CN104711300B - 淫羊藿素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种淫羊藿素的制备方法，该方法包括将淫羊藿提取物在果胶酶的作用下进行酶解反应，得到淫羊藿素。通过本发明的方法得到的淫羊藿素相对于总黄酮的收率可以达到20％以上，纯度超过99％。

Description

淫羊藿素的制备方法

技术领域

本发明涉及淫羊藿素的制备方法，属于医药领域。

背景技术

阿可拉定，又名淫羊藿素、淫羊藿苷元，是从中药材淫羊藿中提取分离得到的主要活性成分淫羊藿提取物经酶转化得到的新的有效单体，其结构式如下式(I)所示：

该化合物的制备方法公开于CN101302548B。该方法以淫羊藿苷为原料，以β-葡萄糖苷酶进行水解，水解产物离心得到的沉淀用丙酮溶解，过滤得到上清液。再将该上清液用水进行重结晶，得到淫羊藿素纯品。

在申请号为201010517793.6的中国专利中公开了一种采用柚苷酶从淫羊藿苷中获得淫羊藿苷元的方法，该方法将淫羊藿苷标准品溶于乙醇溶剂中，在40-70℃时加入了柚苷酶进行酶解，从而得到了淫羊藿 苷元。

在申请号为200910184282.4的中国专利中公开了一种淫羊藿苷元的制备方法，该方法以淫羊藿为原料，通过甲醇提取，蜗牛酶水解等步骤得到淫羊藿苷元粗品。然而，以上淫羊藿素制备方法的酶解法都存在酶解转化率低，酶解产物杂质多的缺陷。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种淫羊藿素的制备方法，通过该方法制备得到的淫羊藿素纯度高。

本发明一方面提供了一种淫羊藿素的制备方法，该方法包括将淫羊藿提取物在果胶酶的作用下进行酶解反应，得到淫羊藿素。

优选地，所述的果胶酶包含聚半乳糖醛酸酶和a-N-***呋喃糖苷酶。

优选地，所述的淫羊藿提取物中的淫羊藿苷质量含量为5％-100％。

优选地，所述的淫羊藿提取物通过以下方法制备得到：以淫羊藿为原料，通过乙醇溶液提取，得到淫羊藿提取物。

优选地，将酶解反应得到的酶解产物，溶解于弱极性有机溶剂中，过滤，收集滤液，向滤液中加入极性溶剂，结晶。

优选地，所述的弱极性有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷和甲基叔丁基醚中的一种或几种，并且所述的极性溶剂为甲醇、乙醇和水中的一种或几种。

最优选地，所述的弱极性有机溶剂为丙酮，所述的极性溶剂为水。

优选地，所述的酶解反应包括以下步骤：

a.将酶解反应得到的酶解产物离心；

b.将离心得到的沉淀中加入丙酮；

c.再将丙酮过滤得到的滤液中加入蒸馏水，进行回流；

d.将回流得到的液体在室温下结晶。

优选地，步骤c中的滤液和蒸馏水的体积比为1-5：1，并且所述的回流温度为50-100℃。

优选地，淫羊藿提取物液体浓缩，接着通过大孔树脂柱吸附，再用体积浓度为30％-100％的乙醇水溶液进行洗脱，得到用于酶解反应的淫羊藿提取物。

优选地，用于酶解反应的淫羊藿提取物中黄酮的质量含量为20％-100％。

优选地，所述淫羊藿的质量和乙醇溶液的体积比为1千克：2-50升，并且提取温度为30-100℃。

优选地，所述的乙醇溶液为体积比为20-90％的乙醇水溶液。

优选地，所述酶解反应的条件为：将淫羊藿提取物和磷酸缓冲液制成pH值为4.0-6.0的底物溶液，向底物溶液中加入果胶酶，果胶酶的质量为淫羊藿提取物质量的5-30倍，酶解温度为45-55℃。

更优选地，果胶酶的质量为淫羊藿提取物质量的10-20倍，底物溶液的pH值为4.5-5.5，酶解温度为48-50℃。

最优选地，所述果胶酶的质量为淫羊藿提取物质量的15倍，底物溶液中含有其总体积的10-15％的乙醇。

优选地，所述底物溶液的pH值是通过磷酸缓冲液进行调节的。

更优选地，所述的磷酸缓冲液为磷酸-柠檬酸缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸 二氢钾缓冲液。

本发明的有益效果在于：本发明方法制备得到的淫羊藿素纯度非常高，含量大于99％，通过果胶酶转化的淫羊藿素，相对于淫羊藿提取物，淫羊藿素的收率可以达到20％，转化后的副产物少，容易去除。

附图说明

图1表示药材原料中的总黄酮，和通过实施例1的步骤1、2和3得到的总黄酮。

图2表示纯化后的淫羊藿素的高效液相色谱图。

图3表示酶解反应进行48小时的高效液相色谱图。

图4表示酶解反应进行70小时的高效液相色谱图。

具体实施方式

除非另外说明，本文中的术语“酶解反应”指的是在酶作用下的水解反应。

除非另外说明，本文中的术语“淫羊藿苷”指的是淫羊藿干燥茎叶中的提取物，为单一成分，具有如下分子结构：

除非另外说明，本文中的术语“总黄酮”指的是通过乙醇提取法得到的淫羊藿提取物中的主要成分，总黄酮包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿次苷，宝霍苷等。在中国药典2010年版第一部306-308页记录了总黄酮的计算方法，按照紫外-可见分光光度法，在270nm波长处的吸光度可以计算总黄酮的含量。

除非另外说明，本文中的术语“果胶酶”购自帝斯曼公司的商标为RAPIDASE果胶酶作为酶解反应用酶，产品编号为984。

实施例1

淫羊藿提取物的制备

步骤1：以除茎的淫羊藿叶300g为原料，将其揉碎，用体积浓度为70％的600L乙醇水溶液进行提取，在75℃下共提取3次。回收乙醇提取液至无醇味，接着将该浓缩液离心，所得滤液通过大孔树脂柱吸附。

步骤2：用体积浓度为20％的乙醇水溶液洗涤步骤1中的大孔树脂柱，洗脱液弃去。

步骤3：用体积浓度为80％的乙醇水溶液进行洗涤步骤2中的大孔树脂柱，收集此时的洗脱液。

将以上三个步骤得到的洗脱液浓缩，得到淫羊藿提取物共计46g。以上三步法得到的淫羊藿提取物通过高效液相色谱检测其中的黄酮成分，见图1下半图。

本实施例中的大孔树脂购自河北宝恩吸附材料有限公司，型号为D101。

通过高效液相色谱检测药材中的黄酮成分，见图1上半图。

高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱：Agela-C18柱；流动相：乙腈-水(其中含体积分数为0.0125％的三氟乙酸)，洗脱梯度见下表1，洗脱时间60min，流速：1.0mL／min，柱温：35℃。紫外检测器检测波长分别为254、272、320nm。

表1溶剂梯度洗脱表

结果显示：除在3分钟时出现的峰为溶剂峰以外，在22分钟、24分钟、46分钟、以及52分钟的出峰均为黄酮成分的峰，通过以上方法检测的药材的总黄酮图谱，与淫羊藿提取物中总黄酮的图谱(HPLC-UV)对比可以看出，大孔树脂纯化后，淫羊藿提取物中总黄酮的含量显著增加，其中总黄酮相对于淫羊藿 原材料的收率达到5-15％。

酶解反应制备淫羊藿素

按照以上步骤，多次提取淫羊藿药材，得到淫羊藿提取物55克、1mol／L的pH5.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液0.15L、乙醇0.22L、660克酶溶解于水中制成的0.7L，pH值为5.2的酶溶液于5L反应器中，反应温度在48℃的条件下进行酶解，具体的条件如表2：

表2酶解条件

淫羊藿提取物	酶	乙醇	水	缓冲液
					55g	660g	0.22L	1.1L	0.15L(1M)

选择帝斯曼公司的商标为RAPIDASE果胶酶作为酶解反应用酶，产品编号为984。

淫羊藿素的纯化

70小时反应结束后，反应液进行离心，去除上清液，沉淀用300mL丙酮溶解，过滤，得到滤液160mL，再在滤液中加入约150mL蒸馏水，75℃回流溶解，室温放置析晶。结晶24小时后，过滤得到结晶，烘干，称重得11.5g。析出晶体为淫羊藿素。淫羊藿素相对于淫羊藿提取物的收率为20.9％，通过高效液相色谱检验淫羊藿素的纯度达到99.5％，见图2。

实施例2

商购淫羊藿提取物酶解法制备淫羊藿素

本实施例中的淫羊藿提取物购自陕西嘉禾植物化工有限公司，商品名称为“淫羊 藿提取物”，其中含有质量分数为90％的淫羊藿苷。

步骤一：酶解法制备淫羊藿素

将商购的80g淫羊藿提取物，其中含有质量分数为90％的淫羊藿苷，分散于浓度为1mol／L的pH5.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液2.0L中，加入乙醇0.6L、RAPIDASE果胶酶1400g，共计1.4L于5L反应器中，反应温度在50℃的条件下进行酶解，具体的条件如表3：

表3酶解条件

通过HPLC检测，反应体系转化70小时，淫羊藿苷转化为淫羊藿素的转化率达到90％。

步骤二：淫羊藿素的纯化

70小时反应结束后，反应液进行离心，去上清，沉淀用2L丙酮溶解，过滤，再在滤液中加入约1L蒸馏水，75℃回流溶解，室温放置析晶。结晶24小时后，过滤得到结晶，烘干，称重得32.9g。析出晶体为淫羊藿素。淫羊藿素相对于90％淫羊藿提取物的收率为41.1％，通过高效液相色谱检验淫羊藿素的纯度达到99.0％。

实施例3

酶转化总黄酮制备淫羊藿素的条件优化

1、pH值、反应温度、底物浓度的考察

选择1mg商购淫羊藿提取物或者按照实施例1方法得到的淫羊藿提取物作 为底物，在200μL缓冲液，15mg酶配制成的7μL果胶酶和250μL水的条件下，分别改变pH值、温度和底物浓度，反应24小时，反应结束后，水饱和正丁醇萃取，寻找最适合的反应条件。通过薄层色谱分析，确定最适合的反应条件。薄层色谱分析条件(展开剂为三氯甲烷：甲醇：水=76：26：6的下层溶液；显色剂为10％硫酸乙醇溶液)。

表4pH值的变化范围

表5反应温度的变化范围

反应条件的进一步考察

为了进一步确定底物淫羊藿提取物浓度和乙醇浓度，以15mg／ml底物浓度左右两侧的10mg／mL和20mg／mL，乙醇体积浓度(10％，15％)以及不同类型的离子缓冲液，进行以下实验：

表6底物浓度、缓冲液对转化率的影响

结果表明：当乙醇体积浓度为15％时，酶已部分失活，因此乙醇体积浓度为10％最合适；当底物淫羊藿提取物浓度为20mg／mL时，转化不完全，而当底物浓度为15mg／mL时，转化较完全，并且醋酸缓冲液的转化效果稍逊于磷酸缓冲液和磷酸-柠檬酸缓冲液。

2.总结

由以上结果可见，利用此果胶酶进行淫羊藿总黄酮大量转化时，选取的底物浓度可以为15mg／mL，乙醇浓度为10％，缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液或者磷酸-柠檬酸缓冲液，pH4.5，温度控制在50-55℃之间，收率可以达到20％以上，得到淫羊藿素的纯度超过99％。

Claims (14)

1.一种淫羊藿素的制备方法，该方法包括将淫羊藿提取物在果胶酶的作用下进行酶解反应，得到淫羊藿素，所述的果胶酶包含聚半乳糖醛酸酶和α-N-***呋喃糖苷酶，所述的酶解反应条件为：将淫羊藿提取物和磷酸缓冲液制成pH值为4.0-6.0的底物溶液，向底物溶液中加入果胶酶，果胶酶的质量为淫羊藿提取物质量的5-30倍，酶解温度为45-55℃，所述的淫羊藿提取物是通过以淫羊藿为原料，通过乙醇溶液提取得到的，所述的淫羊藿提取物中的淫羊藿苷质量含量为5％-100％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将酶解反应得到的酶解产物，溶解于弱极性有机溶剂中，过滤，收集滤液，向滤液中加入极性溶剂，结晶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的弱极性有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷和甲基叔丁基醚中的一种或几种，并且所述的极性溶剂为甲醇、乙醇和水中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的弱极性有机溶剂为丙酮，所述的极性溶剂为水。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a.将酶解反应得到的酶解产物离心；

b.将离心得到的沉淀中加入丙酮；

c.再将丙酮过滤得到的滤液中加入蒸馏水，进行回流；

d.将回流得到的液体在室温下结晶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤c中的滤液和蒸馏水的体积比为1-5:1，并且所述的回流温度为50-100℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，淫羊藿提取物液体浓缩，接着通过大孔树脂吸附，再用体积浓度为30％-100％的乙醇水溶液进行洗脱，得到用于酶解反应的淫羊藿提取物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于酶解反应的淫羊藿提取物中总黄酮的质量含量为20％-100％。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淫羊藿和乙醇溶液的体积比为1千克：2-50升，并且提取温度为30-100℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的乙醇溶液为体积比为20-90％的乙醇水溶液。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，果胶酶的质量为淫羊藿提取物质量的10-20倍，底物溶液的pH值为4.5-5.5，酶解温度为48-50℃。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述果胶酶的质量为淫羊藿提取物质量的15倍，底物溶液中含有其总体积的10-15％的乙醇。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，底物溶液的pH值是通过磷酸缓冲液进行调节的。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲液为磷酸-柠檬酸缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。