一种提高胡萝卜中β-胡萝卜素含量的复合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌剂,尤其涉及一种能显著提高胡萝卜中β-胡萝卜素含量的菌剂,属于微生物技术领域。
背景技术
随着经济的发展和社会的进步以及生活节奏的不断加快,现在人们在工作、生活各方面的压力都比较大,在正常锻炼和保健的同时,越来越多的消费者也在日常的生活中适当补充营养。
β-胡萝卜素是类胡萝卜素(carotenoids)之一,也是橘黄色脂溶性化合物,它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素。许多天然食物中例如:绿色蔬菜、甘薯、胡萝卜、菠菜、木瓜、芒果等,皆存有丰富的β-胡萝卜素,但是存在最多的还是胡萝卜中。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂,具有非常强的抗氧化性,可以预防、延缓和治疗某些疾病,尤其是癌症,同时也能提高机体的免疫功能。同时,β-胡萝卜素具有解毒作用,是维护人体健康不可缺少的营养素,在预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能,并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病,目前被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健品行业,是***粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类优秀有营养的食品添加剂,全世界已有52个国家、地区批准使用,国际上需求量在1000吨以上,年增长率达10%~15%,具有广阔的市场前景。
目前,生产β-胡萝卜素的方法主要有植物提取法,化学合成法,微生物发酵法。天然胡萝卜素具有很好的抗染色体畸变,防癌作用以及较强的生理活性,而市场上的胡萝卜素产品大多数为化学合成法制备的合成品,因此生理活性较低。植物提取法是指从胡萝卜等富含β-胡萝卜素的植物中提取β-胡萝卜素,且胡萝卜中提取β-胡萝卜素已经是主流趋势。但受胡萝卜中β-胡萝卜素含量的限制,当前天然胡萝卜素的价格是化学品的两倍,成本相对较高。如果能够提高胡萝卜中β-胡萝卜素的含量,则可以降低成本,提高产量和效益。
发明内容
鉴于目前胡萝卜中β-胡萝卜素含量普遍较低的问题,本发明的目的在于提供了一种提高胡萝卜中β-胡萝卜素含量的复合菌剂及其应用。
为了实现本发明的目的,发明人通过大量试验研究并不懈努力,最终获得了如下技术方案:
一种复合菌剂,该菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang组成。
需要说明的是,本发明所采用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8,分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中,具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力,能够存活于动物肠道内;该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为2012年06月28日,保藏号为CGMCC No.6312。另外,本发明所采用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang,是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株;该菌株于2006年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号CGMCC No.1697。
优选地,如上所述的复合菌剂,该菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumP-8)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang按1∶(0.5~3)的活菌数量比组成。
本发明人在筛选抑制胡萝卜病原菌的拮抗菌时意外发现,含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的复合菌液对病原菌没有明显抑制作用,但对胡萝卜的生长代谢有明显的影响,尤其可以提高胡萝卜中β-胡萝卜素的含量。基于此发现,本发明人通过接种于MRS培养液中培养发酵,将这两种菌制备成了复合菌剂。因此,本发明提供了上述复合菌剂的应用,即:上述的复合菌剂在提高胡萝卜中β-胡萝卜素含量中的应用。以及,上述的复合菌剂在制备胡萝卜生长液中的应用。
本发明涉及的复合菌剂可以采用如下方法制备:
(1)将所述干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)Zhang和植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)P-8接种于MRS培养液,在37℃条件下培养12-24小时,经离心洗涤后,在菌体沉淀上加入8%-12%灭菌脱脂牛乳液,并调整其菌数为2.0×1010cfu/mL,混匀后倾注培养;
(2)将步骤(1)得到的菌株培养物接种于MRS培养液,在37℃条件下培养12-24小时,再接种8%-12%的灭菌脱脂牛乳液,在37℃条件下培养6-10小时,调整其菌数为3×109cfu/mL,pH值为4.4~4.6。
与现有技术相比,本发明涉及的复合菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang组成,这两种菌对胡萝卜的生长代谢有明显的影响,尤其可以协同提高胡萝卜中β-胡萝卜素的含量,从而为天然胡萝卜素的制备提供了较为理想的原料,最终降低了β-胡萝卜素的生产成本,提高产量和效益。
附图说明
图1为标准曲线,横坐标为β-胡萝卜素含量(μg/ml),纵坐标为吸光值。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。另外,下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P-8)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang在提高胡萝卜中β-胡萝卜素含量的试验
实验地点:莱西店埠后屯(植物乳杆菌组、干酪乳杆菌组、复合菌组和空白对照组各1.7亩)
种植管理:棚规格长115m,宽10m,每棚起垄13垄,每垄上种植萝卜2行,株距5-6cm,每棚施基肥:硫酸钾复合肥(N∶P∶K为15∶15∶15)300斤,有机肥600-700斤,后期不追肥。
实验时间:2016.04.26-2016.6.23
实验作物:胡萝卜(品种为:孟德尔808)
使用量及方法:胡萝卜播种结束之后,立即随水滴灌微生物菌剂(实验组采用的菌剂中活菌总数含量大于109cfu/mL,复合菌组中两种菌的数量比为1∶1)2升/棚,后期不在滴灌含菌水,而根据作物长势灌溉不含菌水,保证各处理灌溉量相同。
β-胡萝卜素含量测定方法(高效液相法):
样品前处理:取不同胡萝卜不同部位的组织4.0g研磨成浆,转移到100ml锥形瓶中,分别加入0.5g维生素C,30ml乙醇,10ml饱和氢氧化钾溶液,于53℃水浴中震荡皂化30min,然后用75ml石油醚反复萃取分离,提取液醚层反复用水洗至近中性(pH6.0以上),蒸馏浓缩并用氮气吹干,然后用50%三氯甲烷(液相专用)50%石油醚混合液定容至25ml,吸取1ml过0.45μm滤膜后进行HPLC测定。
色谱条件:C18色谱柱,流动相甲醇-乙腈-三氯甲烷,检测波长448nm。
标准曲线配制:称取β-胡萝卜素标准品10mg(测定时称取的量为10.8mg)然后用50%三氯甲烷和50%石油醚混合液定容100ml,相当于108μg/ml,然后稀释到72,54,36,21.6,13.5μg/ml,吸取1ml过0.45μm滤膜后进行HPLC测定。制作的标准曲线如图1所示。
计算公式:
c--从标曲查得的胡萝卜素含量,μg/ml;
25--样品定容总体积
m--样品重量
表1实施例1各处理β-胡萝卜素含量
与空白对照组比较,▲P<0.01;与植物乳杆菌组比较,★P<0.01;与干酪乳杆菌组比较,■P<0.01。
实施例2:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P-8)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang在提高胡萝卜中β-胡萝卜素含量的试验
实验地点:莱西店埠后屯,(实验组和对照组各1.7亩)
种植管理:实验组和对照组各约1.7亩,棚规格长115m,宽10m,每棚起垄13垄,每垄上种植萝卜2行,株距5-6cm,每棚施基肥:硫酸钾复合肥(N∶P∶K为15∶15∶15)300斤,有机肥600-700斤,后期不追肥。
实验时间:2016.04.26-2016.6.23
实验作物:胡萝卜(品种为:诺利红)
使用量及方法:胡萝卜播种之后,随水滴灌微生物菌剂(两种菌的数量比为1∶1,活菌总数含量大于109cfu/mL)2升/棚,后期不再滴灌含菌水,而根据作物长势灌溉不含菌水,保证各处理灌溉量相同。
β-胡萝卜素含量测定方法(高效液相法):同实施例1
表2实施例2各处理β-胡萝卜素含量
与空白对照组比较,▲P<0.01;与植物乳杆菌组比较,★P<0.01;与干酪乳杆菌组比较,■P<0.01。
由表1中检测结果可知,在胡萝卜品种“孟德尔808”上,与空白对照组相比,实验组可提高胡萝卜中β-胡萝卜素的含量,尤其是复合菌组可显著提高胡萝卜中β-胡萝卜素的含量(p<0.01);相对于空白对照,复合菌组β-胡萝卜素含量提高了112.67%。由表2中检测结果可知,在胡萝卜品种“诺利红”上,与空白对照组相比,复合菌组也显著提高了胡萝卜中β-胡萝卜素的含量(p<0.01);相对于空白对照,复合菌组β-胡萝卜素含量提高了67.63%。值得注意的是,无论是在胡萝卜品种“诺利红”上还是在胡萝卜品种“孟德尔808”上,复合菌组对β-胡萝卜素含量的提高程度相比单菌组均有显著性差异(p<0.01)。