CN106414500B - 抗-wt1/hla双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种与人免疫效应细胞抗原和WT1肽/HLA‑A表位具有反应性的T细胞受体模拟(TCRm)mAb的双特异性形式。该抗体选择性结合于表达WT1和HLA‑A的白血病和实体瘤细胞以及释放干扰素‑(IFN‑γ)并在体外杀伤靶癌细胞的活化的静止人T细胞。重要的是，所述抗体介导自体T细胞增殖和针对新鲜卵巢癌细胞的定向的强效细胞毒性。利用3种不同的表达WT1/HLA‑A2的人癌症(包括弥漫性Ph+急性淋巴细胞性白血病(ALL)、弥漫性急性髓系白血病或腹膜间皮瘤)在NOD SCID SCID γc^*(NSG)小鼠中证明所述抗体的体内治疗活性。在两个白血病异种移植物模型中，接受所述抗体和T细胞的小鼠也显示更长的存活时间和延迟的肢体瘫痪。还提供了使用本文所述的双特异性抗体刺激初次T细胞应答和二次T细胞应答的方法，所述初次T细胞应答包括刺激针对第一肿瘤抗原的细胞毒性T细胞，所述二次T细胞应答包括刺激针对第一肿瘤抗原和/或针对第二肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞。

Description

抗-WT1/HLA双特异性抗体

相关申请的交叉引用

据此依据35U.S.C.§119(e)要求2013年11月7日提交的美国临时申请序列第61/901,310号和2014年8月15日提交的美国临时专利申请序列号62/037,875的权益，这两个优先权文件的公开内容通过引用整体并入本文。

本申请包含与下列申请的主题相关的主题：2011年4月1日提交的美国临时申请第61/470,635号和2011年5月31日提交的美国临时申请第61/491,392号，以及2013年9月27日提交的标题为"T-Cell Receptor Like Antibodies Specific for WT1 Peptides"的美国非临时申请第14/008,447号和2013年3月15日提交的标题为"Antibodies to CytosolicPeptides"的共同转让的美国临时申请第61/798,563；每个申请的内容据此通过引用整体并入。

联邦资助研究下的权利声明

本发明根据美国国立卫生研究院授予的第P01CA23766和R01CA55349号拨款在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

序列表

本申请包含计算机可读格式的序列表(文件名：48317_SeqListing.txt；创建于：2014年11月7日；大小：93,841个字节)作为本公开的单独部分，所述序列据此通过引用整体并入本申请。

技术领域

本发明总体上涉及抗胞质溶胶蛋白的抗体。更具体地说，本发明涉及抗维尔姆斯氏肿瘤(Wilm's tumor)癌基因蛋白(WT1)的抗体，特别是识别与主要组织相容性抗原以及免疫效应细胞表面上展示的抗原结合的WT1肽的双特异性抗体。

发明背景

识别MHC I类分子的背景中的关键细胞内蛋白的肽片段的治疗性T细胞受体样单克隆抗体(TCRm mAb)的开发，正作为靶向细胞内肿瘤特异性抗原(Ag)的新方法出现。大多数肿瘤特异性Ag是对于经典mAb疗法来说不可及的细胞内蛋白质。这些蛋白质被降解、加工并通过MHC I类分子作为肽/MHC复合物来展示，所述肽/MHC复合物被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的TCR识别。因此，许多针对触发对低密度的肿瘤特异性肽/MHC复合物的T细胞应答的方法已被尝试，取得有限的成功。肾母细胞瘤蛋白(WT1)是用于T细胞免疫疗法的被良好验证的人类肿瘤特异性Ag。WT1在广泛的人造血恶性肿瘤、白血病干细胞以及不同实体瘤中过表达。在正常成人组织中，所述蛋白具有有限的低表达，这使得其成为理想的癌症特异性靶(Gessler等Nature.1990；346(6280):194-197；Menssen等Leukemia.1995；9(6):1060-1067；Oji等Jpn J Cancer Res.1999；90(2):194-204)。WT1表位特异性T细胞和针对WT1全蛋白的抗体在患有造血恶性肿瘤和实体瘤的患者中均被检测到，这表明WT1是高度免疫原性抗原(Gaiger等Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research.2001；7(3增刊):761s-5s；Gillmore等Clinicalcancer research:an official journal of the American Association for CancerResearch.2006；12(1):34-42)。此外，在异体移植干细胞移植后观察到移植物抗白血病与可检测的WT1特异性CTL之间的相关性，进一步证明了这些T细胞的治疗活性。

WT1-衍生的肽片段RMFPNAPYL(RMF；SEQ ID NO:1)是在HLA-A0201分子的背景中用于CD8T细胞识别的研究最充分和验证最充分的表位。RMF表位已被广泛地应用于肽疫苗或作为来自患者(患有急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)和各种实体瘤)的离体扩增的过继转移的CD8T细胞的靶。这些研究证明与一些患者中的临床应答相关的肽表位的免疫原性(Krug等Cancer Immunol Immunother.2010；59(1467-1479)；Maslak等Blood.2010；116(2):171-9；Keilholz等Blood.2009；113(26):6541-8；Oka等ScientificWorldJournal.2007；7:649-65；Oka等Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America.2004；101(38):13885-90；Letsch等和Keiholz,U.，编辑Associate for Immunotherapy of Cancer:Cancer Immunotherapy-2ndAnnual Meeting；2004；Mainz,Germany)。

尽管T细胞免疫疗法取得了显著进展，但仍然很少看到客观临床反应。基于T细胞的疗法的低效率已被归因于低的TCR亲和力，有限的针对高肿瘤负荷的体内强效细胞毒反应、效应细胞的持久性的缺乏，对自身肿瘤Ag的耐受性和通过T调节性(T-reg)细胞和细胞因子产生的免疫抑制(Morris等Blood Reviews 2006；20:61-69；Konnig R.Curr OpinImmunol 2002:14(1)75-83)。为了开发靶向WT1的该重要表位的不同方法，产生对于RMF/HLA-A0201复合物是特异的完全人TCRm mAb。所述mAb显示通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的针对表达WT1的白血病和实体瘤的体外和体内强效治疗活性(Dao等Sci TranslMed.2013；5(176):176ra133)。

ADCC取决于天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和其他免疫效应细胞的存在，所述细胞在白血病或癌症患者中，尤其在治疗后，可以是极其异质的。调节mAb细胞溶解疗法的替代性和有效方法是使用T细胞作为效应细胞。T细胞是最强效的细胞毒性细胞之一，并且占据最大数量的循环细胞毒性细胞。将mAb特异性添加至T细胞的最近方法，诸如经工程化具有基于抗体的嵌合抗原受体(称为CAR)和具有针对肿瘤Ag和CD3T细胞的双重特异性的过继转移的T细胞，已作为将多克隆人T细胞重定向至定义明确的肿瘤相关Ag的高效策略出现。双特异性抗体构建体被设计来将癌细胞上的表面Ag与T细胞上的TCR/CD3复合物交联。所述分子可重定向CD4和CD8T细胞，从而以不依赖于细胞的内部Ag特异性TCR识别、共刺激分子和肿瘤细胞上的HLA表达的一系列方式杀伤肿瘤细胞。其还避免疫苗接种、细胞因子施用或Ag-特异性患者来源的T细胞的离体扩增和输注(Frankel和Baeuerle.Currentopinion in chemical biology.2013；17(3):385-92；Brischwein等Journal ofimmunotherapy.2007；30(8):798-807；Nagorsen等Pharmacology&therapeutics.2012；136(3):334-42；Aigner等Leukemia.2013；27(5):1107-15；Spiess等Naturebiotechnology.2013；31(8):753-8；Nagorsen和Baeuerle.Experimental cellresearch.2011；317(9):1255-60)。对于总B细胞Ag CD19和TCR的CD3e信号链是特异的双特异性T细胞接合子

抗体兰妥莫单抗(Amgen,Thousand Oaks,CA)被FDA批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病(ALL)。

发明概述

先前已描述的双特异性抗体均涉及步是肿瘤特异性的公知的高密度细胞表面Ag。本公开提供了从TCRm mAb衍生的双特异性抗体(称为ESK)。ESK-双特异性抗体能够选择性结合WT1/HLA-A0201阳性肿瘤细胞，并且在多种人癌症模型中通过重定向人T细胞的细胞毒性显示强效治疗活性。T细胞群体至癌症的重定向通过双重靶和效应细胞跟踪及成像来证明。本文所述的TCRm mAb双特异性抗体是靶向广泛表达的低密度细胞内肿瘤特异性Ag例如WT1的强效治疗剂。本文所述的双特异性抗体也能够诱导对于除WT1外的抗原是特异的二次T细胞应答。

在一个方面，本发明涉及重组抗体，其包含特异性结合与主要组织相容性复合物抗原诸如HLA-A2复合的WT1肽并从而甚至当WT1以低密度存在时，可结合WT1/HLA-A2⁺细胞的第一抗原结合部分。所述抗体还包含特异性结合免疫效应细胞上的表面抗原诸如CD3，从而也可结合所述免疫效应细胞的第二抗原结合部分。

在一个方面，本发明涉及重组抗体，其中所述重组抗体包含：(i)第一抗原结合部分，其包含：(A)包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)可变区；和包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)可变区；(B)包含表1-6中所示的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的VH和VL；或(C)包含表1-6中所示的氨基酸序列的scFv；和(ii)第二抗原结合部分，其包含表7中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组抗体包含图10中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)。

在另一个方面，本发明涉及编码本文中公开的重组双特异性抗体的核酸。

在相关方面，本发明涉及包含所述重组双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在另一个方面，本发明涉及包含编码所述重组双特异性抗体的核酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在另一个方面，本发明涉及用于杀伤WT1⁺细胞的方法，所述方法包括将WT1⁺细胞与具有对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的特异性抗体和细胞毒性T细胞的接触。在一些实施方案中，所述细胞毒性T细胞是自体细胞。

在另一个相关方面，本发明涉及治疗患有WT1阳性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的重组双特异性抗体。在一个实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用为自体的CD3⁺细胞毒性T细胞。在一个实施方案中，所述WT1阳性疾病是慢性白血病或急性白血病或WT1⁺癌症，例如慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性/髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、间皮瘤、卵巢癌、胃肠癌、乳腺癌、***癌和胶质母细胞瘤。

在一个方面，本发明涉及重组双特异性抗体，其包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的单链可变片段(scFV)：SEQ IDNO:18、36、54、72、90、108和132；或(B)重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL分别包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:(i)14和16；(ii)32和34；(iii)50和52；(iv)68和70；(v)86和88；(vi)104和106；(vii)128和130；或(C)(i)随后3个VH互补决定区(CDR)：(a)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:2、20、38、56、74、92和116；和(b)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ IDNO:3、21、39、57、75、93和117；和(c)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR3：SEQID NO:4、22、40、58、76、94和118；和(ii)随后3个VL CDR：(a)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO:8、26、44、62、80、98和122；和(b)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:9、27、45、63、81、99,和123；和(c)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO:10、28、46、64、82、100和124。所述重组双特异性抗体还包含第二抗原结合部分，其包含(A)包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL分别包含SEQ IDNO:111和112或SEQ ID NO:134和136中所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了在受试者中刺激初次T细胞应答和二次T细胞应答的方法，所述方法包括施用包含重组抗体的组合物，所述重组抗体包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分特异性地结合于第一肿瘤抗原，并且所述第二抗原结合部分特异性地结合于免疫效应细胞表面抗原，其中初次T细胞应答包括刺激针对所述第一肿瘤抗原的细胞毒性T细胞，并且其中所述二次T细胞应答包括刺激针对所述第一肿瘤抗原和/或针对第二肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞。在一个方面，所述二次T细胞应答不需要抗原呈递细胞或共刺激分子。在另一个方面，所述二次T细胞应答包括刺激针对所述第二肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞。在一个方面，所述第二个肿瘤抗原是非WT1-RMF肿瘤抗原。

在另一个方面，本发明提供了产生针对肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞的方法，所述方法包括用本文公开的重组双特异性抗体活化T细胞。可体内或离体地产生效应T细胞和/或记忆T细胞。在一个方面，产生针对非WT1-RMF肿瘤抗原例如HER2-neu的效应T细胞和/或记忆T细胞。

上文中的概述不旨在限定本发明的每个方面，并且根据以下详细描述(包括附图)本公开的其他特征和有利方面将变得显而易见。本公开旨在作为统一的文件而相关，并且应当理解，设想了本文所述的特征的所有组合，即使特征的组合未在本公开的同一个句子、段落或部分中一起被发现。另外，作为另一个方面，本公开以任何方式在比上文中明确提及的变化更窄的范围内包括本发明的所有实施方案。关于利用“一个”或“一种”描述或要求的本公开的方面，应当理解，除非上下文明确要求更受限制的含义，否则这些术语意指“一个/种或多个/种”。关于被描述为组内的一个或多个的元件，应当理解，设想了组内的所有组合。如果本公开的方面被描述为“包含”特征，则实施方案也被设想“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”。根据本申请的整体性，本公开的另外的特征和变化对于本领域技术人员而言是显然的，并且所有此类特征旨在作为本公开的方面。

附图简述

图1显示通过流式细胞术测量的ESK双特异性抗体的一个实施方案与肿瘤细胞和人T细胞的选择性结合。以10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml的浓度用ESK-双特异性抗体或对照，随后用对于缀合于FITC的His标签是特异的第二mAb对SET-2(1A)、HL-60(1B)或纯化的人CD3T细胞(1C)进行染色。ESK-双特异性抗体在10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的浓度下显示对SET-2细胞的选择性结合。在指定的浓度下单独的对照第二mAb和对照双特异性抗体不结合细胞。ESK和对照双特异性抗体在所有测试的浓度下均不结合于HL-60。对于静止人T细胞，ESK-双特异性抗体显示比对照双特异性抗体更弱的结合。针对ESK-双特异性抗体的中位荧光强度(MFI)：在10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的浓度下分别为91.4、41和13.2。对于对照双特异性抗体：在10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的浓度下分别为188、153和26.2。(1D)ESK-双特异性抗体在WT1+/HLA-A0201+肿瘤细胞存在的情况下诱导IFN-γ分泌。用或不用浓度为3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml或0.03μg/ml的ESK-双特异性抗体或对照双特异性抗体孵育比率为15:1的人T细胞和SET-2细胞，进行过夜。收集上清液，并通过ELISA试剂盒测量IFN-γ释放。单独的T细胞或T细胞与SET-2细胞加上对照双特异性抗体的培养不显示任何可检测的IFN-γ。从而将它们的值从显示的数据扣除。所述数据显示一式二份培养的平均值并且代表两个相似实验之一。

图2显示ESK-双特异性抗体定向针对WT1+/HLA-A0201+肿瘤细胞的T细胞的细胞毒性。在指定浓度的ESK或对照双特异性抗体存在或不存在的情况下，以40:1的E:T比率用SET-2(2A)或HL-60细胞(2B)孵育纯化的T细胞。在5小时的孵育后通过⁵¹Cr-释放测量T细胞的细胞毒性。类似地，在以100:1的E:T比率进行的6小时-⁵¹Cr释放测定中ESK-定向的PBMC针对来自患者的BV173(2C)和CML母细胞(2D)的细胞毒性。通过以指定的E:T比率进行的针对BV173(2E)、JMN(2F)和原发性卵巢癌细胞(2G)的5小时⁵¹Cr释放测定测量ESK-双特异性抗体介导的由EBV致敏的人T细胞产生的细胞毒性。以0.1μg/ml使用双特异性抗体。所有数据点为一式三份培养的平均值，并且代表2至3个相似实验之一。

图3显示ESK-双特异性抗体在自体卵巢癌细胞存在的情况下诱导T细胞活化。在0.1μg/ml ESK或对照双特异性抗体存在的情况下，用自体经辐照的卵巢癌细胞孵育指定数目的来自患者的PBMC/孔，进行前3天。(3A)将细胞培养总共7天，在第8天，将⁵¹Cr-标记的自体肿瘤细胞添加至数千个细胞/孔的效应细胞。6小时后测量⁵¹Cr-释放。(3B)用或不用0.1μg/ml的ESK或对照双特异性抗体孵育PBMC、自体卵巢癌细胞，或PBMC加上卵巢癌细胞，进行7天。添加³H-胸苷过夜，第2天收获细胞。数据代表一式三份培养。

图4显示ESK-双特异性抗体有效地治疗NSG小鼠中的BV173和ALL。在第0天将200万个BV173细胞静脉内注射入小鼠，在第5天确认肿瘤移植物植入，以及将小鼠随机分成治疗组。在第6天静脉内给予1000万个EBV-特异性T细胞，随后在4至5小时后静脉内注射20μg的ESK1或对照双特异性抗体。每周给予1次T细胞，每周给予2次双特异性抗体，持续总共3周。(4A)通过从小鼠的前面进行生物发光成像(BLI)来显示肿瘤负荷。第6天的BLI显示治疗前的肿瘤移植物植入。接受T细胞和ESK-双特异性抗体的小鼠显示肿瘤负荷的显著减小，尤其在骨髓中。(4B)通过将每一只小鼠背面和前面两个位置的发光信号求和计算肿瘤负荷，将每一个组(n＝5)的平均信号绘图。(4C)通过每周称取小鼠的重量评估GVHD，并且未观察到GVHD长达49天。(4D)ESK-双特异性抗体在NSG小鼠中抑制原发性ALL细胞生长。将500万个原发性肿瘤ALL细胞静脉内注射入NSG小鼠。第6天，在通过萤火虫BLI确认肿瘤移植物植入后，将小鼠随机分成不同的治疗组。将3000万个EBV-特异性T细胞静脉内注射入小鼠，随后静脉内注射20μg ESK-双特异性抗体或其对照双特异性抗体。每日进行一次双特异性抗体注射，每周给予T细胞2次，持续总共2周。在肿瘤接种后第18天和第23天的肿瘤抑制示于每一个时间点的俯卧和仰卧视图中。(4E)来自ALL小鼠模型的数据：来自5只小鼠的平均光子/秒显示超过3周后的利用ESK-双特异性抗体处理的小鼠中的肿瘤负荷的近百倍的减小。

图5显示ESK-双特异性抗体有效地治疗NSG小鼠中的SET-2AML。在该模型中，在于第4天确认肿瘤移植物植入后，每周2次静脉内给予1000万个EBV-特异性T细胞，并且每天注射20μg双特异性抗体一次，持续总共6天。(5A)从小鼠的背面显示了肿瘤负荷，以显示脊髓白血病浸润，以显示所有组中的白血病负荷。BLI的尺度从第7天起在图像上增加至约10倍。(5B)通过对每一只小鼠的背面和前面两个位置的发光信号求和来计算肿瘤负荷，将每一个组(n＝5)的平均信号绘图。(5C)还通过因中枢神经***损伤引起的肢体瘫痪来评估白血病浸润。接受T细胞和ESK-双特异性抗体的小鼠未显示CNS麻痹。每一个条块显示5只小鼠/组的平均值。

图6显示ESK-双特异性抗体在荷瘤小鼠的骨髓中介导T细胞保留。(6A)将2000万个海肾转导的EBV-特异性T细胞静脉内注射入已植入了SET-2细胞的小鼠。4小时后，通过静脉内注射给予20μg ESK或对照双特异性抗体。在T细胞注射后立即(0小时)，在双特异性抗体注射后4小时，随后每天通过海肾生物发光成像监测T细胞分布，持续总共3天。(6B)通过对每一只小鼠的发光信号求和来计算T细胞信号，并将每一组(n＝3)的平均信号绘图。(6C)在指定的时间点通过萤火虫生物发光成像同时监测SET-2白血病负荷。单独接受T细胞的小鼠未显示萤火虫信号。接受T细胞和ESK-双特异性抗体的小鼠相较于接受SET-2细胞的小鼠显示白血病负荷的急剧减小。肿瘤抑制与T细胞保留相关联，如图7B中显示的。

图7显示ESK-双特异性抗体消除NSG小鼠中的腹膜间皮瘤细胞。将3000个JMN细胞与6000个EBV-特异性T细胞混合，并将其腹膜内注射入小鼠。1小时后，静脉内注射ESK或对照双特异性抗体，并在连续5天重复该过程。通过在指定的时间点进行萤火虫生物发光成像来监测肿瘤发展。(7A)第1天(处理后1天)在利用ESK-双特异性抗体处理的小鼠中未显示可见的肿瘤，这表明肿瘤细胞的消除。(7B)来自5只小鼠的平均光子/秒显示在超过3周后利用ESK-双特异性抗体处理的小鼠中的肿瘤负荷的将近100倍的减小。

图8显示比较ESK1-L2K双特异性抗体的结合与ET901+L2K双特异性抗体和ET901+OKT3双特异性抗体的结合的FACS结合分析的结果。

图9显示比较ESK1-L2K双特异性抗体的结合与ET901+L2K双特异性抗体和ET901+OKT3双特异性抗体的结合的FACS结合分析的结果。

图10显示包含特异性结合于WT1/HLA-A2的scFv和特异性结合于Cd3的scFv的双特异性抗体的实施方案的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)。

图11A为1)ESK1/OKT3(2μg，还原的)；2)901/OKT3(2μg，还原的)；3)SeeBlue Plus预染色的标准；4)ESK1/OKT3(2μg，非还原的)；5)901/OKT3(2μg，非还原的)的PAGE。11B显示标准。

图12显示抗WT1/HLA-A2复合物的ESK1双特异性单克隆抗体的缔合和离解。

图13显示通过ESK1/OKT3双特异性单克隆抗体(13A)和ESK1与OKT3的混合物(13B)的阳离子交换层析进行的纯化的结果。

图14显示通过ET901/OKT3双特异性单克隆抗体(14A)和901与OKT3的混合物(14B)的阳离子交换层析进行的纯化的结果。

图15显示通过FACS显示的对CD3-阳性Jurkat细胞的结合。

图16显示ESK-双特异性抗体在自体背景中诱导T细胞活化。在20μg/ml的ESK或对照-双特异性抗体存在或不存在的情况下，将来自具有AML的HLA-A2+患者(复发前)的PBMC与纯化的自体CD33+骨髓母细胞(复发后)共培养，在第3和第4天用CD33(针对母细胞)(16B)和CD3(针对T细胞)(16A)进行双重染色，以评估CD3T细胞和母细胞的百分比。通过台盼蓝计数来自CD3+(16C)和CD33+(16D)培养物的活细胞，通过将每一个群体的百分比乘以总细胞数来获得绝对细胞数目。

图17显示ESK-双特异性抗体的药代动力学。数据代表3只小鼠/组的平均值。(17A)使用ESK双特异性抗体静脉内注射入C57BL6/J或腹膜内注射入BALB/c的示踪¹²⁵I-标记的构建体测定ESK双特异性抗体的药代动力学，在48-52小时内测量血液放射性。静脉内注射的双特异性抗体以30分钟的α半衰期迅速地从血液再分配至组织，随后以5小时的β半衰期被清除。在腹膜内递送后，双特异性抗体水平在血液中升高，在注射后3小时达到峰值。随后构建体以相同的β半衰期被清除。来自静脉内注射的总暴露(曲线下面积)大于对于腹膜内注射的总暴露。(17B)使用相同的放射性标记的构建体测定抗体的生物分布模式。2小时后，在除胃和肠道外的主要组织中检测到3％或更少的注射的剂量/克，所述胃和肠道清除脱卤碘。4小时后，在除胃外的主要组织中检测到2％或更少的注射的剂量/克。7小时后，在除胃外的主要组织中检测到1％或更少的注射的剂量/克。

图18显示原发性卵巢癌细胞上的肿瘤抗原的表达。(18A)通过用缀合于FITC的抗-人HLA-A2mAb克隆BB7.2和其同种型对照小鼠IgG2b/FITC对肿瘤细胞进行染色来测量原发性卵巢癌细胞上的HLA-A2的表达。(18B)通过用3μg/ml的缀合于APC的mAb ESK和其同种型对照人IgG1/APC对细胞进行染色来测量相同肿瘤细胞上的WT1RMF/HLA-A2复合物的表达。通过用10μg/ml或1μg/ml的赫赛汀，随后用缀合于FITC的山羊抗-人IgG1mAb对细胞进行染色来测量相同肿瘤细胞上的Her2-neu表达。将利妥昔单抗用作同种型对照。

图19显示ESK-双特异性抗体诱导针对HLA-A2分子的背景中的除WT1RMF外的表位的二次T细胞应答。(19A)在0.1μg/ml的ESK-双特异性抗体或对照双特异性抗体、人IL-5(5ng/ml)和人IL-2(10个单位/ml)存在的情况下，以5:1的效应子:靶比率利用自体肿瘤细胞刺激来自卵巢癌患者的PBMC持续1周，以及通过针对用20μg/ml的指定的肽脉冲的T2细胞进行的IFN-g elispot测定测量表位特异性应答。(19B)以相同的方式，以9:1的效应子:靶比率再刺激来自(A)中的实验的剩余的PBMC，以及通过IFN-g elispot测定测量表位特异性T细胞应答。进行相同的刺激方案和IFN-g elispot测定以比较(19C)纯化的CD3+T细胞对比耗竭了NK和巨噬细胞(指定为T+B)的PBMC、或(19D)PBMC对比纯化的CD3+T细胞或利用死亡的自体肿瘤细胞刺激的T细胞之间的表位特异性T细胞应答。通过频繁的冻融而不使用DMSO来产生死亡的肿瘤细胞。数据代表一式三份培养物的平均值+/-SD。在3小时、3天和6天后收集在0.1μg/ml的双特异性抗体存在或不存在的情况下的来自PBMC或纯化的T细胞与自体卵巢癌细胞的共培养物的上清液，以及通过ELISA试剂盒测量IFN-γ(19E)和TNF-α(19F)。

图20显示通过用不同浓度的小鼠抗-人CD86mAb/PerCp或其同种型对照对细胞进行染色测量的，来自正常供体的PBMC(顶图)和来自患者的卵巢癌细胞(底图)上的共刺激分子CD86表达。同种型对照：1:50、100和200倍稀释。抗-CD86抗体：1:50、100和200倍稀释。

图21显示长寿命的细胞毒性效应细胞的产生。(21A)在于自体肿瘤细胞存在的情况下用ESK-双特异性抗体(0.1μg/ml)活化之前，和之后7周用CD4、CD8、CD45RA、CD45RO和CCR7对图19中的来自患者的PBMC进行染色。显示了门控的CD8T细胞上的CD45RA和CD45RO对比CCR 7。(21B)如通过流式细胞术和细胞计数测量的在双特异性抗体活化后7周CD8T细胞的大的选择性增加。(21C)通过每周补充IL-15(5ng/ml)和IL-2(10U/ml)(持续5周)来扩增来自图19中显示的实验的效应细胞，以及通过标准⁵¹Cr-释放测定来针对自体肿瘤、SET-2和HL-60细胞测量细胞毒性。数据代表一式三份孔的平均值。

发明详述

本文中引用的所有出版物、专利和其他参考文献通过引用整体并入本公开内容。除非另外明确地指出，否则通过引用并入的主题被认为不是对任何权利要求限制的替代。

除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应包括单数。通常地，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和本文所述的杂交的技术结合使用的术语以及所述技术为本领域中公知和常用的那些术语和技术。在实施本发明中，使用免疫学中的许多常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力之内。这些技术更详细地描述于例如"Current Protocolsin Immunology"(John E.Coligan等，编辑，John Wiley&Sons,Inc.1991和定期更新)；Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Melvyn Little，编辑CambridgeUniversity Press 2009中。被本领域技术人员是广泛已知的和依赖于本领域技术人员的这些参考文献和含有标准方案的其他参考文献的内容，包括制造商的说明书和剂量信息，在此通过引用作为本公开的部分并入。

以下缩写用于整个申请中，并且通常旨在被与本领域中已知的所述术语的含义一致地解释：

Ab：抗体

ADCC：抗体依赖性细胞的细胞毒性

ALL：急性淋巴细胞白血病

AML：急性髓系白血病

BiTE：双特异性T细胞接合子

CDC：补体依赖性细胞毒性

CMC：补体介导的细胞毒性

CDR：互补决定区(也参见下面的HVR)

CL：轻链的恒定结构域

CH1：重链的第一恒定结构域

CH1、2、3：重链的第1、第2和第3恒定结构域

CH2、3：重链的第2和第3恒定结构域

CHO：中国仓鼠卵巢

CML：慢性粒细胞性白血病；也称为慢性髓细胞性白血病和慢性髓性白血病

CTL：细胞毒性T细胞

E:T比率：效应子:靶比率

Fab：抗体结合片段

FACS：荧光活化细胞分选

FBS：胎牛血清

FR：框架区

GVHD：移植物抗宿主病

HC：重链

HLA：人白细胞抗原

HVR-H：高变区-重链(也参见CDR)

HVR-L：高变区-轻链(也参见CDR)

Ig：免疫球蛋白

KD：解离常数

k_off：解离速率

k_on：缔合速率

MHC：主要组织相容性复合物

MM：多发性骨髓瘤

scFv：单链可变片段

V_H：可变重链包括重链高变区和重链可变框架区

V_L：可变轻链包括轻链高变区和轻链可变框架区

WT1：肾母细胞瘤蛋白1

在下面的说明中，本文中所用的术语旨在被与这些术语正如它们被本领域技术人员所已知的一样的含义一致地解释。本文在下面提供的定义意在澄清而非限制定义的术语。

如本文中所用，"施用"是指向受试者的身体施加活性成分。

"抗体"，正如这些术语在本领域中所为人已知的，是指免疫***的抗原结合蛋白。术语"抗体"，如本文中提及的，包括具有抗原结合区的完整、全长抗体，其中“抗原结合部分”或“抗原结合区”得以保留的其任意片段，或其单链，例如，单链可变片段(scFv)。天然存在的"抗体"是包含通过二硫键链间连接(inter-connected)的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定(CH)区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定CL区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分成间插以称为框架区(FR)的更加保守的区域的称为互补决定区(CDR)的高变区。每一个VH和VL由按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。

如本文中所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合区”是指结合抗原并且赋予抗体抗原特异性的抗体的区域或部分；抗原结合蛋白的片段，例如，抗体包括保留特异性结合抗原(例如，肽/HLA复合体)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗体片段”所涵盖的抗原结合片段的实例包括Fab片段；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含通过铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等，Nature 1989；341:544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。

此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成接头将它们联接，所述接头使得它们能够被产生为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链。这些被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等，1988Science 242:423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。这些抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且以与针对完整抗体所使用的方式相同的方式来筛选所述片段的效用。

如本文中所用，术语“有效量”意指将会引发例如由研究人员或临床医师正在寻求的组织、***、动物或人的生物或医学反应的化合物或治疗剂的量。

术语“治疗有效量”意指相较于未曾接受此量的相应受试者，导致疾病、病症或副作用的改进的治疗、治愈、预防或改善或疾病或病症的进展速率的减小的任何量。所述术语还在其范围内包括有效地增强正常生理功能的量。.

本公开提供了与双特异性抗体相关的组合物和治疗方法。在一个方面，本发明提供了在受试者刺激初次T细胞应答和二次T细胞应答的方法，所述方法包括施用包含重组抗体的组合物，所述重组抗体包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分特异性结合第一肿瘤抗原并且所述第二抗原结合部分特异性结合免疫效应细胞表面抗原，其中所述初级T细胞响应包括刺激针对第一肿瘤抗原的细胞毒性T细胞，并且其中所述二次T细胞应答包括刺激针对所述第一肿瘤抗原和/或针对第二肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞。在一个方面，所述第一肿瘤抗原为WT1/HLA并且所述第二肿瘤抗原为非-WT1-RMF肿瘤抗原。在相关方面，本发明提供了产生针对肿瘤抗原(任选地非-WT1-RMF肿瘤抗原诸如HER2-neu)的效应T细胞和/或记忆T细胞的方法。本公开的方法还可包括施用免疫效应细胞，例如，细胞毒性细胞诸如CD3+细胞毒性T细胞。通过产生效应T细胞，例如针对肿瘤抗原的细胞毒性T细胞和/或记忆T细胞，本公开的双特异性抗体从而能够实现抗肿瘤细胞的疫苗作用，并且可用于产生用于过继T细胞疗法的细胞。

在另一个方面，本发明提供了用于杀伤WT1阳性细胞的改进的抗-WT1抗体。所述改进的抗-WT1抗体为双特异性抗体，其具有特异性结合WT1(当其以受组织相容性限制的方式利用HLA速递时)的第一抗原结合部分，和特异性结合免疫效应细胞表面上的细胞表面抗原例如CD3，从而能够啮合免疫效应细胞，例如CD3⁺T细胞(即，细胞毒性T细胞)的第二抗原结合部分。在一个方面，根据本公开的重组抗体或其衍生物或片段包含：(i)第一抗原结合部分，其包含：(A)包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)可变区；和包含含有表1-6中所示的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)可变区；(B)包含表1-6中所示的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的VH和VL；或(C)包含表1-6中所示的氨基酸序列的scFv；和(ii)包含表7中所示的氨基酸序列的第二抗原结合部分。在一个方面，所述第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分是抗体片段。抗体片段的实例包括，但不限于Fab片段；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段；包含通过铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段；分离的CDR；和scFv。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有第一结合部分，所述第一结合部分具有包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的可变重链区和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可变轻链区或具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的scFv。此外，所述双特异性抗体具有第二结合部分，所述第二结合部分包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的L2K重链可变区和含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的L2K轻链可变区。

在其他实施方案中，本发明的双特异性抗-WT1抗体的WT1/HLA结合部分包含表1-6或8中所列的一个或多个氨基酸序列(scFv、VH和VL区或CDR)。

在下面表1-7中的序列中，粗体文本指示高变重链与轻链序列之间的接头序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含用于纯化的组氨酸标签。在一些实施方案中，所述抗体包含信号肽和一个或多个包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头。

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

在一个实施方案中，ESK1-双特异性抗体包含特异性结合WT1/HLA-A2并且包含如表1-6中所示的WT1/HLA-A2抗体的氨基酸序列之一的第一抗原结合部分，和结合CD3并且包含上表7中显示的氨基酸序列的抗原结合部分。在一个实施方案中，所述抗体具有图10中显示的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)。在另一个实施方案中，ESK1-双特异性抗体包含特异性结合WT1/HLA-A2并且包含如表8中所示的WT1/HLA-A2抗体的氨基酸序列之一的第一抗原结合部分，和结合OKT3并且包含表9中所示的氨基酸序列的抗原结合部分。

表8

表9

本公开的重组双特异性抗体还包含大体上同源的多肽，其具有与表1-9中描述的肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的抗原结合部分。

根据本公开的双特异性抗体可通过许多常规技术的任何技术来制备。例如，可使用本领域已知的任何技术在重组表达***中产生它们。参见，例如，MonoclonalAntibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等(编辑),Plenum Press,New York(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Land(编辑),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。某些技术包括分离编码目标抗体的多肽链(或其部分)的核酸，和通过重组DNA技术操作所述核酸。可将所述核酸与另一个目标核酸融合，或对其进行改变(例如，通过诱变或其他常规技术)以添加、删除或取代一个或多个氨基酸残基。

本领域中已知的任何表达***可用于产生本公开的重组双特异性抗体。通常地，用包含编码所需多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可使用的宿主细胞当中有原核生物细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。原核生物包括革兰阴性或革兰阳性生物，例如大肠杆菌(E.coli)或和芽孢杆菌属(bacilli)。高等真核生物细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的已建立的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞(ATCC CRL1651)的COS-7品系(Gluzman等，1981,Cell 23:175)、L细胞系、293细胞系、C127细胞系、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HeLa细胞系、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和来源于非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系，如由McMahan等，1991,EMBO J.10:2821描述的。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体例如由Pouwels等，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985在本领域中进行了描述。

可在促进多肽表达的条件下培养转化的细胞，并通过常规蛋白质纯化方法回收多肽。一个这样的纯化方法包括例如在使全部或一部分抗原结合于其的基质上使用亲和层析。被考虑用于本文中的多肽包括大体上不含污染性内源材料的大体上均一的重组双特异性抗体。

在一个方面，从用编码具有第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的肽的重组表达载体转化的宿主细胞产生根据本公开内容的双特异性抗体。在另一个方面，从两个单独的抗体(即，例如使用二硫键连接的具有第一抗原结合部分的抗体和具有第二抗原结合部分的抗体)产生本公开的双特异性抗体。

本文中公开的双特异性抗体的氨基酸序列可以通过本领域中已知的任何方法进行验证，并且可与本文在表1-9中公开的序列相同，或作为加工的结果可在一个或多个氨基酸残基上与这些序列相异。例如，在所有或一部分大体上同源的双特异性抗体上，可通过蛋白水解加工或在培养过程中发生的其他加工，例如C末端Lys残基的加工来除去来自轻链或重链(或相关单链分子)的C-末端氨基酸。或者，可以除去不止一个C末端氨基酸残基，例如2个C-末端氨基酸，或3、4或5个C-末端氨基酸。类似地，N-末端氨基酸可以不存在，例如，1、2、3、4或5个N末端氨基酸可以不存在。

可选择地，或另外地，所述双特异性抗体可经历翻译后修饰，例如但不限于，可将谷氨酰胺环化或转化成焦谷氨酸；另外地或可选择地，氨基酸可经历脱酰胺、异构化、糖基化和/或氧化。本发明的多肽可经历另外的翻译后修饰，包括在本领域中公知的位点上的糖基化，例如N-连接或O-连接糖基化。如先前所述，可在多肽的氨基酸序列中产生变化以排除此类选择或从使此类选择最少化，或在其中此类加工是有益的环境中促进它们。

根据本公开的双特异性抗体包括已以任何方式和出于任何理由被修饰以实现以下目的的多肽：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变结合亲和力以形成蛋白质复合物，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修改其他物理化学或功能性质。另外，在表1-9的任何表中描述的序列中(例如，在形成分子间接触的结构域外部的多肽的部分中)产生的单个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)(例如，在部分的多肽的域形成分子间接触外)包括本公开中。还可使用利用相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)进行的对共有序列的一个或多个氨基酸的***性取代，例如，以产生更稳定的肽秒。另外，共有序列可用于选择用于取代的氨基酸残基；本领域技术人员认识到，另外的氨基酸残基也可被取代。包含共有序列或大体上相同的共有序列变化的约束肽可通过本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992))，通过引用并入本文)。

根据本公开的双特异性抗体可包含在本领域中已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是，例如，κ或λ型轻链恒定区，例如，人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是，例如，α、δ、ε，γ或μ型重链恒定区，例如，人α、δ、ε，γ或μ型重链恒定区。在一个方面中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。

在另一个方面，本发明涉及本公开的双特异性抗体的衍生物或类似物。衍生物可包含赋予所需性质诸如特定用途中的增加的半衰期的任何分子或物质。可用于形成衍生物的分子的实例包括，但不限于白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。衍生物诸如抗体的白蛋白连接的和PEG化衍生物可使用本领域公知的技术来制备。类似物可以是本文所述的双特异性抗体的非肽类似物。非肽类似物通常用于制药工业，如具有与模板肽的那些性质类似的性质的药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“拟肽”。参见，例如，Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等J.Med.Chem.30:1229(1987)，所述文献通过引用并入本文。结构上与本公开的双特异性抗体相似的肽模拟物可用于产生等同的治疗或预防作用。通常地，拟肽在结构上与范式多肽(即，具有所需生化性质或药理活性的多肽)诸如人抗体相似，但具有一个或多个任选地被选自由以下组成的组的键联替代(通过本领域公知的方法)的肽键联：—CH₂NH—、—CH₂S—、—CH₂—CH₂—、—CH═CH-(顺式和反式)、—COCH₂—、—CH(OH)CH₂—和—CH₂SO—。

在一个方面，根据本公开的重组双特异性抗体包含：(I)含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的scFV：SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108和132；或(B)重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL分别包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:(i)14和16；(ii)32和34；(iii)50和52；(iv)68和70；(v)86和88；(vi)104和106；(vii)128和130；或(C)(i)随后3个VH互补决定区(CDR)：(a)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:2、20、38、56、74、92和116；和(b)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:3、21、39、57、75、93和117；和(c)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO:4、22、40、58、76、94和118；和(ii)随后3个VL CDR：(a)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO:8、26、44、62、80、98和122；和(b)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:9、27、45、63、81、99,和123；和(c)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO:10、28、46、64、82、100和124；和(II)包含以下部分的第二抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的单链可变片段(scFV)；或(B)重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:111和112或SEQ ID NO:134和136中所示的氨基酸序列。

在一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ IDNO:9中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VLCDR3。

在另一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:72中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:70中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:74中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ IDNO:94中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的VL CDR1；包含SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在另一个方面，所述重组抗体包含含有如下部分之一的第一抗原结合部分：(A)包含SEQ ID NO:132中所示的氨基酸序列的scFV；或(B)包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:130中所示的氨基酸序列的VL；或(C)包含SEQ ID NO:116中所示的氨基酸序列的VH CDR1；包含SEQ ID NO:117中所示的氨基酸序列的VH CDR2；包含SEQ IDNO:118中所示的氨基酸序列的VH CDR3；包含SEQ ID NO:122中所示的氨基酸序列的VLCDR1；包含SEQ ID NO:123中所示的氨基酸序列的VL CDR2；和包含SEQ ID NO:124中所示的氨基酸序列的VL CDR3。

在一个方面，根据本公开的重组抗体包含第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含含有来自表1-6或8的任一个中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和含有来自表1-6或8的任一个中的VL的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。例如，在一个方面，根据本公开的重组抗体包含来自SEQ ID NO:50的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区和包含来自SEQ ID NO:52的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在另一个方面，根据本公开的重组抗体包含第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含含有来自表1-6或8的任一个中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，所述重链可变区与该VH序列具有至少90％同一性，和/或包含含有来自同一表中的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述轻链可变区与该VL序列具有至少90％同一性。例如，在一个方面，根据本公开的重组抗体包含含有来自SEQ ID NO:50的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:50具有至少90％同一性，和/或包含含有来自SEQ ID NO:52的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO:52具有至少90％同一性。

在另一个方面，根据本公开的重组抗体包含第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含含有来自表7或表9中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，和含有来自表7或表9中的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。例如，在一个方面，根据本公开的重组抗体包含含有来自SEQ ID NO:111的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，和含有来自SEQID NO:112的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在另一个方面，根据本公开的重组抗体包含第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含含有来自表7和表9中的VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，所述重链可变区与该VH序列具有至少90％同一性，和/或包含含有来自同一表中的VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述轻链可变区与该VL序列具有至少90％同一性。例如，在一个方面，根据本公开的重组抗体包含来自SEQ ID NO:111的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:111具有至少90％同一性，和/或包含含有来自SEQ ID NO:112的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO:112具有至少90％同一性。

在一个方面，本公开的双特异性抗体的第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分为scFv。在一个方面，根据本发明的双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108或132中所示的氨基酸序列的scFV的第一抗原结合部分，和/或包含含有SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的scFV的第二抗原结合部分。在另一个方面，根据本发明的双特异性抗体包含含有来自SEQ ID NO:18、36、54、72、90、108或132所示的氨基酸序列的6个CDR(VHCDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)并且与该scFV序列具有至少90％同一性的第一抗原结合部分，和/或含有来自SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的6个CDR(VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)并且与该scFV序列具有至少90％同一性的第二抗原结合部分。

在一个方面，本公开的重组双特异性抗体的第一抗原结合部分特异性结合于WT1HLA，并且第二抗原结合部分特异性结合于免疫效应细胞的表面上的抗原。在另一个方面，所述免疫效应细胞选自由以下组成的组：天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、T细胞及其组合。在另一个方面，所述免疫效应细胞为CD3+细胞。在其他方面，所述重组抗体特异性结合于CD3。在一个方面，所述重组抗体结合于WT1-HLA2+细胞，例如，在其表面上具有低密度的WT1/HLA2的WT1/HLA2+细胞。

在一个方面，本发明提供编码本文所述的重组抗体的核酸。在相关方面，利用包含本公开的核酸的表达载体转化宿主细胞。在一个方面，所述核酸包含表1-9的任一个中所示的DNA序列。

在另一个方面，本公开提供了包含本文中所述的重组双特异性抗体和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的药物组合物。任选地，所述组合物还另外地包含一种或多种生理活性剂，例如，抗-癌剂、佐剂或其他免疫刺激物质，抗-血管生成物质，止痛剂物质等。在各种具体的实施方案中，所述组合物，除了重组双特异性抗体以外，还包含1、2、3、4、5或6种生理活性剂。

在一个方面，本公开的药物组合物包含本文所述的重组抗体和选自由以下组成的组的一种或多种物质：缓冲剂、抗氧化剂诸如抗坏血酸、低分子量多肽(诸如具有少于10个氨基酸的那些多肽)、蛋白质、氨基酸、糖类诸如葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合剂诸如EDTA、谷胱甘肽、稳定剂和赋形剂。与血清白蛋白混合的中性缓冲盐水或盐水是合适的稀释剂的实例。根据适当的行业标准，还可添加防腐剂诸如苄醇。液体药物组合物可以包括，例如，如下物质的一种或多种：无菌稀释剂诸如注射用水，盐水溶液，优选生理盐水，林格氏溶液，等渗氯化钠，可作为溶剂或悬浮介质的不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂；抗氧化剂；螯合剂；缓冲液和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或右旋糖。可将肠胃外制剂封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水的使用是优选的，并且可注射的药物组合物优选是无菌的。在一个方面，可使用合适的赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂来将所述组合物配制成冻干产物。合适的组分在所使用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的。可用于药物制剂的组分的其他实例示于Remington's PharmaceuticalSciences，第16版(1980)和第20版(2000),Mack Publishing Company,Easton,Pa中。

如本领域中所理解的，以适合于适应征的方式向受试者施用包含本公开的双特异性抗体的药物组合物。可将包含本文所述的重组抗体的本公开的药物组合物配制用于通过提供有效剂量的所述双特异性抗体的任何途径的递送。药物组合物可以通过任何合适的技术来施用，包括但不限于，肠胃外、局部或通过吸入。如果注射，则可以例如通过关节内、静脉内、肌内、病灶内、腹膜内或皮下途径，通过推注或连续输注施用药物组合物。可设想局部施用(例如在肿瘤部位)，这可以是透皮递送和从植入物的持续释放。通过吸入的递送包括，例如，经鼻或口腔吸入、喷雾器的使用、以气溶胶形式进行的拮抗剂的吸入等。其他替代物包括眼药水；口服制剂包括片剂、胶囊剂、糖浆、锭剂或口香糖；以及局部制剂诸如洗剂、凝胶、喷雾剂、贴片和软膏。.

在一个方面，本公开提供杀伤WT1阳性细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与本文所描述的重组双特异性抗体和免疫效应细胞接触。本公开还提供了治疗具有WT1阳性疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的重组双特异性抗体。在一个方面，所述方法还包括向受试者施用免疫效应细胞。在一个方面，所述免疫效应细胞是细胞毒性细胞，例如，天然杀伤细胞、巨噬细胞或T细胞。在一个方面，所述细胞毒性T细胞是CD3+细胞毒性T细胞，任选的自体T细胞。在一个方面，所述WT1阳性疾病是白血病(慢性或急性)或WT1阳性癌症。WT1阳性癌症的实例包括，但不限于：慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性/髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、间皮瘤、卵巢癌、胃肠癌、乳腺癌、***癌和胶质母细胞瘤。

本公开因此提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本文所述的重组抗体或组合物。在一个方面，所述癌症选自由以下组成的组：肾上腺癌、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、顶端螺旋瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性红白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、腺鳞癌、脂肪组织肿瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病/淋巴瘤、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关淋巴瘤、腺泡型横纹肌肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎横纹肌样瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、布伦纳瘤、布朗瘤、伯基特淋巴瘤、乳腺癌、脑癌、癌、原位癌、癌肉瘤、软骨瘤、牙骨质瘤、髓样肉瘤、软骨瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛***状瘤、肾的透明细胞肉瘤、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、***、结肠癌、结肠直肠癌、Degos病、***增生性小圆细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、内分泌腺肿瘤、内胚窦瘤、肠病相关性T细胞淋巴瘤、食管癌、尤因氏肉瘤、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡甲状腺癌、神经节瘤、胃肠癌、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、巨细胞成纤维细胞瘤、巨细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、脑胶质瘤、胰高血糖素瘤、性腺母细胞瘤、颗粒细胞瘤、两性胚细胞瘤、胆囊癌、胃癌、多毛细胞白血病、血管母细胞瘤、头颈癌、血管外皮细胞瘤、血液学恶性肿瘤、肝母细胞瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、浸润性小叶癌、肠癌、肾癌、喉癌、恶性雀斑样痣、致死中线癌、白血病、***细胞瘤、脂肪肉瘤、肺癌、***瘤、***肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞癌、非小细胞肺癌、MALT淋巴瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性周边神经鞘瘤、恶性蝾螈瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞瘤、乳腺髓样癌、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、转移性尿路上皮癌、苗勒氏混合瘤、粘液瘤、多发性骨髓瘤、肌肉组织赘生物、蕈样肉芽肿、粘液样脂肪肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻咽癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑色素瘤、眼癌、寡星状细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、视神经瘤、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、潘科斯特瘤、***状甲状腺癌、副神经节瘤、松果体母细胞瘤、松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性腹膜癌、***癌、胰腺癌、咽癌、腹膜假性粘液瘤、肾细胞癌、肾髓样癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、直肠癌、肉瘤、施旺细胞瘤病(Schwannomatosis)、***瘤、睾丸支持细胞瘤、性索-性腺间质瘤、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞肿瘤、小细胞癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、Sezary病、小肠癌、鳞状癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、喉癌、脐尿管癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌、眼色素层黑素瘤、子宫癌、疣状癌、视觉通路胶质瘤、外阴癌、***癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、Warthin瘤和肾母细胞瘤。

在另一个方面，本发明提供了在受试者中刺激初次T细胞应答和二次T细胞应答的方法，所述方法包括施用包含重组抗体的组合物，所述重组抗体包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分特异性结合于第一肿瘤抗原并且所述第二抗原结合部分特异性结合于免疫效应细胞表面抗原，其中所述初级T细胞应答包括刺激针对所述第一肿瘤抗原的细胞毒性T细胞，并且其中所述二次T细胞应答包括刺激针对所述第一肿瘤抗原和/或针对第二肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞。在一个方面，所述第一肿瘤抗原为WT1-HLA并且所述第二肿瘤抗原为非WT1/RMF肿瘤抗原。非-WT1/RMF肿瘤抗原的实例包括，但不限于，HER2-neu、间皮素、Tert、Muc 16、Muc1、PSMA和本领域中已知的其他抗原(Cheever等Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research.2009；15(17):5323-37)。在一个方面，所述初次T细胞应答和/或所述二次T细胞应答包括肿瘤部位(例如，骨髓、肺、肝、脑、泌尿生殖道、胃肠道和/或脾)上的T细胞的增加。

在一个方面，所述二次T细胞应答包括刺激针对所述第一肿瘤抗原和第二肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞。在另一个方面，所述二次T细胞应答包括刺激针对所述第二肿瘤抗原但不针对所述第一肿瘤抗原的效应T细胞。在一个方面，所述二次T细胞应答不需要抗原呈递细胞(即，交叉呈递)或共刺激分子诸如CD86或可诱导的共刺激分子配体(ICOSL)。在另一个方面，所述二次T细胞应答包括CD8T细胞的增加。在相关方面，所述二次T细胞应答是长寿命的，例如持续超过1周，超过2周，超过3周，超过1个月或超过2个月。在一个方面，所述二次T细胞应答包含先前无反应性的T细胞。

在一个方面，根据本公开的刺激初次T细胞应答和二次T细胞应答的方法包括施用包含本文中所述的重组双特异性抗体，例如，包含SEQ ID NO:110中所示的氨基酸序列的重组双特异性抗体的组合物。在另一个方面，所述方法包括施用双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合于WT1/HLA的第一抗原结合部分，并且所述二次T细胞应答包括先前利用非-WT1-RMF抗原活化的T细胞。

在一个方面，所述初次T细胞应答和/或二次T细胞应答在体内发生。例如，可以以有效地刺激针对WT1/HLA的初次T细胞应答和针对非WT1-RMF肿瘤抗原的二次T细胞应答的量向有些需要的患者施用本文所述的双特异性抗体。在另一个方面，所述初次T细胞应答和/或二次T细胞应答可离体发生。例如，可在体外向细胞施用根据本公开的双特异性抗体以活化和扩增具有对于肿瘤抗原例如非-WT1-RMF肿瘤抗原的特异性的T细胞的群体。随后可自体地向有此需要的受试者例如施用治疗有效量的T细胞以治疗癌症。

不希望受理论束缚，所述初次T细胞和/或二次T细胞应答可由双特异性抗体将T细胞的TCR带至与肿瘤细胞足够接近以直接识别所述肿瘤上的另外的MHC/肽表位的能力而引起。在一个方面，在T细胞刺激期过程中所述双特异性抗体的第一抗原结合部分对第一肿瘤抗原例如WT1/HLA的结合可阻断所述T细胞的同源TCR对第一肿瘤抗原的识别，从而导致对于除所述第一肿瘤抗原外的肿瘤抗原是特异的二次T细胞应答。

本公开从而提供了产生针对肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞的方法，所述方法包括利用本文所述的重组抗体活化T细胞。在一个方面，活化后产生的所述T细胞可存活延长的一段时间，例如，至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月或至少二个月。在一个方面，所述重组抗体包含结合于WT1/HLA的第一抗原结合部分，但所产生的效应T细胞和/或记忆T细胞是针对非-WT1-RMF肿瘤抗原例如HER2-neu、间皮素、Tert、Muc 16、Muc1、PSMA和本领域中已知的其他抗原的。在一个方面，体内产生效应T细胞和/或记忆T细胞。在另一个方面，离体产生效应T细胞和/或记忆T细胞，例如，以用于过继T细胞疗法。在一个方面，施用双特异性抗体增加CD8 T细胞的产生，从而导致长寿命的效应物记忆。具有对于WT1/HLA是特异的第一结合部分的根据本公开的双特异性抗体从而能够诱导针对非-WT1肿瘤抗原的疫苗反应，从而导致广泛有效的抗-肿瘤疗法。

本公开的治疗方法包括缓解或预防病症的至少一个症状或其他方面，或减轻疾病的严重度等。在一个方面，本发明的重组双特异性抗体或药物组合物的治疗有效量是有效地抑制WT1阳性细胞的生长、减小肿瘤尺寸/负荷、阻止肿瘤细胞转移/浸润和/或导致细胞死亡(例如，通过细胞凋亡或坏死)的量。在另一个方面，包括预防性施用双特异性抗体例如以诱导二次T细胞应答和产生记忆T细胞的方法，有效地预防疾病的发作或复发或减轻疾病的严重程度。本文所述的双特异性抗体或药物组合物无需实现完全治愈，或消除疾病的每一个症状或表现来构成可行的治疗剂。如本领域中所公认的，治疗剂可减轻给定疾病状态的严重程度，但无需消除疾病的每一个表现以被认为是有用的。类似地，预防性施用的治疗在预防病症的发作中无需完全有效以构成可行的预防试剂。简单地减小疾病的影响(例如，通过减少其症状的数目或严重度，或通过增加另一种治疗的功效，或通过产生另一种有益作用)，或减小疾病将在受试者中发生或恶化的可能性就足够了。

用于本公开的方法的施用的剂量和频率可根据此类因素如施用途径、所使用的特定双特异性抗体、待治疗的疾病的性质和严重程度(无论病况是是急性还是慢性的)以及受试者的大小和一般状况而变化。可在例如可包括剂量递增研究的临床试验中通过相关领域中已知的方法来确定合适的剂量。

可以例如在一段时间内以规律的间隔施用本公开的抗体例如一次或不止一次。一般地，向受试者施用抗体或药物组合物，直至受试者表现针对所选择的指标的高于基线的医学相关程度的改善。

一般地，以剂量存在的本文所述的重组双特异性抗体，或以剂量存在的由编码多核苷酸原位产生的重组双特异性抗体的量在约10μg/kg至约20mg/kg的宿主的范围内。足以提供有效疗法的最小剂量的使用通常是优选的。通常可使用适合于待治疗或预防的病况的测定来监测患者的治疗性或预防性功效；测定对于本领域普通技术人员来说是熟悉的并且在本文中描述了一些测定。

本文中公开的方法可包括本文所述的双特异性抗体的口服给药或通过液体药物组合物的注射进行的递送。当以液体形式施用时，合适的剂量大小将随受试者的大小而变化，但对于10kg至60kg的受试者，通常会在约1ml至约500ml(包含约0.01μg至约1000μg/kg)的范围内。通常可使用实验模型和/或临床试验来确定最佳剂量。最佳剂量可取决于受试者的身体质量、身体面积、体重或血液体积。如本文中所述，合适的剂量也可取决于患者的病况，即疾病的分期、一般健康状况、年龄、性别、体重和医学领域中的技术人员于熟悉的其他因素。

在本文所述的方法的特定实施方案中，所述受试者为人或非人动物。需要本文所述的治疗的受试者可表现出本文所述的疾病、病症或病况的症状或后遗症，或可处于发生所述疾病、病症或病况的风险中。可被治疗的非人动物包括哺乳动物，例如，非人类灵长类(例如，猴、黑猩猩、大猩猩)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛及其他家庭农场和动物园动物。

通过参考以下实施例将更容易地理解本公开，所述实施例以举例说明的方式提供并不旨在是限制性的。

实施例

材料和方法

细胞样品、细胞系和抗体。通过Ficoll密度离心获得来自HLA分型的健康供者和患者的外周血单核细胞(PBMC)。先前已描述了用于获得人白血病和实体瘤细胞系的来源(Dao等，同上)。用于该研究的细胞系包括：AML品系HL60、SET-2、Ph+ALL品系BV173、间皮瘤细胞系JMN和MSTO。已对所有细胞进行了HLA分型。在37C/5％CO₂下将所述细胞系培养在补充有5％FCS、青霉素、链霉素、2mmol/L谷氨酰胺和2-巯基乙醇的RPMI 1640中。如先前所述(Dao等，同上)，利用GFP/荧光素酶转导用于动物研究的肿瘤细胞。ESK1及其对照人IgG1由Eureka Therapeutics Inc(Emeryville,CA)生产，并且按照制造商(Dao等，同上)的说明书进行APC缀合。缀合于FITC或APC的针对人HLA-A2的单克隆抗体(mAb)(克隆BB7.2)及其同种型对照小鼠IgG2b/FITC或APC购自BD Biosciences(San Diego,CA)。缀合于FITC或PE的小鼠抗-His标签mAb和用于人IFN-γ的ELISA试剂盒购自Invitrogen,(NY)。海肾荧光素酶底物ViviRen^TM购自Promega(Madison,WI)。

肽。所有肽购自Genemed Synthesis,Inc.(San Antonio,TX)并由其合成。HER2-neu-369-377的氨基酸序列：KIFGSLAFL(SEQ ID NO:138)；p53 264-272：LFEVRVCAC(SEQ IDNO:139)；WT1：RMFPNAPYL(SEQ ID NO:1)；Prame-300：ALYVDSLFFL(SEQ ID NO:140)；p435：NLTHVLYPV(SEQ ID NO:141)。先前描述了WT1-NQM、AILDF、LDF和总的汇集的肽(Doubrovina等Blood.2012年8月23日；120(8):1633-46)。对照HLA-A2-结合肽来源于尤文氏肉瘤：QLQNPSYDK(SEQ ID NO:142)。

ESK-双特异性抗体的构建、表达和纯化。在一个实施方案中，ESK1双特异性抗体是在N端末端包含ESK1 scFv和在C端末端包含小鼠单克隆抗体的抗-人CD3ε scFv的单链双特异性抗体(图10)。编码ESK1 scFv抗体和抗-人CD3ε scFv抗体的DNA片段由GeneArt(Invitrogen)合成，并使用标准DNA技术将其亚克隆入Eureka哺乳动物表达载体pGSN-Hyg。将六聚组氨酸(His)标签在C端末端***ESK1双特异性抗体的下游以用于抗体纯化和检测。

用ESK1双特异性抗体表达载体转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并通过利用甲硫氨酸亚矾胺(MSX)的标准药物选择(一种基于谷氨酰胺合成酶(GS)的方法(Fan,等Biotechnology Bioengineering.109(4),1007-1005(2012)))实现稳定的表达。收集含有分泌的ESK1-双特异性抗体分子的CHO细胞上清液。使用HisTrap HP柱(GE healthcare)，利用FPLC AKTA***纯化ESK1双特异性抗体。简言之，澄清CHO细胞培养物，将其加载至具有低咪唑浓度(20mM)的柱子上，随后将等梯度高咪唑浓度洗脱缓冲液(500mM)用于洗脱结合的ESK1双特异性抗体蛋白。由替代ESK1scFv的不相关人IgG1抗体(Cat#ET901,EurekaTherapeutics)构建阴性对照双特异性抗体。

流式细胞术分析。对于ESK-双特异性抗体染色，将人T细胞、肿瘤细胞或细胞系与不同浓度的ESK-双特异性抗体或对照双特异性抗体一起在冰上孵育30分钟，洗涤，随后与针对His-标签的第二mAb一起孵育。通过用曲妥珠单抗，随后用第二山羊抗-人IgG对肿瘤细胞进行染色来测量原发性卵巢癌细胞上的HER2-neu表达。通过用各自的mAb对细胞进行直接染色来测量HLA-A2表达和ESK结合。通过用缀合于各种荧光团的CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD19或CD33的mAb对细胞进行直接染色来表征来自患者样品的PBMC或T细胞的表型。在FACS Calibur(Becton Dickinson)上收集流式细胞术数据，利用FlowJo V8.7.1和9.4.8软件分析所述数据。

进行结合研究以检查结合Jurkat(CD3⁺人癌细胞系)细胞的ESK1+L2K双特异性抗体。简言之，将始于10μg/mL的3x系列稀释的双特异性抗体添加至0.5×10⁶个Jurkat细胞。利用100x稀释的缀合有FITC的抗-His标签抗体(Thermo#MA1-81891)或1000x稀释的具有或不具有别藻蓝蛋白(APC)-抗小鼠IgG(Biolegend#Poly4053)的小鼠抗-His标签抗体孵育细胞，和在Guava EasyCyte 6HT(EMD Millipore)上通过流式细胞术分析所述细胞。结果示于图8中。

随后，使用10μg/mL的ESK1+L2K、ET901+L2K和ET901+OKT3抗体，检查利用FITC抗-His对Jurkat细胞的染色。将FITC ET901和APC ET901(ET901为完全人IgG1)用作对照。结果示于图9中。

通过ForteBio Octe分析测定ESK1与ESK1-双特异性抗体对MHC1/WT1肽复合物的结合的比较。结果示于下表中。

表10

全长ESK1-双特异性抗体：在一个实施方案中，所述ESK-1双特异性抗体为全长抗体。简言之，以等摩尔比率组合ESK1或ET901(阴性对照)和抗-CD3(OKT3)，从而产生0.5ml内的每一种抗体的0.8mg/ml的终浓度。将12.5μl的1M 2-巯基乙胺(2-MEA)添加至反应混合物，将溶液在37℃孵育90分钟。利用Zeba脱盐柱(100-200μl,7-kDA,Pierce.)除去2-MEA。将溶液于4℃下贮存过夜，以允许二硫键的再氧化。产量值示于表11中。

表11

使用ForteBio Octet QK测定结合亲和力。将5μg/ml生物素化的MHC-WT1加载至链霉抗生物素蛋白生物传感器上。在洗掉过量抗原后，分别以20μg/ml、10μg/ml和10μg/ml测试ESK-1-OKT3、ESK1和OKT3溶液的缔合和解离常数。使用1:1结合位点模型计算结合参数并将其示于表12中。

表12

ESK-双特异性抗体介导的T细胞活化。使用过全T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec Inc.,San Diego,CA)通过阴性免疫磁性细胞分离来将CD3T细胞从PBMC分离。将不同浓度的ESK-双特异性抗体或其对照双特异性抗体与靶细胞和纯化的CD3T细胞以不同的效应子:靶(E:T)比率一起孵育过夜或不同的时期。收获上清液流体，通过ELISA测量IFN-γ和TNF-α的细胞因子释放。另外，通过细胞增殖评估在来自卵巢癌患者的自体肿瘤细胞存在的情况下ESK-双特异性抗体介导的T细胞活化，通过在7天的共孵育后过夜3H-胸苷掺入测量所述ESK-双特异性抗体介导的T细胞活化。

EBV-特异性T细胞扩增和受体基因转导。通过经由粘附耗竭单核细胞来从PBMC富集T细胞。以20:1的响应者:刺激物(R:S)比率用通过利用EBV的B95.8株的转化产生的转辐照的自体EBV-转化的B细胞(EBV-BLCL)刺激非粘附细胞，并将所述细胞在含有5％HS(YH5；Gemini)的Yssel培养基中培养。第7天开始，每2-3天(Collaborative BiomedicalProducts,Bedford,MA)以10至30个单位/mL将白细胞介素-2(IL-2)添加至T细胞培养物中，每周以4:1R:S比率利用相同的EBV-BLCL再刺激所述培养物。

如先前所述(Doubrovina,E.等Blood 119(11),2644-2655(2012))，用逆转录病毒载体tdrrsRLuc转导EBV特异性T淋巴细胞，扩增所述细胞，通过分选富集其PE。将经转导的EBV特异性T淋巴细胞培养在G-rex培养瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中。对于体内T细胞跟踪研究，将1000万个细胞注射入小鼠，4小时后，静脉内给予海肾荧光素酶底物ViviRen^TM。

ESK-双特异性抗体重定向的T细胞的细胞毒性。将不同浓度的ESK-双特异性抗体或其对照双特异性抗体与靶细胞和PBMC、纯化的CD3T细胞或EBV-特异性T细胞以不同的效应子:靶(E:T)比率一起孵育5小时或过夜。使用来自Promega的Cytotox 96非放射性试剂盒按照它们的说明书，通过⁵¹Cr-释放测定(在5小时的孵育后)或LDH释放测定(在过夜孵育后)测量细胞毒性。在AML患者的情况下，在20μg/ml的ESK或对照-双特异性抗体纯在或不存在的情况下共孵育PBMC和自体母细胞，在第3天和第4天收获所述细胞，并利用CD33(针对白血病母细胞)和CD3(针对T细胞)对细胞进行双重染色。对于卵巢癌患者的情况，将PBMC与自体卵巢癌细胞一起孵育一周，通过⁵¹Cr-释放测定测量细胞毒性。

药代动力学和生物分布研究。使用氯胺T法利用¹²⁵I(PerkinElmer)标记ESK-双特异性抗体或对照双特异性抗体。将一百(100)μg抗体与1mCi ¹²⁵I和20μg氯胺T反应，利用200μg焦亚硫酸钠猝来，随后使用利用2％的PBS中的牛血清白蛋白平衡的10DG柱将其与游离¹²⁵I分离。产物的比活性为6mCi/mg。利用未标记的双特异性抗体将放射性标记的双特异性抗体(2μg)稀释至20μg/剂量，将其眶后注射入小鼠。在不同的时间点收集血液，称重，在γ计数器上进行测量。在24小时后，收获器官，称重，并在γ计数器上测量其活性。

人肿瘤异种移植物NSG模型中进行的ESK-双特异性抗体的治疗性试验。将人EBV-特异性T细胞用于所有异种移植物模型，因为它们的抗原特异性已严重偏向EBV Ag，其中它们不应当诱导GVHD。对于BV173ALL模型，将200万个BV173人白血病细胞静脉内注射入NSG小鼠。在第5天，通过在待被处理的所有小鼠中进行萤火虫成像来确认肿瘤移植物植入；随后将小鼠随机分入不同治疗组。在第6天，将1000万个EBV-特异性T细胞静脉内注射入小鼠。4至6小时后，静脉内注射20μg ESK-双特异性抗体或其对照双特异性抗体，每周重复2次注射，在3周的处理中进行总共6次，同时每周一次静脉内注射T细胞，进行2次。对于SET-2AML模型，将100万个细胞静脉内注射入小鼠，在第3天通过生物发光成像确认肿瘤移植物植入，将小鼠随机分入治疗组。在第4天，静脉内注射1000万个EBV-特异性T细胞静，6小时后，静脉内注射20μg ESK-双特异性抗体或其对照双特异性抗体。在处理过程中，每周2次给予T细胞，并且每隔一天给予双特异性抗体，持续总共6天。在原发性ALL模型中，将500万个ALL细胞静脉内注射入NSG小鼠。在第6天，在待处理的所有小鼠中通过萤火虫荧光素酶成像确认肿瘤移植物植入；随后将小鼠随机分入不同治疗组。将3000万个EBV-特异性T细胞静脉内注射入小鼠，随后静脉内注射20μg ESK双特异性抗体或其对照双特异性抗体。每天给予双特异性抗体注射一次，每周给予T细胞两次，持续总共2周。对于JMN间皮瘤模型，将30万个肿瘤细胞与60万个EBV-特异性T细胞混合，并进行腹膜内(i.p.)注射，1小时后，将20μg ESK-双特异性抗体或对照双特异性抗体静脉内注射入小鼠。每隔一天给予双特异性抗体，持续总共5天。对于所有动物模型，通过每周至少2次萤火虫荧光素酶成像监测肿瘤生长。

ESK-双特异性抗体诱导的二次T细胞应答。在人IL-5(5ng/ml)和人IL-2(10μg/ml)存在的情况下，在0.1μg/ml的ESK-双特异性抗体或对照-双特异性抗体存在或不存在的情况下，以4-5:1的E:T比率将用来自卵巢癌患者的PBMC、耗竭了NK细胞和巨噬细胞的PBMC或纯化的CD3T细胞与经辐照的(3000拉德)自体卵巢癌细胞一起培养在补充有10％自体血浆(AP)的RPMI1640培养基中，持续6天。在第7天，收获细胞，洗涤细胞，并将其用作用于IFN-gELISPOT测定的效应物。简言这家，用100μL的PBS中的小鼠抗-人IFN-g抗体(10Ag/mL；克隆1-D1K；Mabtech)涂覆HA-Multiscreen板(Millipore)，在4℃孵育过夜，用PBS洗涤以除去未结合的抗体，以及用RPMI1640/10％自体血浆(AP)在37℃封闭2小时。将效应细胞与T2细胞(4:1的E:APC比率)或经辐照的自体肿瘤细胞或其他肿瘤细胞系一起涂板。将各种测试肽以20μg/mL添加至孔中。阴性对照孔含有APC和T细胞但不具肽或具有不相关肽。阳性对照孔含有T细胞加上APC加上20μg/mL植物凝集素(PHA,Sigma)。以一式三份进行所有条件。将微量滴定板在37℃孵育20小时，随后用PBS/0.05％Tween充分洗涤，并添加100μl/孔的针对人IFN-g的生物素化的检测抗体(2μg/mL；克隆7-B6-1；Mabtech)。将板在37℃再孵育另外2小时，并如所述的(May等Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research.2007；13(15Pt 1):4547-55.)进行斑点显影。通过使用计算机辅助视频影像分析仪，利用KS ELISPOT 4.0软件(Carl Zeiss Vision)自动地测定斑点数目。

通过每周一次添加具有IL-15和IL-2的新鲜培养基扩增剩余T细胞，达到7至8周。在一些情况下，在与对于第一刺激相同的条件下，以9:1的效应子:靶比率利用自体肿瘤再刺激剩余的T细胞，进行1周，随后如所描述的，通过IFN-g ELISPOT测量T细胞应答。

结果

对WT1+HLA-A0201+肿瘤细胞和T细胞的选择性结合。全长ESK1mAb以受WT1和HLA-A0201限制的方式结合于一小组白血病细胞系和间皮瘤细胞系(Dao等，同上)。测试ESK-双特异性抗体、scFv构建体的结合特异性。ForteBio

(Menlo Park,CA)结合测定显示355nM的ESK-双特异性抗体的Kd。ESK-双特异性抗体以剂量依赖性方式甚至在0.1μg/ml的浓度下结合于SET-2(一种WT1和HLA-A0201双阳性AML细胞系)，但不结合于HL-60(一种WT1阳性，但HLA-A0201阴性的AML细胞系)(图1A，1B)。在所有测试的浓度下未看到对照双特异性抗体对SET-2或HL-60细胞的阳性结合，这表明了ESK-双特异性抗体的特异性。然而两种双特异性抗体均能够结合纯化的人CD3T细胞(图1C)。这些结果证明了双特异性，因为ESK-双特异性抗体能够选择性识别表达WT1和HLA-A0201的肿瘤细胞以及还有人CD3T细胞。

T细胞活化以及针对WT1和HLA-A0201阳性肿瘤细胞的细胞毒性。已显示双特异性抗体构建体对T细胞的活化依赖于T细胞与表达靶抗原的靶细胞之间的邻面接触。这对于避免不希望的由T细胞活化引起的炎症应答是至关重要的，因为双特异性抗体构建体的一个臂识别无变化的CD3信号复合物。在ESK-双特异性抗体和靶SET-2细胞存在的情况下，在ESK-双特异性抗体的指定浓度下观察到剂量依赖性IFN-γ释放(图1D)。单独的或在SET-2细胞存在的情况下与对照-双特异性抗体一起孵育的CD3T细胞显示不可检测水平的IFN-γ，并从ESK-双特异性抗体组的值扣除它们的值。

评估ESK-双特异性抗体定向的针对共表达WT1和HLA-A0201的靶细胞的T细胞的细胞毒性的潜能。将纯化的静止T细胞与靶细胞和系列稀释的ESK双特异性抗体或对照双特异性抗体共孵育5小时，并通过⁵¹Cr-释放测量细胞裂解。ESK-双特异性抗体剂量依赖性诱导针对AML细胞系SET-2但非HL-60的T细胞的细胞毒性，这与图1中显示的它们的结合特异性相符(图2A、2B)。当将共孵育时间延长至16小时，靶细胞裂解在3μg/ml和0.3μg/ml的ESK-双特异性抗体上分别增加至高达90％和80％。类似地，在ESK-双特异性抗体存在的情况下，BV173和原发性CML母细胞(WT1+/HLA-A0201+)在6小时的共孵育中也以剂量依赖性的方式被PBMC裂解(图2C，2D)，并且BV173的杀伤在0.01μg/ml的ESK-双特异性抗体上很明显。相对较弱的针对CML母细胞的杀伤可能归因于该样品中较低水平的HLA-A2和ESK结合的表达。对照双特异性抗体不诱导任何显著的细胞毒性，这表明所述靶特异性是T细胞活化所需的。

先前已利用不同Ag诸如EBV重复引发的ESK-双特异性抗体重定向T细胞的细胞毒性的能力得以阐明。使用此类T细胞可潜在地避免异种移植动物模型中的移植物抗宿主病(GVHD)，因为T细胞的抗原特异性应当只严重地偏向于EBV Ag。利用5小时-51Cr释放，使用0.1μg/ml的ESK-双特异性抗体，通过滴定效应子:靶(E:T)比率来测试T细胞杀伤的潜力。对于ESK-双特异性抗体观察到针对所有测定的靶细胞的高效剂量依赖性杀伤(图2E、2F、2G)。对于BV173，在较高的E:T比率下存在几近50％的杀伤，在低至1.6:1的E:T下存在约25％的杀伤(图2E)。在3.13的E:T比率下对于JMN靶细胞观察到特异性杀伤(图2F)。类似地，发现针对原发性卵巢癌细胞的强细胞毒性在不同的E:T比率下在超过50％至20％杀伤的范围内(图2G)。在间皮瘤细胞系JMN、ALL BV173和原发性卵巢癌细胞(均共表达WT1和HLA-A0201)中，在利用单独的T细胞或利用针对WT1+/HLA-A0201+的对照双特异性抗体的培养物中不存在杀伤。这些结果表明ESK-双特异性抗体可特异性将先前活化的具有除针对WT1外的特异性的T细胞的强效细胞毒性重定向以裂解WT1和HLA-A0201阳性的肿瘤细胞。

随后，更密切地研究T细胞在自体背景中的ESK-双特异性抗体介导的活化和细胞毒性，模拟人体内状况。在0.1μg/ml和ESK-双特异性抗体存在的情况下，以如所指示的各种E:T比率，利用经辐照的自体肿瘤细胞刺激来自卵巢癌患者的PBMC，进行7天。在第8天通过在6小时培养中添加⁵¹Cr-标记的自体肿瘤来测量细胞毒性。在刺激开始时，甚至在100个PBMC下在利用ESK-双特异性抗体的培养物中观察到剂量依赖性杀伤(图3A)。在所有对照组中均未观察到杀伤。平行地，在8天的培养结束时通过3H-胸苷掺入测量T细胞增殖(图3B)。仅在利用ESK-双特异性抗体的培养物中看到显著的细胞增殖。PBMC和单独的肿瘤细胞均未对ESK-或对照-双特异性抗体作出响应。另外，PBMC与单独的自体肿瘤细胞或与对照双特异性抗体的共培养未显示T细胞增殖，这表明T细胞耐受自身肿瘤Ag。总之，这些数据表明ESK-双特异性抗体对T细胞的特异性活化需要肿瘤细胞的存在，并且ESK-双特异性抗体可强制T细胞克服自身耐受性。在来自AML患者的第二自体模型中举例说明了ESK-双特异性抗体诱导自体T细胞增殖和杀伤其靶癌细胞的能力(图16A-16D)。

NSG小鼠中的表达WT1/HLA-A0201的人白血病的治疗。测试ESK-双特异性抗体在先前用BV173Ph+ALL细胞静脉内异种移植6天的NSG小鼠中的体内治疗功效。在处理时，小鼠在其肝、脾和骨髓中具有可见的弥漫性白血病。将T细胞静脉内注射入小鼠，随后在4小时后注射双特异性抗体。始于处理后3天并持续长达3周观察到显著的肿瘤抑制，这在接受ESK-双特异性抗体的小鼠的骨髓中特别明显(图4A)。相反地，包括接受肿瘤细胞、肿瘤和T细胞、肿瘤和ESK-双特异性抗体，或肿瘤和T细胞及对照双特异性抗体的小鼠的对照组中的所有小鼠均在骨髓和其他器官中显示不断增加的肿瘤生长和巨大肿瘤负荷(图4A)。来自5只小鼠的光子强度的平均值显示ESK-双特异性抗体-处理的组中约10倍的肿瘤减小(图4B)。在肿瘤接种后达到49天未观察到显著的GVHD(图4C)。结果证明ESK-双特异性抗体可高效地将强效的T细胞的细胞毒性啮合和定向至杀伤BV173靶细胞。

测试ESK-双特异性抗体在先前用原发性ALL细胞静脉内异种移植的NSG小鼠中的体内治疗功效。将T细胞静脉内注射入小鼠，随后注射ESK-双特异性抗体。对照组中的所有小鼠在骨髓和其他器官中均显示不断增加的肿瘤生长和巨大的肿瘤负荷。在停止处理后9天，持续超过3周观察到显著的双特异性抗体选择性肿瘤抑制，这在小鼠的骨髓中尤其明显(图4D)。来自5只小鼠的光子强度的平均值显示在ESK-双特异性抗体-处理的组中相较于其他对照组约10-20倍的肿瘤减小(图4E)。在肿瘤接种后达到49天在临床上未观察到显著的GVHD。

这些结果证明ESK-双特异性抗体可高效地啮合并重定向强效T细胞毒性以杀伤原发性白血病细胞。如所预期的，EBV特异性人T细胞不显示非特异性杀伤，从而可用于阐明异种移植物模型中的双特异性抗体活性。该模型表明ESK-双特异性抗体的每周2次的施用是不够的，因为其半衰期仅为数小时，并且通过药代动力学研究得以证实。

由于ESK-双特异性抗体在治疗骨髓白血病中似乎更有效，如BV173模型中显示的，因此在更具侵袭性的AML细胞SET-2模型中研究该作用。SET-2细胞货币呈在异种移植后快速迁移至骨髓。通过显示ESK-双特异性抗体的短的5小时的β血浆半衰期的药代动力学研究指导给药和时间安排(图17A)。将处理剂量增加至每日一次双特异性抗体注射，持续总共连续6天。始于肿瘤接种后第4天，小鼠接受处理，此时白血病异种移植物已通过BLI确认(图5A，第一排)。SET-2细胞在骨髓中快速生长，并且在接受SET-2细胞，或SET-2和T细胞的小鼠的骨髓中看到白血病的大量浸润。然而，在停止处理后超过一周，在达14天在ESK-双特异性抗体治疗组中未看到可检测的白血病，并且在达18天后于第32天仅观察到最小白血病负荷。对于所有组对于从第7至18天的图像，BLI的尺度的增益均一减小，以显示预处理时间点中的低水平的白血病。对照-双特异性抗体组在开始时显示略微延迟的白血病负荷。这可由对照-双特异性抗体的抗-CD3臂对EBV-特异性T细胞的活化引起，所述对照-双特异性抗体对于T细胞的结合亲和力比ESK-双特异性抗体强(图1C)。EBV-特异性T细胞已被活化并且在体外扩增数倍，从而使它们对强的多克隆刺激更加易感。活化的T细胞随后释放可产生针对肿瘤细胞的有害环境的炎性细胞因子。虽然ESK-双特异性抗体治疗组中的所有小鼠在1个月后仍然活着，但在利用单独的T细胞处理的或无处理的小鼠的组中仅有20％的存活率(图5B)。ESK-双特异性抗体治疗组中的小鼠在达到40天时未显示由白血病至脊椎骨髓的浸润引起的中枢神经***(CNS)***体征，然而对照组中几乎所有动物都受到影响。(图5C)。这些数据证明ESK-双特异性抗体是针对骨髓中的侵袭性白血病细胞的强效治疗剂。

ESK-双特异性抗体在肿瘤部位介导T细胞保留。虽然已知双特异性抗体有效地啮合T细胞以在体外杀伤靶，但未曾报导记录体内机制的体内研究。研究ESK-双特异性抗体的治疗效果是否是其吸引T细胞保留和保持在活动物的白血病部位的能力的结果。在异种移植GEF/荧光素酶阳性SET-2AML细胞后3天将1000万个利用海肾/荧光素酶转导的EBV-特异性T细胞注射入NSG小鼠中，4小时后注射双特异性抗体。通过在T细胞注射时(0小时)、8(即，在双特异性抗体注射后4小时)、24、48和72小时时的发光成像监测T细胞迁移。T细胞在注射后立即迁移至肺中，随后在8小时的时候分布至其他部分，包括肝、脾和骨髓中(图6A)。在72小时中T细胞信号逐渐衰减。T细胞注射，随后对照双特异性抗体注射显示了与单独的T细胞类似的分布模式和时间过程。然而，利用ESK-双特异性抗体处理的小鼠从4-20小时在肺和BM中显示T细胞信号的显著增强，持续达到72小时。细胞在肺中显著减少，但保留在肝、脾和BM中。生物发光强度的定量显示在ESK-双特异性抗体注射后4小时，相较于其他两个对照组存在至肝、脾和骨髓中的约3倍以上的T细胞积聚(图6B)。同时监测白血病进展显示T细胞保留与白血病负荷之间的反相关性(图6C)。这些结果提供了ESK-双特异性抗体可在白血病部位介导延长的T细胞保留和针对表达WT1和HLA-A0201的肿瘤细胞的有效地定向的T细胞的细胞毒性的强有力的体内证据。

NSG小鼠中的间皮瘤的疗法。由于已显示ESK-双特异性抗体在两个白血病异种移植物模型中的强效治疗活性，因此使用腹膜内注射模型刺激腹腔间皮瘤来研究ESK-双特异性抗体在治疗侵袭性实体瘤中的功效。以1:2的靶-效应物比率将WT1+/HLA-A0201+JMN间皮瘤细胞与EBV-特异性T细胞混合，并将其腹膜内注射入NSG小鼠。1小时后静脉内注射双特异性抗体，重复该过程持续连续5天。1天后，生物发光成像在利用ESK-双特异性抗体处理的小鼠中未显示可见的肿瘤，然而3个对照组中的小鼠显示可见的肿瘤负荷，这表明ESK-双特异性抗体已消除肿瘤细胞(图7A)。由ESK-双特异性抗体产生的肿瘤抑制持续直至第23天；在停止处理后18天，在小鼠中只看到最小的肿瘤负荷。将每组5只小鼠的生物发光强度求平均值显示持久的且在第23天约20多倍的肿瘤抑制(图7B)。

药代动力学：为了测定ESK双特异性抗体的药代动力学，将示踪¹²⁵I-标记的构建体静脉内注射入C57BL6/J，或腹膜注射入BALB/c小鼠，在48-52小时中测量血液放射性活性。静脉内注射的双特异性抗体以30分钟的α半衰期快速从血液再分布至组织，随后以5小时的β半衰期消除。在腹膜内递送，双特异性抗体水平在血液中升高，于注射后3小时达到峰值。所述构建体随后以相同的β半衰期清除。从静脉内注射的总暴露(曲线下面积)大于腹膜内注射。使用相同的放射性构建体测定抗体的生物分布模式。24小时后，在所有组织中检测到<1％的注射剂量/克(图17A，17B)。

ESK-双特异性抗体诱导针对HLA-A0201的背景中的HER2表位的二次T细胞应答。双特异性抗体的作用机制已归功于它们将癌细胞靶与T细胞桥接以形成溶细胞突触的直接作用。使用来自具有卵巢癌的HLA-A*02:01阳性患者的自体体外模型，研究此类邻面接触是否可活化对于由自体肿瘤细胞表达的其他肿瘤抗原是特异的群体中的预先存在的T细胞，以确定双特异性抗体是否可发挥疫苗作用。在低剂量的ESK-双特异性抗体存在的情况下，将患者的PBMC与她的自体肿瘤细胞共培养；一周后，通过IFN-g ELISPOT测定评估受表位特异性HLA-A*02:01限制的T细胞应答。包括单独的细胞或具有对照双特异性抗体的对照组不显示任何特异性IFN-g释放。患者的肿瘤细胞在它们的细胞表面上表达WT1RMF和HER2-neu(图18A-C)。令人惊讶地，在ESK-双特异性介导的相互作用结束后很长时间，诱导针对HER2-neu-369表位、单独的自体肿瘤细胞和SET-2AML细胞的强二次T细胞应答(图19A-F)。这些自体细胞针对56种汇集的WT1衍生的表位、WT1表位RMF、AILDF05或LDF；p53衍生的表位264-273；Prame-300、Prame-435；尤文肉瘤表位EW、Muc1-15、-16和-18；或HL60细胞的应答未被测量到。由于SET-2不表达HER2-neu并且T细胞不识别WT1RMF，因此针对SET-2的T细胞应答显示对既非WT1也非HER2-neu的其他尚待确定的表位的识别。这些结果明确地证明了ESK-双特异性抗体可诱导针对多种肿瘤抗原的二次T细胞应答，从而提供了预料之外的疫苗作用。

原则上，二次T细胞应答应当需要PBMC当中的可吸收肿瘤细胞死亡后释放的细胞内抗原并呈递其的专职APC。或者，肿瘤细胞可在T细胞与肿瘤的邻面接触过程中直接活化预先存在的表位-特异性T细胞。为了阐明机制，观察利用纯化的T细胞以及耗竭了NK细胞和耗竭了巨噬细胞的PBMC(T加B细胞)对比完全PBMC作为效应细胞，所述疫苗作用是否可发生。有趣地，作为效应物的单独的T细胞仍然能够以如通过T加上B细胞(图19C)或完全PBMC(图19D)产生的量级相似的量级响应HER2-neu、自体肿瘤细胞和SET-2细胞。为了排除这些自身癌症抗原的自我T细胞呈递的可能性，在ESK-双特异性抗体存在或不存在的情况下，将纯化的T细胞与自体肿瘤细胞裂解物(通过反复冻融产生的)共培养。在该背景中针对HER2-neu表达或肿瘤细胞未看到T细胞应答(图19D)。这些结果证明了对于双特异性抗体诱导的针对HER2-neu或肿瘤细胞中存在的其他表位的二次T细胞应答既不需要专职APC也不需要表位肿瘤，从而交叉呈递也不是所述机制。

也检查肿瘤细胞抗原呈递是否依赖于共刺激分子。虽然来自健康人供体的CD14+单核细胞显示强CD86表达，但卵巢癌细胞几乎不具有CD86表达。结果表明关键的共刺激分子CD86不可能参与肿瘤细胞抗原呈递(图20)。未检测到CD86或ICOSL表达。共刺激分子的不存在是肿瘤细胞为低效抗原呈递细胞的原因之一；然而，某些细胞因子可提供共刺激信号来满足对于肿瘤特异性T细胞活化的要求。ESK-双特异性抗体诱导PBMC和T细胞分泌IFN-γ和TNF-α(图19E-F)。

为了测试ESK-双特异性抗体是否具有对T细胞群体的任何长效作用，在利用ESK-双特异性抗体初次活化后，在低剂量的IL-15和IL-2中体外扩增T细胞。虽然对照组中的T细胞在培养中存活不超过1周，但由ESK--双特异性抗体活化的T细胞继续生长2个月而无需进一步活化。表型分析显示在通过ESK--双特异性抗体和肿瘤活化后7周，CD8+T细胞增加至群体的89％，并且CD4+T细胞降至6％(图21A-B)。有趣地，在CD8+/CCR7-细胞当中，CD45RA-/CD45RO+细胞增加，表明效应物记忆表型。重要的是，即使在该后一时间点上，这些T细胞仍然保持它们针对自体肿瘤和SET-2AML细胞的原始特异性(图21C)。这些结果表明ESK-双特异性抗体可诱导长效二次特异性CD8T细胞应答。

讨论

本公开提供从TCR-样mAb衍生的第一双特异性抗体构建体。所述ESK-双特异性抗体对于由HLA-A0201分子呈递的WT1RMF表位是特异的。所述ESK-双特异性抗体在体外和体内显示针对多种癌症，包括ALL、AML、间皮瘤和原发性卵巢癌细胞的强效抗肿瘤活性。此处提供的研究与先前的研究不同在于：1)mAb是TCR样mAb，从而允许识别细胞内肿瘤特异性靶；2)肿瘤细胞上的靶密度极低，从而提供了可将双特异性抗体应用于广泛得多的靶的概念验证；3)利用同时的双重效应细胞和靶细胞跟踪显示了ESK-双特异性抗体体内活性的机制(先前双特异性抗体研究未曾显示该结果，因为在大多数动物研究中，在注射之前将效应T细胞和靶细胞混合)；4)通过使用自体***，证明了所述ESK-双特异性抗体可打破T细胞对杀伤原发性卵巢癌细胞的耐受性；5)所述ESK-双特异性抗体诱导针对其他肿瘤抗原诸如HER2-neu的长寿合二次特异性T细胞应答。此外，所述二次T细胞应答不由通过经典APC产生的交叉呈递介导，相反地为通过所述双特异性抗体促进的T细胞与肿瘤细胞之间的直接和物理上紧密的相互作用的结果。

目前正在开发的所有双特异性抗体构建体靶向作为在正常细胞上发现的谱系或分化抗原的细胞表面蛋白，诸如CD19、CD33、***特异性膜抗原(PSMA)或表皮生长因子(EGF)受体。相反地，本公开首先证明TCR-样双特异性抗体构建体能够识别来自肿瘤特异性靶的肽/MHC复合物的低密度表位。这反驳了scFv双特异性抗体构建体因为亲和力太低或活化T细胞的细胞毒性的能力不充足而可能不适合用于靶向低密度Ag的传统观点。本公开首次证明TCR模拟双特异性抗体构建体能够在造血肿瘤和实体瘤的几个小鼠模型中具有强效治疗活性，从而提供了广泛拓宽靶向其他癌症特异性细胞内肿瘤抗原的双特异性抗体的开发的概念验证。虽然从体外测定已知双特异性抗体将T细胞与癌症接触，但先前未在体内观察到此类机制。本公开提供了靶向其他细胞内肿瘤Ag的双特异性mAb的将来开发的概念验证。因此，本文所述的ESK-双特异性抗体可拓宽平台的治疗性应用。

在一个实施方案中，所述ESK-双特异性抗体诱导针对共表达WT1和HLA-A0201的淋巴性白血病和髓样白血病、间皮瘤和原发性卵巢癌细胞的快速且强效的体外细胞毒性活性。相较于在超过16小时的培养后显示T细胞杀伤的利用各种其他双特异性抗体构建体的研究，可在5小时的共孵育中检测到静止T细胞或EBV-特异性T细胞对靶细胞的裂解。ESK-双特异性抗体的细胞毒性活性可通过较长时期的孵育来进一步增强，通过利用SET-2AML细胞实现的高达80-90％的杀伤显示的。这与对于CD33和CD19是特异的其他双特异性抗体mAb共享类似的特性，从而表明ESK-双特异性抗体以一系列方式将T细胞与靶啮合。IFN-g分泌进一步证明ESK-双特异性抗体介导的靶特异性T细胞活化。具有临床相关性的重要观察是ESK-双特异性抗体可高效地活化来自卵巢癌患者的未操作T细胞，以增殖并杀伤自体肿瘤细胞，这表明ESK-双特异性抗体的存在可强制T细胞克服对自身肿瘤Ag的耐受性。已知的是，在实体瘤中频率观察到T细胞浸润。双特异性抗体的相对低的分子量将允许ESK-双特异性抗体更好地渗透进入实体瘤以活化无反应性的或无应答的T细胞杀伤周围肿瘤细胞。

ESK-双特异性抗体的体外细胞毒性在体内也得到验证，如通过其在异种移植物模型中针对Ph1+ALL、AML和间皮瘤的相当强的治疗活性显示的。在两个白血病模型中，肿瘤细胞的消除很明显，尤其在骨髓中。另外，ESK-双特异性抗体预防和延迟了CNS麻痹(由脊椎骨髓的浸润引起的白血病的特征性质)。

当与肿瘤细胞分开地注射T细胞时(通常不用于临床前双特异性抗体实验的方案)，ESK-双特异性抗体在体内杀伤白血病细胞的能力提出了关于双特异性抗体的体内活性的机制的问题。利用SET-2细胞的研究进一步提出了ESK-双特异性抗体是否活跃地在靶上招募和保留T细胞的问题。这些问题通过使用双重生物发光成像同时跟踪效应T细胞和SET-2AML细胞得到解决。利用ESK-双特异性抗体处理的小鼠的骨髓中存在约3倍的T细胞的增加。所述T细胞保留与肿瘤减小密切相关。本公开提供了ESK-双特异性抗体可高效地将T细胞与靶啮合并原位杀伤肿瘤细胞的直接体内证据。

在NSG小鼠中研究ESK-双特异性抗体在利用腹膜间皮瘤的实体瘤模型中的治疗活性。PK研究显示ESK-双特异性抗体的静脉内注射在血流中产生比腹膜内注射高的水平，但所述双特异性抗体的血浆半衰期特征性地短。在处理的小鼠中看到快速且显著的肿瘤抑制，表明ESK-双特异性抗体快速接近腹膜肿瘤细胞。PK研究确认了来自其他双特异性抗体构建体的药代动力学观察，从而表明ESK-双特异性抗体的连续施用可能是获得最佳治疗功效所必需的。

与其他双特异性抗体构建体类似，ESK-双特异性抗体的限制也是天然Fc区的缺乏，从而阻止了与新生FcRn受体的相互作用，这是延迟mAb清除和较长血液PK所必需的。工程化具有双重靶特异性但维持其天然结构的mAb的替代双特异性形式可提供较长的半衰期并且可在临床应用中显著提高其功效。有趣地，观察到全长mAb ESK1在消除小鼠的肺和肝中的消除弥漫性白血病BV173细胞中更有效，而ESK-双特异性抗体在骨髓中似乎更有效。这可反映在身体的不同器官中发现的效应物的含量和类型(例如，肝中的巨噬细胞和血液及骨髓中的T细胞)。该差异还表明，如果可确定适当的剂量和方案，则一起使用的全长IgG和双特异性抗体的组合可提供累加作用。mAb开发中的治疗性TCR是相对新的，并且存在许多未解决的关于它们的可能应用的问题。针对TCRm mAb的双特异性mAb法的开发将允许拓宽它们的范围以包括不仅肿瘤特异性抗原，而且还包括细胞内靶以及其他重要的超低密度靶。

双特异性抗体作用机制迄今已归于T细胞与mAb特异性细胞靶之间的直接相互作用。吸引人的发现是对于WT1RMF表位是特异的ESK-双特异性抗体在自体卵巢癌模型中诱导对于其他癌症抗原(以及非WT1靶)诸如HER2-neu表位369是高度特异的二次T细胞应答。已显示，T细胞与靶细胞之间的此类邻面接触可直接再活化(无需交叉呈递)存在于患者中的耐受性或无反应性的T细胞，以与其他癌症抗原反应。令人惊讶地，检测到强劲且长效的HER2-neu表位特异性T细胞应答，以及其他癌症特异性反应性。存在具有效应物记忆表型的CD8T细胞的增加，这进一步支持新的表位特异性T细胞应答的观察，因为CD8T细胞必须已被活化，才可响应受HLA-A*02:01限制的表位而增殖。单一ESK-双特异性抗体活化的量级及持续时间远优于通常观察到的常规肽/APC诱导的表位特异性T细胞应答(Dao等，同上)。有趣地，即使患者作为先前的过继细胞疗法的结果而在她的循环中具有WT1反应性T细胞，ESK-双特异性抗体不诱导针对原始靶表位WT1-RMF的T细胞应答。这些发现与这样的假说相符，即所述双特异性抗体将T细胞的TCR与肿瘤相细胞拉近以直接识别肿瘤上的新的MHC/肽表位，以及在该T细胞刺激期过程中所述ESK-双特异性抗体对其肽/MHC表位的结合阻断了对来自T细胞的同源TCR的RMF/A0201表位的任何识别。

已在被施予疫苗或T细胞输注的患者中检测到针对不存在于原始疫苗中的各种肿瘤抗原的T细胞的扩增，并且所述扩增与应答相关联；该现象被称为“表位扩散”，并且被认为由通过APC加工细胞凋亡的肿瘤细胞产生的交叉呈递介导的(Corbiere,V.等CancerRes.71(4),1253-1262(2011))。已报导了mAb对CD20的疫苗作用；所述作用似乎也由抗体介导的靶细胞至APC的调理作用介导(Hilchey等Blood 113(16),3809-3812(2009))。

本文中公开的双特异性mAb的新的作用机制的发现可对将来的疗法具有特别重要的意义，因为实体瘤的T细胞浸润与临床反应相关联。由于其的低分子量，双特异性抗体可渗透入实体瘤以活化无反应性或无应答的T细胞杀伤不仅表达已知的双特异性抗体的抗原性靶而且还表达其他未确定的特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞。针对多种新的表位的双特异性抗体介导的细胞毒性T细胞的克隆性扩增应当通过防止癌细胞变体或低抗原密度细胞的逃避，以及通过促进长寿命免疫，在很程度上促成了其长效治疗功效。另外，在特异性过继T细胞疗法之前，可将所述疫苗作用用于离体扩增。

虽然为了阐明理解通过说明和举例的方式已稍详细地描述了前述发明，但根据本公开的教导对于本领域普通技术人员来说很显然的是，可在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。本文中引用的所有参考资料在此通过引用整体并入本申请。

Claims (33)

1.一种重组抗体，所述抗体包含：

(i)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含：

(A)SEQ ID NO:38的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:39的HC-CDR2，和SEQ IDNO:40的HC-CDR3；和，SEQ ID NO:44的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:45的LC-CDR2，和SEQ ID NO:46的LC-CDR3；(B)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或

(C)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的单链可变片段(scFv)；和

(ii)第二抗原结合部分，其包含：

(A)重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL分别包含SEQ IDNO:112和111所示的氨基酸序列；或

(B)单链可变片段(scFV)，其包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组抗体，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分为选自由以下组成的组的抗体片段：Fab片段；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段；包含通过铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段；和scFv。

3.根据权利要求2所述的重组抗体，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分为scFv。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组抗体，其中所述第一抗原结合部分特异性结合于WT1/HLA并且所述第二抗原结合部分特异性结合于免疫效应细胞的表面抗原。

5.根据权利要求4所述的重组抗体，其中所述免疫效应细胞是T细胞。

6.根据权利要求4所述的重组抗体，其中所述免疫效应细胞为CD3⁺细胞并且所述重组抗体特异性结合于CD3。

7.根据权利要求1所述的重组抗体，其中所述重组抗体结合于WT1/HLA2⁺细胞。

8.根据权利要求7所述的重组抗体，其中所述WT1/HLA2⁺细胞在其表面上具有低密度的WT1/HLA2。

9.根据权利要求1所述的重组抗体，其中所述重组抗体特异性结合于CD3。

10.根据权利要求1所述的重组抗体，其中所述重组抗体结合于CD3⁺细胞。

11.根据权利要求1所述的重组抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:110中所示的氨基酸序列。

12.一种核酸，所述核酸编码权利要求1-11中任一项所述的重组抗体。

13.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-11中任一项所述的重组抗体或权利要求12所述的核酸。

14.权利要求1-11中任一项所述的重组抗体在制造用于杀伤WT1⁺细胞的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物用于如下方法，该方法包括将所述细胞与所述抗体和免疫效应细胞接触。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述免疫效应细胞为细胞毒性细胞。

16.根据权利要求1-11中任一项所述的重组抗体在制造用于治疗患有WT1阳性疾病的受试者的药物组合物中的用途。

17.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗受试者中的WT1阳性疾病的方法。

18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述治疗还包括向所述受试者施用免疫效应细胞。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述免疫效应细胞为细胞毒性细胞。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述细胞毒性细胞为CD3⁺细胞毒性T细胞。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述CD3⁺细胞毒性T细胞为自体T细胞。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的用途，其中所述WT1阳性疾病为WT1⁺癌症。

23.根据权利要求16-21中任一项所述的用途，其中所述WT1阳性疾病为慢性白血病或剂型白血病。

24.根据权利要求22所述的用途，其中所述WT1阳性疾病选自由以下组成的组：慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性/髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、间皮瘤、卵巢癌、胃肠癌、乳腺癌、***癌和胶质母细胞瘤。

25.权利要求1-11中任一项所述的重组抗体在制造用于产生针对肿瘤抗原的效应T细胞和/或记忆T细胞的药物组合物中的用途，其中，所述药物组合物用于如下方法，所述方法包括用所述重组抗体活化T细胞。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述T细胞在所述活化步骤后可活超过1周。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述肿瘤抗原为HER2-neu肿瘤抗原。

28.根据权利要求24-27中任一项所述的用途，其中离体产生所述效应T细胞和/或记忆T细胞。

29.根据权利要求24-27中任一项所述的用途，其中体内产生所述效应T细胞和/或记忆T细胞。

30.根据权利要求24-27中任一项所述的用途，其中，所述方法还包括施用免疫效应细胞。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述免疫效应细胞为细胞毒性细胞。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述细胞毒性细胞为CD3⁺细胞毒性T细胞。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述CD3⁺细胞毒性T细胞为自体T细胞。

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