去し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。プレートを再び洗浄し、細胞ペレットを、７０μＬの生存率染料７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５１－６８９８１Ｅ）の１：２００ｖ／ｖ溶液中に再懸濁した。未染色のウェルを、７０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。プレートを、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーターで高速モード（１ウェル当たり６０秒）で実行した。表２９Ａ及び２９Ｂならびに図８Ａ及び８Ｂに示される結果（図は、野生型、Ｂ２Ｍ、ＫＯ、及びＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯのデータのサブセットを示す）は、ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ細胞が、同種異系宿主（ＨＬＡ－Ｂ及びＣにマッチした）において最小限のＣＤ４及びＣＤ８応答を誘発することを実証し、これはＢ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡ ＤＫＯ細胞によって誘発される応答と同等であった。各群の結果は、それぞれの宿主について、４×宿主群の増殖の結果に対して正規化されている。
実施例１２：複数の遺伝子破壊及び挿入のための複数のＬＮＰ組成物の順次送達
Ｔ細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健常なドナー細胞を、４つのＬＮＰ組成物で順次に処理し、各ＬＮＰ組成物を、ＴＲＡＣ（Ｇ０１３００６）（配列番号２４３）、ＴＲＢＣ（Ｇ０１６２３９）（配列番号２４７）、ＣＩＩＴＡ（Ｇ０１３６７５）（配列番号２４６）、またはＨＬＡ－Ａ（Ｇ０１８９９５）のいずれかを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ（表２に示されるような配列番号１３を含むｓｇＲＮＡ）と共配合した。ＬＮＰ組成物は、表３０に示される群に従って、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのいずれかと、それぞれ３５：４７．５：１５：２．５のモル比（群１及び２）で、または脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのいずれかと、それぞれ５０：３５：１０：１．５のモル比（群３）で、示される用量で配合した。群１及び２は、ＬＮＰ濃度が異なる。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。ＴＣＲを標的とするトランスジェニックＷＴ１を、ＡＡＶを使用して相同組換え修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に部位特異的に組み込んだ。ＬＮＰ組成物を各日に調製し、表３０に記載のようにＴ細胞に送達した。
Ｔ細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健常なドナー細胞を、４つのＬＮＰ組成物で順次に処理し、各ＬＮＰ組成物を、ＴＲＡＣ（Ｇ０１３００６）（配列番号２４３）、ＴＲＢＣ（Ｇ０１６２３９）（配列番号２４７）、ＣＩＩＴＡ（Ｇ０１３６７５）（配列番号２４６）、またはＨＬＡ－Ａ（Ｇ０１８９９５）のいずれかを標的とする、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８０２）及びｓｇＲＮＡ（表２に示されるような配列番号１３を含むｓｇＲＮＡ）と共配合した。ＬＮＰ組成物は、表３０に示される群に従って、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのいずれかと、それぞれ３５：４７．５：１５：２．５のモル比（群１及び２）で、または脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのいずれかと、それぞれ５０：３５：１０：１．５のモル比（群３）で、示される用量で配合した。群１及び２は、ＬＮＰ濃度が異なる。脂質核酸アセンブリは、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：２のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。ＴＣＲを標的とするトランスジェニックＷＴ１を、ＡＡＶを使用して相同組換え修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に部位特異的に組み込んだ。ＬＮＰ組成物を各日に調製し、表３０に記載のようにＴ細胞に送達した。
１２．１Ｔ細胞調製
３つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋血清型からのＴ細胞を、２名の健常なドナーの白血球アフェレーシス産物（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を製造者のプロトコルに従って使用して単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０７）、及びＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－１５）を補充したＴ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中で一晩静置した。
３つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋血清型からのＴ細胞を、２名の健常なドナーの白血球アフェレーシス産物（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から単離した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を製造者のプロトコルに従って使用して単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０７）、及びＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－１５）を補充したＴ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中で一晩静置した。
１２．２ＬＮＰ処理及びＴ細胞の増殖
ＬＮＰ組成物を解凍し、ＡｐｏＥ含有培地中で各日に希釈し、以下のようにＴ細胞に送達した。
ＬＮＰ組成物を解凍し、ＡｐｏＥ含有培地中で各日に希釈し、以下のようにＴ細胞に送達した。
１日目に、表３０に示されるようなＬＮＰ組成物を、５μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔを１：５０希釈したＴＣＡＭ中に２×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，１３０－１１１－１６０）。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
２日目に、表３０に示されるようなＬＮＰ組成物を、２０μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で２５μｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１０：１の比で適切な培養物に添加した。
３日目に、表３０に示されるように、３０ ＴＲＡＣ－ＬＮＰ組成物を、５μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコに入れた。次いで、ＷＴ１ ＡＡＶを、３×１０＾５ＧＣ／細胞のＭＯＩで各群に添加した。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤「化合物１」を、０．２５μＭの濃度で各群に添加した。
４日目に、表３０に示されるようなＬＮＰ組成物を、５μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中でプレーティングした。
５～１３日目に、Ｔ細胞を、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－１５）を補充したＴ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中で２４ウェルＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、８０１９２）に移し、製造者のプロトコルに従って増殖させた。簡潔に述べると、Ｔ細胞を８日間増殖させ、培地を２～３日ごとに交換した。
増殖後、編集されたＴ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ノックアウト、ＣＩＩＴＡノックアウトによるＨＬＡ－ＤＲ－ＤＰ－ＤＱノックダウン、ＷＴ１－ＴＣＲ挿入（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残留内因性を発現する細胞（ＣＤ３＋Ｖｂ８－）のパーセンテージを決定した。Ｔ細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとともにインキュベートした。Ｖｂ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４８１０４）、ＨＬＡ－Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４３３２０）、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３６１７１２）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００５３８）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０１０４６）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３１７３３６）、ＣＣＲ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３５３２１４）、ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４８２０）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４１３４）、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４２３０）、ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３１８３２８）、及びＶｉａｋｒｏｍｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログＣ３６６２８）。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、編集及び挿入速度が決定される前に、サイズ及びＣＤ４／ＣＤ８状態でゲートした。連続Ｔ細胞操作後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてそれぞれ表３１及び図１２Ａに示す。全ての意図された編集（ＷＴ１－ＴＣＲの挿入、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウトと組み合わせた）を有するＴ細胞のパーセントを、％ＣＤ３＋Ｖｂ８＋ＨＬＡ－Ａ－ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ－としてゲートし、図１２Ｂに示す。高レベルのＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡノックアウト、ならびにＷＴ１－ＴＣＲ挿入が、全ての群からの編集された試料において観察され、７５％超の完全に編集されたＣＤ８＋Ｔ細胞が得られた。脂質Ａ３５：１５：４７．５：２．５組成物とともに使用した低用量（０．６５μｇ／ｍＬ）は、高用量（２．５μｇ／ｍＬ）での脂質Ａ５０：１０：３５．５：１．５配合と同様の、全ての標的にわたるＴ細胞の編集力を示した。
実施例１３：操作されたＴ細胞の細胞傷害性感受性
操作されたＴ細胞を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって標的化したときの細胞傷害性感受性についてアッセイした。
操作されたＴ細胞を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって標的化したときの細胞傷害性感受性についてアッセイした。
ＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を解凍し、１×１０＾６細胞／ｍＬの細胞濃度で、ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭで構成され、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）をさらに補充したＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に再懸濁した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
解凍の２４時間後、ＮＫ細胞を、０．５μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で次のように標識した：ＣＴＶ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット、フローサイトメトリー用、カタログＣ３４５７１）のバイアルをキットからＤＭＳＯ中で再構成して、５ｍＭのストック濃度を得た。２μＬのＣＴＶストックを１８μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ２１－０４０－ＣＶ）で希釈して、０．５ｍＭの濃度を得た。ＮＫ細胞を５００ｘｇで５分間遠心分離し、培地を吸引し、ＣＴＶ染料の最終濃度が０．５μＭとなるように、細胞を１×１０＾６細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、３７℃で２０分間インキュベートしたＣＴＶ染料溶液と混合した。未結合の染料を、ＴＣＧＭの添加によりクエンチし、５分間インキュベートした。細胞を、５００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞を、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を２×１０＾６細胞／ｍＬの濃度で補充したＴＣＧＭ中に再懸濁する。エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比の範囲を試験するために、ＣＴＶ標識ＮＫ細胞を、６点、２倍の段階希釈で１００μＬの培地中に分取し、細胞の最大数は２×１０＾５細胞であった。培地のみの試料が陰性対照として含まれた。
試験試料としてＨＬＡ－Ａを標的とするＧ０２３５２３（配列番号１０１６）を使用し、ＮＫ殺傷の陽性対照としてＢ２Ｍを標的とするＧ０２３５１９（配列番号８１６）を用いて、ＢＣ２２ｎ及びＵＧＩ ｍＲＮＡを使用してＴ細胞を操作した。
製造者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ１７９５１）を使用して、ロイコパックからＴ細胞を調製した。Ｔ細胞を、将来の使用のために、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０凍結培地（カタログ０７９３０）中で凍結保存した。解凍時に、Ｔ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ１０－０４０－ＣＶ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０６１）、２２μＭの２－メルカプトエタノール、１００ｕＭの非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ２５－０２５－Ｃｌ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、プラス１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）で構成されたＴ細胞Ｒ１０培地中、１．０×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングした。Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ－アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１１１４１Ｄ）で活性化した。ｍＲＮＡトランスフェクション前に、細胞をＴ細胞培地中で７２時間増殖させた。
ＢＣ２２ｎ（配列番号９７２）またはＵＧＩ（配列番号１００５）をコードするｍＲＮＡを含有する溶液を、無菌水中で調製した。５０μＭの標的化ｓｇＲＮＡを貯蔵プレートから除去し、９５℃で２分間変性させた後、氷上で冷却した。活性化の７２時間後、Ｔ細胞を採取し、遠心分離し、Ｐ３エレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中に１２．５×１０＾６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。エレクトロポレーションされる各ウェルについて、１×１０＾５個のＴ細胞を、最終容量２０μＬのＰ３エレクトロポレーション緩衝液中で、２００ｎｇのエディターｍＲＮＡ（ＢＣ２２ｎ）、２００ｎｇのＵＧＩ ｍＲＮＡ、及び２０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡと混合した。製造者のパルスコードを使用して、この混合物をエレクトロポレーションした。
非編集のＴ細胞を、ＮＫ殺傷の陰性対照としてアッセイした。フローサイトメトリーの他の対照には、Ｔ細胞を含まないＣＴＶ標識ＮＫ細胞、非標識ＮＫ細胞及びＴ細胞を組み合わせた「未染色」試料、ならびに非標識熱殺傷及び非熱殺傷ＮＫ細胞及び７ＡＡＤで染色したＴ細胞の１：１混合物が含まれた。Ｔ細胞を、ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＴＣＧＭで構成されたＴＣＧＭ中の２×１０＾５細胞の密度で再懸濁し、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）をさらに補充した。ＮＫ細胞及び培地対照の各ウェルに２万個のＴ細胞を添加した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
２４時間で、ＬＤ熱殺傷ウェルからの細胞の体積の半分を熱殺傷し、アッセイプレートの同じウェルに戻した。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログＡ３１６０５－０２）＋２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ１５－５７５－０２０））中の８０μＬの７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ５５９９２５）の１：２００ｖ／ｖ溶液中に再懸濁した。Ｔ細胞の特異的溶解に関するデータを、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーにより取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。ゲートを最初にＣＴＶ陰性集団上に描画してＮＫ細胞をゲートアウトし、続いて一重項でゲートした後、７－ＡＡＤ陰性集団上にゲートを描画して、生きたＴ細胞をゲートした。Ｔ細胞の溶解パーセントを、１００から生細胞パーセントを減算することによって計算した。ＢＣ２２ｎ及びＨＬＡ－ＡガイドＧ０２３５２３（配列番号１０１６）を使用して編集したＴ細胞を、表３２及び図１３に示すように、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性から保護した。
実施例１４：ヒトＴ細胞をＢＣ２２ｎ、ＵＧＩ及び９１ｍｅｒ ｓｇＲＮＡを用いて編集する
受容体ノックアウトによって評価した９１ｍｅｒ ｓｇＲＮＡの塩基編集有効性を、同じガイド配列を有する１００ｍｅｒ ｓｇＲＮＡフォーマットのものと比較した。
受容体ノックアウトによって評価した９１ｍｅｒ ｓｇＲＮＡの塩基編集有効性を、同じガイド配列を有する１００ｍｅｒ ｓｇＲＮＡフォーマットのものと比較した。
試験した９１ｍｅｒ ｓｇＲＮＡは、２０ヌクレオチドガイド配列（Ｎによって表される）と、次のようなガイド足場：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧｍＵｍＧｍＣ＊ｍＵ（配列番号１００３）を含み、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、及びＮは、別途示されない限り、それぞれアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、及び任意のリボヌクレオチドである。ｍは、２’Ｏ－メチル修飾を示し、＊は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示す。ガイドの非修飾バージョン及び修飾バージョンを表６（配列表）に提供する。
実施例１４．１．Ｔ細胞調製
健常なヒトドナーアフェレーシスを商業的に取得し（Ｈｅｍａｃａｒｅ）、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）中に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を使用して、陽性選択を介してＴ細胞を単離した。Ｔ細胞を分取し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）において将来の使用のために凍結保存した。
健常なヒトドナーアフェレーシスを商業的に取得し（Ｈｅｍａｃａｒｅ）、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）中に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を使用して、陽性選択を介してＴ細胞を単離した。Ｔ細胞を分取し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）において将来の使用のために凍結保存した。
健常なヒトドナーアフェレーシスを商業的に取得し（Ｈｅｍａｃａｒｅ）、細胞を洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－０７０－５２５）中に再懸濁し、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で処理した。Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０－１２２－３５２）を使用して、陽性選択を介してＴ細胞を単離した。Ｔ細胞を分取し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ０７９３０）において将来の使用のために凍結保存した。
解凍時に、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖ＳＦＭ及びＴ細胞増殖サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログＡ１０４８５０１）、５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ、カタログ１００－５１２）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）で構成されたＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中、１．０×１０＾６細胞／ｍＬの密度でＴ細胞をプレーティングした。Ｔ細胞をこの培地中に２４時間静置し、その時点で、１：１００の体積比で添加されたヒト試薬であるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１１１－１６０）で活性化した。ＬＮＰ処理の前に、Ｔ細胞を４８時間活性化した。
実施例１４．２．Ｔ細胞ＬＮＰ処理及び増殖
活性化の４８時間後、Ｔ細胞を採取し、５００ｇで５分間遠心分離し、Ｔ細胞プレーティング培地（ＴＣＰＭ）：４００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含有するＴＣＧＭの無血清バージョン中に１×１０＾６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。ＴＣＰＭ中の５０μＬのＴ細胞（５×１０＾４個のＴ細胞）をウェルごとに添加して、平底９６ウェルプレートで処理した。
活性化の４８時間後、Ｔ細胞を採取し、５００ｇで５分間遠心分離し、Ｔ細胞プレーティング培地（ＴＣＰＭ）：４００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及び１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を含有するＴＣＧＭの無血清バージョン中に１×１０＾６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。ＴＣＰＭ中の５０μＬのＴ細胞（５×１０＾４個のＴ細胞）をウェルごとに添加して、平底９６ウェルプレートで処理した。
ＬＮＰを、実施例１に記載されるように、３５：４７．５：１５：２．５（脂質Ａ／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）の比で調製した。約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比で、ＬＮＰを配合した。ＬＮＰは、表３４に記載のｓｇＲＮＡ、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ（配列番号９７２）、またはＵＧＩ ｍＲＮＡ（配列番号１００５）のいずれかの単一のＲＮＡ種を封入した。
Ｔ細胞処理の前に、ｓｇＲＮＡを封入するＬＮＰを、Ｔ細胞処理培地（ＴＣＴＭ）：インターロイキン２、５または７の非存在下で２０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３を含有するＴＣＧＭのバージョン中で６．６４μｇ／ｍＬに希釈した。これらのＬＮＰを３７℃で１５分間インキュベートし、ＴＣＴＭを使用して１：４で段階希釈し、これにより、６．６４μｇ／ｍＬ～ゼロの範囲の８点希釈系列が得られた。同様に、ＢＣ２２ｎ ｍＲＮＡ（配列番号９７２）またはＵＧＩ ｍＲＮＡ（配列番号１００５）を有する単一カーゴＬＮＰを、それぞれＴＣＴＭ中で３．３２及び１．６７μｇ／ｍＬに希釈し、３７℃で１５分間インキュベートし、前のステップで段階希釈されたｓｇＲＮＡ ＬＮＰと１：１の体積で混合した。最後に、得られた混合物からの５０μＬを、１：１の体積比で９６ウェルプレート中のＴ細胞に添加した。Ｔ細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、その時点でそれらを採取し、５００ｇで５分間遠心分離し、２００μＬのＴＣＧＭ中に再懸濁し、インキュベーターに戻した。
実施例１４．４．フローサイトメトリーによる受容体ノックアウトの評価
ＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのセットを、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の多形（ｈｙｐｅｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）性のためにＮＧＳの代わりにフローサイトメトリーによって評価した。
ＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのセットを、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の多形（ｈｙｐｅｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）性のためにＮＧＳの代わりにフローサイトメトリーによって評価した。
ＬＮＰ処理の７日後、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、受容体ノックアウトを評価した。Ｔ細胞を、固定可能な生存率染料（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログＣ３６６２８）及びＨＬＡ－Ａ２を標的とする抗体カクテル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４３３０４）でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。任意のマーカーの発現が決定される前に、Ｔ細胞をサイズ、生存率及びＣＤ８陽性でゲートした。得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９．０．２にプロットし、可変勾配（４パラメータ）非線形回帰を使用して分析した。
表３４及び３５ならびに図１４に示されるように、試験した９１ｍｅｒ ｓｇＲＮＡが１００ｍｅｒバージョンを上回った。１００ｍｅｒフォーマット（ＨＬＡ－Ａ）でより低い効力（すなわち、より高いＥＣ５０）を有する標的は、９１ｍｅｒ ｓｇＲＮＡの使用から最も利益を得るようである。
実施例１５：ＮＧＳによるＨＬＡ－Ａ編集とフローサイトメトリーによるタンパク質ＫＯとの相関
３つのＴ細胞ドナーからの凍結Ｔ細胞、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇの第１のヘテロ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇの第２のホモ接合体、及びＨＬＡ－Ａ＊０３：０１：０１Ｇの第３のホモ接合体を、１．５×１０＾６細胞／ｍＬの細胞濃度で、２．５パーセントのＧｅｍＣｅｌｌ ＰｌｕｓヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ番号１００－５１２）、及び各１０ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ １００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５００６１）、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５６３００８０）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０－１２２）を含み、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－１５）をさらに補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４８５－０１）で構成されたＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に解凍し、３７℃のインキュベーターで一晩静置した。
３つのＴ細胞ドナーからの凍結Ｔ細胞、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ、０３：０１：０１Ｇの第１のヘテロ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇの第２のホモ接合体、及びＨＬＡ－Ａ＊０３：０１：０１Ｇの第３のホモ接合体を、１．５×１０＾６細胞／ｍＬの細胞濃度で、２．５パーセントのＧｅｍＣｅｌｌ ＰｌｕｓヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ番号１００－５１２）、及び各１０ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ １００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５００６１）、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５６３００８０）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０－１２２）を含み、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－１５）をさらに補充したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４８５－０１）で構成されたＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に解凍し、３７℃のインキュベーターで一晩静置した。
解凍の２４時間後、細胞を、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０）を使用して、１：１００の希釈で３７℃で２４時間活性化した。細胞をウェルごとに１００μＬ当たり１×１０＾５細胞でプレーティングし、次いで最高用量として５μｇ／ｍＬから始まり０．０４μｇ／ｍＬまで下げたＬＮＰ配合ガイドの段階希釈でトランスフェクトした。
トランスフェクション後５日目に、各ドナーからの細胞を回転させ、ＮＧＳアッセイのために収集した。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液を使用して抽出した。ＰＣＲ１を実施して、遺伝子特異的配列を増幅し、一方、ＰＣＲ２を実施して、シークエンシングのための共通アダプターを増幅した（ＮＥＢカタログ番号Ｎ０４９４）。ＰＣＲ試料を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒカタログ番号Ａ６３８８１）を使用して、ＮＧＳによりシークエンシングする前に清浄した。
トランスフェクション後８日目に、アッセイプレートを染色し、フローサイトメトリーによって分析した。染色の目的で、プレートを５００ｘｇで５分間回転させ、フリックして培地を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液中１００μＬのＦｃブロッカー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）の１：１００ｖ／ｖ溶液を各ウェルに添加した。細胞をＦｃブロッカー中に再懸濁し、プレートを室温で５分間インキュベートした。各抗体（ＨＬＡ－Ａ２モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７－９８７６－４２及びＨＬＡ－Ａ３モノクローナル抗体（ＧＡＰ．Ａ３）、ＰＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１２－５７５４－４２）が１：１００ｖ／ｖ希釈で存在するように抗体カクテルを調製し、１００μＬのこの抗体混合物を各試料ウェルに添加した。プレートをアルミ箔で覆うことによって光から保護し、２～８℃で２０～３０分間インキュベートした。染色後、プレートを６００ｘｇで３分間回転させ、フリックして培地を除去し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。プレートを再び洗浄し、細胞ペレットを１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。プレートを、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーターで高速モード（１ウェル当たり６０秒）で実行した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏで実施した。
タンパク質ノックアウトと編集との高い相関は、表３６～３８及び図１５Ａ～１５Ｃに示されるように、３つのドナー全てにおいて、また３つの独自のプライマーセットについて観察された。
実施例１６．追加の実施形態
以下の番号付けされた実施形態は、本明細書の実施形態に対する追加の支持及び説明を提供する。
以下の番号付けされた実施形態は、本明細書の実施形態に対する追加の支持及び説明を提供する。
実施形態１
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、前記操作されたヒト細胞。
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記細胞は、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、前記操作されたヒト細胞。
実施形態２
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、（ａ）ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及び（ｂ）ｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、前記操作されたヒト細胞。
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子の遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、（ａ）ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及び（ｂ）ｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、前記操作されたヒト細胞。
実施形態３
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ１１、及びＨＬＡ－Ａ２４から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ１１、及びＨＬＡ－Ａ２４から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態４
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態５
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ２の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ２の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態６
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ３の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ３の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態７
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１１の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１１の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態８
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ２４の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ２４の発現を低減または排除した、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態９
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１０
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１１
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１２
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１３
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１４
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１５
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１６
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１７
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、前記操作されたヒト細胞。
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、前記操作されたヒト細胞。
実施形態１８
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む、前記操作されたヒト細胞。
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、Ｃ－Ｔ置換、またはＡ－Ｇ置換を含む、前記操作されたヒト細胞。
実施形態１９
前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２０：前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、または前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２１
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも６、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも６、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２２
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも１つのＣ－Ｔ置換または少なくとも１つのＡ－Ｇ置換を含む、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも１つのＣ－Ｔ置換または少なくとも１つのＡ－Ｇ置換を含む、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２３
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、以下から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞：（ａ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、及びｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、（ｂ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、（ｃ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、（ｄ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、（ｅ）ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、（ｆ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、（ｇ）ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、（ｈ）ｃｈｒ６：２９９４５２９０－２９９４５３１０、ｃｈｒ６：２９９４５２９６－２９９４５３１６、及びｃｈｒ６：２９９４５２９７－２９９４５３１７、ｃｈｒ６：２９９４５３００－２９９４５３２０、（ｉ）ｃｈｒ６：２９８９０１１７－２９８９０１３７、ｃｈｒ６：２９９２７０５８－２９９２７０７８、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４２５４１－２９９４２５６１、ｃｈｒ６：２９９４２５４２－２９９４２５６２、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５５０－２９９４２５７０、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３０６２－２９９４３０８２、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０９２－２９９４３１１２、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１１８－２９９４３１３８、ｃｈｒ６：２９９４３１１９－２９９４３１３９、ｃｈｒ６：２９９４３１２０－２９９４３１４０、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３１２８－２９９４３１４８、ｃｈｒ６：２９９４３１２９－２９９４３１４９、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１３６－２９９４３１５６、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３１４２－２９９４３１６２、ｃｈｒ６：２９９４３１４３－２９９４３１６３、ｃｈｒ６：２９９４３１８８－２９９４３２０８、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３６－２９９４３５５６、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５５８、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５７６、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９９－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２０、ｃｈｒ６：２９９４３６０１－２９９４３６２１、ｃｈｒ６：２９９４３６０２－２９９４３６２２、ｃｈｒ６：２９９４３６０３－２９９４３６２３、ｃｈｒ６：２９９４３７７４－２９９４３７９４、ｃｈｒ６：２９９４３７７９－２９９４３７９９、ｃｈｒ６：２９９４３７８０－２９９４３８００、ｃｈｒ６：２９９４３８２２－２９９４３８４２、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５７－２９９４３８７７、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４３８５９－２９９４３８７９、ｃｈｒ６：２９９４３８６０－２９９４３８８０、ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９４４０７７－２９９４４０９７、ｃｈｒ６：２９９４４０７８－２９９４４０９８、ｃｈｒ６：２９９４４４５８－２９９４４４７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、ｃｈｒ６：２９９４４５９７－２９９４４６１７、ｃｈｒ６：２９９４４６４２－２９９４４６６２、ｃｈｒ６：２９９４４６４３－２９９４４６６３、ｃｈｒ６：２９９４４７７２－２９９４４７９２、ｃｈｒ６：２９９４４７８２－２９９４４８０２、ｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、ｃｈｒ６：２９９４４９０７－２９９４４９２７、ｃｈｒ６：２９９４５０２４－２９９４５０４４、ｃｈｒ６：２９９４５０９７－２９９４５１１７、ｃｈｒ６：２９９４５１０４－２９９４５１２４、ｃｈｒ６：２９９４５１０５－２９９４５１２５、ｃｈｒ６：２９９４５１１６－２９９４５１３６、ｃｈｒ６：２９９４５１１８－２９９４５１３８、ｃｈｒ６：２９９４５１１９－２９９４５１３９、ｃｈｒ６：２９９４５１２４－２９９４５１４４、ｃｈｒ６：２９９４５１７６－２９９４５１９６、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１８０－２９９４５２００、ｃｈｒ６：２９９４５１８７－２９９４５２０７、ｃｈｒ６：２９９４５１８８－２９９４５２０８、ｃｈｒ６：２９９４５２２８－２９９４５２４８、ｃｈｒ６：２９９４５２３０－２９９４５２５０、ｃｈｒ６：２９９４５２３１－２９９４５２５１、ｃｈｒ６：２９９４５２３２－２９９４５２５２、ｃｈｒ６：２９９４５３０８－２９９４５３２８、ｃｈｒ６：２９９４５３６１－２９９４５３８１、ｃｈｒ６：２９９４５３６２－２９９４５３８２、及びｃｈｒ６：３１３８２５４３－３１３８２５６３、（ｊ）ｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、ｃｈｒ６：２９９４２８１６－２９９４２８３６、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８２８－２９９４２８４８、ｃｈｒ６：２９９４２８３７－２９９４２８５７、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４２９０５－２９９４２９２５、ｃｈｒ６：２９９４２９１２－２９９４２９３２、ｃｈｒ６：２９９４２９１３－２９９４２９３３、ｃｈｒ６：２９９４３４９０－２９９４３５１０、ｃｈｒ６：２９９４３４９７－２９９４３５１７、ｃｈｒ６：２９９４３４９８－２９９４３５１８、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、及びｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、（ｋ）ｃｈｒ６：２９９４２８８４－２９９４２９０４、ｃｈｒ６：２９９４３５１９－２９９４３５３９、ｃｈｒ６：２９９４２８６３－２９９４２８８３、（ｌ）ｃｈｒ６：２９９４３５１７－２９９４３５３７、及びｃｈｒ６：２９９４３５２３－２９９４３５４３、（ｍ）ｃｈｒ６：２９９４２８４５－２９９４２８６９、ｃｈｒ６：２９９４２８５２－２９９４２８７６、ｃｈｒ６：２９９４２８６５－２９９４２８８９、ｃｈｒ６：２９９４２８９１－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９０３－２９９４２９２７、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２８、ｃｈｒ６：２９９４３５１８－２９９４３５４２、ｃｈｒ６：２９９４３５２５－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３５－２９９４３５５９、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５６２、ｃｈｒ６：２９９４３５３９－２９９４３５６３、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４８－２９９４３５７２、ｃｈｒ６：２９９４３５５５－２９９４３５７９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５８０、ｃｈｒ
６：２９９４３５５７－２９９４３５８１、ｃｈｒ６：２９９４３５５８－２９９４３５８２、ｃｈｒ６：２９９４３５５９－２９９４３５８３、ｃｈｒ６：２９９４３５６３－２９９４３５８７、ｃｈｒ６：２９９４３５６４－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６５－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５９２、ｃｈｒ６：２９９４３５７１－２９９４３５９５、ｃｈｒ６：２９９４３５７２－２９９４３５９６、ｃｈｒ６：２９９４３５９５－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３５９６－２９９４３６２０、及びｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２４、（ｎ）ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、または（ｏ）ｃｈｒ６：２９９４２４６９－２９９４２４８９、ｃｈｒ６：２９９４３０５８－２９９４３０７８、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０８０－２９９４３１００、ｃｈｒ６：２９９４３１８７－２９９４３２０７、ｃｈｒ６：２９９４３１９２－２９９４３２１２、ｃｈｒ６：２９９４３１９７－２９９４３２１７、ｃｈｒ６：２９９４３８１２－２９９４３８３２、ｃｈｒ６：２９９４４３４９－２９９４４３６９、ｃｈｒ６：２９９４４９９６－２９９４５０１６、ｃｈｒ６：２９９４５０１８－２９９４５０３８、及びｃｈｒ６：２９９４５３４１－２９９４５３６１、ｃｈｒ６：２９９４５５２６－２９９４５５４６。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、以下から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞：（ａ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、及びｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、（ｂ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、（ｃ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、（ｄ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、（ｅ）ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、（ｆ）ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、（ｇ）ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、（ｈ）ｃｈｒ６：２９９４５２９０－２９９４５３１０、ｃｈｒ６：２９９４５２９６－２９９４５３１６、及びｃｈｒ６：２９９４５２９７－２９９４５３１７、ｃｈｒ６：２９９４５３００－２９９４５３２０、（ｉ）ｃｈｒ６：２９８９０１１７－２９８９０１３７、ｃｈｒ６：２９９２７０５８－２９９２７０７８、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４２５４１－２９９４２５６１、ｃｈｒ６：２９９４２５４２－２９９４２５６２、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５５０－２９９４２５７０、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３０６２－２９９４３０８２、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０９２－２９９４３１１２、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１１８－２９９４３１３８、ｃｈｒ６：２９９４３１１９－２９９４３１３９、ｃｈｒ６：２９９４３１２０－２９９４３１４０、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３１２８－２９９４３１４８、ｃｈｒ６：２９９４３１２９－２９９４３１４９、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１３６－２９９４３１５６、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３１４２－２９９４３１６２、ｃｈｒ６：２９９４３１４３－２９９４３１６３、ｃｈｒ６：２９９４３１８８－２９９４３２０８、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３６－２９９４３５５６、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５５８、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５７６、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９９－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２０、ｃｈｒ６：２９９４３６０１－２９９４３６２１、ｃｈｒ６：２９９４３６０２－２９９４３６２２、ｃｈｒ６：２９９４３６０３－２９９４３６２３、ｃｈｒ６：２９９４３７７４－２９９４３７９４、ｃｈｒ６：２９９４３７７９－２９９４３７９９、ｃｈｒ６：２９９４３７８０－２９９４３８００、ｃｈｒ６：２９９４３８２２－２９９４３８４２、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５７－２９９４３８７７、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４３８５９－２９９４３８７９、ｃｈｒ６：２９９４３８６０－２９９４３８８０、ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９４４０７７－２９９４４０９７、ｃｈｒ６：２９９４４０７８－２９９４４０９８、ｃｈｒ６：２９９４４４５８－２９９４４４７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、ｃｈｒ６：２９９４４５９７－２９９４４６１７、ｃｈｒ６：２９９４４６４２－２９９４４６６２、ｃｈｒ６：２９９４４６４３－２９９４４６６３、ｃｈｒ６：２９９４４７７２－２９９４４７９２、ｃｈｒ６：２９９４４７８２－２９９４４８０２、ｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、ｃｈｒ６：２９９４４９０７－２９９４４９２７、ｃｈｒ６：２９９４５０２４－２９９４５０４４、ｃｈｒ６：２９９４５０９７－２９９４５１１７、ｃｈｒ６：２９９４５１０４－２９９４５１２４、ｃｈｒ６：２９９４５１０５－２９９４５１２５、ｃｈｒ６：２９９４５１１６－２９９４５１３６、ｃｈｒ６：２９９４５１１８－２９９４５１３８、ｃｈｒ６：２９９４５１１９－２９９４５１３９、ｃｈｒ６：２９９４５１２４－２９９４５１４４、ｃｈｒ６：２９９４５１７６－２９９４５１９６、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１８０－２９９４５２００、ｃｈｒ６：２９９４５１８７－２９９４５２０７、ｃｈｒ６：２９９４５１８８－２９９４５２０８、ｃｈｒ６：２９９４５２２８－２９９４５２４８、ｃｈｒ６：２９９４５２３０－２９９４５２５０、ｃｈｒ６：２９９４５２３１－２９９４５２５１、ｃｈｒ６：２９９４５２３２－２９９４５２５２、ｃｈｒ６：２９９４５３０８－２９９４５３２８、ｃｈｒ６：２９９４５３６１－２９９４５３８１、ｃｈｒ６：２９９４５３６２－２９９４５３８２、及びｃｈｒ６：３１３８２５４３－３１３８２５６３、（ｊ）ｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、ｃｈｒ６：２９９４２８１６－２９９４２８３６、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８２８－２９９４２８４８、ｃｈｒ６：２９９４２８３７－２９９４２８５７、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４２９０５－２９９４２９２５、ｃｈｒ６：２９９４２９１２－２９９４２９３２、ｃｈｒ６：２９９４２９１３－２９９４２９３３、ｃｈｒ６：２９９４３４９０－２９９４３５１０、ｃｈｒ６：２９９４３４９７－２９９４３５１７、ｃｈｒ６：２９９４３４９８－２９９４３５１８、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、及びｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、（ｋ）ｃｈｒ６：２９９４２８８４－２９９４２９０４、ｃｈｒ６：２９９４３５１９－２９９４３５３９、ｃｈｒ６：２９９４２８６３－２９９４２８８３、（ｌ）ｃｈｒ６：２９９４３５１７－２９９４３５３７、及びｃｈｒ６：２９９４３５２３－２９９４３５４３、（ｍ）ｃｈｒ６：２９９４２８４５－２９９４２８６９、ｃｈｒ６：２９９４２８５２－２９９４２８７６、ｃｈｒ６：２９９４２８６５－２９９４２８８９、ｃｈｒ６：２９９４２８９１－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９０３－２９９４２９２７、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２８、ｃｈｒ６：２９９４３５１８－２９９４３５４２、ｃｈｒ６：２９９４３５２５－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３５－２９９４３５５９、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５６２、ｃｈｒ６：２９９４３５３９－２９９４３５６３、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４８－２９９４３５７２、ｃｈｒ６：２９９４３５５５－２９９４３５７９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５８０、ｃｈｒ
６：２９９４３５５７－２９９４３５８１、ｃｈｒ６：２９９４３５５８－２９９４３５８２、ｃｈｒ６：２９９４３５５９－２９９４３５８３、ｃｈｒ６：２９９４３５６３－２９９４３５８７、ｃｈｒ６：２９９４３５６４－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６５－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５９２、ｃｈｒ６：２９９４３５７１－２９９４３５９５、ｃｈｒ６：２９９４３５７２－２９９４３５９６、ｃｈｒ６：２９９４３５９５－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３５９６－２９９４３６２０、及びｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２４、（ｎ）ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、または（ｏ）ｃｈｒ６：２９９４２４６９－２９９４２４８９、ｃｈｒ６：２９９４３０５８－２９９４３０７８、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０８０－２９９４３１００、ｃｈｒ６：２９９４３１８７－２９９４３２０７、ｃｈｒ６：２９９４３１９２－２９９４３２１２、ｃｈｒ６：２９９４３１９７－２９９４３２１７、ｃｈｒ６：２９９４３８１２－２９９４３８３２、ｃｈｒ６：２９９４４３４９－２９９４４３６９、ｃｈｒ６：２９９４４９９６－２９９４５０１６、ｃｈｒ６：２９９４５０１８－２９９４５０３８、及びｃｈｒ６：２９９４５３４１－２９９４５３６１、ｃｈｒ６：２９９４５５２６－２９９４５５４６。
実施形態２４
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２５
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２６
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２７
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２８
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２９
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３０
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３１
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３２
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３３
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３４
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３５
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３６
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３７
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３８
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３９
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４０
前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２３～３９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２３～３９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４１
前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２３～４０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２３～４０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４２
前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１７、１９、１８、または２０個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１７、１９、１８、または２０個の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４３
前記遺伝子編集系が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子編集系が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４４
前記遺伝子編集系が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子編集系が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４５
前記遺伝子編集系が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子編集系が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、実施形態２３～４１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４６
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９タンパク質を含む、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９タンパク質を含む、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態４７
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態４８
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、任意選択でＮｍｅ２Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、任意選択でＮｍｅ２Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態４９
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５０
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５１
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５２
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５３
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５４
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃ－Ｔ塩基エディターである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃ－Ｔ塩基エディターである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５５
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ａ－Ｇ塩基エディターである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ａ－Ｇ塩基エディターである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５６
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５７
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ１２ａである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ１２ａである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５８
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＣａｓＸである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＣａｓＸである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態５９
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態６０
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｍａｄ７ヌクレアーゼである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｍａｄ７ヌクレアーゼである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態６１
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記核酸によってコードされるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼである、実施形態４５に記載の操作された細胞。
実施形態６２
前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、実施形態１７～６１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、実施形態１７～６１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６３
前記ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６４
前記ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６５
前記ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択され、前記ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択され、前記ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６６
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６７
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６８
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６９
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７０
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７１
前記細胞が、前記細胞の表面上でＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減した、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、前記細胞の表面上でＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減した、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７２
前記細胞が、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子の遺伝子修飾を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子の遺伝子修飾を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７３
前記細胞が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子において遺伝子修飾を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子において遺伝子修飾を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７４
前記細胞が、前記細胞の表面上で、ＴＲＡＣタンパク質の発現を低減した、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、前記細胞の表面上で、ＴＲＡＣタンパク質の発現を低減した、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７５
前記細胞が、前記細胞の表面上で、ＴＲＢＣタンパク質の発現を低減した、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、前記細胞の表面上で、ＴＲＢＣタンパク質の発現を低減した、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７６
前記操作された細胞が、外因性核酸をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、外因性核酸をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７７
前記操作された細胞が、前記操作された細胞の表面上で発現される標的化受容体または前記受容体に対するリガンドをコードする外因性核酸を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、前記操作された細胞の表面上で発現される標的化受容体または前記受容体に対するリガンドをコードする外因性核酸を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７８
前記標的化受容体が、ＣＡＲである、実施形態７７に記載の操作された細胞。
前記標的化受容体が、ＣＡＲである、実施形態７７に記載の操作された細胞。
実施形態７９
前記標的化受容体が、ＴＣＲである、実施形態７７に記載の操作された細胞。
前記標的化受容体が、ＴＣＲである、実施形態７７に記載の操作された細胞。
実施形態８０
前記標的化受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、実施形態７７に記載の操作された細胞。
前記標的化受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、実施形態７７に記載の操作された細胞。
実施形態８１
前記操作された細胞が、前記受容体のためのリガンドを含む、実施形態７７に記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、前記受容体のためのリガンドを含む、実施形態７７に記載の操作された細胞。
実施形態８２
前記操作された細胞が、前記操作された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、前記操作された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８３
前記操作された細胞が、免疫細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、免疫細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８４
前記細胞が、一次細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、一次細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態８５
前記操作された細胞が、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８６
前記操作された細胞が、リンパ球である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記操作された細胞が、リンパ球である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８７
前記細胞が、Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８８
前記細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８９
前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９０
前記細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９１
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９２
前記細胞が、マクロファージである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、マクロファージである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９３
前記細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つの操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つの操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態９４
前記細胞が、血漿Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、血漿Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態９５
前記細胞が、メモリーＢ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、メモリーＢ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態９６
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９７
前記幹細胞または前駆細胞が、ＨＳＣまたはｉＰＳＣである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記幹細胞または前駆細胞が、ＨＳＣまたはｉＰＳＣである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９８
前記細胞が、活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態９９
前記細胞が、非活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、非活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１００
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、または前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、または前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１０１
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも６、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも６、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１０２
前記遺伝子修飾が、インデルを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、インデルを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１０３
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも１つのＣ－Ｔ置換または少なくとも１つのＡ－Ｇ置換を含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも１つのＣ－Ｔ置換または少なくとも１つのＡ－Ｇ置換を含む、先行実施形態のいずれかに記載の操作された細胞。
実施形態１０４
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
実施形態１０５
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
実施形態１０６
実施形態１０５に記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
実施形態１０５に記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
実施形態１０７
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも６５％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも６５％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１０７．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも６５％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも６５％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１０８
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも７０％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも７０％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１０８．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも７０％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも７０％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１０９
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも８０％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも８０％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１０９．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも８０％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも８０％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１０
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９０％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９０％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１０．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９０％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９０％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１１
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９２％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９２％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１１．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９２％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９２％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１２
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９３％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９３％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１２．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９３％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９３％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１３
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９４％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９４％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１３．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９４％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９４％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１４
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９５％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９５％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１４．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９５％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９５％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１５
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９６％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９６％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１５．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９６％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９６％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１６
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９７％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９７％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１６．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９７％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９７％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１７
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９８％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９８％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１７．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９８％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９８％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１８
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９％のＨＬＡ－Ａ陰性である、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１８．１
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９９％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって測定した場合、前記細胞集団の少なくとも９９％が、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、実施形態１０５に記載の集団または実施形態１０６に記載の薬学的組成物。
実施形態１１９
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９４％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９４％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２０
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９５％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９５％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２１
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９６％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９６％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２２
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９７％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９７％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２３
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９８％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９８％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２４
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９％のＣＩＩＴＡ陰性である、実施形態１０５～１１８のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２５
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９５％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９５％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２６
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９７％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９７％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２７
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９８％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９８％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２８
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１２９は、フローサイトメトリーによって測定した場合、前記細胞集団が、少なくとも９９．５％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、実施形態１０５～１２４のいずれか１つに記載の集団または薬学的組成物。
実施形態１３０
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法。
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法。
実施形態１３１
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する方法。
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する方法。
実施形態１３２
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法。
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する方法。
実施形態１３３
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除した、操作されたヒト細胞を作製する方法であって、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、細胞を、（ａ）（ｉ）配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは（ｉｖ）表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは（ｖ）表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは（ｖｉ）（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除した、操作されたヒト細胞を作製する方法であって、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、細胞を、（ａ）（ｉ）配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは（ｉｖ）表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは（ｖ）表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは（ｖｉ）（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
実施形態１３４
非修飾細胞と比較してヒト細胞におけるＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減する方法であって、前記細胞を、（ａ）（ｉ）配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは（ｉｖ）表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは（ｖ）表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは（ｖｉ）（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
非修飾細胞と比較してヒト細胞におけるＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減する方法であって、前記細胞を、（ａ）（ｉ）配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは（ｉｉｉ）配列番号１～２１１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは（ｉｖ）表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは（ｖ）表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは（ｖｉ）（ｖ）から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含むＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、（ｂ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
実施形態１３５
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９タンパク質を含む、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９タンパク質を含む、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１３６
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１３７
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１３８
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１３９
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４０
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４１
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４２
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４３
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｃ－Ｔ塩基エディターである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｃ－Ｔ塩基エディターである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４４
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ａ－Ｇ塩基エディターである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ａ－Ｇ塩基エディターである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４５
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼを含む、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４６
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｃａｓ１２ａである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｃａｓ１２ａである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４７
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、ＣａｓＸである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、ＣａｓＸである、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４８
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である、実施形態１３３または１３４に記載の方法。
実施形態１４９
前記細胞を、例えば、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子を標的とする遺伝子編集系と接触させることによって、非修飾細胞と比較して、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む、実施形態１３３～１４８のいずれか１つに記載の方法。
前記細胞を、例えば、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子を標的とする遺伝子編集系と接触させることによって、非修飾細胞と比較して、前記細胞におけるＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む、実施形態１３３～１４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５０
前記細胞を、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む、実施形態１３３～１４９のいずれか１つに記載の方法。
前記細胞を、ＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む、実施形態１３３～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５１
非修飾細胞と比較して、前記細胞内のＴＣＲタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む、実施形態１３３～１５０のいずれか１つに記載の方法。
非修飾細胞と比較して、前記細胞内のＴＣＲタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む、実施形態１３３～１５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５２
前記細胞を、外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１３３～１５１のいずれか１つに記載の方法。
前記細胞を、外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１３３～１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５３
前記細胞を、標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法。
前記細胞を、標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５４
前記細胞を、前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法。
前記細胞を、前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５５
前記細胞を、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤（ＤＮＡＰＫｉ）と接触させることをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法。
前記細胞を、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤（ＤＮＡＰＫｉ）と接触させることをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５６
前記ＤＮＡＰＫｉが、化合物１である、実施形態１５５に記載の方法。
前記ＤＮＡＰＫｉが、化合物１である、実施形態１５５に記載の方法。
実施形態１５７
前記細胞が、同種異系細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、同種異系細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１５８
前記細胞が、一次細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、一次細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１５９
前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６０
前記細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６１
前記細胞が、メモリーＴ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、メモリーＴ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６２
前記細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６３
前記細胞が、血漿Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、血漿Ｂ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６４
前記細胞が、メモリーＢ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、メモリーＢ細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６５
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６６
前記細胞が、マクロファージである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、マクロファージである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６７
前記細胞が、幹細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、幹細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６８
前記細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１６９
前記細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７０
前記細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７１
前記細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７２
前記細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７３
前記細胞が、辺縁幹細胞（ＬＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、辺縁幹細胞（ＬＳＣ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７４
前記細胞が、前駆細胞、例えば、内皮前駆細胞または神経前駆細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、前駆細胞、例えば、内皮前駆細胞または神経前駆細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７５
前記細胞が、組織特異的一次細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、組織特異的一次細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７６
前記細胞が、軟骨細胞、筋細胞、及びケラチノサイトから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、軟骨細胞、筋細胞、及びケラチノサイトから選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７７
前記細胞が、活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７８
前記細胞が、非活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、非活性化細胞である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１７９
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、抗体または抗体断片である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、抗体または抗体断片である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８０
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドは、完全長ＩｇＧ抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドは、完全長ＩｇＧ抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８１
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、一本鎖抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、一本鎖抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８２
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、中和抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、中和抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８３
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、酵素である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、酵素である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８４
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、サイトカインである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、サイトカインである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８５
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、融合タンパク質である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、融合タンパク質である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８６
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、可溶性受容体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、可溶性受容体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８７
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８８
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、標的化受容体が、遺伝子修飾されたＴＣＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、標的化受容体が、遺伝子修飾されたＴＣＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１８９
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９０
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、ＣＡＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、ＣＡＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９１
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、ユニバーサルＣＡＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、ユニバーサルＣＡＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９２
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９３
前記細胞が、遺伝子編集系で操作される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記細胞が、遺伝子編集系で操作される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９４
前記遺伝子編集系が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、実施形態１９３に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記遺伝子編集系が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、実施形態１９３に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９５
前記遺伝子編集系が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、実施形態１９３に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記遺伝子編集系が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、実施形態１９３に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９６
前記遺伝子編集系が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含み、任意選択で、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、実施形態１９３に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記遺伝子編集系が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含み、任意選択で、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、実施形態１９３に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９７
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、ベクター中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、ベクター中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９８
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ベクター中、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと同じベクター中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ベクター中、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと同じベクター中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態１９９
前記外因性核酸が、ベクター中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記外因性核酸が、ベクター中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２００
前記ベクターが、ウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０１
前記ベクターが、非ウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ベクターが、非ウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０２
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０３
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０４
前記ベクターが、ＡＡＶである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ベクターが、ＡＡＶである、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０５
前記ガイドＲＮＡが、脂質核酸アセンブリ組成物中、任意選択で、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と同じ脂質核酸アセンブリ組成物中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ガイドＲＮＡが、脂質核酸アセンブリ組成物中、任意選択で、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と同じ脂質核酸アセンブリ組成物中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０６
前記外因性核酸が、脂質核酸アセンブリ組成物中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記外因性核酸が、脂質核酸アセンブリ組成物中で前記細胞に提供される、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０７
前記脂質核酸アセンブリ組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記脂質核酸アセンブリ組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０８
前記外因性核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記外因性核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２０９
前記外因性核酸が、相同組換え（ＨＲ）によって、前記細胞のゲノムに組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記外因性核酸が、相同組換え（ＨＲ）によって、前記細胞のゲノムに組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１０
前記外因性核酸が、前記細胞のゲノム内のセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記外因性核酸が、前記細胞のゲノム内のセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１１
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１３を含むか、または前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１３を含むか、または前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１２
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１３
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１４
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１５
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１６
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号２６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号２６を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１７
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３７を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１８
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３８を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２１９
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３９を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２０
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号４１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号４１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２１
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号４３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号４３を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２２
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号４５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号４５を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２３
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号６２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号６２を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２４
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２５
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含み、前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２６
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２７
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２８
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２２９
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３０
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３１
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３２
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの５’末端における最初の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの５’末端における最初の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３３
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの３’末端における最後の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの３’末端における最後の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３４
がん細胞によって発現されたポリペプチドに対する特異性を有するＴＣＲを発現するために使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
がん細胞によって発現されたポリペプチドに対する特異性を有するＴＣＲを発現するために使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３５
養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３６
がんを有する対象を治療する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
がんを有する対象を治療する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３７
感染性疾患を有する対象を治療する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
感染性疾患を有する対象を治療する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３８
自己免疫疾患を有する対象を治療する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
自己免疫疾患を有する対象を治療する際に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
実施形態２３９
細胞バンクであって、（ａ）先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、または先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって産生される操作された細胞と、（ｂ）前記細胞バンク内のドナー細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を文書化する情報を含むカタログと、を含む、前記細胞バンク。
細胞バンクであって、（ａ）先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、または先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって産生される操作された細胞と、（ｂ）前記細胞バンク内のドナー細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を文書化する情報を含むカタログと、を含む、前記細胞バンク。
実施形態２４０
前記細胞バンクが、前記細胞バンク内の他のドナー細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子の独自の組み合わせを有する、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０個のドナー細胞を含む、実施形態２３９に記載の細胞バンク。
前記細胞バンクが、前記細胞バンク内の他のドナー細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子の独自の組み合わせを有する、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０個のドナー細胞を含む、実施形態２３９に記載の細胞バンク。
実施形態２４１
操作された細胞を、それを必要とするレシピエント対象に投与する方法であって、前記方法は、（ａ）前記レシピエント対象のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を決定することと、（ｂ）先行実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞もしくは細胞集団、または先行実施形態のうちのいずれか１つの方法によって産生される操作された細胞もしくは細胞集団を選択することであって、前記操作された細胞が、前記レシピエント対象と同じＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、前記選択することと、（ｃ）前記選択された操作された細胞を前記レシピエント対象に投与することと、を含む、前記方法。
操作された細胞を、それを必要とするレシピエント対象に投与する方法であって、前記方法は、（ａ）前記レシピエント対象のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を決定することと、（ｂ）先行実施形態のうちのいずれか１つの操作された細胞もしくは細胞集団、または先行実施形態のうちのいずれか１つの方法によって産生される操作された細胞もしくは細胞集団を選択することであって、前記操作された細胞が、前記レシピエント対象と同じＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、前記選択することと、（ｃ）前記選択された操作された細胞を前記レシピエント対象に投与することと、を含む、前記方法。
実施形態２４２
前記対象が、前記操作された細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する、実施形態２４１に記載の方法。
前記対象が、前記操作された細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する、実施形態２４１に記載の方法。
実施形態２４３
養子細胞移植（ＡＣＴ）療法のための部分的にマッチした対象への投与に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法であって、前記部分的にマッチした対象が、前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する、前記操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
養子細胞移植（ＡＣＴ）療法のための部分的にマッチした対象への投与に使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法であって、前記部分的にマッチした対象が、前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する、前記操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態２４４
前記操作された細胞または細胞集団が、前記対象と共有されるＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む、実施形態１３０～１３２、２３５～２３８、２４１～２４３のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
前記操作された細胞または細胞集団が、前記対象と共有されるＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む、実施形態１３０～１３２、２３５～２３８、２４１～２４３のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態２４５
前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、前記対象の１つ以上のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子にマッチする対立遺伝子からなる、先行実施形態１３０～１３２、２３５～２３８、２４１～２４３のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、前記対象の１つ以上のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子にマッチする対立遺伝子からなる、先行実施形態１３０～１３２、２３５～２３８、２４１～２４３のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態２４６
前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、前記対象の一方もしくは両方のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子及び／または一方もしくは両方のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子にマッチする対立遺伝子からなる、先行実施形態１３０～１３２、２３５～２３８、２４１～２４３のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、前記対象の一方もしくは両方のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子及び／または一方もしくは両方のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子にマッチする対立遺伝子からなる、先行実施形態１３０～１３２、２３５～２３８、２４１～２４３のいずれか１つに記載の操作された細胞、組成物、薬学的組成物、または方法。
Claims (96)
- 非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、前記操作されたヒト細胞。
- 非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、
ａ．ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及び
ｂ．ｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含み、
前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、前記操作されたヒト細胞。 - 前記細胞が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ１１、及びＨＬＡ－Ａ２４から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の発現を低減または排除した、請求項１または２に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８６４－ｃｈｒ６：２９９４２９０３内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－ｃｈｒ６：２９９４３６０９内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５５０内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドを含む、前記操作されたヒト細胞。
- 非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａの表面発現を低減または排除し、ＨＬＡ－Ａ遺伝子における遺伝子修飾を含む、操作されたヒト細胞であって、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にインデル、ＣからＴへの置換、またはＡからＧへの置換を含む、前記操作されたヒト細胞。
- 前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、請求項１２または１３に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも５、６、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- ＨＬＡ－Ａ発現が、
ａ．ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、及びｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、
ｂ．ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、
ｃ．ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、
ｄ．ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、及びｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、
ｅ．ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、
ｆ．ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、及びｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、
ｇ．ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、及びｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、
ｈ．ｃｈｒ６：２９９４５２９０－２９９４５３１０、ｃｈｒ６：２９９４５２９６－２９９４５３１６、及びｃｈｒ６：２９９４５２９７－２９９４５３１７、ｃｈｒ６：２９９４５３００－２９９４５３２０、
ｉ．ｃｈｒ６：２９８９０１１７－２９８９０１３７、ｃｈｒ６：２９９２７０５８－２９９２７０７８、ｃｈｒ６：２９９３４３３０－２９９３４３５０、ｃｈｒ６：２９９４２５４１－２９９４２５６１、ｃｈｒ６：２９９４２５４２－２９９４２５６２、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５４３－２９９４２５６３、ｃｈｒ６：２９９４２５５０－２９９４２５７０、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３０６２－２９９４３０８２、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０９２－２９９４３１１２、ｃｈｒ６：２９９４３１１５－２９９４３１３５、ｃｈｒ６：２９９４３１１８－２９９４３１３８、ｃｈｒ６：２９９４３１１９－２９９４３１３９、ｃｈｒ６：２９９４３１２０－２９９４３１４０、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３１２８－２９９４３１４８、ｃｈｒ６：２９９４３１２９－２９９４３１４９、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３４－２９９４３１５４、ｃｈｒ６：２９９４３１３５－２９９４３１５５、ｃｈｒ６：２９９４３１３６－２９９４３１５６、ｃｈｒ６：２９９４３１４０－２９９４３１６０、ｃｈｒ６：２９９４３１４２－２９９４３１６２、ｃｈｒ６：２９９４３１４３－２９９４３１６３、ｃｈｒ６：２９９４３１８８－２９９４３２０８、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３６－２９９４３５５６、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５５８、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５７６、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９０－２９９４３６１０、ｃｈｒ６：２９９４３５９９－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２０、ｃｈｒ６：２９９４３６０１－２９９４３６２１、ｃｈｒ６：２９９４３６０２－２９９４３６２２、ｃｈｒ６：２９９４３６０３－２９９４３６２３、ｃｈｒ６：２９９４３７７４－２９９４３７９４、ｃｈｒ６：２９９４３７７９－２９９４３７９９、ｃｈｒ６：２９９４３７８０－２９９４３８００、ｃｈｒ６：２９９４３８２２－２９９４３８４２、ｃｈｒ６：２９９４３８２４－２９９４３８４４、ｃｈｒ６：２９９４３８５７－２９９４３８７７、ｃｈｒ６：２９９４３８５８－２９９４３８７８、ｃｈｒ６：２９９４３８５９－２９９４３８７９、ｃｈｒ６：２９９４３８６０－２９９４３８８０、ｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６、ｃｈｒ６：２９９４４０７７－２９９４４０９７、ｃｈｒ６：２９９４４０７８－２９９４４０９８、ｃｈｒ６：２９９４４４５８－２９９４４４７８、ｃｈｒ６：２９９４４４７８－２９９４４４９８、ｃｈｒ６：２９９４４５９７－２９９４４６１７、ｃｈｒ６：２９９４４６４２－２９９４４６６２、ｃｈｒ６：２９９４４６４３－２９９４４６６３、ｃｈｒ６：２９９４４７７２－２９９４４７９２、ｃｈｒ６：２９９４４７８２－２９９４４８０２、ｃｈｒ６：２９９４４８５０－２９９４４８７０、ｃｈｒ６：２９９４４９０７－２９９４４９２７、ｃｈｒ６：２９９４５０２４－２９９４５０４４、ｃｈｒ６：２９９４５０９７－２９９４５１１７、ｃｈｒ６：２９９４５１０４－２９９４５１２４、ｃｈｒ６：２９９４５１０５－２９９４５１２５、ｃｈｒ６：２９９４５１１６－２９９４５１３６、ｃｈｒ６：２９９４５１１８－２９９４５１３８、ｃｈｒ６：２９９４５１１９－２９９４５１３９、ｃｈｒ６：２９９４５１２４－２９９４５１４４、ｃｈｒ６：２９９４５１７６－２９９４５１９６、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１７７－２９９４５１９７、ｃｈｒ６：２９９４５１８０－２９９４５２００、ｃｈｒ６：２９９４５１８７－２９９４５２０７、ｃｈｒ６：２９９４５１８８－２９９４５２０８、ｃｈｒ６：２９９４５２２８－２９９４５２４８、ｃｈｒ６：２９９４５２３０－２９９４５２５０、ｃｈｒ６：２９９４５２３１－２９９４５２５１、ｃｈｒ６：２９９４５２３２－２９９４５２５２、ｃｈｒ６：２９９４５３０８－２９９４５３２８、ｃｈｒ６：２９９４５３６１－２９９４５３８１、ｃｈｒ６：２９９４５３６２－２９９４５３８２、及びｃｈｒ６：３１３８２５４３－３１３８２５６３、
ｊ．ｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、ｃｈｒ６：２９９４２８１６－２９９４２８３６、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８１７－２９９４２８３７、ｃｈｒ６：２９９４２８２８－２９９４２８４８、ｃｈｒ６：２９９４２８３７－２９９４２８５７、ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４２９０５－２９９４２９２５、ｃｈｒ６：２９９４２９１２－２９９４２９３２、ｃｈｒ６：２９９４２９１３－２９９４２９３３、ｃｈｒ６：２９９４３４９０－２９９４３５１０、ｃｈｒ６：２９９４３４９７－２９９４３５１７、ｃｈｒ６：２９９４３４９８－２９９４３５１８、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５０２－２９９４３５２２、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、及びｃｈｒ６：２９９４２８１５－２９９４２８３５、
ｋ．ｃｈｒ６：２９９４２８８４－２９９４２９０４、ｃｈｒ６：２９９４３５１９－２９９４３５３９、ｃｈｒ６：２９９４２８６３－２９９４２８８３、
ｌ．ｃｈｒ６：２９９４３５１７－２９９４３５３７、及びｃｈｒ６：２９９４３５２３－２９９４３５４３、
ｍ．ｃｈｒ６：２９９４２８４５－２９９４２８６９、ｃｈｒ６：２９９４２８５２－２９９４２８７６、ｃｈｒ６：２９９４２８６５－２９９４２８８９、ｃｈｒ６：２９９４２８９１－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９０３－２９９４２９２７、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２８、ｃｈｒ６：２９９４３５１８－２９９４３５４２、ｃｈｒ６：２９９４３５２５－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３５－２９９４３５５９、ｃｈｒ６：２９９４３５３８－２９９４３５６２、ｃｈｒ６：２９９４３５３９－２９９４３５６３、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４７－２９９４３５７１、ｃｈｒ６：２９９４３５４８－２９９４３５７２、ｃｈｒ６：２９９４３５５５－２９９４３５７９、ｃｈｒ６：２９９４３５５６－２９９４３５８０、ｃｈｒ６：２９９４３５５７－２９９４３５８１、ｃｈｒ６：２９９４３５５８－２９９４３５８２、ｃｈｒ６：２９９４３５５９－２９９４３５８３、ｃｈｒ６：２９９４３５６３－２９９４３５８７、ｃｈｒ６：２９９４３５６４－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６５－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５９２、ｃｈｒ６：２９９４３５７１－２９９４３５９５、ｃｈｒ６：２９９４３５７２－２９９４３５９６、ｃｈｒ６：２９９４３５９５－２９９４３６１９、ｃｈｒ６：２９９４３５９６－２９９４３６２０、及びｃｈｒ６：２９９４３６００－２９９４３６２４、
ｎ．ｃｈｒ６：２９９４２８８５－２９９４２９０５、ｃｈｒ６：２９９４２８９５－２９９４２９１５、ｃｈｒ６：２９９４２８９６－２９９４２９１６、ｃｈｒ６：２９９４２８９８－２９９４２９１８、ｃｈｒ６：２９９４２８９９－２９９４２９１９、ｃｈｒ６：２９９４２９００－２９９４２９２０、ｃｈｒ６：２９９４２９０４－２９９４２９２４、ｃｈｒ６：２９９４３５１１－２９９４３５３１、ｃｈｒ６：２９９４３５２０－２９９４３５４０、ｃｈｒ６：２９９４３５２１－２９９４３５４１、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５６６－２９９４３５８６、ｃｈｒ６：２９９４３５６８－２９９４３５８８、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５６９－２９９４３５８９、ｃｈｒ６：２９９４３５７０－２９９４３５９０、ｃｈｒ６：２９９４３５７３－２９９４３５９３、ｃｈｒ６：２９９４３５７８－２９９４３５９８、ｃｈｒ６：２９９４３５８５－２９９４３６０５、及びｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、または
ｏ．ｃｈｒ６：２９９４２４６９－２９９４２４８９、ｃｈｒ６：２９９４３０５８－２９９４３０７８、ｃｈｒ６：２９９４３０６３－２９９４３０８３、ｃｈｒ６：２９９４３０８０－２９９４３１００、ｃｈｒ６：２９９４３１８７－２９９４３２０７、ｃｈｒ６：２９９４３１９２－２９９４３２１２、ｃｈｒ６：２９９４３１９７－２９９４３２１７、ｃｈｒ６：２９９４３８１２－２９９４３８３２、ｃｈｒ６：２９９４４３４９－２９９４４３６９、ｃｈｒ６：２９９４４９９６－２９９４５０１６、ｃｈｒ６：２９９４５０１８－２９９４５０３８、及びｃｈｒ６：２９９４５３４１－２９９４５３６１、ｃｈｒ６：２９９４５５２６－２９９４５５４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作された細胞。 - 前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９７内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ａ発現が、前記ゲノム座標ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５５０内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ａ発現が、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内に少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含むＨＬＡ－Ａゲノム標的配列に結合する遺伝子編集系によって低減または排除される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ａゲノム標的配列が、前記ゲノム座標内に少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性である、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、及びＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２のうちのいずれか１つから選択され、前記ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、以下のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子：ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２のうちのいずれか１つから選択される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２及びＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１及びＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、前記細胞の表面上でＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を低減した、請求項１～３１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子の遺伝子修飾を有する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子における遺伝子修飾を有する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、前記細胞の表面上でＴＲＡＣタンパク質またはＴＲＢＣタンパク質の発現を低減した、請求項１～３４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、前記操作された細胞の表面上で発現される標的化受容体または前記受容体のリガンドをコードする外因性核酸を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記標的化受容体が、ＣＡＲまたはＴＣＲである、請求項３６に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、前記操作された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、免疫細胞である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、一次細胞である、請求項１～３９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、リンパ球である、請求項１～４１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１～４２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、インデルを含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム座標内に少なくとも１つのＣからＴへの置換または少なくとも１つのＡからＧへの置換を含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
- 請求項１～４６のいずれか１項に記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
- 請求項１～４７のいずれか１項に記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
- 請求項４８に記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
- 前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＨＬＡ－Ａ陰性である、請求項４８に記載の集団または請求項４９に記載の薬学的組成物。
- 前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＣＩＩＴＡ陰性である、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の集団または薬学的組成物。
- 前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定されるとき、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の内因性ＴＣＲタンパク質陰性である、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の集団または薬学的組成物。
- 請求項１～５３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する、方法。
- 請求項１～５３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する、方法。
- 請求項１～５３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を治療する、方法。
- 非修飾細胞と比較してＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減または排除した、操作されたヒト細胞を作製する方法であって、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｂに対してホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃに対してホモ接合性であり、細胞を、
ａ．ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは
ｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは
ｉｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列に対して少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは
ｉｖ．表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは
ｖ．表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは
ｖｉ．（ｖ）から選択される配列に対して少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含む、前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、あるいはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。 - 非修飾細胞と比較してヒト細胞におけるＨＬＡ－Ａタンパク質の表面発現を低減する方法であって、細胞を、
ａ．ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１～２１１から選択されるガイド配列、あるいは
ｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、あるいは
ｉｉｉ．配列番号１～２１１から選択される配列に対して少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列、あるいは
ｉｖ．表２～５に列挙されるゲノム領域を含む標的部位に結合するガイド配列、あるいは
ｖ．表１～２及び５に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、または表４に列挙されるゲノム領域の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であるガイド配列、あるいは
ｖｉ．（ｖ）から選択される配列に対して少なくとも９５％、９０％、または８５％同一であるガイド配列を含む、前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、あるいはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。 - 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９タンパク質を含む、請求項５６または５７に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１である、請求項５６または５７に記載の方法。
- 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤または前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、Ｃ－Ｔ塩基エディター、Ａ－Ｇ塩基エディター、またはＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ（Ａ３Ａ）及びＲＮＡガイドニッカーゼである、請求項５６または５７に記載の方法。
- 前記細胞を、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＲＥＢ、ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ、及びＮＦ－ＹＣから選択される遺伝子を標的化する遺伝子編集系と接触させることによって、非修飾細胞と比較して前記細胞中のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む、請求項５６～６０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞をＣＩＩＴＡガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む、請求項５６～６１のいずれか１項に記載の方法。
- 非修飾細胞と比較して、前記細胞中のＴＣＲタンパク質の表面発現を低減または排除することをさらに含む、請求項５６～６２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞を、外因性核酸と接触させることをさらに含む、請求項５６～６３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記外因性核酸が、前記細胞によって分泌される標的化受容体またはポリペプチドをコードする、請求項６４に記載の方法。
- 前記細胞をＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤（ＤＮＡＰＫｉ）と接触させることをさらに含み、任意選択で、前記ＤＮＡＰＫｉが、化合物１である、請求項６４に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系細胞である、請求項１～６６のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞が、一次細胞である、請求項１～６７のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞が、Ｔ細胞であり、任意選択で、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはメモリーＴ細胞である、請求項１～６８のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞が、Ｂ細胞であり、任意選択で、前記Ｂ細胞が、血漿Ｂ細胞またはメモリーＢ細胞である、請求項１～６８のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞が、幹細胞であり、任意選択で、前記幹細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、または辺縁幹細胞（ＬＳＣ）である、請求項１～６８のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、抗体または抗体断片である、請求項１～７１のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、全長ＩｇＧ抗体、単鎖抗体、または中和抗体である、請求項１～７２のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞によって分泌されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を前記外因性核酸と接触させ、前記分泌されたポリペプチドが、サイトカインである、請求項１～７３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 標的化受容体をコードする外因性核酸を含むか、または前記細胞を標的化受容体をコードする外因性核酸と接触させ、前記標的化受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＡＲ、または増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である、請求項１～７４のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記細胞が、遺伝子編集系で操作される、請求項１～７５のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記遺伝子編集系が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項７６に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記遺伝子編集系が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含み、任意選択で、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、請求項７６に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び／または前記外因性核酸が、ベクターで前記細胞に提供され、任意選択で、前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡ及び前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、同じベクターで提供される、請求項５６～７８のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記ガイドＲＮＡまたは前記外因性核酸が、脂質核酸アセンブリ組成物中、任意選択で、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と同じ脂質核酸アセンブリ組成物中で、前記細胞に提供される、請求項５６～７９のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記脂質核酸アセンブリ組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項８０に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３４４～４３８、４７２～５０４、５３３～５６０、及び１０１６の配列のうちのいずれか１つ、または配列番号３４４～４３８、４７２～５０４、及び５３３～５６０、及び１０１６の配列のうちのいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である配列を含む単一のガイドＲＮＡを含む、請求項５６～８１のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号１３～１８、２６、３７～３９、４１、４３、４５、及び６２のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含むか、あるいは前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、配列番号３５６～３６１、３６９、３８０～３８２、３８４、３８６、３８８、及び４０５の配列のうちのいずれか１つ、または配列番号３５６～３６１、３６９、３８０～３８２、３８４、３８６、３８８、及び４０５の配列のうちのいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である配列を含む単一のガイドＲＮＡを含む、請求項５６～８２のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記ＨＬＡ－ＡガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項５６～８３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記少なくとも１つの修飾が、（ｉ）２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、（ｉｉｉ）２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの５’末端にある最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、（ｖ）前記ガイドＲＮＡの３’末端にある最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、（ｖｉ）前記ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合、（ｖｉｉ）前記ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合、（ｖｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端にある最初の３個のヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｘ）前記ガイドＲＮＡの３’末端にある最後の３個のヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、または（ｉ）～（ｉｘ）のうちの１つ以上の組み合わせを含む、請求項８４に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- がん細胞によって発現されたポリペプチドに対する特異性を有するＴＣＲを発現するために使用するための、請求項１～８５のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 対象に養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として投与する際に使用するための、請求項１～８５のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- がん、感染性疾患、または自己免疫疾患を有する対象を治療する際に使用するための、請求項１～８５のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 細胞バンクであって、
ａ．請求項１～４６及び６７～８８のいずれか１項に記載の操作された細胞、または請求項５６及び５８～８８のいずれか１項に記載の方法によって産生された操作された細胞と、
ｂ．前記細胞バンク中のドナー細胞の前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を文書化する情報を含むカタログと、を含む、前記細胞バンク。 - 前記細胞バンクが、前記細胞バンク中の他のドナー細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子の独自の組み合わせを有する、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０個のドナー細胞を含む、請求項８９に記載の細胞バンク。
- 操作された細胞を、それを必要とするレシピエント対象に投与する方法であって、
ａ．前記レシピエント対象の前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を決定することと、
ｂ．１～４６、４８、５０～５２、及び６７～８８のいずれか１項に記載の操作された細胞もしくは細胞集団、または請求項５６及び５８～８８のいずれか１項に記載の方法によって産生された操作された細胞を選択することであって、前記操作された細胞が、前記レシピエント対象と同じＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、前記選択することと、
ｃ．前記選択された操作された細胞を前記レシピエント対象に投与することと、を含む、前記方法。 - 前記対象が、前記操作された細胞のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する、請求項９１に記載の方法。
- 養子細胞移植（ＡＣＴ）療法のために部分的に適合した対象に投与する際に使用するための、請求項１～９２のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法であって、前記部分的に適合した対象が、前記操作された細胞または細胞集団のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する、前記操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記操作された細胞または細胞集団が、前記対象と共有されるＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む、請求項５３～５５、８７～８８、及び９１～９３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記操作された細胞または細胞集団の前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、前記対象の１つ以上のＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む、請求項５３～５５、８７～８８、及び９１～９３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
- 前記操作された細胞または細胞集団の前記ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が、前記対象の１つまたは両方のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子及び／または１つまたは両方のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む、請求項５３～５５、８７～８８、及び９１～９３のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物、または方法。
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