CN108949791A - 微环dna表达抗hpv治疗性工程抗体及其应用 - Google Patents

微环dna表达抗hpv治疗性工程抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微环DNA表达抗HPV治疗性工程抗体及其应用。具体涉及一种用于在体内表达抗HPV双特异性抗体的微环DNA载体。双特异性抗体介导效应细胞(T细胞或NK细胞)杀伤HPV感染细胞或HPV整合癌细胞。本申请首次披露HPV阳性靶细胞与效应细胞桥接器(MC.HPV‑BTEC)的微环DNA载体设计方案，适用于HPV感染及HPV相关癌症的治疗。

Description

微环DNA表达抗HPV治疗性工程抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微环(Minicircle,MC)DNA载体，更具体为一种用于在体内表达抗HPV(人***瘤病毒)双特异性抗体的微环DNA载体。
背景技术
人***瘤病毒(HPV)属于人类高致病性病毒，传播非常广泛，能够引起人类皮肤和黏膜的多种良性***状瘤，也可以引起宫颈病变。HPV病毒是导致***的直接病因和主要原因。已知的HPV病毒有100多种，主要分为高危型和低危型。高危型包括16、18、45、58等15种型别，其中HPV 16和18型是致癌性最强的型别。***是女性生殖***常见的恶性肿瘤，全球每年出现约55万新发***病例，有20多万人死于***。我国的形势同样严峻，每年约有13万新增患者。HPV病毒除了引发***之外，还会导致皮肤疣、生殖器疣。此外，HPV病毒并不只针对女性，男性也可以感染HPV病毒，导致男性的***癌、***癌和口腔癌等。***属于极少数病因和机理明确、可通过早期检查能够预防和治愈的癌症。目前，预防***的手段主要是***的早期筛查和免疫接种***疫苗(HPV疫苗)。
HPV病毒上的蛋白主要包括晚期蛋白L1(主要衣壳蛋白)、晚期蛋白L2(次要衣壳蛋白)、早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7。由L1、L2蛋白出发制备的***疫苗属于预防性疫苗。高危型HPV的E6、E7蛋白是主要的转化蛋白，与HPV致癌作用密切相关。由E6、E7蛋白出发制备的***疫苗属于治疗性疫苗。目前已经上市的***疫苗包括默沙东的4价疫苗Gardasil和葛兰素史克的2价疫苗Cervarix，均属于预防性疫苗。2017年7月，国内首个***疫苗，葛兰素史克的“希瑞适”上市，该疫苗适用于9-25岁的女性。
对于预防和治疗HPV感染及HPV相关癌症，可采用与HPV病毒特异性结合的双特异性抗体。双特异性抗体介导效应细胞(T细胞或NK细胞)杀灭HPV感染细胞或HPV整合癌细胞。制备双特异性抗体可以采用基因工程的手段。微环(Minicircle，MC)DNA载体表达方法属于基因工程制备法。利用微环DNA载体可以表达微环双特异性抗体(MC.BsAb)。其中，双特异性抗体可以介导效应细胞(T细胞或NK细胞)杀灭HPV阳性细胞(即HPV感染细胞或HPV相关/整合的癌细胞)。与该发明最接近的技术是我们发明的微环DNA载体表达双特异性抗体的技术(MC.BsAb，CN 201710245146.6)。
发明内容
本发明涉及微环(Minicircle，MC)DNA载体在体内表达抗人***瘤病毒(HPV)工程抗体，用于治疗HPV感染及HPV相关癌症。
本发明提供了一种表达HPV阳性靶细胞与效应细胞桥接器(Bridge betweentarget cell(HPV-positive cell)and effector cell，HPV-BTEC)的重组基因载体，所述桥接器包含：与靶细胞作用靶点特异性结合的部分A，和与效应细胞作用靶点特异性结合的部分B。
在一个实施方案中，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子。优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。优选的，所述重组基因载体为重组表达载体，选自原核表达载体或真核表达载体；优选真核表达载体；更优选用于哺乳动物细胞真核表达的重组表达载体。
在一个实施方案中，所述桥接器选自蛋白或多肽。优选的，所述桥接器选自双特异性抗体。优选的，所述部分A和所述部分B分别选自蛋白分子或多肽分子。优选的，所述部分A和部分B分别选自Fab、Fab’、单链抗体(scFv)、单域抗体(VHH)、单链T细胞受体(scTCR)和其它。
在一个实施方案中，所述靶细胞选自HPV感染细胞、HPV整合癌细胞或其它。所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它。优选的，所述部分A特异性结合的作用靶点选自：HPV病毒的E6蛋白与MHC-I的复合物，或E7蛋白与MHC-I的复合物；更优选的，所述复合物选自HLA-A2/E6或HLA-A2/E7。所述部分B特异性结合的作用靶点选自：CD3、CD16、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD56、NKG2D、NCR或其它。
在一个实施方案中，所述部分A选自单链T细胞受体(scTCR)，其包含：β链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，和α链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述部分B选自单链抗体(scFv)，(1)其包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述部分B特异性结合的作用靶点选自CD3；或者(2)其包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述部分B特异性结合的作用靶点选自CD16.
在一个实施方案中，所述部分A包含的β链可变区具有与SEQ ID NO：1所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的α链可变区与SEQ ID NO：3所示序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述部分B包含的重链可变区具有与SEQ ID NO：5或9所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的轻链可变区具有与SEQ ID NO：7或11所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
本发明提供了一种表达HPV阳性靶细胞与效应细胞桥接器的重组基因载体，所述重组基因载体包含所述桥接器的编码基因。
在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：部分A的编码基因，和/或包含部分B的编码基因。优选的，部分A选自单链T细胞受体(scTCR)，其编码基因包含：β链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和/或α链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。优选的，部分B选自单链抗体(scFv)，(1)其编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；或者(2)其编码基因包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：与上述部分A和/或部分B的编码基因的核苷酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的桥接器具有与之前实施方案中所述的桥接器相同的功能。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。
在一个实施方案中，所述重组基因载体包含所述桥接器的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13-18中任一项所示。
在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：与上述桥接器的编码基因的核苷酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的桥接器具有与之前实施方案中所述的桥接器相同的功能。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。
本发明提供了一种由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的桥接器。优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子。更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。
本发明提供了一种之前实施方案中所述的重组基因载体的制备方法，具体步骤包括：
(1)从现有技术中分别获取HPV特异性T细胞受体样抗体(抗E6蛋白与MHC-I的复合物或E7蛋白与MHC-I的复合物的TCR，TCR-L)以及CD3抗体、CD16抗体的重链可变区(VH)序列、轻链可变区(VL)序列。
(2)根据上述(1)中VH、VL序列设计成多种组合形式的桥接器，并构建表达所述桥接器的重组基因载体。
任选的，
(3)在体内外鉴定所述桥接器的表达水平，并检测表达产物介导效应细胞对靶细胞的杀伤效果。
在一个实施方案中，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子。优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。优选的，所述桥接器选自蛋白或多肽。更优选的，所述桥接器选自双特异性抗体。优选的，所述靶细胞选自HPV感染细胞、HPV整合癌细胞或其它。所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它。
本发明提供了一种宿主细胞，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体。
在一个实施方案中，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了一种之前实施方案中所述的桥接器的制备方法，具体步骤包括：
(1)构建所述重组基因载体；
(2)将所述重组基因载体导入宿主细胞；
(3)在适合表达的条件下，培养宿主细胞，诱导表达，分离纯化，获得所述双特异性抗体。
本发明提供了一种药物组合物，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的桥接器，以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将重组基因载体或双特异性抗体与药学上可接受的载体混合或用载体稀释。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液体。制剂选自片剂、丸剂、粉剂、胶囊、混悬剂、乳剂、溶液剂、气溶胶、注射用溶液等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明提供了之前实施方案中所述的重组基因载体、所述的桥接器、所述的宿主细胞或所述的药物组合物在制备用于HPV感染或HPV相关癌症的药物中的用途。优选的，所述HPV相关癌症选自***。
本发明的积极效果包括：
本发明首次公开HPV特异性的HPV阳性靶细胞与效应细胞桥接器(MC.HPV-BTEC)的微环DNA载体设计方案，适用于HPV感染及HPV相关癌症的治疗。当效应细胞的浓度为靶细胞的2.5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用非常微弱。而HPV-BTEC能够将效应细胞的杀伤作用提高12％左右。当效应细胞的浓度为靶细胞的5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用为15％左右。而HPV-BTEC能够将效应细胞的杀伤作用再次提高3倍以上。在通常的生理条件下，HPV-BTEC能够大幅度提高效应细胞对靶细胞的杀伤作用。可见，本发明的HPV-BTEC、微环DNA载体对于预防和治疗HPV感染及HPV相关癌症具有很好的前景，提供了一条新的临床思路。
附图说明
图1：表达抗HPV scTCR/CD3scFv桥接器HPV-BTEC的微环DNA载体结构图。
图2：表达抗HPV scTCR/CD16scFv桥接器HPV-BTEC的微环DNA载体结构图。
图3：表达抗HPV scTCR/CD3scFv桥接器HPV-BTEC的微环DNA载体结构图。
图4：表达抗HPV scTCR/CD16scFv桥接器HPV-BTEC的微环DNA载体结构图。
图5：表达抗HPV scTCR/CD3scFv桥接器HPV-BTEC的微环DNA载体结构图。
图6：表达抗HPV scTCR/CD16scFv桥接器HPV-BTEC的微环DNA载体结构图。
图7：HPV-BTEC介导效应细胞杀伤靶细胞的结果图。E代表效应细胞(CIK)；T代表靶细胞(Caski)；16E6/CD3-BTEC代表anti-HPV16-HLA-A2/E6/CD3-BTEC。
具体实施方式
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
实施例1、HPV阳性靶细胞与效应细胞桥接器(HPV-BTEC)的构建
设计HPV-BTEC并构建相应的微环DNA表达载体，HPV-BTEC表达框包括多种结构，具体如下：
(1)scFv-scFv结构：
其中，SP为信号肽(Signal Peptide)；Linker为连接序列。anti-CD3.VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；anti-CD3.VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；anti-CD16.VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；anti-CD16.VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；anti-HPV-TCRL.VH或anti-HPV-TCR.Vα的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；anti-HPV-TCRL.VL或anti-HPV-TCR.Vβ的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(2)DART(Dual-Affinity Re-Targeting antibody)结构：
DART表达框经翻译、剪切后形成两条肽链(Chain 1、Chain 2)；这两条链通过配对的E/K-coli形成稳定的异二聚体。
其中，SP为信号肽(Signal Peptide)；Linker为连接序列，Furin为furin蛋白酶剪切位点，2A为2A自剪切位点。Furin剪切位点的氨基酸序列为R-X-[R/K]-R(比如RRKR)，X指代任一种氨基酸；E/K coli为电性相反、配对的螺旋结构，且K coli和E coli可互换位置；2A包括E2A、F2A、P2A和T2A等。其中，anti-CD3.VH、anti-CD3.VL、anti-CD16.VH、anti-CD16.VL、anti-HPV-TCRL.VH、anti-HPV-TCR.Vα、anti-HPV-TCRL.VL、anti-HPV-TCR.Vβ各元件的氨基酸序列及其编码基因与上述(1)中的一致。
(3)DART-Fc结构：
DART-Fc表达框经翻译、剪切后形成两条链(Chain 1、Chain 2)；Chain 1和Chain2通过配对的E/K-coli以及Fc“knob-into-hole”结构形成稳定的异二聚体。“knob-into-hole”设计既可避免同二聚体的产生，还能增加半衰期。
其中，SP为信号肽(Signal Peptide)；Linker为连接序列，Furin为furin蛋白酶剪切位点，2A为2A自剪切位点。Furin剪切位点的氨基酸序列为R-X-[R/K]-R(比如RRKR)，X指代任一种氨基酸；E/K coli为电性相反、配对的螺旋结构，且K coli和E coli可互换位置；Fc-knob和Fc-hole分别为IgG Fc段CH2-CH3突变体，它们也可互换位置；2A包括E2A、F2A、P2A和T2A等。其中，anti-CD3.VH、anti-CD3.VL、anti-CD16.VH、anti-CD16.VL、anti-HPV-TCRL.VH、anti-HPV-TCR.Vα、anti-HPV-TCRL.VL、anti-HPV-TCR.Vβ各元件的氨基酸序列及其编码基因与上述(1)中的一致。
实施例2、微环DNA载体的构建以及微环(MC)的制备
微环(MC)的制备方法如下：
1、合成HPV-BTEC的编码基因。
2、选择合适的位点双酶切微环DNA空载体pMC.BESPX。
3、使用seamless克隆或者传统克隆方法(如，酶切-连接)将HPV-BTEC的编码基因***双酶切后的空载体pMC.BESPX中，构建成微环DNA载体(pMC.HPV-BTEC)。
4、微环载体(pMC.HPV-BTEC)分别转化大肠杆菌E coli.ZYCY10P3S2T，按标准微环制备方法得到相应的微环DNA(MC.HPV-BTEC)。
其中，微环DNA空载体pMC.BESPX、工程菌E coli.ZYCY10P3S2T，以及微环制备方法见参考文献Nat Biotechnol.2010,28:1287-1289.
实施例3、HPV工程抗体(HPV-BTEC)的表达和纯化
一、HPV-BTEC的表达方法
采用superfect质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)将上述微环DNA转染293T细胞，在无血清培养基中培养三天后分别收集293T细胞培养上清。
二、HPV-BTEC的纯化方法
1、收集细胞培养上清液进行低温超速离心，取上清。
2、HPV-BTEC利用His-Tag亲和树脂(cOmplete His-Tag Purification Resin，Roche)纯化。
3、纯化后的蛋白使用PAGE或Western Blot定性检测，并使用Bradford法定量检测蛋白浓度。
4、纯化产物置于-20℃或-80℃长期保存。
实施例4、HPV-BTEC的结合实验
采用流式细胞术检测HPV-BTEC与靶细胞(Targets，T)、效应细胞(Effector，E)的结合活性，包括如下步骤：
1、细胞培养：靶细胞(HPV阳性细胞,比如Hela)；效应细胞(T细胞或NK细胞)。
2、收集细胞：贴壁细胞使用胰酶消化，加含血清培养基中和后离心弃上清得细胞；悬浮细胞直接离心收集。
3、两种细胞均用预冷PBS洗涤2次，200g离心4min，收集细胞，分别计数。
4、每个实验组分别分配1×105个靶细胞和效应细胞，分组如下：
空白组(不加HPV-BTEC)和HPV-BTEC组
5、加入HPV-BTEC溶液100μL/组，冰上孵育30min。
6、加入1mL预冷PBS洗涤，200g离心4min，收集细胞，加事先预冷并混好anti-flag抗体的PBS 100μL，冰上孵育30min。
7、加入1mL预冷PBS洗涤，200g离心4min，收集细胞，加入100μL PBS重悬，上流式观察结合情况。
实施例5、HPV-BTEC介导效应细胞杀伤靶细胞
一、实验分组
实验材料：效应细胞(E，CIK细胞)，靶细胞(T，Caski细胞)，HPV-BTEC(结合HPV 16型E6蛋白/CD3的双特异性抗体，anti-HPV16-HLA-A2/E6/CD3-BTEC)
具体分组和实验材料的用量如下表所示：
二、实验方法
1、提前1天将靶细胞(T，Caski细胞)接种于96孔板上，细胞接种量为2×104/孔。
2、第二天更换新鲜opti-MEM培养基，100μL/孔。
3、效应细胞(E，CIK细胞)计数并重悬于opti-MEM培养基中，按照各个分组中E：T的比例，加入相应数量的效应细胞。
4、在相应的孔中每孔加入纯化的HPV-BTEC，终浓度为10ng/mL，混匀。
5、37℃细胞培养箱孵育6小时。
6、加入cck8(Dojindo，日本)试剂(20μL/孔)，37℃细胞培养箱孵育2小时后，450nm处测定吸光度。
7、根据cck8试剂盒(Dojindo，日本)说明书，统计活细胞数目并推算杀伤效率：
杀伤率＝[((T+E)-T&E)/T]×100％
其中，T代表活的靶细胞数量；E代表活的效应细胞数量；则T+E等于活的靶细胞和效应细胞的总数；T&E代表靶细胞经效应细胞杀伤后的活细胞数量。二、实验结果
图7显示了HPV-BTEC介导效应细胞杀伤靶细胞的结果图。当效应细胞的浓度为靶细胞的2.5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用非常微弱。而HPV-BTEC能够将效应细胞的杀伤作用提高12％左右。当效应细胞的浓度为靶细胞的5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用为15％左右。而HPV-BTEC能够将效应细胞的杀伤作用再次提高3倍以上。当效应细胞的浓度为靶细胞的10倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用，与是否存在HPV-BTEC相差不大。可见，在通常的生理条件下，HPV-BTEC能够大幅度提高效应细胞对靶细胞的杀伤作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳新诺微环生物科技有限公司
<120> 微环DNA表达抗HPV治疗性工程抗体及其应用
<130> CP11801141C
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 135
<212> PRT
<213> BTEC抗靶细胞HLA-A2/E6的scTCR Vβ氨基酸序列
<400> 1
Pro Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr
1 5 10 15
Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Thr
20 25 30
Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Val Ser Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe
50 55 60
Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser Gly Leu Pro
65 70 75 80
Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile Ser Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Ser Gln Thr Gly Ala Arg Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
130 135
<210> 2
<211> 405
<212> DNA
<213> BTEC抗靶细胞HLA-A2/E6的scTCR Vβ的编码基因
<400> 2
cctggcacca gtctcctatg ctgggtggtc ctgggtttcc tagggacaga tcacacaggt 60
gctggagtct cccagtctcc caggtacaaa gtcacaaaga ggggacagga tgtagctctc 120
aggtgtgatc caatttcggg tcatgtatcc ctttattggt accgacaggc cctggggcag 180
ggcccagagt ttctgactta cttcaattat gaagcccaac aagacaaatc agggctgccc 240
aatgatcggt tctctgcaga gaggcctgag ggatccatct ccactctgac gatccagcgc 300
acagagcagc gggactcggc catgtatcgc tgtgccagca gctcccagac aggggcccgc 360
acagatacgc agtattttgg cccaggcacc cggctgacag tgctc 405
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> BTEC抗靶细胞HLA-A2/E6的scTCR Vα氨基酸序列
<400> 3
Ala Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp Val
1 5 10 15
Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln Glu
20 25 30
Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn Thr
35 40 45
Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Ile
50 55 60
Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr Ala
65 70 75 80
Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala Ser
85 90 95
Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly His Pro Ser Ser
100 105 110
Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val
115 120 125
Thr Pro
130
<210> 4
<211> 390
<212> DNA
<213> BTEC抗靶细胞HLA-A2/E6的scTCR Vα的编码基因
<400> 4
gcccttgaac atctgttgat aatactgtgg atgcaactta cctgggtatc tggtcagcaa 60
ttgaaccagt ctccacagtc catgtttatc caagaagggg aggacgtgtc catgaattgt 120
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gtactgttga tagccctcta taaggcgggc gaactgacat ccaatggaag actcacagcc 240
caattcggaa ttacccggaa ggattctttc ctcaacatct ccgcgagtat tccatctgat 300
gtaggaatat acttctgtgc agggcatccg tctagcaaca gtggatatgc cctcaatttt 360
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<212> PRT
<213> BTEC抗效应细胞抗CD3 VH氨基酸序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> BTEC抗效应细胞抗CD3 VH的编码基因
<400> 6
gaggtgcaac tcgtcgaatc aggagggggc ctggtccaac ccggaggaag cctgaggctc 60
agttgtgctg cctcaggctt taccttcaat acttacgcga tgaactgggt aagacaagct 120
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tactatgccg attctgtaaa ggatagattc acaataagcc gagacgacag caaaaactca 240
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cacgggaact tcgggaactc ttatgtcagt tggtttgcgt actggggtca aggcacactc 360
gtgaccgtat catca 375
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<212> PRT
<213> BTEC抗效应细胞抗CD3 VL氨基酸序列
<400> 7
Gln Ala Trp Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn
20 25 30
Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu
35 40 45
Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
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<211> 327
<212> DNA
<213> BTEC抗效应细胞抗CD3 VL的编码基因
<400> 8
caagcctgga ctcaggagcc atcccttaca gtgtctcctg gaggaactgt aacactcacc 60
tgcagatcat caaccggggc tgtgacaacg agcaactacg ctaattgggt ccaacagaag 120
cctggtcaag ctccgcgagg attgatcggg ggaacaaaca aacgcgcacc ttggacacct 180
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<213> BTEC抗效应细胞抗CD16 VH氨基酸序列
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> DNA
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caagtccagc ttgtgcagtc aggtgctgag gttaaaaaac caggagaaag tctgaaggta 60
tcatgtaagg cctcaggtta tacgtttact tcatattaca tgcactgggt gcgacaggct 120
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gcacaaaagt ttcagggtcg cgtgacaatg acaagagaca cgtccacgtc cacggtctac 240
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<212> PRT
<213> BTEC抗效应细胞抗CD16 VL氨基酸序列
<400> 11
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
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His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<212> DNA
<213> BTEC抗效应细胞抗CD16 VL的编码基因
<400> 12
tcctacgttc tcactcagcc cagtagtgtc tcagttgctc cagggcaaac ggccacgatt 60
agttgcggag gtcacaacat aggcagtaag aatgtacatt ggtaccaaca gcgaccaggc 120
cagagccccg ttttggtcat ctatcaggat aataagcggc caagtggaat accggagcgg 180
ttcagcggta gtaacagtgg gaacaccgcc actctgacta tatccggtac gcaagctatg 240
gacgaagcag actactattg ccaggtgtgg gataactaca gcgtactgtt cggaggcggg 300
acgaaactta cagtcttg 318
<210> 13
<211> 1755
<212> DNA
<213> 抗HLA-A2/E6/CD3 BTEC（scTCR-scFv）的编码基因
<400> 13
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac 60
tacaaagatg atgacgataa ggcccttgaa catctgttga taatactgtg gatgcaactt 120
acctgggtat ctggtcagca attgaaccag tctccacagt ccatgtttat ccaagaaggg 180
gaggacgtgt ccatgaattg tacaagctcc agtatcttca acacgtggct gtggtacaaa 240
caggatcctg gggaaggacc agtactgttg atagccctct ataaggcggg cgaactgaca 300
tccaatggaa gactcacagc ccaattcgga attacccgga aggattcttt cctcaacatc 360
tccgcgagta ttccatctga tgtaggaata tacttctgtg cagggcatcc gtctagcaac 420
agtggatatg ccctcaattt tggaaagggc acctccctgc tggttacccc acctggtggt 480
ggtggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctgg tggtggtggt 540
tctggtggtg gtggttctcc tggcaccagt ctcctatgct gggtggtcct gggtttccta 600
gggacagatc acacaggtgc tggagtctcc cagtctccca ggtacaaagt cacaaagagg 660
ggacaggatg tagctctcag gtgtgatcca atttcgggtc atgtatccct ttattggtac 720
cgacaggccc tggggcaggg cccagagttt ctgacttact tcaattatga agcccaacaa 780
gacaaatcag ggctgcccaa tgatcggttc tctgcagaga ggcctgaggg atccatctcc 840
actctgacga tccagcgcac agagcagcgg gactcggcca tgtatcgctg tgccagcagc 900
tcccagacag gggcccgcac agatacgcag tattttggcc caggcacccg gctgacagtg 960
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ggaggaagcc tgaggctcag ttgtgctgcc tcaggcttta ccttcaatac ttacgcgatg 1080
aactgggtaa gacaagctcc tgggaagggg cttgaatggg tggctcgcat tcggtcaaag 1140
tataataatt atgcgaccta ctatgccgat tctgtaaagg atagattcac aataagccga 1200
gacgacagca aaaactcact ttaccttcag atgaactcac tcaaaacaga ggacacagca 1260
gtgtattact gtgtgagaca cgggaacttc gggaactctt atgtcagttg gtttgcgtac 1320
tggggtcaag gcacactcgt gaccgtatca tcaggcgaag gtactagtac tggttctggt 1380
ggaagtggag gttcaggtgg agcagaccaa gcctggactc aggagccatc ccttacagtg 1440
tctcctggag gaactgtaac actcacctgc agatcatcaa ccggggctgt gacaacgagc 1500
aactacgcta attgggtcca acagaagcct ggtcaagctc cgcgaggatt gatcggggga 1560
acaaacaaac gcgcaccttg gacacctgca cgctttagcg gcagtctcct gggaggtaag 1620
gcggccctga ctattaccgg agcgcaggct gaagatgaag ctgattatta ttgtgctctt 1680
tggtatagca atctttgggt attcggtggg ggaaccaagc tcactgtgct cggccatcat 1740
caccatcatc attag 1755
<210> 14
<211> 1731
<212> DNA
<213> 抗HLA-A2/E6/CD16 BTEC（scTCR-scFv）的编码基因
<400> 14
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac 60
tacaaagatg atgacgataa ggcccttgaa catctgttga taatactgtg gatgcaactt 120
acctgggtat ctggtcagca attgaaccag tctccacagt ccatgtttat ccaagaaggg 180
gaggacgtgt ccatgaattg tacaagctcc agtatcttca acacgtggct gtggtacaaa 240
caggatcctg gggaaggacc agtactgttg atagccctct ataaggcggg cgaactgaca 300
tccaatggaa gactcacagc ccaattcgga attacccgga aggattcttt cctcaacatc 360
tccgcgagta ttccatctga tgtaggaata tacttctgtg cagggcatcc gtctagcaac 420
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tctggtggtg gtggttctcc tggcaccagt ctcctatgct gggtggtcct gggtttccta 600
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gacaaatcag ggctgcccaa tgatcggttc tctgcagaga ggcctgaggg atccatctcc 840
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tcccagacag gggcccgcac agatacgcag tattttggcc caggcacccg gctgacagtg 960
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cactgggtgc gacaggctcc tggtcagggg ttggagtgga tgggaatcat caatccatcc 1140
ggtggtagca ccagctacgc acaaaagttt cagggtcgcg tgacaatgac aagagacacg 1200
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tattgtgcac gcggcagtgc ttactactac gatttcgcag attattgggg gcaggggact 1320
ttggttacag tctcctccgg cgaaggtact agtactggtt ctggtggaag tggaggttca 1380
ggtggagcag actcctacgt tctcactcag cccagtagtg tctcagttgc tccagggcaa 1440
acggccacga ttagttgcgg aggtcacaac ataggcagta agaatgtaca ttggtaccaa 1500
cagcgaccag gccagagccc cgttttggtc atctatcagg ataataagcg gccaagtgga 1560
ataccggagc ggttcagcgg tagtaacagt gggaacaccg ccactctgac tatatccggt 1620
acgcaagcta tggacgaagc agactactat tgccaggtgt gggataacta cagcgtactg 1680
ttcggaggcg ggacgaaact tacagtcttg catcatcacc atcatcatta g 1731
<210> 15
<211> 1962
<212> DNA
<213> 抗HLA-A2/E6/CD3 BTEC（DART）的编码基因
<400> 15
atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60
caggcagtgg tgacccagga accttctctg accgtgtctc caggcggaac agtgacactg 120
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gtctcccagt ctcccaggta caaagtcaca aagaggggac aggatgtagc tctcaggtgt 540
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cagcgggact cggccatgta tcgctgtgcc agcagctccc agacaggggc ccgcacagat 780
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atcagccggg acgacagcaa gaacagcctg tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag 1740
gacacagccg tgtactattg cgtgcgccac ggcaacttcg gcaacagcta cgtcagctgg 1800
ttcgcctatt gggggcaggg aacactggtg acagtgtcta gcgccagcac caaaggcgaa 1860
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gaagtggcag ccctggagaa gcatcatcac catcatcatt ga 1962
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<213> 抗HLA-A2/E6/CD16 BTEC（DART）的编码基因
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tcctacgttc tcactcagcc cagtagtgtc tcagttgctc cagggcaaac ggccacgatt 120
agttgcggag gtcacaacat aggcagtaag aatgtacatt ggtaccaaca gcgaccaggc 180
cagagccccg ttttggtcat ctatcaggat aataagcggc caagtggaat accggagcgg 240
ttcagcggta gtaacagtgg gaacaccgcc actctgacta tatccggtac gcaagctatg 300
gacgaagcag actactattg ccaggtgtgg gataactaca gcgtactgtt cggaggcggg 360
acgaaactta cagtcttggg aggaggaagc ggaggaggag gacctggcac cagtctccta 420
tgctgggtgg tcctgggttt cctagggaca gatcacacag gtgctggagt ctcccagtct 480
cccaggtaca aagtcacaaa gaggggacag gatgtagctc tcaggtgtga tccaatttcg 540
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gagaggcctg agggatccat ctccactctg acgatccagc gcacagagca gcgggactcg 720
gccatgtatc gctgtgccag cagctcccag acaggggccc gcacagatac gcagtatttt 780
ggcccaggca cccggctgac agtgctcgct agcaccaagg gcaaggtggc agcttgcaag 840
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acctgggtat ctggtcagca attgaaccag tctccacagt ccatgtttat ccaagaaggg 1140
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gaaagtctga aggtatcatg taaggcctca ggttatacgt ttacttcata ttacatgcac 1560
tgggtgcgac aggctcctgg tcaggggttg gagtggatgg gaatcatcaa tccatccggt 1620
ggtagcacca gctacgcaca aaagtttcag ggtcgcgtga caatgacaag agacacgtcc 1680
acgtccacgg tctacatgga attgtcatcc ctgagatcag aggacaccgc cgtatattat 1740
tgtgcacgcg gcagtgctta ctactacgat ttcgcagatt attgggggca ggggactttg 1800
gttacagtct cctccgccag caccaaaggc gaagtggcag cttgcgagaa ggaagtggcc 1860
gctctggaga aggaagtggc cgctctggaa aaggaagtgg cagccctgga gaagcatcat 1920
caccatcatc attga 1935
<210> 17
<211> 3342
<212> DNA
<213> 抗HLA-A2/E6/CD3 BTEC（DART-Fc）的编码基因
<400> 17
atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60
caggcagtgg tgacccagga accttctctg accgtgtctc caggcggaac agtgacactg 120
acctgcagaa gcagcacagg cgccgtgaca accagcaact acgccaattg ggtgcagcag 180
aagccaggac aggcccctag aggcctgatt ggaggcacaa acaagagagc cccttggacc 240
ccagccagat tctccggatc tctgctggga ggcaaagccg ccctgacaat cacaggagct 300
caggccgaag acgaggccga ctactattgc gccctctggt acagcaacct ctgggtgttc 360
ggcggaggaa caaagctgac agtgctggga ggaggaggaa gcggaggagg aggacctggc 420
accagtctcc tatgctgggt ggtcctgggt ttcctaggga cagatcacac aggtgctgga 480
gtctcccagt ctcccaggta caaagtcaca aagaggggac aggatgtagc tctcaggtgt 540
gatccaattt cgggtcatgt atccctttat tggtaccgac aggccctggg gcagggccca 600
gagtttctga cttacttcaa ttatgaagcc caacaagaca aatcagggct gcccaatgat 660
cggttctctg cagagaggcc tgagggatcc atctccactc tgacgatcca gcgcacagag 720
cagcgggact cggccatgta tcgctgtgcc agcagctccc agacaggggc ccgcacagat 780
acgcagtatt ttggcccagg cacccggctg acagtgctcg ctagcaccaa gggcaaggtg 840
gcagcttgca aggagaaggt ggccgctctg aaggagaaag tggccgctct gaaggagaaa 900
gtggccgccc tgaaggaggg aggcggcgat aagacacaca cttgccctcc ttgtccagct 960
ccagaagcag caggaggacc tagcgtgttc ctgttccctc ccaagcctaa ggacaccctg 1020
atgatcagcc ggaccccaga agtgacttgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaagacccc 1080
gaggtcaagt tcaattggta cgtggacgga gtggaggtgc acaacgctaa gaccaagccc 1140
agggaggagc agtacaacag cacctacagg gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 1200
gattggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggccct gccagcccct 1260
atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagcctagag aacctcaggt gtacaccctg 1320
ccccctagca gagaggagat gaccaagaac caggtctccc tctggtgcct ggtgaagggc 1380
ttctacccta gcgacatcgc cgtggagtgg gaatctaacg gtcagccaga gaacaactac 1440
aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc 1500
gtggacaaaa gccgctggca gcagggcaac gtgttctctt gcagcgtgat gcacgaggcc 1560
ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc caggaaagag aagaaagaga 1620
ggcagcggcg agggaagagg atctctgctg acttgcggcg acgtggaaga gaatcccggc 1680
cctatggaga ccgacacact cctcctctgg gtgctgctcc tctgggtgcc aggatctaca 1740
ggcgcccttg aacatctgtt gataatactg tggatgcaac ttacctgggt atctggtcag 1800
caattgaacc agtctccaca gtccatgttt atccaagaag gggaggacgt gtccatgaat 1860
tgtacaagct ccagtatctt caacacgtgg ctgtggtaca aacaggatcc tggggaagga 1920
ccagtactgt tgatagccct ctataaggcg ggcgaactga catccaatgg aagactcaca 1980
gcccaattcg gaattacccg gaaggattct ttcctcaaca tctccgcgag tattccatct 2040
gatgtaggaa tatacttctg tgcagggcat ccgtctagca acagtggata tgccctcaat 2100
tttggaaagg gcacctccct gctggttacc ccaggcggcg gaagcggagg aggaggagaa 2160
gtgcagctgg tggaaagcgg aggaggactg gtgcagccag gaggatctct gagactgtct 2220
tgcgccgcca gcggctttac attcagcacc tacgccatga attgggtccg gcaggctcca 2280
ggaaaaggac tcgagtgggt cggaaggatc cggagcaagt acaacaacta cgccacctac 2340
tacgccgaca gcgtgaaggg caggttcacc atcagccggg acgacagcaa gaacagcctg 2400
tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag gacacagccg tgtactattg cgtgcgccac 2460
ggcaacttcg gcaacagcta cgtcagctgg ttcgcctatt gggggcaggg aacactggtg 2520
acagtgtcta gcgccagcac caaaggcgaa gtggcagctt gcgagaagga agtggccgct 2580
ctggagaagg aagtggccgc tctggaaaag gaagtggcag ccctggagaa gggaggcggc 2640
gataagacac acacttgccc tccttgtcca gctccagaag cagcaggagg acctagcgtg 2700
ttcctgttcc ctcccaagcc taaggacacc ctgatgatca gccggacccc agaagtgact 2760
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaagac cccgaggtca agttcaattg gtacgtggac 2820
ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag cccagggagg agcagtacaa cagcacctac 2880
agggtggtgt ccgtgctgac agtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 2940
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgccagcc cctatcgaga agaccatcag caaggccaag 3000
ggccagccta gagaacctca ggtgtacacc ctgcccccta gcagagagga gatgaccaag 3060
aaccaggtgt ccctgtcttg cgccgtgaag ggcttctacc ctagcgacat cgccgtggag 3120
tgggaatcta acggtcagcc agagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggatagc 3180
gacggcagct tcttcctggt gtccaagctg accgtggaca aaagccgctg gcagcagggc 3240
aacgtgttct cttgcagcgt gatgcacgag gccctgcata acagatacac ccagaagagc 3300
ctgagcctga gcccaggaaa gcatcatcac catcatcatt ga 3342
<210> 18
<211> 3315
<212> DNA
<213> 抗HLA-A2/E6/CD16 BTEC（DART-Fc）的编码基因
<400> 18
atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60
tcctacgttc tcactcagcc cagtagtgtc tcagttgctc cagggcaaac ggccacgatt 120
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gacgaagcag actactattg ccaggtgtgg gataactaca gcgtactgtt cggaggcggg 360
acgaaactta cagtcttggg aggaggaagc ggaggaggag gacctggcac cagtctccta 420
tgctgggtgg tcctgggttt cctagggaca gatcacacag gtgctggagt ctcccagtct 480
cccaggtaca aagtcacaaa gaggggacag gatgtagctc tcaggtgtga tccaatttcg 540
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tacttcaatt atgaagccca acaagacaaa tcagggctgc ccaatgatcg gttctctgca 660
gagaggcctg agggatccat ctccactctg acgatccagc gcacagagca gcgggactcg 720
gccatgtatc gctgtgccag cagctcccag acaggggccc gcacagatac gcagtatttt 780
ggcccaggca cccggctgac agtgctcgct agcaccaagg gcaaggtggc agcttgcaag 840
gagaaggtgg ccgctctgaa ggagaaagtg gccgctctga aggagaaagt ggccgccctg 900
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ggaggaccta gcgtgttcct gttccctccc aagcctaagg acaccctgat gatcagccgg 1020
accccagaag tgacttgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aagaccccga ggtcaagttc 1080
aattggtacg tggacggagt ggaggtgcac aacgctaaga ccaagcccag ggaggagcag 1140
tacaacagca cctacagggt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1200
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc cagcccctat cgagaagacc 1260
atcagcaagg ccaagggcca gcctagagaa cctcaggtgt acaccctgcc ccctagcaga 1320
gaggagatga ccaagaacca ggtctccctc tggtgcctgg tgaagggctt ctaccctagc 1380
gacatcgccg tggagtggga atctaacggt cagccagaga acaactacaa gaccaccccc 1440
ccagtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaaaagc 1500
cgctggcagc agggcaacgt gttctcttgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1560
tacacccaga agagcctgag cctgagccca ggaaagagaa gaaagagagg cagcggcgag 1620
ggaagaggat ctctgctgac ttgcggcgac gtggaagaga atcccggccc tatggagacc 1680
gacacactcc tcctctgggt gctgctcctc tgggtgccag gatctacagg cgcccttgaa 1740
catctgttga taatactgtg gatgcaactt acctgggtat ctggtcagca attgaaccag 1800
tctccacagt ccatgtttat ccaagaaggg gaggacgtgt ccatgaattg tacaagctcc 1860
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atagccctct ataaggcggg cgaactgaca tccaatggaa gactcacagc ccaattcgga 1980
attacccgga aggattcttt cctcaacatc tccgcgagta ttccatctga tgtaggaata 2040
tacttctgtg cagggcatcc gtctagcaac agtggatatg ccctcaattt tggaaagggc 2100
acctccctgc tggttacccc aggcggcgga agcggaggag gaggacaagt ccagcttgtg 2160
cagtcaggtg ctgaggttaa aaaaccagga gaaagtctga aggtatcatg taaggcctca 2220
ggttatacgt ttacttcata ttacatgcac tgggtgcgac aggctcctgg tcaggggttg 2280
gagtggatgg gaatcatcaa tccatccggt ggtagcacca gctacgcaca aaagtttcag 2340
ggtcgcgtga caatgacaag agacacgtcc acgtccacgg tctacatgga attgtcatcc 2400
ctgagatcag aggacaccgc cgtatattat tgtgcacgcg gcagtgctta ctactacgat 2460
ttcgcagatt attgggggca ggggactttg gttacagtct cctccgccag caccaaaggc 2520
gaagtggcag cttgcgagaa ggaagtggcc gctctggaga aggaagtggc cgctctggaa 2580
aaggaagtgg cagccctgga gaagggaggc ggcgataaga cacacacttg ccctccttgt 2640
ccagctccag aagcagcagg aggacctagc gtgttcctgt tccctcccaa gcctaaggac 2700
accctgatga tcagccggac cccagaagtg acttgcgtgg tggtggacgt gtcccacgaa 2760
gaccccgagg tcaagttcaa ttggtacgtg gacggagtgg aggtgcacaa cgctaagacc 2820
aagcccaggg aggagcagta caacagcacc tacagggtgg tgtccgtgct gacagtgctg 2880
caccaggatt ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcca 2940
gcccctatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc ctagagaacc tcaggtgtac 3000
accctgcccc ctagcagaga ggagatgacc aagaaccagg tgtccctgtc ttgcgccgtg 3060
aagggcttct accctagcga catcgccgtg gagtgggaat ctaacggtca gccagagaac 3120
aactacaaga ccaccccccc cgtgctggat agcgacggca gcttcttcct ggtgtccaag 3180
ctgaccgtgg acaaaagccg ctggcagcag ggcaacgtgt tctcttgcag cgtgatgcac 3240
gaggccctgc ataacagata cacccagaag agcctgagcc tgagcccagg aaagcatcat 3300
caccatcatc attga 3315

Claims (10)

1.一种表达HPV阳性靶细胞与效应细胞桥接器(Bridge between target cell(HPV-positive cell)and effector cell，HPV-BTEC)的重组基因载体，其特征在于，所述桥接器包含：与靶细胞作用靶点特异性结合的部分A，和与效应细胞作用靶点特异性结合的部分B；
优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体；
再优选的，所述桥接器选自蛋白或多肽；更优选的，所述桥接器选自双特异性抗体；
更优选的，所述部分A和所述部分B分别选自蛋白分子或多肽分子；特别优选的，所述部分A和部分B分别选自Fab、Fab’、单链抗体(scFv)、单域抗体(VHH)、单链T细胞受体(scTCR)和其它。
2.如权利要求1所述的重组基因载体，所述靶细胞选自HPV感染细胞、HPV整合癌细胞或其它；所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它；
优选的，所述部分A特异性结合的作用靶点选自：HPV病毒的E6蛋白与MHC-I的复合物，或E7蛋白与MHC-I的复合物；更优选的，所述复合物选自HLA-A2/E6或HLA-A2/E7；优选的，所述部分B特异性结合的作用靶点选自：CD3、CD16、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD56、NKG2D、NCR或其它。
3.如权利要求1或2所述的重组基因载体，所述部分A选自单链T细胞受体(scTCR)，其包含：β链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，和α链可变区，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示；
更优选的，所述部分B选自单链抗体(scFv)，(1)其包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述部分B特异性结合的作用靶点选自CD3；或者(2)其包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述部分B特异性结合的作用靶点选自CD16。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组基因载体，所述重组基因载体包含所述桥接器的编码基因；
优选的，所述重组基因载体包含：部分A的编码基因，和/或包含部分B的编码基因；
更优选的，部分A选自单链T细胞受体(scTCR)，其编码基因包含：β链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和/或α链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO：4所示；
更优选的，部分B选自单链抗体(scFv)，(1)其编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示；或者(2)其编码基因包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；
特别优选的，所述重组基因载体包含所述桥接器的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：13-18中任一项所示。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体所表达的桥接器。
6.如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体的制备方法，具体步骤包括：
(1)从现有技术中分别获取HPV特异性T细胞受体样抗体(TCR-L)以及CD3抗体、CD16抗体的重链可变区(VH)序列、轻链可变区(VL)序列；
(2)根据上述(1)中VH、VL序列设计成多种组合形式的桥接器，并构建表达所述桥接器的重组基因载体；
任选的，
(3)在体内外鉴定所述桥接器的表达水平，并检测表达产物介导效应细胞对靶细胞的杀伤效果。
7.如权利要求6所述的制备方法，所述HPV特异性T细胞受体样抗体(TCR-L)选自抗HPVE6蛋白与MHC-I的复合物或抗HPV E7蛋白与MHC-I的复合物的TCR；
优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体；
再优选的，所述桥接器选自蛋白或多肽；更优选的，所述桥接器选自双特异性抗体；
优选的，所述靶细胞选自HPV感染细胞、HPV整合癌细胞或其它；优选的，所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体，或由权利要求6或7所述的制备方法所得到的重组基因载体；
优选的，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.一种药物组合物，其包含如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体，或如权利要求5所述的桥接器，或由权利要求6或7所述的制备方法所得到的重组基因载体，以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体，如权利要求5所述的桥接器，如权利要求8所述的宿主细胞，或如权利要求9所述的药物组合物在制备用于HPV感染或HPV相关癌症的药物中的用途；
优选的，所述HPV相关癌症选自***。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021042947A1 (zh) * 2019-09-03 2021-03-11 深圳新诺微环生物科技有限公司 微环dna疫苗设计及应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978226A (zh) * 2011-09-05 2013-03-20 中国科学院深圳先进技术研究院 微环dna基因载体组合物及其制备方法和应用
CN104342453A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 深圳先进技术研究院 含基因工程抗体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
CN104561069A (zh) * 2013-10-23 2015-04-29 深圳先进技术研究院 含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
CN104587490A (zh) * 2014-09-25 2015-05-06 中国人民解放军第四五八医院 治疗性hbv微环dna疫苗及其制备方法
CN105316314A (zh) * 2014-07-29 2016-02-10 深圳先进技术研究院 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用
CN106349391A (zh) * 2015-07-17 2017-01-25 中国科学院深圳先进技术研究院 Hbv特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环dna及应用
US20170158739A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-08 The Government of the United States of America, as Represented by the Secretary, Department of Homel Minicircle dna vector vaccine platform for foot-and-mouth disease and methods thereof
CN106810610A (zh) * 2015-11-30 2017-06-09 中国科学院深圳先进技术研究院 抗EpCAM和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978226A (zh) * 2011-09-05 2013-03-20 中国科学院深圳先进技术研究院 微环dna基因载体组合物及其制备方法和应用
CN104342453A (zh) * 2013-08-06 2015-02-11 深圳先进技术研究院 含基因工程抗体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
CN104561069A (zh) * 2013-10-23 2015-04-29 深圳先进技术研究院 含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用
CN105316314A (zh) * 2014-07-29 2016-02-10 深圳先进技术研究院 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用
CN104587490A (zh) * 2014-09-25 2015-05-06 中国人民解放军第四五八医院 治疗性hbv微环dna疫苗及其制备方法
CN106349391A (zh) * 2015-07-17 2017-01-25 中国科学院深圳先进技术研究院 Hbv特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环dna及应用
CN106810610A (zh) * 2015-11-30 2017-06-09 中国科学院深圳先进技术研究院 抗EpCAM和CD3特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用
US20170158739A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-08 The Government of the United States of America, as Represented by the Secretary, Department of Homel Minicircle dna vector vaccine platform for foot-and-mouth disease and methods thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GASPAR, V ET AL: "Minicircle DNA vectors for gene therapy: advances and applications", 《EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021042947A1 (zh) * 2019-09-03 2021-03-11 深圳新诺微环生物科技有限公司 微环dna疫苗设计及应用

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