CN107011417A

CN107011417A - 重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法

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Publication number: CN107011417A
Application number: CN201710234819.8A
Authority: CN
Inventors: 宋勤叶; 姚作俊; 郭海勇; 逯纪成; 孙泰然
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: CN107011417B

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种如SEQ ID No.2所示的基因。本发明还提供了一种如上所述的蛋白在检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用，主要是作为包被抗原使用。本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒，包括：如上所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG和底物显色液。本发明以SEQ ID No.1所示的重组蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA检测猪流行性腹泻病毒抗体，具有较好的特异性、敏感性及重复性，结果直观准确。

Description

重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是导致初生仔猪死亡的重要传染病之一。该病由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高死亡率为特征。PED于1971年首次发生于英国的生长育肥猪群，随后在欧洲其他国家以及亚洲相继发生。1976年我国广东、上海、黑龙江等地发生PED，随后该病在国内猪场呈地方流行性形式流行，并从患病猪群分离到了PEDV。2010年10月，由PEDV变异株引起的初生仔猪腹泻在我国暴发流行，迅速在全国各地传播。此次流行以7 10d龄内的哺乳仔猪受害最严重，其发病率高达100％，死亡率达50％～90％，给我国养猪生产造成了巨大经济损失。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，基因组全长约28kb，为线性单股正链RNA病毒。病毒基因组编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中S蛋白位于病毒粒子表面，是PEDV最重要的结构蛋白，由1383aa组成，包括信号肽、中和表位、跨膜区和胞浆区。S蛋白可以分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个区域，S1区位于病毒表面，可与宿主细胞上的受体结合，能诱导中和抗体的产生；S2区位于病毒内部，介导病毒与宿主细胞的融合。因此，S蛋白是PEDV感染免疫研究和疫苗设计的主要靶蛋白，S蛋白抗体水平及其变化动态是评价免疫效果和监测免疫状态的重要依据，同时也可以作为PEDV感染血清流行病学调查的重要指标。丁振江等(2014)基于重组PEDV S1蛋白建立了PEDV IgA抗体间接ELISA方法，华耀等(2016)建立了基于PEDV S蛋白的PEDVIgG间接ELISA方法。由于S1蛋白区域是诱导机体保护性免疫应答的主要区域，所以针对该区域的特异抗体水平更能够间接反映疫苗诱导的免疫保护水平和机体抗感染免疫水平。已知血清PEDV抗体与局部黏膜免疫水平具有正相关性，而检测血清IgG抗体ELISA方法的应用范围更加广泛。因此，非常有必要建立基于S1蛋白的IgG抗体ELISA检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒和检测方法，本发明提供的检测方法简便、特异性、灵敏性和稳定性强。

本发明提供了一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码如上所述的重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供的重组蛋白可作为包被抗原，利用间接ELISA法对猪流行性腹泻病毒抗体进行检测。

本发明还提供了一种如上所述的重组蛋白在检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用，主要是作为包被抗原使用。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒，包括：如上所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG和底物显色液。

其中，所述封闭液为含5％新生牛血清的PBST溶液。

本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体的检测方法，包括以下步骤：

将如上所述的重组蛋白用包被液包被后，用洗涤液洗涤，加入封闭液封闭，加入稀释的待测血清进行反应，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG再次反应后洗涤，加入底物显色液进行显色，获得检测结果。

本发明以SEQ ID No.1所示的重组蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA检测猪流行性腹泻病毒抗体，具有较好的特异性、敏感性及重复性，结果直观准确。

本发明针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白基因序列设计并合成了特异性引物，扩增了相应核苷酸序列，构建了表达该区域(S1)的原核表达质粒，在IPTG诱导下体外表达了重组S1蛋白，应用Western blot对表达蛋白进行了鉴定，并通过将蛋白免疫小鼠，证明表达的蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠产生高水平特异抗体。应用本发明提供的重组蛋白作为检测抗原，建立了基于PEDV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法，并用该方法检测了产前4周用PEDV灭活疫苗免疫母猪的初乳、分娩当天血清及其仔猪1、7、14、21、28和35日龄(d)时血清中的PEDV抗体。结果表明，建立的间接ELISA方法能够特异地检测PEDV抗体，与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒的抗血清无交叉反应，在每mL PEDV抗体阳性血清中最低可以检测到8.3μg的总蛋白，与免疫过氧化物酶单层试验检测结果的符合率为97.14％，批内和批间重复性试验的变异系数小于10％。免疫母猪初乳、分娩当天血清中的PEDV抗体阳性率为100％，初乳比血清中的平均抗体水平低；1d仔猪血清PEDV抗体阳性率为50％，平均抗体水平低，与初乳中的抗体水平接近，7d以后所有仔猪血清全部转为PEDV抗体阴性。(结论)建立的ELISA方法能够特异地检测PEDV抗体；产前用PEDV灭活疫苗给怀孕母猪免疫1次时，其所产仔猪血清中的母源特异抗体阳性率和抗体水平低，且维持时间短暂。

附图说明

图1为本发明实施例扩增得到的目的片段的电泳图；

图2是重组表达质粒pET28a-S1的PCR和酶切鉴定；

图3为重组PEDV S1蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析；

图4为重组PEDV S1蛋白表达形式的SDS-PAGE分析；

图5为重组PEDV S1蛋白免疫小鼠后的血清特异抗体；

图6为免疫母猪初乳、血清中的PEDV抗体及其所产仔猪血清中的特异抗体动态。

具体实施方式

实施例1

1 材料与方法

1.1 菌种和表达载体

E.coli DH5α和BL21感受态细胞、原核表达载体pET-28a(+)，均由河北农业大学动物传染病实验室保存。

1.2 主要试剂与抗体

TRIzol总RNA提取试剂、dNTPs、Taq DNA聚合酶、离心柱型DNA凝胶纯化回收试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录酶，为Promega公司产品；限制性核酸内切酶BamH I和Xho I，购自宝生物工程(大连)有限公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，购自北京康为试剂生物科技有限公司；蛋白定量测试盒，购自南京建成生物工程研究所。HRP-羊抗猪IgG和HRP-羊抗鼠IgG，购自北京索莱宝生物技术有限公司。猪抗PEDV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A型轮状病毒(RVA)等病毒抗体以及小鼠抗PEDV阳性和阴性血清，由河北农业大学动物传染病实验室制备和保存。

1.3 PEDV S1蛋白基因原核表达质粒的构建与鉴定

1.3.1 引物设计与合成

针对PEDV S蛋白基因，应用生物学软件Oligo6.0设计扩增S1部分片段的特异引物：

U1：5′-ACTGAATTCATGGTACTGGGCGGTTATCTA-3′，

L1：5′-ATTCTCGAGTTAGGCTAAGTGAGGATCTGA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 目的基因的PCR扩增与回收

提取PEDVRNA，反转录为cDNA后，用引物U1—L1进行PCR，扩增目的核酸片段。PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增的目的片段大小为945bp。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小与预期相符后，用离心株型DNA凝胶纯化回收试剂盒回收目的基因。

1.3.3 重组表达质粒pET28a-S1的构建与鉴定

用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ消化回收的PCR产物及原核表达载体pET28a(+)，酶切产物经电泳后，分别用离心株型DNA凝胶纯化回收试剂盒回收纯化回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接PCR产物和pET28a(+)；将连接产物pET28a-S1转化到DH5α感受态细胞，将其涂布于Kan⁺/LB平板上，37℃培养16～18h；挑取单个菌落做菌液PCR鉴定，提取菌液质粒用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切鉴定，鉴定正确的菌液送往生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.4 重组蛋白S1的诱导表达与鉴定

1.4.1 重组S1蛋白的表达

将构建的PEDV S1蛋白重组表达质粒pET28a-S1转化到E.coli BL21感受态细胞中，涂布于Kan⁺/LB固体培养基上，于37℃培养24h，挑取阳性菌落(pET28a-S1/BL21)接种到Kan⁺/LB液体培养基中，37℃过夜振摇培养，然后按1∶100的比例转接Kan⁺/LB液体培养基中，37℃230r/min振摇培养至菌群对数生长期(OD_600nm＝0.6～0.8)时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，35℃诱导表达5h，收集诱导前和诱导后菌体1mL 12000r/min，离心1min收集菌体沉淀，加50μL的PBS和50μL的2×SDS上样缓冲液，混匀，12000r/min离心1min，进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白的表达情况及其分子量大小。同时设立转化空质粒pET-28a的BL21(pET-28a/BL21)菌体作为对照。

1.4.2 重组蛋白S1的表达形式

取诱导表达后的菌液，7500r/min离心10min，弃去上清，每克菌体沉淀加入2mL菌体裂解液混匀，冰浴10min，在冰上间断超声裂解，直到菌液清亮，4℃12000r/min离心10min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，确定蛋白的表达形式。

1.4.3 重组蛋白S1的Western blot鉴定

取诱导表达的菌液，SDS-PAGE电泳后，将蛋白转印到PVDF膜上，将膜放入5％的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜；加入1:320稀释的小鼠抗PEDV血清，室温，摇床上摇动1h；洗膜后，加入1∶2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温振荡1～2h；洗涤后，将膜放入DAB底物显色液中显色3～10min，条带清晰后用去离子水终止反应，拍照记录结果。

1.5 重组蛋白S1的免疫原性

取诱导表达的菌液表达蛋白，按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明，纯化目的蛋白。经SDS-PAGE分析纯化蛋白有无杂带，用紫外分光光度计测定蛋白含量。取重组蛋白免疫6只6周龄小鼠，共免疫3次，每次间隔2周，接种剂量和途径见表1。同时设立2只非免疫小鼠，作为阴性对照。每次接种后2周尾静脉采血，分离血清，用ELISA检测特异抗体。ELISA检测抗体的主要步骤为：用1μg/mL的重组S1蛋白包被96孔酶标板，每孔100μL/孔，重复2孔；封闭后，加入1:160倍稀释的待检血清，于37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL 1:2000倍稀的羊抗鼠IgG-HRP，于37℃孵育45min，洗涤；每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，室温避光反应15min；每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应。用酶联检测仪测定OD_450nm值，分析重组蛋白诱导小鼠特异抗体的产生情况。

表1 重组蛋白的免疫接种程序

1.6 基于重组S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

1.6.1 抗原包被浓度与封闭液的确定

将纯化的重组PEDV S1蛋白与不同封闭液组成方阵，筛选最佳抗原包被浓度和封闭液，即用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)将纯化的重组PEDV S1蛋白稀释为0.25、0.5和1μg/mL，分别加入96孔酶标板各孔内，100μL/孔，重复2孔；将酶标板置37℃孵育1h，然后置4℃作用过夜；弃去包被液，每孔用280μLPBST(0.05％Tween-20的0.01mol/LpH值7.4PBS)洗涤3次，3min/次，拍干；在相应浓度的抗原孔内加入不同封闭液(含5％新生牛血清、5％马血清、5％脱脂奶粉、2％BSA和1％明胶的PBST)，100μL/孔，置37℃孵育1h，弃去封闭液，拍干；在相应抗原包被孔内加入100μL 1:40倍稀释的猪抗PEDV阳性血清和阴性血清；将酶标板置37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL 1:1000倍稀的羊抗猪IgG-HRP，将酶标板置37℃孵育45min，洗涤；每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，室温避光反应15min；每孔加入50μL的2MH₂SO₄终止反应。用酶联检测仪测定OD_450nm值，比较阴、阳性血清的OD值，以及阳性血清(P)与阴性血清(N)OD值的比值(P/N值)。当P/N值最大时的抗原包被浓度和封闭液为最佳抗原包被浓度和封闭液。

1.6.2 包被条件与封闭条件的确定

将适量的重组PEDV S1蛋白加到酶标板相应孔内，分别在下列5种条件下进行抗原包被，即37℃作用1h、4℃过夜，37℃作用1h，25℃作用1h、4℃过夜，25℃作用1h，4℃过夜。然后分别在下列4种条件下封闭抗原孔，即37℃孵育30min、37℃孵育1h、25℃孵育30min、25℃孵育1h。随后按照1.4.1中的反应条件依次加入待检血清和酶标抗体进行ELISA，确定最佳抗原包被条件和封闭条件。

1.6.3 待检血清浓度与酶标抗体浓度的确定

分别将抗PEDV阳性和阴性血清作1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280倍稀释，将羊抗猪IgG-HRP作1:500和1:1000倍稀释，组成方阵，按照1.4.1中的反应条件，进行ELISA，确定待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度。

1.6.4 待检血清和酶标抗体反应时间的确定

取重组PEDV S1蛋白包被好的酶标板，在相应孔内分别加入100μL抗PEDV阳性和阴性血清(1:40倍稀释)，于37℃下分别作用45min和1h；洗涤后，每孔加入100μL羊抗猪IgG-HRP(1:1000倍稀释)，于37℃下分别作用30min和45min；显色，终止反应，测定阴、阳性血清的OD值，比较P/N值，确定待检血清与酶标抗体的最佳反应时间。

1.6.5 血清阴阳性临界值的确定

用建立的方法检测50份PEDV抗体阴性血清，计算样品OD_450nm值的平均值(X)和标准方差(SD)。根据统计学原理，样本的OD_450nm值≥X+3SD时，判为阳性，OD_450nm值≤X+2SD时，判为阴性，介于二者之间者判为可疑。

1.6.6 特异性与敏感性试验

用建立的间接ELISA方法检测PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV和RVA等病毒抗体，同时设立PEDV阴、阳性抗体对照，评价方法的特异性。

将5份PEDV抗体阳性血清作1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释后，用建立的ELISA方法检测特异抗体。每个稀释度做3个重复，同时设立3个稀释液对照和3个空白孔对照。以能够检测到PEDV抗体的最高稀释倍数血清中的蛋白含量平均值来评价方法的敏感性。

1.6.7 对比试验分别用建立的ELISA方法与免疫过氧化物酶单层试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)检测70份猪血清，比较两种方法的检测结果，评价ELISA方法与IPMA的符合率。

1.6.8 重复性试验用同一批次重组PEDV S1蛋白包被酶标板，同时检测10份猪血清，每份血清重复3孔，共重复3次试验。另取4个批次的重组PEDV S1蛋白包被酶标板，分别检测10份猪血清，每份血清重复3孔。根据变异系数(CV)，分析建立ELISA方法的批内与批间重复性。

1.6.9 初步应用随机选取5头怀孕母猪，于产前4周经后海穴免疫接种PED灭活疫苗，母猪生产后，通过自然哺乳方法使每头初生仔猪吃到初乳。应用建立的ELISA方法检测初乳、母猪分娩当天血清及其所产仔猪(每窝10～13头)在1d、7d、14d、21d、28d和35d时血清中的特异抗体，初步分析初生仔猪血清中特异母源抗体的动态变化。

2 结果

2.1 重组表达质粒pET28a-S1的构建与鉴定

提取PEDV RNA，反转录后经PCR，扩增到了预期大小(945bp)的目的片段，结果参见图1，图1为本发明实施例扩增得到的目的片段的电泳图，其中，1为DNA相对分子质量标准；2为PCR产物。用DNA凝胶纯化回收试剂盒回收目的基因，经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ消化后与原核表达载体pET28a(+)在体外连接，构建了重组表达质粒pET28a-S1，经PCR、酶切和测序后，证明目的基因片段(S1)成功克隆到重组表达质粒pET28a(+)的相应位置，参见图2，图2是重组表达质粒pET28a-S1的PCR和酶切鉴定，其中，1为DNA相对分子质量标准；2为重组质粒菌液PCR产物；3为pET28a质粒PCR对照；4为未酶切的pET28a-S1；5为pET28a-S1的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切产物。扩增的PEDV S1核酸序列如SEQ ID No.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.2 重组蛋白S1的表达与Western blot鉴定

在35℃下经IPTG诱导5h后，结果参见图3，图3为重组PEDV S1蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析，其中，a为重组S1蛋白的表达与纯化。M.蛋白质低分子质量标准；1.pET-28a/BL21诱导前；2.pET28a/BL21诱导后；3.pET28a-S1/BL21诱导前；4.pET28a-S1/BL21诱导5h；5.纯化后的重组蛋白。B为重组S1蛋白的Western blot分析。M.蛋白质低分子质量标准；1.重组蛋白与小鼠抗PEDV阴性血清反应；2.重组蛋白与小鼠抗PEDV阳性血清反应。结果表明，pET28a-S1/BL21表达的重组蛋白分子量约38kDa，与预期大小一致(图3a)，经Westernblot检测，该蛋白能够与小鼠抗PEDV血清特异结合(图3b)。

2.3 重组蛋白S1以包涵体形式表达

携带重组表达质粒的BL21(pET28a-S1/BL21)经IPTG诱导5h后，收集细菌，经超声波裂解后，其沉淀和上清的SDS-PAGE显示，在沉淀中出现预期大小的蛋白，而在上清中几乎没有预期大小蛋白，结果参见图4，图4为重组S1蛋白表达形式的SDS-PAGE分析，其中，M为蛋白质低分子质量标准；1为裂解沉淀；6为裂解上清。表明重组S1蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达。

2.4 重组蛋白S1具有良好的免疫原性

用表达的重组蛋白首次免疫小鼠后14天，6只小鼠的三只血清中检测到了特异抗体；第二次免疫后14天全部免疫小鼠血清中均检测到了高水平的特异抗体，第三次免疫后14天的抗体水平与第二次的几乎维持在相同水平，参见图5，图5为重组S1蛋白免疫小鼠后的血清特异抗体，其中，V1～V6为重组蛋白免疫小鼠；Neg.1和Neg.2，非免疫对照小鼠；0,1～3，分别指免疫前及第一、二和三次免疫后14天采集的血清样本。上述结果表明，表达的重组S1蛋白能够刺激小鼠产生特异抗体，具有良好的免疫原性。

2.5基于重组S1蛋白的PEDV间接ELISA抗体检测方法

2.5.1间接ELISA的工作条件与判定标准

以重组S1蛋白作为包被抗原，建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。ELISA方法的主要操作步骤与判定标准为：用1μg/mL的重组PEDV S1蛋白在37℃孵育1h、4℃下过夜包被酶标板，洗涤，用5％新生牛血清的PBST在37℃下封闭1h；洗涤，加入1:40倍稀释的待检猪血清，在37℃下反应1h；洗涤，加入1:1000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，于37℃下反应45min；洗涤，加入新鲜配制的TMB底物溶液，室温避光反应15min；加入2M H₂SO₄终止反应，结果参见表2～表5。用酶联检测仪测定OD_450nm值，判定结果。当样品OD_450nm值≥0.373时，判定为特异抗体阳性；当OD_450nm值≤0.305时，判定为阴性；当OD_450nm值介于两者之间时，判定为可疑。

表2 抗原包被浓度与封闭液的确定

注：+，阳性血清；－，阴性血清；P/N，阳性血清OD_450nm值/阴性血清OD_450nm值。

表3 最佳抗原包被条件与封闭条件的确定

表4 待检血清与酶标抗体最佳稀释浓度的确定

表5 待检血清与酶标二抗最佳作用时间的确定

2.5.2 间接ELISA的特异性与敏感性

用建立的方法检测已知PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV和RVA抗体时，OD值均＜0.305，参见表6，表明建立的ELISA方法与其他病毒血清没有交叉反应，具有良好的特异性。将PEDV抗体阳性血清倍比稀释，当每mL猪抗PEDV血清中含8.3μg蛋白时，建立的ELISA能够检测到PEDV特

异抗体，表明该ELISA方法至少能够检测到＜8.3μg的特异抗体。

表6 ELISA的特异性检测

注：+，阳性血清；－，阴性血清。

2.5.3 间接ELISA与免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)的符合率

应用IPMA和ELISA从70份血清中分别检出PEDV抗体阳性血清34份和35份，检出PEDV抗体阴性血清36份和35份，二者检测结果的阳性符合率为97.06％，阴性符合率为97.22％，总符合率为97.14％。

2.5.4 重复性

当用同一批次的重S1蛋白包被酶标板，重复3次检测相同的血清样品，或者用4个批次的重组S1蛋白包被酶标板，检测相同血清样品时，其变异系数分别为3.75％～9.30％和1.49％～7.84％，均低于10％(表7和表8)。该结果表明，无论是批内还是批间重复试验，重组PEDV S1蛋白作为检测抗原均具有很好的重复性。

表7 批内重复试验

表8 批间重复试验

2.5.5 初步应用

在5头产前免疫接种PED灭活疫苗的怀孕母猪初乳和血清中，均可以检测到PEDV特异抗体，其中初乳比血清中的平均抗体水平低，OD_450nm值为分别为0.508±0.058和0.824±0.093(图6a)。5窝1日龄仔猪的血清抗体阳性率为50％，抗体阳性仔猪的平均抗体水平低(OD_450nm值为0.481±0.057)，7日龄后所有仔猪的血清全部转为抗体阴性(图6b)。图6为免疫母猪初乳、血清中的PEDV抗体及其所产仔猪血清中的特异抗体动态，其中，a为免疫母猪初乳和血清中的PEDV抗体,1、2、3、4和5为母猪编号；b为每窝仔猪血清中的PEDV抗体动态。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 河北农业大学

<120> 重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser

1 5 10 15

Thr Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly

20 25 30

Ile Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile

35 40 45

Ser Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys

50 55 60

Ala Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln

65 70 75 80

Phe Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr

85 90 95

Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser

100 105 110

Glu His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val

115 120 125

Phe Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg

130 135 140

Val Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp

165 170 175

Gly Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ser Ala

180 185 190

Asn Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser

195 200 205

Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly

210 215 220

Lys Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile

225 230 235 240

Pro Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile

245 250 255

Asp Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu

260 265 270

Arg Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile

275 280 285

Val Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn

290 295 300

Ser Ser Asp Pro His Leu Ala

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtactgggcg gttatctacc tattggtgaa aaccagggtg tcaattcaac ttggtactgt 60

gctggccaac atccaactgc tagtggcgtt catggtatct ttgttagcca tattagaggt 120

ggtcatggct ttgagattgg catttcgcaa gagccttttg accctagtgg ttaccagctt 180

tatttacata aggctactaa cggtaacact aatgctactg cgcgactgcg catttgccag 240

tttcctagca ttaaaacatt gggccccact gctaataatg atgttacaac aggtcgtaat 300

tgcctattta acaaagccat cccagctcat atgagtgaac atagtgttgt cggcataaca 360

tgggataatg atcgtgtcac tgtcttttct gacaagatct attattttta ttttaaaaat 420

gattggtccc gtgttgcgac aaagtgttac aacagtggag gttgtgctat gcaatatgtt 480

tacgaaccca cctactacat gcttaatgtt actagtgctg gtgaggatgg tatttcttat 540

caaccctgta cagctaattg cattggttat tctgccaatg tatttgctac tgagcccaat 600

ggccacatac cagaaggttt tagttttaat aattggtttc ttttgtccaa tgattccact 660

ttggtgcatg gtaaggtggt ttccaaccaa ccattgttgg tcaattgtct tttggccatt 720

cctaagattt atggactagg ccaatttttt tcctttaatc aaacgatcga tggtgtttgt 780

aatggagctg ctgtgcagcg tgcaccagag gctctgaggt ttaatattaa tgacacctct 840

gtcattcttg ctgaaggctc aattgtactt catactgctt taggaacaaa tttttctttt 900

gtttgcagta attcctcaga tcctcactta gcctaa 936

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的重组蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述的重组蛋白在检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用。

5.一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒，包括：权利要求2所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG和底物显色液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含5％新生牛血清的PBST溶液。

7.一种猪流行性腹泻病毒抗体的检测方法，包括以下步骤：

将权利要求2所述的重组蛋白用包被液包被后，用洗涤液洗涤，加入封闭液封闭，加入稀释的待测血清进行反应，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG再次反应后洗涤，加入底物显色液进行显色，获得检测结果。