JP2022546364A - キメラ抗原受容体系及びその使用 - Google Patents

キメラ抗原受容体系及びその使用 Download PDF

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グレワル，イクバル
シン，サンジャヤ
ハーヴィラ，ポール
ザ サード，マーティン，ジャック ボロック
タモト，ニンカ
リー，ヨンハイ
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ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
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Abstract

本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲを含む細胞、モノクローナル抗体及び二重特異性抗体又はそれらの抗原結合フラグメント、並びにそれらを含むキットが提供される。ＣＡＲ及び二重特異性抗体は、癌を治療することを必要とする対象における癌を治療する方法において、少なくとも１つの腫瘍抗原及び少なくとも１つの腫瘍を標的とするように設計されている。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年７月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／７０５，７８０号及び２０１９年８月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／８９２，２２５号に対する優先権を主張する。各開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
（発明の分野）
本開示は、腫瘍細胞による抗原回避、免疫監視、及び異質性を克服するための分子設計戦略に関する。より具体的には、本開示は、腫瘍標的化のための調整可能な単／多特異性を助けるために、結合部分及び二重特異性抗体を固定するモジュラＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、ファイル名が「０６５７６８．３６ＷＯ１配列表」で、２０２０年８月１３日に作成され、１１４ｋｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
免疫療法は、固形腫瘍及び他の癌を治療するための新しい方法を提供する（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：１３６１－５（２０１８）；Ｍｉｒｚａｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１８５０（２０１７））。モノクローナル抗体、Ｔ細胞再指向化（redirection）二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、及びごく最近のものであるキメラ抗原受容体Ｔ細胞（Chimeric antigen receptor T-cell、ＣＡＲ－Ｔ）を含む生物製剤は、腫瘍の治療を大幅に改善している。現在、２つのＣＡＲ－Ｔ療法が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されており、更なる療法が治験の最中である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｅｈｔａ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２：５５１－６１（２０１９））。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔに基づいた療法が最近成功を収めているとはいえ、それらに欠点がないというわけではない（Ｍｉｎｕｔｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．９：１７６（２０１９）、Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７１－５（２０１３）、Ｂｒｕｄｎｏ ａｎｄ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，Ｂｌｏｏｄ １２７：３３２１－３０（２０１６）、及びＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７：３０３ｒａ１３９（２０１５））。ＣＡＲ－Ｔは、患者から血液を収集し、Ｔ細胞を抽出し、更に、一般に腫瘍関連抗原（tumor associated antigen、ＴＡＡ）を標的とする単鎖可変領域フラグメント（single chain fragment variable、ｓｃＦｖ）で、キメラ抗原受容体を発現させることによって生成される。これは、患者のＴ細胞を再プログラムして腫瘍細胞を特異的に標的とし、腫瘍細胞を破壊するものである（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７２０－４（１９９３））。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、一般的な療法の方針となり、より多くの患者にとっての選択肢となるにつれて、物品のコスト、製造プロセスのコンプライアンス、及び患者にとってその費用が賄えるか否かが、議論の俎上に載ってきている。このために、汎用的なＣＡＲ－Ｔ／同種異系のＣＡＲ－Ｔがあれば、ドナー特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する必要性を軽減すると考えられる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：５０９－１５（２０１５）、及びＥｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－７（２０１７）を参照のこと）。
更に、承認されている現行のＣＡＲ－Ｔは、単一のＴＡＡのみを標的とし、異種のＴＡＡ発現を有する腫瘍に対して有効ではなく、抗原損失が回避されない（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＣＤ１９－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１７７ｒａ１３８（２０１３））。様々なグループは、ＣＡＲに２つの抗原認識部位を含ませること、又は汎用的な免疫受容体を介することのいずれか一方によって、多くのＴＡＡを標的とする方法をこれまでに見出している（Ｍｉｎｕｔｏｌｏ，Ｎ．Ｇ．，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｅ．＆Ｐｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｊｒ．Ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９，１７６（２０１９）、Ｃｈｏ Ｊ．Ｈ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．＆Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｗ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ Ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ １７３，１４２６－１４３８ ｅ１４１１（２０１８）、Ｚｈａｏ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｑ．，Ｓｏｎｇ，Ｙ．＆Ｌｉｕ，Ｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＣＡＲｓ，ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １１，１３２（２０１８））。この分離されたアプローチは、ユニバーサルＴ細胞という単一源を用いた多数のＴＡＡの標的化を可能にする。このために、遺伝子操作されたＣＡＲ成分とは無関係であり、腫瘍細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞を同時に結合することができる汎用ＣＡＲ－アダプタ対が設計された。したがって、本明細書では、Ｔ細胞のＣＡＲストーク内のペプチドリンカーを標的とすることができ、またＴＡＡも標的とする、二重特異性抗体が提供される（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，１５９－１６３（１９９７））。コンジット（Conduit）ＣＡＲ－Ｔと称されるこの系は、用量依存的に、腫瘍特異的細胞毒性を示すものである。
一般的な一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）系に関し、ＣＡＲ系が、（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）に連結された標的ポリペプチドリンカーペプチドを含むＣＡＲ－Ｔ構築物であって、標的ポリペプチドリンカーペプチドが、ＣＡＲストーク内にある、ＣＡＲ－Ｔ構築物と、（２）二重特異性抗体であって、（ａ）標的ポリペプチドリンカーペプチドに結合する第１の抗原結合部位、及び（ｂ）癌細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体と、を含み、二重特異性抗体によってＣＡＲ－Ｔ細胞と癌細胞とが結合され、二重特異性抗体が、癌細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞とを架橋して、癌細胞を死滅させる。
別の一般的な一態様では、本発明は、ＣＡＲ系に関し、ＣＡＲ系は、（１）標的ポリペプチドリンカーペプチド用の抗原結合部位を含む単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲ－Ｔ構築物と、（２）二重特異性抗体であって、（ａ）非抗原結合ｓｃＦｖに連結された標的ポリペプチドリンカーペプチドと、（ｂ）癌細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第２の抗原結合部位と、を含む、二重特異性抗体と、を含み、二重特異性抗体によってＣＡＲ－Ｔ細胞と癌細胞とが結合され、二重特異性抗体が、癌細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞とを架橋して、癌細胞を死滅させる。
本明細書では、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み得る。特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号７のポリペプチド配列を含み、かつ軽鎖可変領域が、配列番号８のポリペプチド配列を含む。
特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、例えば、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
本明細書では、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントも提供されるが、（ａ）第１のポリペプチド成分は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、又は（ｉｉ）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含み、かつ（ｂ）第２のポリペプチド成分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくはヒトＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２の抗原結合ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、前立腺特異的膜抗原（prostate-specific membrane antigen、ＰＳＭＡ）、好ましくはヒトＰＳＭＡ、又はＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質２（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 2、ＴＭＥＦＦ２）、好ましくはヒトＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する。第２の抗原結合ドメインは、例えば、（ａ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のポリペプチド配列をそれぞれ有する、又は（ｂ）配列番号９２、９３、９４、９５、９６、及び９７のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域を含み得る。
特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、配列番号２５又は配列番号９０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を含む第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を有する。第１の抗原結合ドメインは、例えば、配列番号７のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含むことができ、第２の抗原結合ドメインは、例えば、配列番号２５又は配列番号９０のポリペプチド配列を有する第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を含むことができる。
特定の実施形態では、単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３５及び配列番号２８、配列番号３６及び配列番号２８、配列番号３７及び配列番号２７、配列番号３８及び配列番号２７、配列番号１０１及び配列番号２８、配列番号１０２及び配列番号２８、配列番号１０３及び配列番号９８、又は配列番号１０４及び配列番号９８から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、及びＬＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。非抗原結合ｓｃＦｖは、例えば、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含み得る。
特定の実施形態では、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、モノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである。
本発明で開示されるようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸も提供される。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドも提供される。ＣＡＲは、例えば、（ａ）細胞外ドメインであって、（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー又は（２）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、細胞外ドメインと、（ｂ）膜貫通領域と、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み得る。
特定の実施形態では、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、及びＬＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。非抗原結合ｓｃＦｖは、例えば、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含み得る。非抗原結合ｓｃＦｖは、例えば、配列番号３３又は配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
特定の実施形態では、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ８細胞外ドメインである。ＣＤ８細胞外ドメインは、例えば、配列番号４１のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。ＣＤ８膜貫通ドメインは、例えば、配列番号４２のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。ＣＤ１３７共刺激ドメインは、例えば、配列番号４３のアミノ酸配列を含むことができ、かつＣＤ３ζ 活性化ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３９又は配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含み得る。重鎖可変領域は、例えば、配列番号７のポリペプチド配列を含むことができ、かつ軽鎖可変領域は、例えば配列番号８のポリペプチド配列を含むことができる。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、例えば、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に開示されるような単離ポリヌクレオチドによってコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。
本明細書に開示されるような単離核酸又は単離ポリヌクレオチドを含む、単離ベクターもまた提供される。
本明細書に記載されるような単離ベクターを含む、単離宿主細胞も提供される。単離宿主細胞は、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞、好ましくはヒトＴ細胞又はヒトＮＫ細胞を含み得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成する方法も提供される。本方法は、例えば、本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチドを含むＴ細胞又はＮＫ細胞を、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成するための条件下で培養することと、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を回収することと、を含み得る。
また、（ａ）本明細書に開示されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド、及び（ｂ）本明細書に開示されるような単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットも提供される。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌を治療することを必要とする対象において、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌を治療する方法も提供される。本方法は、本明細書に開示されるようなＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞、並びに本明細書に開示されるような二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
コンジットＣＡＲ－Ｔ系の作用機序を示す概略図である。ユニバーサルＣＡＲストークでトランスフェクトされたＴ細胞は、細胞表面上のＧ４Ｓリンカーを有する不活性ｓｃＦｖを含有する。腫瘍細胞は、細胞表面上に腫瘍特異的抗原を含有する。架橋二重特異性抗体アダプタを使用して、架橋二重特異性抗体及び腫瘍特異的抗原の両方を結合することによって、腫瘍細胞上にユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が向かう。架橋二重特異性抗体の腫瘍抗原標的化部分を変化させることにより、同じユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を依然使用しながら、異なる腫瘍抗原を使用して、癌及びその再発を治療することが可能である。 酵素結合免疫吸着検定法（enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）の結果を提供するグラフであり、ＣＥＮ－６３ Ｃ１３の抗Ｇ４Ｓ抗体の、Ｇ４Ｓリンカー（丸）及び非Ｇ４Ｓリンカー（四角）を含有する固定化ｓｃＦｖへの結合を示す。ＣＥＮ－６３ Ｃ１３の抗Ｇ４Ｓ抗体は、用量依存的結合と、０．５７ｎＭのＥＣ５０を示した。 非Ｇ４Ｓリンカーを有する細胞表面ｓｃＦｖではなく、Ｇ４Ｓリンカーを有する細胞表面ｓｃＦｖへのＣＥＮ－６３ Ｃ１３の結合を示すグラフである。所望のｓｃＦｖドメインを有するＣＡＲ－Ｔ構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＣＥＮ－６３ Ｃ１３抗体の結合を、蛍光標識された抗ヒトＦｃ抗体を使用して評価した。ＣＥＮ－６３－１３は、０．７８ｎＭのＥＣ５０計算値で、用量依存的に細胞表面抗原に結合した。 ＷＴ（Ｇ４Ｓ）４ペプチドリンカー及びリンカー切断型バリアントに結合する、ＣＥＮ－６３ Ｃ１３抗体のＫＤ値を提供するグラフである。ＣＥＮ－６３ Ｃ１３の結合に必要な最小リンカー－１の長さは、１０アミノ酸であると決定された。１０アミノ酸未満のリンカーについては、結合は観察されなかった。ビオチン化ペプチドリンカーをストレプトアビジンバイオセンサ上に固定化し、ＣＥＮ－６３ Ｃ１３の、完全長及び切断型リンカーへの結合を、バイオレイヤー干渉法を使用して測定した。 コンジットＣＡＲ－Ｔプラットフォームで使用される二重特異性抗体アダプタの設計を示す概略図である。表は、コンジットＣＡＲ－Ｔプラットフォームを検証するために使用される４つの二重特異性抗体アダプタの腫瘍結合アーム及びリンカー結合アームを示す。 コンジットＣＡＲ－Ｔ発現の検証を示すチャートである。 コンジットＣＡＲ－Ｔ発現の検証を示すチャートである。 コンジットＣＡＲ－Ｔ発現の検証を示すチャートである。 コンジットＣＡＲ－Ｔ発現の検証を示すチャートである。コンジット（Ｇ４Ｓ）４ＣＡＲ－Ｔ細胞は、活性化初代ヒトＴリンパ球を、所望のＣＡＲ－Ｔ構築物のためのインビトロ転写ｍＲＮＡコードでエレクトロポレーションすることによって作製された。図６Ａは、ＣＥＮ－６３ Ｃ１３抗体を有する場合又は有さない場合のコンジット－ＣＡＲ発現の、トランスフェクトされたＴ細胞を染色することによる検出を示す。図６Ｂは、二重特異性抗体アダプタを有する場合又は有さない場合のコンジット－ＣＡＲ発現の比較を示す。アダプタの添加は、コンジットＣＡＲ発現に影響を与えなかった。図６Ｃは、抗Ｇ４Ｓ ＣＥＮ－６３－１３抗体、続いて抗ヒトＰＥ二次抗体によって検出されたアイソタイプＣＡＲ－導入遺伝子の発現を示す。ＣＤ３＋ Ｐａｎ－Ｔ細胞のｍＲＮＡ形質導入の２日後に、染色を実施した。図６Ｄは、レンチウイルスをトランスフェクトされたＰａｎ－Ｔ細胞上で検出することができる、Ｎ末端ＭＹＣタグを含有する（Ｇ４Ｓ）３リンカーを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲを示す。ＭＹＣ陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＥＮ－６３－１３による染色が増加したが、ＭＹＣ陰性細胞は、ＣＥＮ－６３－１３による染色がほとんどなかった。 ユニバーサルＣＡＲストークを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９活性化の量を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。 ユニバーサルＣＡＲストークを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９活性化の量を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。 ユニバーサルＣＡＲストークを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９活性化の量を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。 ユニバーサルＣＡＲストークを発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９活性化の量を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。図７Ａは、標的腫瘍細胞の存在下でエフェクタＴ細胞のみがＣＤ６９のベースライン発現を示したことを示す。図７Ｂは、エフェクタＴ細胞に添加された腫瘍細胞が、エフェクタＴ細胞のみに対するＣＤ６９の発現を増加させたことを示す。図７Ｃは、腫瘍細胞とコンジット二重特異性分子との両方の存在下で、エフェクタＴ細胞上に、最大レベルのＣＤ６９の誘導が発生したことを示す。図７Ｄは、二重特異性抗体の存在下で、ユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍細胞と共培養したときに、最高レベルのＴ細胞活性化が発生したことを示すグラフである。 コンジットＣＡＲ－Ｔプラットフォームの検証を示すグラフである。 コンジットＣＡＲ－Ｔプラットフォームの検証を示すグラフである。コンジットＣＡＲ細胞は、二重特異性抗体アダプタの存在下で腫瘍細胞を死滅させた。図８Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を腫瘍細胞と共に４時間インキュベートした際の、ＣＤ１０７ａ発現の分析を示す。ＣＤ１０７ａの発現は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ＋細胞、及びＣＤ８＋ ＣＡＲ－細胞でゲーティングすることによって測定された。二重特異性分子は、ＣＤ１０７ａ発現を有意に活性化した。図８Ｂは、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイによって測定された際の異なるＥ：Ｔ比での二重特異性分子の細胞溶解潜在力を示す。５μＭの最終濃度で、全ての二重特異性分子は、より高いＥ：Ｔ比において強力な細胞傷害性を示した。 二重特異性細胞結合及び増殖、並びにリガンド結合依存性増殖及び脱顆粒反応を示すチャートである。 二重特異性細胞結合及び増殖、並びにリガンド結合依存性増殖及び脱顆粒反応を示すチャートである。 二重特異性細胞結合及び増殖、並びにリガンド結合依存性増殖及び脱顆粒反応を示すチャートである。図９Ａ：ＢｓＡｂの存在そのものだけでは、ＣＡＲ表面発現を変化させない。ＢｓＡｂ分子（５μｇ／ｍＬ）を、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを有するアイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞に添加し、２日間インキュベートした。ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＣＡＲ表面発現は、抗Ｇ４Ｓ抗体によって検出され（なお、ここでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＡＲが示されている）、二重特異性抗体の存在下でも又は非存在下でも同様のままであった。図９Ｂ：２つの異なるドナーからのＰａｎＴ細胞を使用して生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＢｓＡｂの存在下／非存在下でＰＳＭＡ発現腫瘍細胞と共培養した。ＣＦＳＥ染色強度を、刺激の７２時間後に分析した。ＢｓＡｂの非存在下でのＣＦＳＥ染色は、グレーのヒストグラムで示され、ＢｓＡｂの存在下でのＣＦＳＥ染色は、グリーンのヒストグラムで示されている。図９Ｃ：（Ｇ４Ｓ）４含有ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＢｓＡｂ１を有するＰＳＭＡ発現腫瘍細胞及びＢｓＡｂ１を有さないＰＳＭＡ発現腫瘍細胞と共培養した。５時間の共培養後、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ検出量を測定した。ＣＥＮ－６３－１３ｍＡｂを使用して、ＣＡＲ発現を検出した。代表的なプロットは、ＣＡＲ陰性細胞が、ＢｓＡｂ１の存在下又は非存在下で、ＣＤ１０７ａの発現がなかったということを示す。ＣＡＲ＋の集団では、二重特異性抗体とインキュベートされた細胞のみが、ＣＤ１０７ａの発現が認識可能な程度に増加したことを示し、腫瘍細胞の存在下でのＣＤ１０７ａ発現には、ＢｓＡｂが必要であるということを示唆している。 ＣＡＲ－Ｔ媒介性の細胞傷害性及びサイトカインプロファイルの動態的監視を示すグラフである。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイを使用して、連続希釈されたＢｓＡｂの存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるリアルタイムの腫瘍細胞溶解を測定した。 ＣＡＲ－Ｔ媒介性の細胞傷害性及びサイトカインプロファイルの動態的監視を示すグラフである。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイを使用して、連続希釈されたＢｓＡｂの存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるリアルタイムの腫瘍細胞溶解を測定した。 ＣＡＲ－Ｔ媒介性の細胞傷害性及びサイトカインプロファイルの動態的監視を示すグラフである。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイを使用して、連続希釈されたＢｓＡｂの存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるリアルタイムの腫瘍細胞溶解を測定した。 ＣＡＲ－Ｔ媒介性の細胞傷害性及びサイトカインプロファイルの動態的監視を示すグラフである。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイを使用して、連続希釈されたＢｓＡｂの存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるリアルタイムの腫瘍細胞溶解を測定した。二重特異性抗ＰＳＭＡ及び抗Ｇ４Ｓリンカー分子（ＢｓＡｂ１及び２）を生成し、ＰＳＭＡ発現ＰＣ３細胞を標的とするｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイで更に試験した（図１０Ａ）。この９７時間にわたる実験では、アイソタイプＧ４Ｓ含有ＣＡＲ－Ｔ細胞対ＰＣ３細胞のＥ：Ｔ比は５：１であった。実験を三組ずつで実施した。図１０Ｂ：７２時間後の異なるＥ：Ｔ比に対するパーセント細胞溶解度も評価し、ＢｓＡｂ１及びＢｓＡｂ２について示す。図１０Ｃ：同様のｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性実験を、抗ＴＭＥＦＦ２リンカー二重特異性抗体及び抗Ｇ４Ｓリンカー二重特異性抗体を使用して実施した。用量依存性の細胞傷害性は、ＢｓＡｂの存在下でのみ観察された。図１０Ｄ：ＣＡＲ－Ｔと腫瘍細胞との共培養における上清の、サイトカインプロファイル（Ｅ：Ｔ＝５：１）を示す。ＩＮＦγ、ＧＭＣＳＦ、及びＩＬ－６レベルを、インキュベーションの７２時間後に評価し、二重特異性抗体の存在下で上昇させた。データは、平均±ＳＤとして表わされている。ＣＡＲ－Ｔ細胞とＰＣ３細胞との両方を含む群どうしの間の有意性を、多重比較（Ｔｕｋｅｙ試験）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。このような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１選択肢は、第２要素なしに第１要素が適用可能であることを指す。第２選択肢は、第１要素なしに第２要素が適用可能であることを指す。第３選択肢は、第１及び第２要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。米国特許審査便覧セクション２１１１．０３を参照のこと。
本明細書で使用するとき、「被験体／対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
「右」、「左」、「下方」、及び「上方」という語は、参照される図面内での方向を指定する。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれらをコードする単離ポリヌクレオチド、単離モノクローナル抗体又は二重特異性抗体及びその抗体結合フラグメント並びにそれらをコードする核酸）に関連して、以下に示す配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせした場合に同じであるか、あるいは特定のパーセントの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
配列比較のために、典型的には１つの配列は、試験配列がそれに対して比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。上記のＴは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積位置合わせスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコアであって、常に＞０）と、パラメータＮ（一致しない残基についてのペナルティスコアで、常に＜０）とを用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積位置合わせスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したとき、１つ以上の負のスコアリング残基の位置合わせの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、位置合わせの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝３、期待値（Ｅ）＝１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似していると見なされる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２ポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用するとき、「単離（された）」という用語は、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの構成成分が天然に生じる生物の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質）から実質的に分離されたか、これらの他の成分とは別に生成されたか、又はこれらの他の成分から精製されたものであることを意味する。このため、「単離（された）」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離（された）」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、その組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離される。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。
本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ以上の改変された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により改変された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「改変された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
本明細書で使用するとき、「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクト又は形質導入した細胞である。別の一実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクト又は形質導入された細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞との同一性を有していない場合がある。
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現されるＣＡＲは、宿主細胞の細胞質内、細胞培養の成長培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
本明細書で使用するところの「免疫細胞」又は「免疫エフェクタ細胞」なる用語は、免疫応答、例えば免疫エフェクタ応答の促進に関与する細胞のことを指す。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、及び骨髄由来食細胞が挙げられる。特定の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞はＴ細胞であり、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されていることから、ＣＡＲ－Ｔ細胞と呼ばれる。
本明細書で使用するとき、「遺伝子操作された免疫細胞」なる用語は、細胞の全遺伝物質にＤＮＡ又はＲＮＡの形の更なる遺伝物質を加えることによって遺伝子改変された免疫細胞（免疫エフェクタ細胞とも呼ばれる）のことを指す。本明細書の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞は、本発明に基づくＣＡＲ構築物を発現するように遺伝子改変されたものである。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で使用するとき、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）なる用語は、少なくとも、単一特異性抗体若しくは多重特異性抗体によって結合される細胞外ドメイン又は単一特異性抗体若しくは多重特異性抗体上の標的に特異的に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内Ｔ細胞受容体活性化シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを指す。細胞外ドメインは、リンカーポリペプチドに対する結合ドメイン、リンカーポリペプチドそのもの、又は組み換えポリペプチドに融合されたリンカーポリペプチドを含み得る。癌細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するように遺伝子操作された多重特異性抗体と、ＣＡＲの細胞外ドメインとの結合の結果、ＣＡＲはクラスター化し、ＣＡＲ保有細胞に活性化刺激が与えられる。ＣＡＲは、免疫エフェクタ細胞の特異性を新たに方向付け、主要組織適合性（major histocompatibility、ＭＨＣ）とは独立した形で、ＴＡＡ発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の増殖、サイトカイン産生、貪食作用、及び／又は産生を誘導する。
一態様では、ＣＡＲは、非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。一態様では、ＣＡＲは、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の態様によれば、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
別の特定の一態様によれば、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含み得る。
別の特定の一態様によれば、非抗原結合ｓｃＦｖは、例えば、配列番号３３又は配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
特定の一態様によれば、抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み得る。
別の特定の一態様によれば、抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含み得る。
別の特定の一態様によれば、抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、例えば、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
別の特定の一態様によれば、細胞外ドメインは、ＣＤ８細胞外ドメインであって、（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー又は（２）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合する抗原結合ドメインに連結されたＣＤ８細胞外ドメインを含み得る。ＣＤ８細胞外ドメインは、例えば、配列番号４１のアミノ酸配列を含み得る。
別の特定の一態様によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。ＣＤ８膜貫通ドメインは、例えば、配列番号４２のアミノ酸配列を含み得る。
別の特定の一態様によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。ＣＤ１３７共刺激ドメインは、例えば、配列番号４３のアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ３ζ活性化ドメインは、例えば、配列番号４４のアミノ酸配列を含み得る。
別の特定の一態様によれば、ＣＡＲは、配列番号３９又は配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
別の特定の一態様によれば、本明細書に開示されるような単離ポリヌクレオチドによってコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供される。
本明細書で使用するとき、「シグナルペプチド」なる用語は、新生ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）におけるリーダー配列であって、新生タンパク質を翻訳と同時又は翻訳後に小胞体に誘導した後、表面発現させる配列のことを指す。
本明細書で使用するとき、「細胞外抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、又は「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、細胞膜の外側に位置し、抗原、標的、若しくはリガンドに結合することができるか、あるいは細胞外ドメインの一部分を特異的に認識する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントによって特異的に結合されることができるポリペプチドリンカー）によって結合されることができるＣＡＲの部分を指す。
本明細書で使用するとき、「ヒンジ領域」なる用語は、ＣＡＲタンパク質の２つの隣接するドメイン、例えば、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するＣＡＲの部分を指す。
本明細書で使用するとき、「膜貫通ドメイン」なる用語は、細胞膜を横切って延在し、ＣＡＲを細胞膜に固定するＣＡＲの部分を指す。
本明細書で使用するとき、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞膜内にあるＣＡＲの部分であって、ＣＡＲの細胞外ドメインが係合したときにシグナル伝達カスケードを活性化するように作用する部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、共刺激ドメイン及び活性化ドメインを含み得る。
共刺激ドメイン
本明細書で使用するとき、キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体の効力を増加させるために共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込むことができる。共刺激（シグナル伝達）ドメインは、共刺激分子に由来し得る。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激ドメインは、共刺激分子に由来し得るが、その共刺激分子としては、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（α、β、δ、ε、γ、ζ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、プログラム死－１（programmed death-1、ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（inducible T cell costimulator、ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（lymphocyte function-associated antigen-1、ＬＦＡ－１、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４、ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦＲ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンドサイトカイン受容体、活性化ＮＫ細胞受容体、又はそれらのフラグメント若しくはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ１３７共刺激ドメインである。
活性化ドメイン
本明細書で使用するとき、キメラ抗原受容体は、活性化ドメインを含み得る。活性化ドメインには、ＣＤ３が含まれ得るが、これに限定されない。ＣＤ３は、天然Ｔ細胞上のＴ細胞受容体の要素であり、ＣＡＲ中の重要な細胞内活性化要素であることが示されている。好ましい一施形態では、ＣＤ３は、ＣＤ３ゼータ（ζ）である。
ヒンジ領域
本明細書に記載されるように、キメラ抗原受容体は、ヒンジ領域を含み得る。これは、「スペーサー」領域と呼ばれることもある細胞外ドメインの一部である。本発明によれば、様々なヒンジを使用することができ、例えば、上記のような共刺激分子、免疫グロブリン（Ｉｇ）配列、又は標的細胞から所望の特別な距離を達成するための好適な他の分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞外領域全体が、ヒンジ領域を構成する。
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインはヒンジ領域を含み、ヒンジ領域はポリペプチドリンカー配列である。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドを含む。特定の実施形態では、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、非抗原結合ｓｃＦｖに操作可能に連結され得る。
（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、例えば、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態では、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。ポリペプチドリンカー配列の例は、表１に見出すことができる。
Figure 2022546364000001
膜貫通領域
本明細書で使用するとき、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通領域／ドメインを含み得る。ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞内ドメインにも同様に融合され得る。一実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つに天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換によって選択又は修飾し、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。膜貫通ドメインは、天然又は合成の供給源のいずれか一方に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型又は膜貫通型タンパク質に由来し得る。本発明における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（α、β、δ、ε、γ、ζ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４、ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦＲ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、サイトカイン受容体、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、又はそれらのフラグメント若しくはそれらの任意の組み合わせに由来し（すなわち、それらを含むか、又はそれから遺伝子操作で作製され）得るが、それらに限定されない。好ましい一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。
免疫細胞
特定の態様によれば、本発明は、本明細書では、単離ポリヌクレオチド、又はＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを含むベクターを含む免疫細胞である細胞を提供する。本発明の単離ポリヌクレオチド及び／又はベクターを含む免疫細胞は、「遺伝子操作された免疫細胞」と称され得る。好ましくは、遺伝子操作された免疫細胞は、ヒトに由来する（組み換え前の段階ではヒト起源である）。
遺伝子操作された免疫細胞は、例えば、リンパ系の細胞であり得る。リンパ系の細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（Natural Killer、ＮＫ）細胞が挙げられ得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）を発現するが、ほとんどの細胞は、α鎖及びβ鎖を発現し、より少数の細胞群がγ鎖及びδ鎖を発現する。本発明の遺伝子操作された免疫細胞として有用なＴ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり得るが、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬとも呼ばれる、ＣＤ８＋細胞）、メモリーＴ細胞（例えば、中央メモリーＴ細胞、幹様メモリーＴ細胞、及びエフェクタメモリーＴ細胞が挙げられる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変Ｔ細胞、及びγδＴ細胞が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。他の例示的な免疫細胞としては、マクロファージ、抗原提示細胞（antigen presenting cell、ＡＰＣ）、又は細胞媒介免疫応答の阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤経路受容体（例えば、ＰＤ－１）を発現する任意の免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用することができる免疫細胞の前駆細胞は、造血幹細胞及び／又は先祖細胞を含む。造血幹細胞及び／又は先祖細胞は、当該技術分野で既知の方法によって、骨髄、臍帯血、サイトカイン動員後の成人末梢血などに由来し得る。免疫細胞は、本発明のＣＡＲを組み換え発現するように遺伝子操作される。
免疫細胞及びその前駆細胞は、市販の方法を含む当該技術分野で既知の方法によって単離され得る（例えば、Ｒｏｗｌａｎｄ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９９）を参照されたい）。免疫細胞又はその前駆体の供給源には、末梢血、臍帯血、骨髄、又は他の造血細胞源が含まれるが、これらに限定されない。様々な技術を用いて、細胞を単離又は濃縮された所望の免疫細胞に分離することができる。例えば、ネガティブ選択方法を使用して、所望の免疫細胞ではない細胞を除去することができる。更に、ポジティブ選択方法を使用して、所望の免疫細胞又はその前駆体を単離又は濃縮するか、あるいはポジティブ選択方法とネガティブ選択方法とを組み合わせて使用することができる。特定のタイプの細胞、例えば、特定のＴ細胞を単離する場合、様々な細胞表面マーカーを使用して、又はマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３４）を組み合わせて使用して、細胞を分離することができる。
免疫細胞又はその前駆細胞は、免疫細胞又はその前駆細胞が本発明の治療方法において投与される対象に対して自己由来であってもよく又は自己由来でなくてもよい。自己由来細胞は、ＣＡＲを組み換え発現する遺伝子操作された免疫細胞が投与される対象から単離される。任意選択的に、細胞は白血球搬出法によって得ることができ、その方法では、白血球が、採取された血液から選択的に除去され、組み換えられてから、ドナーに再輸血される。あるいは、対象とは異なる、すなわち非自己由来ドナーからの同種異系細胞を使用することができる。非自己由来ドナーの場合、細胞は、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen、ＨＬＡ）について分類及び一致させて、適切なレベルの適合性が決定される。自己由来細胞及び非自己由来細胞の両方について、細胞は、使用準備が整うまで、任意選択的に凍結保存され得る。
本発明のＣＡＲの組み換え発現に使用することができる免疫細胞を単離するための様々な方法がこれまでに説明されており、使用することができる。そのような方法としては、末梢ドナーリンパ球を使用すること（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ３：３５－４５（２００３）、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１２６－９（２００６））、腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltrating lymphocyte、ＴＩＬ）由来のリンパ球培養物を使用すること（Ｐａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４９５－５０４（２０００）、Ｐａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３８２－９２（２０００））、及び人工抗原提示細胞（artificial antigen-presenting cell、ＡＡＰＣ）又は樹状細胞を用いた、インビトロで増殖させた抗原特異的末梢血白血球を選択的に使用すること（Ｄｕｐｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：５４１７－４２７（２００５）、Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０２：４９８－５０５（２００３））が挙げられ得るが、これらに限定されない。幹細胞を使用する場合、細胞は、当該技術分野において周知の方法によって単離され得る（例えば、Ｋｌｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（２００２）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（２００７）を参照）。
特定の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法は、免疫エフェクタ細胞が本発明の実施形態に基づく１つ以上のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクタ細胞にトランスフェクト又は形質導入することを含む。免疫治療用の免疫細胞の調製方法は、例えば、参照により本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／１３０６３５号、同第２０１３／１７６９１６号、及び同第２０１３／１７６９１５号に記載されている。遺伝子操作された免疫細胞を調製するために使用することが可能な個々の工程は、例えば、参照によって本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／０３９５２３号、同第２０１４／１８４７４１号、同第２０１４／１９１１２８号、同第２０１４／１８４７４４号、及び同第２０１４／１８４１４３号に開示されている。
特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞は、本発明のＣＡＲにより遺伝子改変された（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターにより形質導入された）後、インビトロで活性化及び増殖される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、参照によって本明細書に援用するところの米国特許第６３５２６９４号、同第６５３４０５５号、同第６９０５６８０号、同第６６９２９６４号、同第５８５８３５８号、同第６８８７４６６号、同第６９０５６８１号、同第７１４４５７５号、同第７０６７３１８号、同第７１７２８６９号、同第７２３２５６６号、同第７１７５８４３号、同第５８８３２２３号、同第６９０５８７４号、同第６７９７５１４号、同第６８６７０４１号、米国特許出願公開第２００６／１２１００５号に記載される方法を用いて、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前又は後で活性化及び増殖させることができる。Ｔ細胞は、インビトロ又はインビボで増殖させることができる。一般的に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを結合させた表面と接触させることによって増殖させることができる。非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体、若しくはその抗原結合フラグメント、又は表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体との接触によって、又はタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触とカルシウムイオノフォアとの組み合わせによって、又はＣＡＲ自体の活性化などによって、刺激することができる。Ｔ細胞の表面のアクセサリ分子を共刺激するには、アクセサリ分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適した条件としては、例えば、血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／若しくＩＬ－２１、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ、並びに／又は当業者には周知の細胞の増殖用の他の任意の添加物質を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適当な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又は、Ｘ－ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ社））が挙げられる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、参照によって本明細書に援用するところの米国特許第６０４０１７７号、同第５８２７６４２号、及び国際公開第２０１２１２９５１４号に記載される方法などの方法を用いて、フィーダー細胞及び適当な抗体及びサイトカインによって活性化及び刺激して増殖させることができる。
抗体
一般的な一態様では、本発明は、ポリペプチドリンカーに特異的に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。ポリペプチドリンカーは、例えば、表１に提供されるポリペプチドリンカーから選択され得る。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ｎが少なくとも２である）である。
別の一般的な一態様では、本発明は、単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及びポリペプチドリンカーを標的とするように遺伝子操作することができる。ポリペプチドリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ｎが少なくとも２である）であり得る。二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とし、非抗原結合成分（例えば、ポリペプチドリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎが少なくとも２である）リンカーを含む非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ））を有するように操作することもできる。
抗体を作製する方法、及び癌を含む疾患を治療するために抗体を、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共に使用する方法も提供される。本発明の抗体は、１つ以上の望ましい機能的特性を有するが、そのような特性としては、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び／又は（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカーに対する高い親和性、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び／又は（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカーに対する高い特異性、エフェクタ媒介性腫瘍細胞溶解、補体依存性細胞傷害性（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、抗体依存性貪食作用（antibody-dependent phagocytosis、ＡＤＰＣ）、及び／又は腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（antibody-dependent cellular-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を刺激する能力、複合化された薬剤の動員を媒介する能力、並びに単独で投与される場合又は他の抗癌剤治療と併用して投与される場合に、対象及び動物モデルにおける腫瘍成長を阻害する能力が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、広義で使用され、免疫グロブリン、又はモノクローナル又はポリクローナルである、ヒト、ヒト化、複合、及びキメラ抗体を含む抗体分子並びに抗体フラグメントを含む。全般的には、抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であることが好ましい。脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちκ及びλのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ラット又はヒト抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重鎖及び軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含み、これらの領域のそれぞれは３つのドメイン（すなわち、相補性決定領域１～３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３））を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と称される。
本明細書で使用するとき、「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する単離抗体は、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合しない抗体を、実質的に含まない）。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性のある自然発生変異を除いて同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組み換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合フラグメント」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異的抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体又は親抗体フラグメントが結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＦｄフラグメントを含む。他の特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントはＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
本明細書で使用するとき、用語「単鎖抗体」は、約５～約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野において従来既知の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野において従来既知の単一ドメイン抗体を指す。
本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において既知の任意の技術を用いて作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトな若しくは完全長の抗体、そのフラグメント、並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
本明細書で使用するとき、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性が保持されるが、人体における抗原の抗原性が低下するように、改変によりヒト抗体への配列相同性を増加させた非ヒト抗体を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ又は３つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗原結合ドメインの可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗原結合ドメインの配列に対応する。
本明細書で使用するとき、用語「多重特異性抗体」は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数のうちの第１免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、又は四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用するとき、用語「二重特異性抗体」は、２つ以下のエピトープ又は２つ以下の抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープ（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））に対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープ（例えば、Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチド）に対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープ（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））に対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、第２のエピトープ（例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチド）に対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープ（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））に対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２の抗原に対する結合特異性を有しない重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列（例えば、非抗原結合単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））と、を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープ（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））に対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメント（例えば、非抗原結合単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））と、を含む。
本明細書で使用するとき、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）」という用語は、発現されて、ＴＡＡに結合することができる抗体によって認識されることができる任意の抗原を指す。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の例としては、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＭＥＦＦ２、ＫＬＫ２、ＣＤ７０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺幹細胞抗原（prostate stem cell antigen、ＰＣＳＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ又はＢＣＭ）、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（G-protein coupled receptor family C group 5 member D、ＧＰＲＣ５Ｄ）、インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（Interleukin-1 receptor accessory protein、ＩＬ１ＲＡＰ）、デルタ様３（delta-like 3、ＤＬＬ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（carbonic anhydrase IX、ＣＡＩＸ）、癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、上皮性糖タンパク質－２（epithelial glycoprotein-2、ＥＧＰ２）、上皮性糖タンパク質－４０（epithelial glycoprotein－40、ＥＧＰ－４０）、上皮性接着分子（epithelial adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、葉酸結合タンパク質（folate-binding protein、ＦＢＰ）、胎児性アセチルコリン受容体（acetylcholine receptor、ＡＣｈＲ）、葉酸受容体ａ及びｂ（folate receptor a and b、ＦＲａ及びＦＲｂ）、ガングリオシドＧ２（ganglioside G2、ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、上皮増殖因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢ３、ＥＲＢ４、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase、ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（interleukin-13 receptor subunit alpha-2、ＩＬ－１３Ｒａ２）、ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kinase insert domain receptor、ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（L1 cell adhesion molecule、ＬＩＣＡＭ）、メラノーマ関連抗原１（メラノーマ抗原ファミリーＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン－１６（Ｍｕｃ－１６）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、癌精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、腫瘍関連糖タンパク質７２（tumor-associated glycoprotein 72、ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子受容体（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（Wilms tumor protein、ＷＴ－１）、タイプ１チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６（Ｎｋｐ３０）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン－４（chondroitin sulfate proteoglycan－４、ＣＳＰＧ４）、ＤＮＡＸアクセサリ分子（DNAX accessory molecule、ＤＮＡＭ－１）、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐＨＡ２）、線維芽細胞関連タンパク質（fibroblast associated protein、ＦＡＰ）、Ｇｐ１００／ＨＬＡ－Ａ２、グリピカン３（glypican 3、ＧＰＣ３）、ＨＡ－１Ｈ、ＨＥＲＫ－Ｖ、ＩＬ－１１Ｒａ、潜在膜タンパク質（latent membrane protein、ＬＭＰ１）、神経細胞接着分子（neural cell-adhesion molecule、Ｎ－ＣＡＭ／ＣＤ５６）、及びＴＲＡＩＬ受容体（trail receptor、ＴＲＡＩＬ Ｒ）が挙げられ得るが、それらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する」抗原結合ドメインは、ＴＡＡ、好ましくはヒトＴＡＡに、ＫＤが１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１０Ｍ以下で結合する抗原結合ドメインを指す。用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、ある抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴法を使用することによって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサシステムを使用することなどによって、又は例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤー干渉法の技術を使用することによって、求めることができる。
本明細書で使用するとき、「（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチド」は、ＧＧＧＧＳ（配列番号８９）アミノ酸モチーフを有するペプチドを指し、式中のｎは、ＧＧＧＧＳモチーフの反復数である。（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、若しくは少なくとも１０個の反復数、又はその間にある任意の値の反復数を有し得る。特定の実施形態では、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、少なくとも２個の反復数を有する。（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、例えば、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。好ましい一実施形態では、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用するとき、「（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドに特異的に結合する」抗原結合ドメインは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチド、好ましくは（Ｇ４Ｓ）４リンカーペプチドに、ＫＤが１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１０Ｍ以下で結合する抗原結合ドメインを指す。
本明細書で使用するとき、「非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、抗原に特異的に結合しないｓｃＦｖを指す。ｓｃＦｖは、ＫＤが１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１０Ｍ以下で、いかなる潜在的な抗原にも結合しないように設計される。ｓｃＦｖによる抗原の非特異的結合が起こり得るが、しかし一般に、抗原の非特異的結合は、ＫＤが１×１０－３Ｍ以上で起こる。
抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。
特定の一態様によれば、本明細書では、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。その単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み得る。
別の特定の一態様によれば、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の特定の一態様によれば、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、例えば、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
特定の一態様によれば、本明細書では、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントも提供されるが、（ａ）第１のポリペプチド成分は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、又は（ｉｉ）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含み、かつ（ｂ）第２のポリペプチド成分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくはヒトＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
別の特定の一態様によれば、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２の抗原結合ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
別の特定の一態様によれば、第２の抗原結合ドメインは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、好ましくはヒトＰＳＭＡ、又はＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質２（ＴＭＥＦＦ２）、好ましくはヒトＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する。第２の抗原結合ドメインは、例えば、（ａ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のポリペプチド配列、又は（ｂ）配列番号９２、９３、９４、９５、９６、及び９７のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域を含み得る。
別の特定の一態様によれば、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域と、を含み、第２の抗原結合ドメインは、配列番号２５又は配列番号９０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のポリペプチド配列を含む第２の重鎖可変領域と、配列番号２６又は配列番号９１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域と、を含む。
別の特定の一態様によれば、単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３５及び配列番号２８、配列番号３６及び配列番号２８、配列番号３７及び配列番号２７、配列番号３８及び配列番号２７、配列番号１０１及び配列番号２８、配列番号１０２及び配列番号２８、配列番号１０３及び配列番号９８、又は配列番号１０４及び配列番号９８から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の特定の一態様によれば、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
別の特定の一態様によれば、非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸とに関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、本発明のＣＡＲ、モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合フラグメント、及び／又は二重特異性抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードしている核酸配列を変更できるということが当業者には理解されるであろう。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを含むベクターと、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターと、に関する。本開示を鑑みると、当業者に知られている任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えばプラスミドなどの組み換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は抑制型プロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当技術分野において知られており、細胞内でその抗原結合ドメインを生成するために、本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った組み換え発現ベクターを生成することができる。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを含むベクターで形質導入された細胞に関する。「形質導入された」又は「形質導入」という用語は、外因性の核酸が宿主細胞に移送又は導入されるプロセスを指す。「形質導入された」細胞は、外因性の核酸で形質導入されたものである。その細胞は、対象の一次細胞及びその子孫を含む。特定の実施形態では、細胞は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されて、癌などの疾患を治療する。特定の実施形態では、細胞は、ヒトＣＡＲ－ＮＫ細胞であり、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＮＫ細胞は、癌などの疾患を治療するために用いられる。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする単離核酸を含むベクターでＴ細胞に形質導入することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する方法に関する。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなＣＡＲ－Ｔを産生する方法に関する。方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための条件下で、本明細書に開示されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＴ細胞を培養することと、ＣＡＲ－Ｔ細胞を回収することと、を含む。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする単離核酸を含むベクターでＮＫ細胞に形質導入することによって、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を作製する方法に関する。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなＣＡＲ－ＮＫを産生する方法に関する。方法は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成するための条件下で、本明細書に開示されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＮＫ細胞を培養することと、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を回収することと、を含む。
別の一般的な態様において、本発明は、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。本開示を考慮すると、当業者に知られている任意の宿主細胞を、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの組み換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１若しくはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体の発現の場合）、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＨＥＫ２９３細胞（例えば、完全長ＩｇＧ抗体の発現の場合）である。特定の実施形態によれば、組み換え発現ベクターは、組み換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に形質転換される。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法であって、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する条件下で、当該モノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている核酸を含む細胞を培養することと、当該細胞又は細胞培養物から（例えば上清から）当該抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することと、を含む、方法に関する。発現した抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞から収集し、当該技術分野において公知の従来の技術に従って、そして、本明細書に記載のとおり精製することができる。
医薬組成物
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されるような単離ポリヌクレオチド又は核酸（例えば、ＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチド、あるいはモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸）、本明細書に開示されるような単離ポリペプチド（例えば、単離モノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、又はＣＡＲ）、本明細書に開示されるような宿主細胞、及び／又は本明細書に開示されるような遺伝子操作された免疫細胞、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。本明細書で使用するとき、「医薬組成物」という用語は、本明細書に開示されるような単離ポリヌクレオチド若しくは核酸、本明細書に開示されるような単離ポリペプチド、本明細書に開示されるような宿主細胞、及び／又は本明細書に開示されるような遺伝子操作された免疫細胞を、医薬的に許容される担体と一緒に含む生成物を意味する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、及び／又は遺伝子操作された免疫細胞と、それらを含む組成物はまた、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造において有用である。
本明細書で使用するとき、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するとき、用語「医薬的に許容される担体」は、本発明による組成物の効果にも本発明による組成物の生物活性にも干渉しない無毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮すると、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、宿主細胞、及び／又は遺伝子操作された免疫細胞の医薬組成物における使用に好適な、任意の医薬的に許容される担体を、本発明で使用できる。
医薬的に許容される担体を有する医薬的活性成分の製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１種類以上の医薬的に許容される担体が、本発明の医薬組成物を配合する際に使用され得る。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ゲルなどを含んでいてよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０重量％の水、又は少なくとも６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、又は少なくとも９５重量％の水を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば、注射器又は注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射は、例えば、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、硝子体内に、又は静脈内に送達され得る。
別の一実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができるか、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／若しくは希釈剤を加える、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤及び／又はコーティング錠剤などの錠剤、並びにカプセル剤（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成用の粉末の形態であってもよい。
剤形は即時放出であってもよく、その場合、水溶性若しくは水分散性担体を含んでいてよく、又は剤形は遅延放出、持続放出、若しくは調節放出であってもよく、その場合、胃腸管若しくは皮下における剤形の溶解速度を制御する非水溶性ポリマーを含んでいてよい。
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内に、口内に、又は舌下に送達され得る。
水性製剤のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは約７．０～約９．５である。本発明の別の一実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約７．０である。
本発明の別の一実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。緩衝剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な緩衝剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の一実施形態では、医薬組成物は、防腐剤を含む。防腐剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２－フェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の一実施形態では、医薬組成物は等張剤を含む。等張剤の非限定的な例としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アルジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，３－プロパンジオール、及び１，３－ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、単糖類、二糖類、若しくは多糖類、又は水溶性グルカンであり得る。等張剤の別の例は、糖アルコールであり、用語「糖アルコール」は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有するＣ（４～８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。等張剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な等張剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の一実施形態では、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なキレート剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の一実施形態では、医薬組成物は、安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１種類以上の凝集阻害剤、１種類以上の酸化阻害剤、１種類以上の界面活性剤、及び／又は、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
本発明の別の一実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ－／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、及びＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質（例えばモノチオグリセロール）、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は全体に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な安定剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１種類以上の界面活性剤、好ましくは１種類の界面活性剤、少なくとも１種類の界面活性剤、又は２種類の異なる界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双性界面活性剤からなる群から選択され得る。界面活性剤は、個々に又は全体に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な界面活性剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は全体に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１種類を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されたようなモノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む方法に関する。
別の一般的な一態様では、本発明は、本明細書に開示されたようなＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬組成物を製造する方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞と、医薬的に許容される担体とを組み合わせて医薬組成物を得ることを含む方法に関する。
使用方法
別の一般的な一態様では、本発明は、癌を治療することを必要とする対象において癌を治療する方法であって、本明細書に開示されるような二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを有するＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
癌は、例えば、前立腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管細胞癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma、ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、及び他の液体腫瘍から選択され得るが、これらに限定されない。
本発明の実施形態によれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞若しくはＣＡＲ－ＮＫ細胞及び／又は二重特異性抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、治療有効量の、本明細書に開示されるような発現ＣＡＲ及び二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。本明細書で使用するとき、用語「治療有効量」は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を惹起する活性成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ通常の方法で決定することができる。
ＣＡＲ及び二重特異性抗体に言及して本明細書で使用するとき、治療有効量とは、それを必要とする対象において、免疫応答を調節する、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて形質導入された、Ｔ細胞又はＮＫ細胞で発現されるＣＡＲ分子の量を意味する。また、ＣＡＲに言及して本明細書で使用するとき、治療有効量とは、疾患、障害、又は病態の治療を結果としてもたらし、あるいは疾患、障害、又は病態の進行を防止又は遅延させ、あるいは疾患、障害、又は病態に関連する諸症状を低減又は完全に緩和する、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて形質導入されたＴ細胞又はＮＫ細胞で発現されるＣＡＲ分子の量を意味する。
特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害、又は病態は癌であり、好ましくは、前立腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管細胞癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、並びに他の液体腫瘍から選択される群から選択される癌である。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療の量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を軽減又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために最適に漸増される。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への想定される投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に適した形で製剤化することができる。
本発明の細胞は、当業者に既知の任意の便利な方法で投与することができる。例えば、本発明の細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、及び／又は移植によって対象に投与することができる。本発明の細胞を含む組成物は、経動脈に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、瘤内に、髄内に、筋肉内に、胸膜内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の細胞は、対象のリンパ球枯渇を伴って又は伴わずに投与され得る。
本明細書に開示されるようなＣＡＲを発現する細胞を含む医薬組成物は、滅菌液体調製物、典型的には細胞懸濁液を含む等張性水溶液、又は任意選択的に、選択されたｐＨにまで緩衝されるエマルジョン、分散液などとして提供され得る。組成物は、細胞の完全性維持及び生存のために好適で、しかも細胞組成物の投与にも好適な担体、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などを含むことができる。
滅菌注射溶液は、所望に応じて、様々な他の成分を有する好適な量の適切な溶媒に、本発明の細胞を組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、細胞組成物と共に使用するために好適な、かつヒトなどの対象への投与に好適な、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含み得る。細胞組成物を提供するのに好適な緩衝剤は、当該技術分野において周知である。使用される任意のビヒクル、希釈剤、又は添加剤は、本発明の細胞の完全性及び生存性を維持することに適合するものである。
本発明の細胞は、生理学的に許容される任意のビヒクルで投与することができる。本発明の細胞を含む細胞集団は、精製された細胞集団を含み得る。当業者は、様々な周知の方法を使用して、ある細胞集団における細胞を容易に決定することができる。本発明の遺伝子改変細胞を含む細胞集団における純度の範囲は、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約１００％であり得る。投与量は、当業者によって容易に調整することができ、例えば、純度の減少は投与量の増加を必要とする可能性がある。
本発明の細胞は、細胞が投与される対象の体重の１キログラム当たりの細胞数（細胞数／ｋｇ）に基づく用量として概ね投与される。大略的に、細胞用量は、投与の形態及び位置に応じて、体重の約１０４～約１０１０細胞数（個）／ｋｇの範囲内であり、例えば、約１０５～約１０９、約１０５～約１０８、約１０５～約１０７、又は約１０５～約１０６の範囲内である。一般に、全身投与の場合、本発明の免疫細胞が腫瘍及び／又は癌の領域で投与される局所投与よりも高い用量が使用される。例示的な用量範囲には、１×１０４～１×１０８、２×１０４～１×１０８、３×１０４～１×１０８、４×１０４～１×１０８、５×１０４～６×１０８、７×１０４～１×１０８、８×１０４～１×１０８、９×１０４～１×１０８、１×１０５～１×１０８、１×１０５～９×１０７、１×１０５～８×１０７、１×１０５～７×１０７、１×１０５～６×１０７、１×１０５～５×１０７、１×１０５～４×１０７、１×１０５～４×１０７、１×１０５～３×１０７、１×１０５～２×１０７、１×１０５～１×１０７、１×１０５～９×１０６、１×１０５～８×１０６、１×１０５～７×１０６、１×１０５～６×１０６、１×１０５～５×１０６、１×１０５～４×１０６、１×１０５～４×１０６、１×１０５～３×１０６、１×１０５～２×１０６、１×１０５～１×１０６、２×１０５～９×１０７、２×１０５～８×１０７、２×１０５～７×１０７、２×１０５～６×１０７、２×１０５～５×１０７、２×１０５～４×１０７、２×１０５～４×１０７、２×１０５～３×１０７、２×１０５～２×１０７、２×１０５～１×１０７、２×１０５～９×１０６、２×１０５～８×１０６、２×１０５～７×１０６、２×１０５～６×１０６、２×１０５～５×１０６、２×１０５～４×１０６、２×１０５～４×１０６、２×１０５～３×１０６、２×１０５～２×１０６、２×１０５～１×１０６、３×１０５～３×１０６細胞数（個）／ｋｇなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、用量は、単回用量が投与されているかどうか、又は複数回用量が投与されているかどうかを考慮するように調整することができる。有効用量と見なされるべきものの正確な決定は、対象ごとに個別の因子に基づくことができる。
本明細書で使用するとき、用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は全て、癌に関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善又は回復を指し、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」はまた、疾患、障害、又は病態を退縮させる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、腫瘍若しくはより好ましくは癌などの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
特定の実施形態によれば、癌の治療に使用される組成物が提供される。癌治療のために、提供される組成物を、別の治療法と併用することも可能であり、そのような別の治療法としては、化学療法、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ、抗ＬＡＧ－３ｍＡｂ、抗ＥＧＦＲｍＡｂ、抗ＨＥＲ－２ｍＡｂ、抗ＣＤ１９ｍＡｂ、抗ＣＤ３３ｍＡｂ、抗ＣＤ４７ｍＡｂ、抗ＣＤ７３ｍＡｂ、抗ＤＬＬ－３ｍＡｂ、抗アペリンｍＡｂ、抗ＴＩＰ－１ｍＡｂ、抗ＦＯＬＲ１ｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ、抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ、抗ＰＤ－１ｍＡｂ、他の免疫－腫瘍学薬、抗血管新生薬、放射線療法、抗体－薬物複合体（antibody-drug conjugate、ＡＤＣ）、標的療法、又は他の抗癌薬が挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態によれば、癌を治療することを必要とする対象において癌を治療する方法は、本明細書に開示されるような二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を対象に投与することを含む。
本明細書で使用するとき、対象への２種類以上の治療薬の投与との関連において用いられる用語「併用」とは、２種類以上の治療薬の使用を指す。用語「併用」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。例えば、第１治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
キット
別の一般的な一態様では、本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド、本明細書に開示されるようなＣＡＲ、本明細書に開示されるような遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体及び／若しくは二重特異性抗体又はそれらの抗原結合フラグメント、本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体及び／若しくは二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸、本明細書に開示されるような単離ポリヌクレオチド又は核酸を含むベクター、並びに本明細書に開示されるような医薬組成物のうちの任意のものを含むキット、単位投与量、及び製造物品が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、キットは、好ましくは、その使用のための取扱説明書を提供する。
特定の態様では、（１）本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドと、（２）本明細書に開示されるような単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと、を含むキットが、本明細書において提供される。
別の特定の一態様では、（１）本明細書に開示されるような単離ＣＡＲ－Ｔ及び／又は単離ＣＡＲ－ＮＫ細胞と、（２）本明細書に開示されるような単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと、を含むキットが、本明細書において提供される。
別の特定の一態様では、（１）本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドと、（２）本明細書に開示されるような二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸と、を含むキットが、本明細書において提供される。
別の特定の一態様では、（１）本明細書に開示されるような単離ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又は単離ＣＡＲ－ＮＫ細胞と、（２）本明細書に開示されるような二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸と、を含むキットが、本明細書において提供される。
別の特定の一態様では、医薬組成物を含むキットが本明細書において提供され、その医薬組成物は、医薬的に許容される担体と、（１）本明細書に開示されるようなＣＡＲをコードする核酸、又は本明細書に開示されるような単離ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／若しくは単離ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む、単離ポリヌクレオチドと、（２）単離二重特異性抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は二重特異性抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸と、を含む。
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態１は、ａ．配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する。
実施形態２は、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態３は、
ａ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１又は２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態４は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態５は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態６は、ｓｃＦｖが、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態７は、請求項１～６のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている単離核酸である。
実施形態８は、実施形態７に記載の単離核酸を含む単離ベクターである。
実施形態９は、実施形態８に記載のベクターを含む単離宿主細胞である。
実施形態１０は、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．第１のポリペプチド成分は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが少なくとも２である）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、又は（ｉｉ）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含み、かつ
ｂ．第２のポリペプチド成分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくはヒトＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１１は、
ａ．第１の抗原結合ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ
ｂ．第２の抗原結合ドメインが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１０に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１２は、第２の抗原結合ドメインが、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、好ましくはヒトＰＳＭＡ、又はＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質２（ＴＭＥＦＦ２）、好ましくはヒトＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する、実施形態１０又は１１に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１３は、第２の抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のポリペプチド配列をそれぞれ有するか、又は
ｂ．配列番号９２、９３、９４、９５、９６、及び９７のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域を含む、実施形態１２に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１４は、
ａ．第１の抗原結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含み、かつ
ｂ．第２の抗原結合ドメインが、配列番号２５又は配列番号９０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を含む第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を有する、実施例１１～１３のいずれか１つに記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１５は、
ａ．第１の抗原結合ドメインが、配列番号７のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含み、かつ
ｂ．第２の抗原結合ドメインが、配列番号２５又は配列番号９０のポリペプチド配列を有する第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を含む、実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１６は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、実施形態１０～１５のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１７は、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３５及び配列番号２８、配列番号３６及び配列番号２８、配列番号３７及び配列番号２７、配列番号３８及び配列番号２７、配列番号１０１及び配列番号２８、配列番号１０２及び配列番号２８、配列番号１０３及び配列番号９８、又は配列番号１０４及び配列番号９８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１０～１６のいずれか１つに記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１８は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１０に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態１９は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態１８に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態２０は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態１８又は１９に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態２１は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１０又は１８～２０のいずれか１つに記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態２２は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、実施形態２１に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントである。
実施形態２３は、実施形態１０～２２のいずれか１つに記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている単離核酸配列である。
実施形態２４は、実施形態２３に記載の単離核酸配列を含む単離ベクターである。
実施形態２５は、実施形態２４に記載の単離ベクターを含む単離宿主細胞である。
実施形態２６は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、ＣＡＲが、
ａ．（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー、又は（２）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
ｂ．膜貫通領域と、
ｃ．細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドである。
実施形態２７は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態２６に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態２８は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態２６又は２７に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態２９は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３０は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号３３又は配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３１は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３２は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、実施形態３１に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３３は、細胞外ドメインが、ＣＤ８細胞外ドメインである、実施形態２６～３２のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３４は、ＣＤ８細胞外ドメインが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、実施形態３３に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３５は、膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインである、実施形態２６～３４のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３６は、ＣＤ８膜貫通ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３７は、細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、実施形態２６～３６のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３８は、ＣＤ１３７共刺激ドメインが、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、かつＣＤ３ζ活性化ドメインが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、実施形態３７に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態３９は、ＣＡＲが、配列番号３９又は配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６～３８のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４０は、抗原結合ドメインが、ａ．配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
抗原結合ドメインが、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する、実施形態２６に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４１は、抗原結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態４０に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４２は、抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態４０又は４１に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４３は、抗原結合ドメインがキメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、実施形態４０～４２のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４４は、抗原結合ドメインが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態４０～４３のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４５は、ｓｃＦｖが、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の単離ポリヌクレオチドである。
実施形態４６は、実施形態２６～４５のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドによってコードされる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
実施形態４７は、実施形態２６～４５のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドを含む単離ベクターである。
実施形態４８は、実施形態４７に記載の単離ベクターを含む単離宿主細胞である。
実施形態４９は、宿主細胞が、Ｔ細胞、好ましくはヒトＴ細胞である、実施形態４８に記載の宿主細胞である。
実施形態５０は、宿主細胞が、ＮＫ細胞、好ましくはヒトＮＫ細胞である、実施形態４８に記載の宿主細胞である。
実施形態５１は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を生成する方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための条件下で、実施形態２６～４５のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドを含むＴ細胞を培養することと、ＣＡＲ－Ｔ細胞を回収することと、を含む方法である。
実施形態５２は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－ＮＫ細胞を生成する方法であって、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成するための条件下で、実施形態２６～４５のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチドを含むＮＫ細胞を培養することと、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を回収することと、を含む方法である。
実施形態５３は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する宿主細胞を作製する方法であって、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に、実施形態４７のベクターで形質導入することを含む方法である。
実施形態５４は、キットであって、
ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、ＣＡＲが、
ｉ．（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー、又は（２）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
ｉｉ．膜貫通領域と
ｉｉｉ．細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドと、
ｂ．実施形態１０～２２のいずれか１つに記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと、を含む、キットである。
実施形態５５は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態５４に記載のキットである。
実施形態５６は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態５４又は５５に記載のキットである。
実施形態５７は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態５４～５６のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態５８は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号３３又は配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５４～５７のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態５９は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５４～５８のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態６０は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、実施形態５９に記載のキットである。
実施形態６１は、ＣＡＲが、配列番号３９又は配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５４～６０のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態６２は、抗原結合ドメインが、ａ．配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
抗原結合ドメインが、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する、実施形態５４に記載のキットである。
実施形態６３は、抗原結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態６２に記載のキットである。
実施形態６４は、抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態６２又は６３に記載のキットである。
実施形態６５は、抗原結合ドメインがキメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、実施形態６２～６４のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態６６は、抗原結合ドメインが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態６２～６５のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態６７は、ｓｃＦｖが、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６６に記載のキットである。
実施形態６８は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌を治療することを必要とする対象において、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌を治療する方法であって、その方法が、実施形態４８に記載の単離宿主細胞と、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物と、を対象に投与することを含み、
二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含み、
ａ．第１のポリペプチド成分は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが少なくとも２である）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、又は（ｉｉ）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含み、かつ
ｂ．第２のポリペプチド成分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくはヒトＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、方法である。
実施形態６９は、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．第１の抗原結合ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ
ｂ．第２の抗原結合ドメインが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態６８に記載の方法である。
実施形態７０は、第２の抗原結合ドメインが、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、好ましくはヒトＰＳＭＡ、又はＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質２（ＴＭＥＦＦ２）、好ましくはヒトＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する、実施形態６８又は６９に記載の方法である。
実施形態７１は、第２の抗原結合ドメインが、
ａ．配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のポリペプチド配列をそれぞれ有するか、又は
ｂ．配列番号９２、９３、９４、９５、９６、及び９７のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域を含む、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７２は、
ａ．第１の抗原結合ドメインが、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含み、かつ
ｂ．第２の抗原結合ドメインが、配列番号２５又は配列番号９０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を含む、実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７３は、
ａ．第１の抗原結合ドメインが、配列番号７のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含み、かつ
ｂ．第２の抗原結合ドメインが、配列番号２５又は配列番号９０のポリペプチド配列を有する第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を含む、実施形態６８～７２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７４は、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、実施形態６８～７３に記載の方法である。
実施形態７５は、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３５及び配列番号２８、配列番号３６及び配列番号２８、配列番号３７及び配列番号２７、配列番号３８及び配列番号２７、配列番号１０１及び配列番号２８、配列番号１０２及び配列番号２８、配列番号１０３及び配列番号９８、又は配列番号１０４及び配列番号９８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６８～７４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７６は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態６８に記載の方法である。
実施形態７７は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態７６に記載の方法である。
実施形態７８は、非抗原結合ｓｃＦｖが、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、実施形態７６又は７７に記載の方法である。
実施形態７９は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６８又は７６～７８に記載の方法である。
実施形態８０は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、実施形態７９に記載の方法である。
実施例１：普遍的に認識されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ドメインの開発
材料及び方法
二重特異性クローニング
２つの異なる前立腺癌抗原を標的とする二重特異性モノクローナル抗体を生成した：（ａ）抗Ｇ４Ｓ×抗ＰＳＭＡ及び（ｂ）抗Ｇ４Ｓ×抗ＴＭＥＦＦ２。抗Ｇ４ＳのｓｃＦｖ、又は抗ＰＳＭＡのｓｃＦｖ、又は抗ＴＭＥＦＦ２のｓｃＦｖの配列を含む、ＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋを合成した。設計された重鎖分子を、５’端及び３’端に、１５ｂｐのオーバーラップを含有するｇｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ））をライゲーション非依存クローニング用に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ法（ＣｌｏｎＴｅｃｈ（Ｔａｋａｒａ）（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））を用いて合成した。全ての軽鎖構築物を、ヒトκ定常ドメインへのインフレームライゲーションのために、ＢｓｗｉＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有するｐＬｏｎｚａベクターに挿入した。ヒトＣＤ４シグナルペプチドをコードして、モノクローナル抗体の培養上清への効率的な分泌を可能にした。全てのｇｂｌｏｃｋを滅菌水中で再構築ｋｔし、５０℃で１０分間にわたって、製造業者のプロトコルに従ってインキュベートした。ｐＬｏｎｚａベクター（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して線状化し、続いてゲル抽出及びクリーンアップを行った。線状化ベクター：インサートの質量比を２：１として、続いて５０℃で１５分間にわたって熱パルスを与えた。注入反応を大腸菌（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）に形質転換し、得られたコロニーをミニプレップのためにスケーリングした。全ての構築物は、エンドトキシンを含まないｍａｘｉ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて配列検証し、スケールアップさせた。
ＣＡＲ－Ｔクローニング、レンチウイルス産生、及びＣＡＲ－Ｔ生成
Ｈ３－２３／Ｌ１－３９、すなわち、ＣＡＲ－Ｔ構築物用生殖細胞系列ｓｃＦｖ（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８：１０４５－６３（２０１６））は、レンチウイルスベクター内のＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限部位に対応する、５’及び３’のオーバーラップを含むように設計された。設計されたＤＮＡインサートは、ホモサピエンスのためにコドン最適化され、ＩＤＴ社で合成された。上記のＩｎＦｕｓｉｏｎ法を用いて、構築物のクローニングを行った。トランスフェクションの前に、全ての構築物を配列確認した。
Ｇ４Ｓリンカーに対するｓｃＦｖを生成した。ＣＤ８α－鎖シグナル配列、ｓｃＦｖ配列、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ、並びにＣＤ３ξドメインを含む、ヒトコドン最適化ＤＮＡを、レンチウイルスベクターにクローニングした。高力価複製欠損レンチウイルスベクターを生成するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＲＳＶ．ＲＥＶ、ｐＭＤＬｇ、及びＣＡＲ含有レンチウイルスベクターで、２９３Ｔヒト胚性腎臓細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後に、ウイルス上清を回収した。ウイルス粒子を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ濃縮器（Ｔａｋａｒａ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて濃縮した。濃縮ウイルス粒子をＰＢＳに再懸濁させ、－８０℃で凍結保存した。ネガティブ選択による白血球搬出法実施後に、ＨｅｍａＣａｒｅ社から購入した健康なボランティアドナーから一次ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離させた。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ｍＡｂでコーティングしたビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激した、完全培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）で培養した。活性化の２４時間後、Ｔ細胞に、約５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、レンチウイルスベクターによって形質導入した。ヒト組み換えインターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、１日おきに５０ＩＵ／ｍＬの最終濃度になるまで添加し、０．５～１×１０６個／ｍＬの細胞密度を維持した。ＣＡＲ表面発現を、副次的染色としてのＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体後の、主要染色としてのＧ４Ｓリンカーに対するモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって検証した。
発現
ＥｘｐｉＣＨＯ哺乳動物発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、タンパク質発現に使用した。成熟タンパク質に適切な軽鎖ローディングを確保するために、３：１の軽鎖ＤＮＡ：重鎖ＤＮＡの比を用いた。細胞を６×１０６個／ｍＬの密度にまで増殖させ、トランスフェクションの前に分割した。（表２に示すように）軽鎖及び重鎖の共トランスフェクションによって、二重特異性抗体及び単一特異性抗体を発現させ、生成させた。ＤＮＡ混合物をＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅと共にインキュベートし、直ちに培養物に添加した。３０００ｇで１０分間遠心分離することによって、ＥｘｐｉＣＨＯ懸濁培養物を回収し、細胞をペレット化した。上清を０．２２μｍの膜を使用して濾過し、残留細胞粒子を除去した。Ｒｏｃｈｅ社製ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤を上清に添加して、タンパク質分解を最小限に抑えた。上清は、精製するまでの間、４℃で保管された。
Figure 2022546364000002
組み換えタンパク質の精製
５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で平衡化した。上清を、最大捕捉のために１ｍＬ／分の流量で、カラムに適用した。紫外線Ａ２８０によって監視しながら、２０カラム分の体積のＰＢＳを使用して、クリーンなベースラインが得られるまでカラムを洗浄した。１０カラム分の体積の１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）を用いて、定組成溶離を実施した。溶離したタンパク質を分画し、Ａ２８０での吸光度を使用して濃度を決定した。非変性及び変性ＳＤＳ ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド）ゲル（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、画分を、組み換えタンパク質の有無について検査し、プールした。このようにして精製されたタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって純度が９５％超であると判定され、使用するまでの間、４℃で保管された。
ヒトＴ細胞の培養及びエレクトロポレーション
ヒト汎（Ｐａｎ）Ｔ細胞を、健康なドナーの末梢血単球細胞（peripheral blood monocyte cell、ＰＢＭＣ）から単離し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５５μＭのβ－メルカプトエタノール、及び１００Ｕペニシリン／１００Ｕストレプトマイシンを含むＴ細胞用完全培地／ＲＰＭＩ培地で培養した。
ＰａｎＴ細胞を生体外で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８のＤｙｎａｂｅａｄｓ磁気ビーズを用いて、約１２～１４日にわたり、製造元プロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に従って増殖させた。これらの細胞を、１×１０６個／バイアルで凍結させて、液体窒素中で保管した。
エレクトロポレーションの前に、Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を用いてＤｙｎａｂｅａｄｓによって、２４時間にわたって予備活性化した。５～１０×１０６個のＴ細胞を、２０μＬの一次細胞ヌクレオフェクション溶液（Ｐ３初代細胞４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット）に再び懸濁させた。Ｔ細胞を、１０μｇのＩＶＴ（インビトロ転写合成）ＲＮＡと混合し、ヌクレオフェクション用キュベットストリップに移植した。活性化されたヒトＴ細胞用のプログラムＥＯ１０５を用い、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、調製したＴ細胞培地を使用して、トランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートに移し、３～４日間にわたって培養を続けた。
Ｔ細胞活性化及びサイトカインプロファイリング
Ｔ細胞の活性化細胞及びサイトカインプロファイリングキットを使用して、ＴＣＡ（T cell activation assay、Ｔ細胞活性化アッセイ）のハイスループットアッセイを、Ｔ細胞のサブセットを特定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン分泌を測定する目的で実施した。簡潔に説明すると、腫瘍細胞株ＰＣ３ Ｍ１１を、９６ウェルプレート中（１×１０４細胞（個数）／ウェル）で培養した。次の日に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、５×１０４細胞個数の濃度で添加した（Ｅ：Ｔ＝５：１）。二重特異性分子を、最終濃度５μＭで共培養ウェルに添加した。細胞を３２時間にわたって共培養した。共培養の終了時に、細胞を１回洗浄し、ＣＤ６９及びＣＤ２５及びＨＬＡ－ＤＲに対する抗体で染色した。更に、分泌されたＩＦＮ－γ及びＴＮＦα及びＩＬ－２及びＩＬ－６及びＩＬ－１７及びＩＬ－１３及びＩＬ－１０及びＧＭ－ＣＳＦを含む分泌されたサイトカインのレベルを定量化した。データは、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｐｌｕｓで取得し、Ｔ細胞活性化キットデータテンプレートを使用して、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアで分析した。
ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｂ９６プレート（Ｎｕｎｃ；Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、０．１μｇ／ｍＬの濃度の抗原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間にわたって、ＰＢＳ＋５％の粉乳でブロッキングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。ＣＥＮ－６３－１３ｍＡｂ及び対照ｍＡｂの連続希釈液（１：３）を、１００ｎＭの出発濃度で、ＰＢＳ中で調製し、プレートのウェルに添加して、室温でのインキュベーションを９０分間にわたって実施した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。洗浄ステップに続いて、１：１００００のヤギ抗ヒトＦｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ検出抗体１００μＬを添加し、室温で１時間にわたってインキュベートした。プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質（１－ｓｔｅｐ ＴＭＢ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、１：１００の希釈で添加した。４５０ｎｍでの光学密度を、（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で測定した。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）において分析した。
Ｇ４Ｓペプチド含有ｓｃＦｖのフローサイトメトリー蛍光検出
ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞を、標準ＤＭＥＭ（グルコース、Ｌ－グルタミン、ＮａＨＣＯ３、及びフェノールレッドを含むダルベッコ改変イーグル培地成分）で培養した。リンカー含有ｓｃＦｖタンパク質構築物について、ｍＲＮＡを用いた細胞のトランスフェクションを、製造業者のプロトコル（ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実施した。ＩＶＴ合成ｍＲＮＡを５μｇ、１×１０６細胞（個）／ｍＬの密度で、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞内にトランスフェクトし、フローサイトメトリー分析の２４時間前にインキュベートした。細胞を、１００，０００個／ウェルの濃度で９６ウェルＵ底プレートに添加した。プレートを３００ｇで３分間にわたって回転させ、上清を廃棄した。Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料を細胞に添加し、暗いチャンバ内で、１０分間にわたって室温でインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、上清を廃棄した。一次抗体の開始濃度１００ｎＭで、１２ポイントの１：３の連続希釈液を調製した。一連の希釈液を細胞に添加し、４℃で１時間にわたって暗所でインキュベートした。プレートを３００ｇで３分間にわたって回転させ、上清を廃棄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ），Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を流しながら２回洗浄した。二次抗体（抗ヒトＦｃ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、製造元のプロトコルに従って、ＦＡＣＳ緩衝液内で希釈した。二次抗体を５０μＬ細胞に添加し、４℃で３０分間にわたって暗所でインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、上清を廃棄し、次いで５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で元に戻した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、抗Ｇ４Ｓ抗体の細胞表面結合を検出した。データ処理は、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、用量応答結合曲線を生成した。
バイオレイヤー干渉法による結合エピトープの決定
ＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を使用して、ビオチン化Ｇ４Ｓペプチドとウサギ抗（Ｇ４Ｓ）４リンカー抗体との間の結合反応速度を測定した。ビオチン化Ｇ４Ｓペプチド（ＷＴ、対照又は切断ペプチド）をストレプトアビジンセンサ上に固定化し、ウサギ抗（Ｇ４Ｓ）４リンカー抗体を、センサ固定化Ｇ４Ｓペプチドへの結合について、メーカーの取扱説明書に従って試験した。会合及び解離速度は、波長（ｎｍ）のシフトによって測定され、ＫＤ（平衡解離定数）は、データを１：１結合モデルに当てはめることによって得られた。全ての反応は、２５℃の温度下で、１倍の反応速度測定用緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）内で実施された。データをＯｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎプログラム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で収集し、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓプログラム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して分析した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１０７ａアッセイ及び増殖アッセイ
ＣＤ１０７ａアッセイに関して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞と共に９６ウェルのプレート内で共培養した。なお、エフェクタ対標的比（Ｅ：Ｔ）は５：１で、抗ＰＳＭＡ×抗Ｇ４Ｓ ＢｓＡｂ（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で共培養を行った。フィコエリスリンで標識した抗ＣＤ１０７ａ抗体を、Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を添加する１時間前に添加し、プレートを３時間にわたってインキュベートした。抗ＣＤ８抗体を添加し、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１回洗浄し、フローサイトメトリーに供した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって解析した。Ｔ細胞増殖アッセイの場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、５ｍＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造元のプロトコルに従って事前に標識した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞と共に、１対１のエフェクタ：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）で、９６ウェル丸底プレートにおいて、２００μＬのＲＰＭＩ完全培地内で共培養した。抗ＰＳＭＡ×抗Ｇ４ＳのＢｓＡｂ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。３日間のインキュベーション後、Ｔ細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂで染色し、ＣＦＳＥの分布について分析した。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅによる細胞毒性アッセイ
細胞毒性を、リアルタイム細胞分析装置ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（Ｒｏｃｈｅ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｚｔｅｒｌａｎｄ）で、標的細胞として接着腫瘍細胞株を使用して測定した。全ての実験は、それぞれの標的細胞培養培地を使用して行った。５０μＬの培地を、バックグラウンド値の測定のために、Ｅ－Ｐｌａｔｅｓ ９６（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｒｅｎｚａｃｈ－Ｗｙｈｌｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加した。実験で使用される標的細胞には、ＰＣ３Ｍ１１及びＣ４－２Ｂ及びＬｎＣａｐ腫瘍細胞株を含む。標的細胞を、ウェルあたり約１０，０００個の密度で、追加の１００μＬ培地に播種した。好適な細胞密度は、これ以前に実施した滴定実験によって決定された。細胞付着は、プラトー相に達するまでＲＴＣＡ ＳＰ機器（Ｒｏｃｈｅ）及びＲＴＣＡソフトウェアバージョン１．１（Ｒｏｃｈｅ）を使用してモニタリングされた。
ＣＡＲ－Ｔ細胞を、２０：１～１：１の範囲に及ぶ異なるエフェクタ：標的比（Ｅ：Ｔ）で添加した。又は異なる投与量のＢｓＡｂを０．２～２０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で添加した。エフェクタ細胞を添加してから、インピーダンス測定を１５分ごとに、最大８１時間にわたって実施した。全ての実験を、３組で実施した。電気インピーダンスの変化は無次元細胞指標（cell index、ＣＩ）値として表されたが、これは、電極センサの細胞被覆に対応する相対インピーダンス変化から導出され、培地のみを用いたベースラインインピーダンス値に対して正規化された値である。取得されたデータを分析するために、ＣＩ値をエクスポートし、溶解のパーセンテージを、いかなるエフェクタＴ細胞も欠く対照細胞に対して計算した。細胞溶解のパーセンテージは、単純な式を使用して容易に計算される：細胞溶解の割合（％）＝（（細胞指標エフェクタなし－細胞指標エフェクタあり）／細胞指標エフェクタなし）×１００。
ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞毒性もまた、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ生細胞イメージングシステムを使用することによって試験された。共培養を、上記のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイと同じにセットアップした。画像を３０分ごとに撮影し、死細胞の数を数量化した。
サイトカインアッセイ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ）
ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔのヒトＴ細胞の活性化及びサイトカインプロファイリングキットを、Ｔ細胞の活性化及びサイトカインプロファイルを得るために適用した。簡潔に説明すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞と共に、１対１のエフェクタ：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）で、９６ウェル丸底プレートにおいて、２００μＬのＲＰＭＩ完全培地内で共培養した。抗ＰＳＭＡ×抗Ｇ４ＳのＢｓＡｂ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。ＢｓＡｂを含まずに共培養したものを対照として使用した。２４時間後、Ｔ細胞活性化を、３０μＬの細胞／上清混合物サンプルから、ＴＣＡキットによってプロトコルに従って評価した。サンプルは、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳで取得した。検量線は、分泌されたサイトカインのレベルを定量化するものである。データをＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアで分析した。
結果
モジュラ式Ｔ細胞療法を開発するために、抗体によって普遍的に認識されるペプチドを含有するＣＡＲストークを設計した。（Ｇ４Ｓ）４（配列番号４５）リンカーペプチドを選択したが、それはそのリンカーペプチドが比較的良好な生物物理学的特性を有するためであった。Ｇ４Ｓに対するモノクローナル抗体を得るために、ウサギをＧ４Ｓペプチドで免疫化した。免疫応答の生成に続いて、これらのウサギから脾臓を採取した。可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＶ遺伝子回復を実施した。ヒトκ軽鎖によるヒトＩｇＧ１骨格上でのｖ領域の発現に続いて、１ステップの親和性クロマトグラフィを実施した。ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーアッセイにより、１つのモノクローナル抗体、ＣＥＮ－６３－１３が、０．５７ｎＭ（図２及び図３）の解離定数で、Ｇ４Ｓリンカーに免疫特異的に結合したことが確認された。
ＣＥＮ－６３－１３可変領域を、可変重鎖／リンカー／可変軽鎖（ＨＬ）（配列番号２９）と可変軽鎖／リンカー／可変重鎖（ＬＨ）（配列番号３０）との両方の配向で、単鎖フラグメント可変領域（ｓｃＦｖ）に再フォーマットした。以前に発見された、ＰＳＭＡに対する可変領域の配列（クローンＩＤ：ＰＳ３Ｂ３５）（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９（１３）：３１９２～８（１９９９））を用いて、４つの異なるモリソンスキャフォールド二重特異性抗体構築物を設計した（図５）（表２）。再フォーマットされたｓｃＦｖの発現及び安定性を試験するために、ＨＬｓｃＦｖ及びＬＨｓｃＦｖの両方をＨｕＩｇＧ１のＣ末端に融合させた（それぞれ配列番号３１及び３２）抗ＰＳＭＡＦａｂドメインを有するモリソン構築物が設計された。９アミノ酸リンカーである（ＧＡＧ）３（配列番号５６）が、ｓｃＦｖとＦｃ領域との間のテザーとして使用された。次に、ＨＬ配向及びＬＨ配向の両方で、ヒトＩｇＧ１のＣ末端に融合した抗ＰＳＭＡｓｃＦｖを有するＣＥＮ－６３－１３可変領域Ｆａｂを設計した。これらの構築物の各々を、懸濁液ＣＨＯ発現系で発現させ、１ステップの親和性クロマトグラフィによって精製した。ＣＥＮ－６３－１３及びＰＳ３Ｂ３５抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を表４に提供する。上述されたような同様の戦略を利用して、同様の二重特異性コンジット抗体が誘導された。その腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、別の前立腺癌のＴＡＡ、すなわちＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質（ＴＭＥＦＦ２）であった。
ＣＥＮ－６３－１３可変領域に対する最適な結合エピトープを、Ｇ４Ｓペプチドの構築物を利用して決定した。切断されたペプチドのパネルを、バイオレイヤー干渉法によってアッセイした。ＷＴ Ｇ４Ｓリンカー（配列番号４５）から、最大８つのアミノ酸（配列番号４６～５３）が欠落しているペプチドが、結合親和性が２倍だけ減少したのが示された。ＷＴと比較して結合親和性が６倍減少した１０－ｍｅｒペプチド（配列番号５５）は、ＣＥＮ－６３－１３によって検出される可能性がある最小リンカーを表す（図４）。表３は、バイオレイヤー干渉法を使用して決定された、ＣＥＮ－６３－１３の、タンパク質及びペプチド抗原への結合に対するＫＤ値を示す。
Figure 2022546364000003
コンジット二重特異性抗体を使用してＴ細胞を腫瘍細胞に導くために、Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号４５）を遺伝子操作して、第２世代のＣＡＲストーク（配列番号３９及び配列番号４０）内に「不活性」ｓｃＦｖ（配列番号３３及び３４）を実現した。
レンチウイルスでトランスフェクトされたＰａｎ－Ｔ細胞、及びｍＲＮＡをコードするＣＡＲでトランスフェクトされたＰａｎ－Ｔ細胞の両方が生成された。細胞外（Ｇ４Ｓ）４ＳｃＦｖリンカーは、ヒトＣＥＮ－６３－１３抗体及びＰＥ標識抗ヒト二次抗体を利用するフローサイトメトリー分析によって検出することができた（図６Ｃ参照）。（Ｇ４Ｓ）４を含有するアイソタイプＣＡＲを結合することに加えて、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現するレンチウイルスを介して、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及びＮ末端ＭＹＣタグで形質導入されたＰａｎ－Ｔ細胞への結合も実証された。ＭＹＣ陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞で、ＣＥＮ－６３－１３は共染色された（図６Ｄ）。
Ｔ細胞はまた、ＣＡＲストークをコードするＤＮＡでもトランスフェクトされた。Ｔ細胞のみの場合と比較すると、ＣＤ６９の発現では３倍の増加が観察され、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を示した（図７Ａ～図７Ｄ）。
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の存在が、ＣＡＲ－Ｔ細胞を発現しているアイソタイプＳｃＦｖにおけるＣＡＲ表面発現に影響を与えたかどうかを、その後調査した。培養したＣＡＲ－Ｔ細胞を分割し、ＢｓＡｂ（５μｇ／ｍＬ）を培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞に添加し、他方で対照ウェルには抗体を添加しなかった。次いで、細胞を広範囲にわたって洗浄し、ＣＡＲ表面発現を、２４時間後に観察した。図９Ａに示すように、ＢｓＡｂとインキュベーションしたものは、ＣＡＲの表面発現レベルを変化させなかった。
ＢｓＡｂだけとのインキュベーションでは、ＣＡＲ増殖又は表面発現を変化させなかったため、二重特異性分子に加えて腫瘍細胞の添加が増殖を誘発し得るかどうかを調べた。ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を用いて、ＢｓＡｂの存在下又は非存在下でのＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を比較した。二重特異性抗体を共培養に添加したときに、（２つのドナーで観察された）Ｔ細胞の増殖が実証された（図９Ｂ）。特に、ＢｓＡｂの非存在下でもなにがしかの増殖が観察されたが、しかしこれは腫瘍細胞との同種異系反応に起因する可能性が高い。
ＣＤ１０７ａは、ＣＤ８＋活性化、脱顆粒化、及び細胞溶解機能に対する有効なバイオマーカーである。アイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、標的化二重特異性抗体Ｇ４ＳリンカーとＰＳＭＡとの存在が、ＰＳＭＡ＋腫瘍細胞の存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化することができるかどうかを決定しようと試みた。アイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＢｓＡｂ（５μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞と共培養した。５時間の共培養後、ＣＤ１０７ａの発現の増加が、ＢｓＡｂの存在下の場合の細胞集団全体で観察され、ＢｓＡｂ添加に応答して脱顆粒化が発生したことを示唆した（図９Ｃ）。ＣＥＮ－６３－１３抗体を使用して、Ｇ４Ｓ含有ＣＡＲ－Ｔ細胞を検出した（洗浄後）。ＣＤ８＋細胞（ＣＡＲ＋ＣＤ８＋及びＣＡＲ－ＣＤ８＋）の両方の集団について、ＣＤ１０７ａの発現を比較した。図９Ｃに示されるように、ＢｓＡｂの存在下では、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ１０７ａの発現について濃縮されていた（合計２１．２％もの高いレベルである）。他方でＢｓＡｂの非存在下では、ＣＡＲ＋集団（ＢｓＡｂを含まない）の両方において、ＣＤ１０７ａのレベルがはるかに低いことが観察された。更に、ＣＤ１０７ａの発現は、ＢｓＡｂの存在下及び非存在下で、ＣＤ８＋ＣＡＲ－細胞集団においては、検出不能であった。これらの結果は、ＣＤ１０７ａの発現の増加には、ＢｓＡｂの存在下において、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋細胞による寄与が主であったことが示された。
次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むアイソタイプＳｃＦｖが、腫瘍細胞を溶解する能力を持つかどうかを、ＢｓＡｂの存在下で調べた。まず、ＰＳＭＡ及びＧ４Ｓを標的とする二重特異性抗体を、コンジット又はアダプタ分子として利用した。抗ＰＳＭＡのＢｓＡｂ１は、重鎖Ｃ末端に付加された抗ＰＳＭＡのＳｃＦｖを有するＣＥＮ－６３－１３のｆａｂアームを含有する。抗ＰＳＭＡのＢｓＡｂ２は、抗ＰＳＭＡのＦａｂアーム及びＣ末端ＣＥＮ－６３－１３ＳｃＦｖで逆の配向を使用する。これらの抗ＰＳＭＡ×抗Ｇ４ＳのＢｓＡｂを、アイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞及びＰＳＭＡ＋のＰＣ３細胞の存在（Ｅ：Ｔ比＝５：１）下で滴定し、腫瘍細胞溶解を、ｘＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅモニタリングを使用して、９７時間の時間経過中観察した（図１０Ａ）。ＢｓＡｂを欠くウェルにおいては、腫瘍成長はその勢いが衰えないままであった。アイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞は、いずれかのＢｓＡｂの存在下でも腫瘍特異的溶解を媒介した。
別個の実験では、ＣＡＲ－Ｔ：ＰＣ３細胞のＥ：Ｔ比を変化させて、ＢｓＡｂ濃度は変化させなかった（５μｇ／ｍＬ）。これらの結果は、従来のＣＡＲ－Ｔアッセイと同様に、アイソタイプＣＡＲ－ＴのＢｓＡｂ特異的殺傷が、Ｅ：Ｔ比の変化と共に変化することを示す（図１０Ｂ）。ＣＥＮ－６３－１３ ＳｃＦｖが重鎖Ｃ末端に付加された抗ＴＭＥＦＦ２のＦａｂアームを含有する抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体を使用しても、同様の結果が観察された。この場合、アイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢｓＡｂの存在下で、ＬＮＣａＰ前立腺由来腫瘍細胞を殺傷することが示された（図１０Ｃ）。
二重特異性抗体の存在下でコンジットＣＡＲ－Ｔ細胞の潜在的細胞毒性を実証したが、ＣＡＲ－Ｔ活性化時に一般的に観察されたサイトカインが、ＢｓＡｂの存在下でも生成されているかどうかを定量化することが次に求められた。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮγ、ＩＬ－６、及びＧＭ－ＣＳＦレベルを、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅによる測定によって定量化した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を腫瘍細胞と、Ｅ：Ｔ比＝５：１で共培養し、二重特異性分子を、５μＭの最終濃度で添加した。二重特異性分子の添加は、標的細胞の存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン産生を有意に増加させた（図１０Ｄ）。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルは、ＢｓＡｂ１の存在下ではおよそ２倍に、ＢｓＡｂ２の存在下では３倍になったことが観察された。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のレベルも（ＣＡＲ－Ｔ及びＰＣ３だけの場合と比較して）同様に増加した。インターロイキン－６（ＩＬ－６）のレベルは、ＢｓＡｂ２の存在下では有意に増加したが、ＢｓＡｂ１の存在下では有意には増加しなかった。
サイトカイン発現のこれらの対照を上回る増加は、コンジット二重特異性が、Ｔ細胞を腫瘍細胞に特異的に導くことができ、その結果、Ｔ細胞活性化をもたらすということを示唆している。不活性ｓｃＦｖ、Ｈ３－２３／Ｌ１－３９のＣＤＲを表４に示す。
Figure 2022546364000004
コンジット二重特異性アプローチの腫瘍特異的細胞傷害性は、インピーダンスベースの細胞生存率アッセイを使用して実証された。腫瘍細胞を導電性プレートに接着させ、インピーダンスを経時的に測定した。Ｔ細胞が添加されなかった場合、腫瘍細胞の質量は指数関数的に増加した。Ｔ細胞とコンジット二重特異性抗体との両方が存在する下では、様々なエフェクタＴ細胞対標的比で、強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性が観察された。
これらの結果をまとめると、コンジット二重特異性アプローチが、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、腫瘍特異的抗原を発現している腫瘍細胞に導くことができるということを示唆している。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、標準的な細胞表面活性化マーカー及びサイトカインの発現の増加を示す。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

Claims (50)

  1. ａ．配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する、
    前記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. ａ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦＶ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 前記ｓｃＦｖは、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている単離核酸。
  8. 請求項７に記載の単離核酸を含む単離ベクター。
  9. 請求項８に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
  10. 第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    ａ．前記第１のポリペプチド成分は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが少なくとも２である）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、又は（ｉｉ）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含み、かつ
    ｂ．前記第２のポリペプチド成分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくはヒトＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、
    前記単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  11. ａ．前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ
    ｂ．前記第２の抗原結合ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
    請求項１０に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 前記第２の抗原結合ドメインは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、好ましくはヒトＰＳＭＡ、又はＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質２（ＴＭＥＦＦ２）、好ましくはヒトＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する、請求項１０又は１１に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. 前記第２の抗原結合ドメインは、
    ａ．配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のポリペプチド配列をそれぞれ有するか、又は
    ｂ．配列番号９２、９３、９４、９５、９６、及び９７、のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域を含む、
    請求項１０～１２のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  14. ａ．前記第１の抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域を含み、かつ
    ｂ．前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号２５又は配列番号９０と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域を含む、
    請求項１０～１３のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  15. ａ．前記第１の重鎖可変領域は、配列番号７のポリペプチド配列を含み、かつ前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号８のポリペプチド配列を含み、
    ｂ．前記第２の重鎖可変領域は、配列番号２５又は配列番号９０のポリペプチド配列を含み、かつ第２の軽鎖可変領域は、配列番号２６又は配列番号９１のポリペプチド配列を含む、
    請求項１０～１４のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  16. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  17. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３５及び配列番号２８、配列番号３６及び配列番号２８、配列番号３７及び配列番号２７、配列番号３８及び配列番号２７、配列番号１０１及び配列番号２８、配列番号１０２及び配列番号２８、配列番号１０３及び配列番号９８、又は配列番号１０４及び配列番号９８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  18. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１０に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  19. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１８に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  20. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１８又は１９に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  21. 前記（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項１０又は１８～２０のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント。
  22. 請求項１０～２１のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしている単離核酸配列。
  23. 請求項２２に記載の単離核酸配列を含む単離ベクター。
  24. 請求項２３に記載の単離ベクターを含む単離宿主細胞。
  25. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、
    前記ＣＡＲは、
    ａ．（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー、又は（２）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    ｂ．膜貫通領域と、
    ｃ．細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、
    前記単離ポリヌクレオチド。
  26. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチド。
  27. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項２５又は２６に記載の単離ポリヌクレオチド。
  28. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  29. 前記（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  30. 前記ＣＡＲは、配列番号３９又は配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  31. 前記抗原結合ドメインは、
    ａ．配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
    前記抗原結合ドメインは、（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎは少なくとも２である）に特異的に結合する、
    請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチド。
  32. 前記抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  33. 前記抗原結合ドメインは、
    ａ．配列番号７のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、
    請求項３１又は３２に記載の単離ポリヌクレオチド。
  34. 前記抗原結合ドメインは、キメラ及び／若しくはヒトであるか、又はヒト化されたものである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  35. 前記抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
  36. 前記ｓｃＦｖは、配列番号２９又は配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の単離ポリヌクレオチド。
  37. 請求項２５～３６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドによってコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  38. 請求項２５～３６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む単離ベクター。
  39. 請求項３８に記載の単離ベクターを含む単離宿主細胞。
  40. 前記宿主細胞は、Ｔ細胞、好ましくはヒトＴ細胞である、請求項３９に記載の宿主細胞。
  41. キットであって、
    ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであり、前記ＣＡＲが、
    ｉ．（１）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー、又は（２）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカーに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    ｉｉ．膜貫通領域と、
    ｉｉｉ．細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、単離ポリヌクレオチド、及び、
    ｂ．請求項１０～２１のいずれか一項に記載の単離二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント
    を含む、前記キット。
  42. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項４１に記載のキット。
  43. 前記非抗原結合ｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項４２に記載のキット。
  44. 前記（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のキット。
  45. 前記ＣＡＲは、配列番号３９又は配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のキット。
  46. 腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌を治療することを必要とする対象において、前記腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する前記癌を治療する方法であって、
    前記方法は、請求項３９に記載の単離宿主細胞と、二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物とを前記対象に投与することを含み、
    前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１のポリペプチド成分及び第２のポリペプチド成分を含み、
    ａ．前記第１のポリペプチド成分は、（ｉ）（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが少なくとも２である）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、又は（ｉｉ）非抗原結合単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）及び（Ｇ４Ｓ）ｎポリペプチドリンカー（式中、ｎが、少なくとも２である）を含み、かつ
    ｂ．前記第２のポリペプチド成分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくはヒトＴＡＡに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、
    前記方法。
  47. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、
    ａ．前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、及び６のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、かつ
    ｂ．前記第２の抗原結合ドメインが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
    請求項４６に記載の方法。
  48. 前記第２の抗原結合ドメインは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、好ましくはヒトＰＳＭＡ、又はＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質２（ＴＭＥＦＦ２）、好ましくはヒトＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する、請求項４６又は４７に記載の方法。
  49. 前記第２の抗原結合ドメインは、
    ａ．配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４のポリペプチド配列をそれぞれ有するか、又は
    ｂ．配列番号９２、９３、９４、９５、９６、及び９７のポリペプチド配列をそれぞれ有する
    重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域を含む、
    請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、
    ａ．配列番号７のポリペプチド配列を有する第１の重鎖可変領域、及び配列番号８のポリペプチド配列を有する第１の軽鎖可変領域、並びに
    ｂ．配列番号２５又は配列番号９０のポリペプチド配列を有する第２の重鎖可変領域、及び配列番号２６又は配列番号９１のポリペプチド配列を有する第２の軽鎖可変領域
    を含む、
    請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
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