CN106317136A - 一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其解决了现有方法过于复杂、成本高且效果不理想的技术问题，其包括如下步骤：将ɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤，除去菌体，得滤液；将滤液调pH至酸性，然后将溶液通过中等极性的大孔吸附树脂，收集流出液；将流出液过低极性大孔吸附树脂，之后用水冲洗柱子，再用乙醇溶液洗脱，得洗脱液；将洗脱液经真空干燥浓缩至结晶析出时，放置，ɑ-熊果苷以结晶形式析出；将结晶用有机溶剂悬起，过滤，并用有机溶剂洗涤，即可得制成品。本发明可用于从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷。

Description

一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体地说是一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法。
背景技术
熊果苷是一种氢醌苷类化合物，是酪氨酸酶的抑制剂，能阻断多巴及多巴醌的合成，从而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用。天然提取物中含的是β-熊果苷，但ɑ-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上，有效性和安全性高于β-熊果苷。ɑ-熊果苷化学合成比较难，易形成ɑ-熊果苷和β-熊果苷的混合物，分离难度大。因此越来越多的研究倾向于用微生物法或酶法合成ɑ-熊果苷。
公开号为CN1635139A的中国发明专利申请公开了一种发酵生产ɑ-熊果苷的方法，利用野油菜黄单胞菌，以氢醌和蔗糖为底物进行发酵，发酵液分别通过弱极性大孔吸附树脂AB-8和极性大孔吸附树脂S-8柱进行分离，然后通过真空干燥获得纯品。
公开号为CN102329838A的中国发明专利申请公开了一种以黑曲霉菌株转化生产ɑ-熊果苷的方法，以氢醌和麦芽糖作为底物发酵，发酵液经Amberlite XAD-16或D101大孔吸附树脂提取，得到ɑ-熊果苷。
以上两件专利申请对于分离纯化过程都是简单提及，最终得到的产品无论从色泽还是纯度上都有待于提高。
另外，生物法都是采用氢醌做底物，发酵结束后都会有少量的氢醌残余，而氢醌是一种已知的皮肤致敏物，禁用于护肤品中，因此在ɑ-熊果苷的分离纯化过程中若不能有效除去氢醌，会直接影响产品质量甚至导致产品不合格。
公开号为CN103483401A的中国发明专利申请提出了一种从ɑ-熊果苷发酵液中除去氢醌的方法，用磷酸三丁酯进行多次萃取与反萃取，并需引入无机盐。该方法使得熊果苷纯化工艺更加复杂化。
发明内容
本发明就是为了解决现有方法过于复杂、成本高且效果不理想的技术问题，提供一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其可以提高ɑ-熊果苷的分离效率和产品质量。
本发明提供一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征是包括如下步骤：(1)将ɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤，除去菌体，得滤液；(2)将步骤(1)中得到的滤液调pH至酸性，然后将溶液通过中等极性的大孔吸附树脂，收集流出液；(3)将步骤(2)中得到的流出液过低极性大孔吸附树脂，之后用水冲洗柱子，再用乙醇溶液洗脱，得洗脱液；(4)将步骤(3)中得到的洗脱液经真空干燥浓缩至结晶析出时，放置，ɑ-熊果苷以结晶形式析出；(5)将步骤(4)中形成的ɑ-熊果苷结晶用有机溶剂悬起，过滤，并用有机溶剂洗涤，即可得到白色ɑ-熊果苷产品。
优选地，步骤(1)中的中空纤维膜为截留分子量为6000-60000的中空纤维膜。
优选地，步骤(2)中，调pH至酸性是指调pH至3-5。
优选地，步骤(2)中，中等极性的大孔吸附树脂，指Amberlite XAD-6、XAD-7、XAD-7HP或XAD-8树脂。
优选地，步骤(3)中的低极性的大孔吸附树脂，指H103、H107或H1020树脂，所述乙醇溶液的体积百分比浓度为10％-15％。
优选地，步骤(5)中的有机溶剂为丙酮。
本发明中α-熊果苷的分离纯化过程相对简单，能够彻底除去氢醌，所得α-熊果苷产品色泽度好(参见图 1)，纯度高。用HPLC外标法检测所得熊果苷的纯度达99％以上(参见图 2)，HPLC检测条件为：柱子：C18柱(4.6*150mm，3.5um)；流动相：90％含1/1000甲酸的水，10％甲醇；流速：0.3mL/min；柱温：45℃。
通过本发明所述方法得到的α-熊果苷产品经核磁图谱验证确实为α-熊果苷(参见图 3A和图 3B)，α-熊果苷5.34ppm处偶合常数J＝3.6Hz， 区别于β-熊果苷此处的偶合常数J＝7.8，且从核磁图谱上未看到杂质峰。
附图说明
图 1为本发明所得熊果苷产品性状照片；
图 2为本发明所得熊果苷的HPLC图谱；
图 3A为所得熊果苷的核磁图谱氢谱；
图 3B为所得熊果苷的核磁图谱碳谱。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。本发明实施例中所用到的试剂均从公开市场上购买。本发明中ɑ-熊果苷发酵液是指用氢醌做底物微生物发酵制备ɑ-熊果苷的发酵产物。
实施例1
将4Lɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤***(膜的截留分子量为60000)除去菌体，过滤后的清液用1.0mol/L的盐酸调pH 3.0,然后通过Amberlite大孔吸附树脂XAD-7(1.5升)，流出液继续通过大孔吸附树脂H103(1.5升)，用3倍柱体积的水冲洗H103树脂柱，后用4倍柱体积的体积百分比浓度10％的乙醇溶液洗脱，收集含ɑ-熊果苷的洗脱液，真空浓缩至大部分结晶析出时，于4℃环境中放置1小时，此时更多的晶体析出，用事先预冷的丙酮将结晶悬起，过滤，并用少量丙酮洗涤得ɑ-熊果苷纯品。
实施例2
将4Lɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤***(膜的截留分子量为30000)除去菌体，过滤后的清液用1.0mol/L的盐酸调pH 4.0,然后通过Amberlite大孔吸附树脂XAD-8(1.5升)，流出液继续通过大孔吸附树脂H103(1.5升)，用3倍柱体积的水冲洗H103树脂柱，后用4倍柱体积的体积百分比浓度10％的乙醇洗脱，收集含ɑ-熊果苷的洗脱液，真空浓 缩至大部分结晶析出时，于4℃环境中放置1小时，此时更多的晶体析出，用事先预冷的丙酮将结晶悬起，过滤，并用少量丙酮洗涤得ɑ-熊果苷纯品。
实施例3
将4Lɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤***(膜的截留分子量为60000)除去菌体，过滤后的清液用1.0mol/L的盐酸调pH 5,然后通过Amberlite大孔吸附树脂XAD-7(1.5升)，流出液继续通过大孔吸附树脂H107(1.5升)，用3倍柱体积的水冲洗H107树脂柱，后用4倍柱体积的体积百分比浓度15％的乙醇洗脱，收集含ɑ-熊果苷的洗脱液，真空浓缩至大部分结晶析出时，于4℃环境中放置1小时，此时更多的晶体析出，用事先预冷的丙酮将结晶悬起，过滤，并用少量丙酮洗涤得ɑ-熊果苷纯品。
实施例4
将4Lɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤***(膜的截留分子量为6000)除去菌体，过滤后的清液用1.0mol/L的盐酸调pH 4.0,然后通过Amberlite大孔吸附树脂XAD-6(1.5升)，流出液继续通过大孔吸附树脂H103(1.5升)，用3倍柱体积的水冲洗H103树脂柱，后用4倍柱体积的体积百分比浓度15％的乙醇洗脱，收集含ɑ-熊果苷的洗脱液，真空浓缩至大部分结晶析出时，于4℃环境中放置1小时，此时更多的晶体析出，用事先预冷的丙酮将结晶悬起，过滤，并用少量丙酮洗涤得ɑ-熊果苷纯品。

Claims (6)

1.一种从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将ɑ-熊果苷发酵液通过中空纤维膜过滤，除去菌体，得滤液；
（2）将步骤（1）中得到的滤液调pH至酸性，然后将溶液通过中等极性的大孔吸附树脂，收集流出液；
（3）将步骤（2）中得到的流出液过低极性大孔吸附树脂，之后用水冲洗柱子，再用乙醇溶液洗脱，得洗脱液；
（4）将步骤（3）中得到的洗脱液经真空干燥浓缩至结晶析出时，放置，ɑ-熊果苷以结晶形式析出；
（5）将步骤（4）中形成的ɑ-熊果苷结晶用有机溶剂悬起，过滤，并用有机溶剂洗涤，即可得到ɑ-熊果苷产品。
2.根据权利要求1所述的从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征在于所述步骤（1）中的中空纤维膜为截留分子量为6000-60000的中空纤维膜。
3.根据权利要求1所述的从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征在于所述步骤（2）中，调pH至酸性是指调pH至3-5。
4.根据权利要求1所述的从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征在于所述步骤（2）中，中等极性的大孔吸附树脂，指AmberliteXAD-6、XAD-7、XAD-7HP或XAD-8树脂。
5.根据权利要求1所述的从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征在于所述步骤（3）中的低极性的大孔吸附树脂，指H103、H107或H1020树脂，所述乙醇溶液的体积百分比浓度为10%-15%。
6.根据权利要求1所述的从ɑ-熊果苷发酵液中分离ɑ-熊果苷的方法，其特征在于所述步骤（5）中的有机溶剂为丙酮。
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