CN115487542A - 一种尿液中修饰核苷的固相萃取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿液中修饰核苷固相萃取方法及其应用。该方法采用石墨烯材料作为固相萃取柱填料，对人体尿液样本中的多种修饰核苷进行萃取和富集，然后使用液相色谱串联质谱进行分析检测。本发明的优点是可以实现尿液等生物样本中N6‑甲基腺苷(m6A)、N1‑甲基鸟苷(m1G)、5‑甲基尿苷(m5U)、5‑甲基胞苷(m5C)等多种修饰核苷的同时萃取和富集。本发明方法可在分析化学、代谢组学、临床医学以及预防医学领域中应用，具有很好的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于分析化学、医学和纳米材料技术领域。涉及一种尿液中修饰核苷的固相萃取方法及其应用，通过使用石墨烯材料作为固相萃取填料，能实现尿液中多种修饰核苷的萃取和富集。
背景技术
修饰核苷在人体中发挥着重要的生物学功能，它们的紊乱与人类多种疾病有关，包括癌症。最常见的核苷修饰类型是甲基化修饰，此外还有乙酰化修饰等。N6-甲基腺苷(m6A) 是最重要的甲基化修饰核苷，其水平是动态可逆的，并且调控着mRNA的剪切、翻译、转录和表达。N1-甲基腺苷(m1A)、2'-O-甲基腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)、2'-O- 甲基鸟苷(Gm)、N1-甲基鸟苷(m1G)、N2-甲基鸟苷(m2G)、N7-甲基鸟苷(m7G)、N2,N2- 二甲基鸟苷(m2,2G)、2'-O-甲基尿苷(Um)、3-甲基尿苷(m3U)、5-甲基尿苷(m5U)、 5,2'-O-二甲基尿苷(m5Um)、2'-O-甲基胞苷(Cm)、3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基胞苷(m5C)、 N4-乙酰基胞苷(N4-AcC)等都是重要的RNA修饰，这些修饰核苷在细胞分化、胚胎发育以及各种癌症的发病机制中发挥着重要的作用。因此对这些修饰核苷进行定性定量分析在分析化学、临床医学、生命科学、代谢组学等研究领域有着非常重要的作用。
液相色谱串联质谱技术可以对尿液样本中的修饰核苷进行定性定量分析，是鉴定其作为疾病早期诊断标志物的一种强有力工具。但是，尿液样本成分复杂、并且一些修饰核苷的含量较低，因此必须降低复杂基质的干扰、对痕量分析物进行富集浓缩，从而提高检测灵敏度。固相萃取是一种简单快速、高效、低成本的富集技术。目前已报道的对尿液样本中修饰核苷进行固相萃取所使用的的填料主要包括：十八烷基反相吸附剂(C18)、亲水-亲脂平衡反相吸附剂(HLB)、混合型阳离子交换吸附剂(MCX)等。但这些填料都存在一定的局限性，无法实现对不同种类的修饰核苷的同时萃取与富集，如：C18和HLB作为固相萃取填料对胞嘧啶修饰核苷的吸附较弱；而MCX作为固相萃取填料对尿嘧啶修饰核苷的吸附较弱。
发明内容
针对现有技术存在的弊端，本发明的目的是提供一种尿液中修饰核苷固相萃取方法，通过使用石墨烯作为固相萃取填料，对尿液样本进行前处理，可以同时萃取、富集尿液中多种修饰核苷，获得最佳的目标物提取效率，再结合液相色谱串联质谱技术进行修饰核苷的定性定量分析。
为实现上述发明目的，本发明方法通过以下步骤实现：
(1)将-80℃放置的尿液样本于室温下解冻，以4℃、13000rpm转速离心15分钟。取上清液5μL于1.5mL离心管中，并加水稀释至300μL；
(2)称取0.1-1mg填料于固相萃取小柱中，依次加入甲醇、水对柱体进行活化、平衡处理；
(3)随后将尿样加入固相萃取柱，并用水清洗，随后用洗脱溶剂进行洗脱并收集洗脱液，将洗脱液进行真空离心抽干；
(4)用水复溶后，进行液相色谱串联质谱分析；
(5)运用液相色谱串联质谱技术，将不同浓度的混合标准溶液进行分析检测，利用标准品与其对应同位素内标的峰面积比值，得到线性回归方程。对尿液样本进行测定，代入线性方程，从而计算得到样本中分析物的含量。
所述步骤(1)中取离心后尿液上清液的体积为5μL，加入同位素内标溶液的体积为5 μL，加入水稀释后的总体积为300μL。
所述步骤(2)的填料为石墨烯材料，用量为0.75mg。
所述步骤(2)中固相萃取柱体积为1mL，内径5.5mm，用于封住萃取柱两端的固相萃取柱的筛板孔径为5.7mm。
所述步骤(2)中活化、平衡处理采用的溶剂分别是甲醇和水，体积各1mL。
所述步骤(3)中洗脱溶剂为含0.1％乙酸的甲醇溶液，洗脱体积为1.5mL。
所述步骤(4)中使用的液相色谱串联质谱分析选择Waters BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,1.7μm)，0.1％(体积百分比)乙酸甲醇溶液作为有机相A，0.1％乙酸水作为水相B。采用以下梯度进行洗脱：0-3min 95％B；3-5min 95-85％B；5-6.5min 85-75％B；6.5-8.5min 75％B；8.5-9min 75-65％B；9-9.5min 65-5％B；9.5-10.5min 5％B；10.5-11min5％-95％B； 11-16min 95％B；流速为0.25mL/min；进样量为5μL，进样模式为自动进样；柱温25℃。
所述步骤(5)中混合标准溶液含有N6-甲基腺苷(m6A)、N1-甲基腺苷(m1A)、2'-O-甲基腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)、2'-O-甲基鸟苷(Gm)、N1-甲基鸟苷(m1G)、 N2-甲基鸟苷(m2G)、N7-甲基鸟苷(m7G)、N2,N2-二甲基鸟苷(m2,2G)、2'-O-甲基尿苷(Um)、 3-甲基尿苷(m3U)、5-甲基尿苷(m5U)、5,2'-O-二甲基尿苷(m5Um)、2'-O-甲基胞苷(Cm)、 3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基胞苷(m5C)、N4-乙酰基胞苷(N4-AcC)。浓度范围分别为： m6A(1-100nM)、m1A(500-5000nM)、Am(0.5-50nM)、m6Am(1-50nM)、Gm(10-400nM)、m1G (100-2000nM)、m2G(50-1000nM)、m7G(1-100nM)、m2,2G(100-4000nM、Um(10-400nM)、 m3U(10-250nM)、m5U(1-50nM)、m5Um(1-100nM)、Cm(25-1000nM)、m3C(10-500nM)、 m5C(0.5-10nM)和N4-AcC(50-4000nM)。加入的同位素内标浓度为：[D3]m6A(10nM)、[D3]m1A(125nM)、[13C5]Am(5nM)、[D3]m6Am(5nM)、[13C15N2]Gm(22.5nM)、[13C15N2]m1G(390 nM)、[13C15N2]m7G(50nM)、[D6]m2,2G(125nM)、[D3]Um(25nM)、[13C15N2]m3U(50nM)、 [13C5]m5U(10nM)、[13C5]m5Um(100nM)、[D3]Cm(50nM)和[13CD3]m5C(5nM)。
为了达到最佳的实验条件，我们优化了石墨烯的质量(0.1-1mg)，洗脱溶剂(乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇)，加酸种类及比例(0.1％乙酸甲醇、0.5％乙酸甲醇、1％乙酸甲醇、0.1％甲酸甲醇、0.5％甲酸甲醇、1％乙酸甲醇)，洗脱体积(0.5-2mL)。结果表明：0.75mg的石墨烯为最优的填料使用量；0.1％乙酸甲醇为最优的洗脱溶剂，具有最高的洗脱能力；1.5mL为最佳的洗脱体积。因此，选择1.5mL含0.1％乙酸的甲醇作为最终洗脱溶剂。
本发明使用石墨烯作为固相萃取填料，实现了尿液样本中m6A、m1A、Am、m6Am、 Gm、m1G、m2G、m7G、m2,2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C和N4-AcC同时萃取和富集，并实现其质谱定性定量分析。这对于同时定性定量尿液样本中多种修饰核苷具有重要意义。与当前技术相比，本发明具有如下显著性效果：
(1)本发明提供的基于石墨烯材料的固相萃取方法，能够有效地从尿液中萃取m6A、 m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、m7G、m2,2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C 和N4-AcC等修饰核苷，与常规的固相萃取柱(如Oasis C18、HLB、MCX等)相比，基于石墨烯填料的固相萃取可以实现这些不同种类修饰核苷的同时萃取与富集。
(2)目前市场上常见的商品化固相萃取柱，单价约在30-50元/根，对于大数量样本而言，成本较高。本发明所使用的石墨烯材料，每个样品只需要0.75mg，较少的量即可实现对多种修饰核苷的同时吸附，每个样本的处理成本在10元以下，从而极大地降低了分析成本。
(3)应用本发明对肺癌患者以及健康志愿者的尿液进行前处理，取得了满意的富集效果，并实现了尿液中十余种修饰核苷的同时检测，说明本发明具有较强的实用性和较大的临床及科研市场推广价值。
附图说明
图1：尿液中修饰核苷的固相萃取条件优化(以4种典型的修饰核苷为例)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1一种尿液中修饰核苷的固相萃取方法
本发明方法通过以下步骤实现：
(1)将-80℃放置的尿液样本于室温下解冻，在4℃、13000rpm转速离心15分钟，取尿液上清液5μL加入5μL混合同位素内标溶液置于1.5mL离心管中，并加水稀释至300μL；
(2)称取0.75mg石墨烯材料于固相萃取小柱中，上下放孔径为5.7mm的筛板盖严，筛板，向固相萃取柱中依次加入1mL甲醇、1mL水进行活化、平衡处理；固相萃取柱体积为1mL，内径5.5mm；
(3)随后将稀释的尿样加入固相萃取柱中，加入1mL水清洗，随后用1.5mL的洗脱溶剂进行洗脱解吸目标分析物，收集洗脱液并真空离心抽干，其中洗脱溶剂为含0.1％乙酸的甲醇溶液；
(4)用50μL水复溶后，使用UPLC-MS/MS进行液相色谱串联质谱分析；液相色谱串联质谱分析选择Waters BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)，0.1％乙酸甲醇溶液作为有机相，0.1％乙酸水作为水相。
(5)运用液相色谱串联质谱技术，将不同浓度的混合标准溶液进行分析检测，利用标准品与其对应同位素内标的峰面积比值，得到线性回归方程。对尿液样本进行测定，代入线性方程，从而计算得到样本中分析物的含量。
实施例中所使用的液相色谱为Waters公司的Acquity UPLC，质谱仪为AB SCIEX公司的4000QTRAP质谱仪。
实施例中UPLC-MS/MS检测条件为：流动相：A相为0.1％乙酸甲醇；B相为0.1％乙酸水；采用以下梯度进行洗脱：0-3min 95％B；3-5min 95-85％B；5-6.5min 85-75％B；6.5-8.5 min 75％B；8.5-9min 75-65％B；9-9.5min 65-5％B；9.5-10.5min 5％B；10.5-11min5％-95％ B；11-16min 95％B；流速为0.25mL/min；使用的色谱柱为Waters公司BEH C18柱(2.1×100 mm,1.7μm)；进样量为5μL，进样模式为自动进样。
实施例2
本实施例的目的是为了评估提取回收率，以验证该固相萃取方法富集尿液中m6A、m1A、Am、 m6Am、Gm、m1G、m2G、m7G、m2,2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC 的可行性和有效性。
在尿液样品中加入三种不同浓度(低、中、高)的17种核苷标准品，并加入同位素标准品混合液，用本发明的萃取方法对添加了标准品和同位素内标的尿液标本处理后进行UPLC-MS/MS检测分析。依据回收率＝(加标样品浓度-未加标样品浓度)/加标浓度×100％计算回收率。
(1)配制低、中、高三种浓度的17种核苷标准品混合溶液，浓度如下：m6A(10,20,40nM)、m1A(750,1500,3000nM)、Am(2.5,5,25nM)、m6Am(2.5,5,25nM)、Gm(40,80,160nM)、m1G(250,500,1000nM)、m2G(100,200,400nM)、m7G(5,10,50nM)、m2,2G(500,1000,2000 nM)、Um(40,80,160nM)、m3U(40,80,160nM)、m5U(2.5,5,25nM)、m5Um(5,10,50nM)、 Cm(100,200,400nM)、m3C(75,150,300nM)、m5C(0.5,1,5nM)和N4-AcC(300,600,1200nM)。
(2)配制15种同位素标记核苷的混合溶液，浓度如下：[D3]m6A(200nM)、[D3]m1A(2.5μM)、[13C5]Am(100nM)、[D3]m6Am(100nM)、[13C15N2]Gm(450nM)、[13C15N2]m1G(7.8μM)、[13C15N2]m7G(1μM)、[D6]m2,2G(2.5μM)、[D3]Um(500nM)、[13C15N2]m3U(1μM)、[13C5]m5U(200nM)、[13C5]m5Um(2μM)、[D3]Cm(1μM)、[13CD3]m5C(100nM)和[13C5]N4-AcC(2.5μM)。使用时稀释至所需要的浓度。
(3)取四份相同的尿液上清各5μL，向其中的三份中分别加入步骤(1)中配制的低、中、高浓度混合溶液。随后每份各加5μL混合同位素内标溶液，其中15种同位素标记的核苷的添加量分别为：[D3]m6A(50fmol)、[D3]m1A(625fmol)、[13C5]Am(25fmol)、[D3]m6Am(25fmol)、[13C15N2]Gm(112.5fmol)、[13C15N2]m1G(1.95pmol)、[13C15N2]m7G(250fmol)、[D6]m2,2G(625fmol)、[D3]Um(125fmol)、13C15N2]m3U(250fmol)、[13C5]m5U(50fmol)、[13C5]m5Um(500fmol)、[D3]Cm(250fmol)、[13CD3]m5C(25fmol)和[13C5]N4-AcC(625fmol)。
(4)实施例中液相色谱串联质谱的检测条件为：流动相A相为0.1％乙酸甲醇；B相为0.1％乙酸水；采用以下梯度进行洗脱：0-3min 95％B；3-5min 95-85％B；5-6.5min 85-75％ B；6.5-8.5min 75％B；8.5-9min 75-65％B；9-9.5min 65-5％B；9.5-10.5min 5％B；10.5-11min 5％-95％B；11-16min 95％B；流速为0.25mL/min；使用的色谱柱为Waters公司C18柱(2.1 ×100mm,1.7μm)；进样量为5μL，进样模式为自动进样。
(5)对上述四份尿液上清运用基于石墨烯的固相萃取处理后，进行液相色谱串联质谱分析，每个样本测量两次。
(6)在三个加标浓度下，计算回收率。详细的回收率结果如表1所示。
表1 基于石墨烯的固相萃取回收率
由表1结果可见：在三个加标浓度下，这17种修饰核苷的回收率介于80.42％到109.80％， RSD值小于13.96％。表明本发明所采用的基于石墨烯的固相萃取方法可以用于尿液中m6A、 m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、m7G、m2,2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、 N4-AcC的同时萃取和富集。
应用实施例1
(1)将-80℃下保存的50例肺癌患者的尿液样本于室温下解冻，在4℃下13000rpm离心15 分钟，取5μL上清液并加入5μL同位素内标混合溶液，再加水稀释到300μL。尿液样本使用实施例1中所描述的固相萃取方法处理。将洗脱液真空离心干燥，然后用50μL水复溶。
(2)将复溶后的待测物在13000rpm中离心1分钟，取上清液，按实施例1所述流动相及分析条件进行液相色谱串联质谱分析。
(3)根据构建的标准曲线计算肺癌患者尿液中m6A、m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、 m2G、m7G、m2,2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC浓度。
(4)结果分析为：运用本发明所示的基于石墨烯的固相萃取方法，我们从50名肺癌患者收集的尿液中检测到了m6A、m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、m7G、m2,2G、Um、 m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC，并实现了这17种修饰核苷的准确定量分析。
应用实施例2
(1)将-80℃下保存的30例正常人的尿液样本于室温下解冻，在4℃下13000rpm离心15分钟，取5μL上清液并加入5μL同位素内标混合溶液，再加水稀释到300μL。尿液样本使用实施例1中所描述的固相萃取方法处理。将洗脱液真空离心干燥，然后用50μL水复溶。
(2)将复溶后的待测物在13000rpm中离心1分钟，取上清液，按实施例1所述流动相及分析条件进行液相色谱串联质谱分析。
(3)根据构建的标准曲线计算正常人尿液中m6A、m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、 m7G、m2, 2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC浓度。
(4)结果分析为：运用本发明所示的基于石墨烯的固相萃取方法，我们从30名正常人收集的尿液中检测到了m6A、m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、m7G、m2,2G、Um、m3U、 m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC并实现了这17种修饰核苷的准确定量分析。
对所测得的肺癌以及健康志愿者尿液中的m6A、m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、 m7G、m2, 2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC浓度进行统计学分析，我们发现相较于健康志愿者，肺癌患者尿液中m6A、m1G、Um、m5C显著升高，而m5U、Cm、 m3C显著降低。
本发明的实用性，由上述两个应用实例结果可进一步说明本发明提供的基于石墨烯的固相萃取新方法可用于尿液等复杂生物样本中的m6A、m1A、Am、m6Am、Gm、m1G、m2G、 m7G、m2 ,2G、Um、m3U、m5U、m5Um、Cm、m3C、m5C、N4-AcC等修饰核苷的同时萃取和富集，在分析化学、代谢组学、临床医学以及预防医学领域具有很好的应用价值，因此该发明是有效的。
Claims (8)
1.一种尿液中修饰核苷固相萃取方法，其特征在于，采用石墨烯材料作为固相萃取柱填料，同时萃取和富集尿液中多种修饰核苷，然后运用液相色谱串联质谱进行检测分析，从而提高检测灵敏度和准确度，具体通过以下步骤实现：
(1)尿液样本在室温下解冻，在4℃下13000rpm转速离心15分钟，取上清液于1.5mL离心管中，加入同位素内标溶液，并加水稀释；
(2)称取0.1-1mg吸附剂填料于固相萃取小柱中，并依次用甲醇、水进行活化、平衡处理；
(3)将稀释的尿样加入到固相萃取柱中，用水清洗，真空泵抽干后进行洗脱并收集洗脱液，将洗脱液进行真空离心干燥；
(4)用水复溶后，进行液相色谱串联质谱分析；
(5)运用液相色谱串联质谱技术，将不同浓度的混合标准溶液进行分析检测，利用标准品与其对应同位素内标的峰面积比值，得到线性回归方程，对尿液样本进行测定，代入线性方程，从而计算得到样本中分析物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中取离心后尿液上清液的体积为5μL，加入同位素内标溶液的体积为5μL，加入水稀释后的总体积为300μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中吸附剂填料为石墨烯，质量为0.75mg，固相萃取柱体积为1mL，内径5.5mm，固相萃取柱的筛板孔径为5.7mm，活化、平衡溶剂分别为甲醇、水，体积均为1mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中水清洗所用的体积为1mL，洗脱液为1.5mL含0.1％乙酸的甲醇溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所使用的色谱柱为Waters公司的C18色谱柱，其中A相为0.1％乙酸甲醇；B相为0.1％乙酸水；采用以下梯度进行洗脱：0-3min 95％B；3-5min 95-85％B；5-6.5min 85-75％B；6.5-8.5min 75％B；8.5-9min 75-65％B；9-9.5min 65-5％B；9.5-10.5min 5％B；10.5-11min 5％-95％B；11-16min 95％B；流速为0.25mL/min；进样量为5μL，进样模式为自动进样；柱温25℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中混合标准溶液为N6-甲基腺苷、N1-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、N1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N7-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、2'-O-甲基尿苷、3-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5,2'-O-二甲基尿苷、2'-O-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷和N4-乙酰基胞苷，使用的稳定同位素内标化合物为[D3]N6-甲基腺苷、[D3]N1-甲基腺苷、[13C5]2'-O-甲基腺苷、[D3]N6,2'-O-二甲基腺苷、[13C15N2]2'-O-甲基鸟苷、[13C15N2]N1-甲基鸟苷、[13C15N2]N7-甲基鸟苷、[D6]N2,N2-二甲基鸟苷、[D3]2'-O-甲基尿苷、[13C15N2]3-甲基尿苷、[13C5]5-甲基尿苷、[13C5]5,2'-O-二甲基尿苷、[D3]2'-O-甲基胞苷、[13CD3]5-甲基胞苷和[13C5]N4-乙酰基胞苷。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中混合标准品溶液的浓度范围分别为：1-100nM N6-甲基腺苷、500-5000nM N1-甲基腺苷、0.5-50nM 2'-O-甲基腺苷、1-50nM N6,2'-O-二甲基腺苷、10-400nM 2'-O-甲基鸟苷、100-2000nM N1-甲基鸟苷、50-1000nM N2-甲基鸟苷、1-100nM N7-甲基鸟苷、100-4000nM N2,N2-二甲基鸟苷、10-400nM2'-O-甲基尿苷、10-250nM 3-甲基胞苷、1-50nM 5-甲基胞苷、1-100nM 5,2'-O-二甲基尿苷、25-1000nM 2'-O-甲基胞苷、10-500nM 3-甲基胞苷、0.5-10nM 5-甲基胞苷和50-4000nMN4-乙酰基胞苷；同位素内标化合物添加量分别为：50fmol[D3]N6-甲基腺苷、625fmol[D3]N1-甲基腺苷、25fmol[13C5]2'-O-甲基腺苷、25fmol[D3]N6,2'-O-二甲基腺苷、112.5fmol[13C15N2]2'-O-甲基鸟苷、1.95pmol[13C15N2]N1-甲基鸟苷、250fmol[13C15N2]N7-甲基鸟苷、625fmol[D6]N2,N2-二甲基鸟苷、125fmol[D3]2'-O-甲基尿苷、250fmol[13C15N2]3-甲基胞苷、50fmol[13C5]5-甲基胞苷、500fmol[13C5]5,2'-O-二甲基尿苷、250fmol[D3]2'-O-甲基胞苷、25fmol[13CD3]5-甲基胞苷和625fmol[13C5]N4-乙酰基胞苷。
8.权利要去1所述方法在萃取、富集和检测尿液中修饰核苷中的应用，其特征在于，所述修饰核苷分别为：N6-甲基腺苷、N1-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、N1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N7-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、2'-O-甲基尿苷、3-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5,2'-O-二甲基尿苷、2'-O-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷和N4-乙酰基胞苷。
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Citations (8)
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2022
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